CN116036298A

CN116036298A - 牛奶外泌体在制备药物载体中的应用

Info

Publication number: CN116036298A
Application number: CN202111263036.5A
Authority: CN
Inventors: 王伊; 宋海峰; 凌焱; 徐铭枝; 董亚南
Original assignee: Demiao Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Guangwu Huiwen Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-10-28

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。本发明采用牛奶外泌体作为药物载体，该外泌体来源于牛奶，安全可靠，又具有牛奶外泌体的功能性质，将其作为药物载体，可实现蛋白质药物的口服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽，实现利拉鲁肽的口服给药，治疗二型糖尿病。

Description

牛奶外泌体在制备药物载体中的应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为"exosome"。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

目前现有的外泌体纯化技术主要有以下几种方法

1、超速离心法(差速离心)

超离法是最常用的外泌体纯化手段，是外泌体提取的金标准，但规模较小，过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。

2、密度梯度离心

在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。密度梯度离心存在的问题是步骤繁琐，耗时。

3、超滤离心

超滤离心法提取外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。

4、磁珠免疫法

磁珠法提取外泌体效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

5、PEG-base沉淀法

聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。

6、试剂盒提取

商业化的外泌体提取试剂盒，提取外泌体规模小，并且会产生很多杂蛋白，外泌体纯度和回收率低。

因此本发明拟解决不依赖于离心，高效大规模提取牛奶外泌体的方法。

更重要的是，外泌体的载药是难点，本发明实现并提高了外泌体对蛋白药的载药。

目前蛋白药常用的给药方式是注射给药，注射给药复杂，并且存在安全性风险。

发明内容

有鉴于此，因此本发明采用牛奶外泌体作为药物载体，该外泌体来源于牛奶，安全可靠，又具有牛奶外泌体的功能性质，将其作为药物载体，可实现蛋白质药物的口服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽，实现利拉鲁肽的口服给药，治疗二型糖尿病。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括蛋白质药物。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括利拉鲁肽。

本发明还提供了牛奶外泌体作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括蛋白质药物。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括利拉鲁肽。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药途径为口服给药。在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病包括II型糖尿病。

更重要的是，本发明还提供了口服药物，包括有效成分和作为药物载体的牛奶外泌体。

本发明中，所述应用或所述口服药物中，所述牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、前处理；

步骤2、初步纯化、浓缩；

步骤3、精纯；

所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；

所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；

所述精纯包括CIMmultus QA柱纯化、Capto core700柱纯化、S400分子筛色谱法纯化中的一种或两者以上的组合。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中去除脂肪包括：

(1)采用静置自然沉降和过滤的方法去除脂肪；和/或

(2)采用离心的方法去除脂肪；

所述过滤包括深层过滤和/或囊式滤器过滤。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述去除蛋白采用溶解蛋白法和/或沉淀蛋白法；

所述溶解蛋白法包括柠檬酸钠溶解法；

所述沉淀蛋白法包括EDTA沉淀蛋白法、磷酸钠沉淀蛋白法、硫酸铵沉淀蛋白法中的一种或两者的组合。

在本发明的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法包括如下步骤：取等体积的牛奶与质量浓度为2％的柠檬酸钠溶液混合，冰浴震摇，滤膜过滤。

所述柠檬酸钠溶解法具体为：将等体积的牛奶倒入质量浓度为2％的柠檬酸钠溶液中，摇床冰浴震摇60min，牛奶样品均变澄清，将澄清的牛奶样品用 0.2μm滤膜进行过滤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述EDTA沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与EDTA溶液混合，室温静置，离心，滤膜过滤；所述EDTA 溶液的浓度为0.35M，pH值为7.0。

在本发明的一些具体实施方案中，所述柠檬酸钠溶解法具体为：取等体积的牛奶倒入EDTA溶液中，室温沉淀，静置15min，沉淀后的牛奶样品 12000rpm，离心40min，接着将上清用0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠溶液的浓度为1M，pH值为6.3。

在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法包括如下步骤：

不同的牛奶种类，磷酸钠沉淀蛋白法的具体步骤不相同：

(1)全脂牛奶

取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，-80℃冷冻；

(2)脱脂牛奶

取牛奶于16000rpm离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶与磷酸钠溶液混合，搅拌，沉淀，室温静置，于3500rpm离心10min，收集上清经滤膜过滤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸钠沉淀蛋白法具体包括如下步骤：取牛奶16000rpm，离心30min去除脂肪，将等体积的牛奶倒入磷酸钠溶液中，磁力搅拌器350rpm，搅拌15min，沉淀后的牛奶样品3500rpm，离心10min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法包括如下步骤：取等体积的牛奶与硫酸铵溶液混合，室温静置，离心，滤膜过滤；所述硫酸铵溶液的浓度为3.0M。

在本发明的一些具体实施方案中，所述硫酸铵沉淀蛋白法具体包括如下步骤：将等体积的牛奶倒入硫酸铵溶液中，边倒边轻轻用玻璃棒搅拌，室温进行沉淀，静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。

本发明还提供了治疗疾病的方法，以牛奶外泌体为药物载体，担载药物施用于动物体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括蛋白质药物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括利拉鲁肽。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药途径为口服给药。

在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病包括II型糖尿病。

本发明采用牛奶外泌体作为药物载体，该外泌体来源于牛奶，安全可靠，又具有牛奶外泌体的功能性质，将其作为药物载体，可实现蛋白质药物的口服给药。通过利用牛奶外泌体装载利拉鲁肽，实现利拉鲁肽的口服给药，治疗二型糖尿病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示TFF+BE-SEC和UC提取牛奶外泌体工艺路线图；

图2示TEM下3种方法提取的外泌体的形态表现(Bar＝500nm)(A： TFF；B：TFF+BE-SEC；C：UC)；

图3示3种方法提取外泌体的粒径分布(A：TFF；B：TFF+BE-SEC；C： UC.)；

图4示3种方法提取牛奶外泌体的SEC-HPLC色谱图(A：TFF；B： TFF+BE-SEC；C：UC.)；

图5示超声后的利拉鲁肽溶液(左，超声后有较多沉淀析出，溶液呈胶体状)及牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液(右)；

图6示Core700柱子纯化牛奶外泌体超声装载利拉鲁肽样品；

图7示Core700柱子纯化超声处理的利拉鲁肽样品；

图8示QA柱纯化Milk外泌体和利拉鲁肽超声后样品；

图9示QA柱纯化超声处理的利拉鲁肽样品；

图10示超声并过Core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液对荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经超声处理的利拉鲁肽原料药处理组)；

图11示探索利用电转方法实现外泌体转装载PKH67的条件；其中，图11A 示不同电压条件下电转PKH67-外泌体混合液(100μF电容)，样品FITC阳性率和颗粒浓度；图11B示500V电压不同电容条件下电转PKH67-外泌体混合液，样品FITC阳性率和颗粒浓度；

图12示Core700柱子纯化牛奶外泌体电穿孔装载利拉鲁肽样品；

图13示Core700柱子纯化电穿孔处理利拉鲁肽样品；

图14示电转并过core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液对荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经电转处理的利拉鲁肽原料药处理组)；

图15示探索利用孵育方法实现外泌体转装载PKH67的条件；其中，图15 左图示不同温度条件下孵育PKH67-外泌体混合液(0.5h)，样品FITC阳性率和颗粒浓度；图15右图示50℃孵育不同时间，样品FITC阳性率和颗粒浓度；

图16示Core700柱子纯化电穿孔处理利拉鲁肽样品；

图17示共孵育并过Core700后的利拉鲁肽溶液及外泌体-利拉鲁肽混合液对荧光素酶表达量的影响(阳性对照均为0.375ug/ml未经共孵育处理的利拉鲁肽原料药处理组)；

图18示外泌体装载不同药物的细胞药效；

图19示纳米流式检测灌胃给药不同时间点小鼠血清中阳性外泌体颗粒数；

图20示纳米流式检测舌下给药不同时间点小鼠血清中阳性外泌体颗粒数；

图21示小鼠舌下给不同载药的外泌体，1小时后灌胃葡萄糖溶液，检测小鼠血糖的随时间的变化；

图22示小鼠舌下给不同浓度的外泌体-利拉鲁肽，检测小鼠随机血糖随时间的变化；

图23示小鼠禁食6小时后，舌下给不同浓度的外泌体-利拉鲁肽，检测小鼠空腹血糖随时间的变化。

具体实施方式

本发明公开了牛奶外泌体在制备药物载体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的牛奶外泌体在制备药物载体中的应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1可工业放大的牛外泌体纯化工艺

1)采用不同蛋白去除方法对牛奶样品进行预处理

a.EDTA沉淀蛋白法：将脱脂牛奶与相同体积、不同浓度、不同pH的 EDTA混合，室温孵育15min，沉淀酪蛋白。EDTA的浓度为0.15～0.35mol·L ^－1，pH值为6.0～8.0。12 000r·min^－1，离心40min，上清依次采用0.80、0.45 和0.20μm滤膜过滤。

b.磷酸钠沉淀蛋白法：在磷酸钠溶液中加入等量的脱脂牛奶。对磷酸钠的浓度和pH范围进行几次预实验，如采用0.5mol·L^－1(pH 5.3、pH 6.5和 pH 7.6)、1.0mol·L^－1(pH5.2、pH6.3和pH7.6)和2.0mol·L^－1(pH 6.0、 pH 7.0和pH 8.0)磷酸钠。4℃过夜沉淀蛋白，沉淀后的上清依次通过0.80、 0.45和0.20μm滤膜过滤。

c.柠檬酸钠溶解蛋白法：将脱脂乳与等量的2％、4％、6％、8％和16％的柠檬酸钠混合，冰上孵育2h溶解酪蛋白，0.20μm滤膜过滤。

2)TFF法初纯和浓缩牛奶外泌体

预处理后的牛奶上清采用相对分子质量为750 000的中空纤维柱进行处理。设置***参数TMP最大压力为2个大气压，报警压力为2个大气压；体积：最小体积为100mL，报警体积为100mL。将样品倒入循环杯中，采用1×PBS进行置换，直至透过的蛋白浓度为0.00g·L^－1后，将杯中的液体继续浓缩到原液的1/20收集样品。

3)BE-SEC和UC精纯牛奶外泌体BE-SEC：

Pure 25纯化***采用超纯水进行冲洗，并连接HiScreen Capto Core700柱继续采用超纯水冲洗3个柱体积，冲洗结束继续采用缓冲液 1×PBS平衡3个柱体积，将初纯样品采用HiScreen CaptoCore 700柱进行纯化，流速为2mL·min^－1，收集流穿出峰位置样品，即为牛奶外泌体。

实验结果：

如图1所示，采用蛋白沉淀的方法获取预处理样品，并采用TFF结合 BE-SEC的纯化方法，获得牛奶外泌体。通过与传统外泌体提取方法——UC 进行对比证明本工艺方法所获的的样品得率和纯度更高。

如图2所示，TFF、BE-SEC和UC提取的外泌体在TEM下均能观察到膜结构，呈现出茶托状或圆盘状。但TEM下UC提取的外泌体拍摄背景较杂，蛋白聚集物较多。蛋白沉淀预处理样品，并采用TFF结合BE-SEC的纯化方法背景比较干净。

采用NanoFCM检测外泌体的颗粒粒径、浓度和纯度的结果如图3所示： TFF获得的外泌体平均粒径为(66.92±16.39)nm，得率为3.6×10¹³个颗粒·L^-1，纯度为58％；TFF+BE-SEC制备的牛奶外泌体直径大小较为集中，为30～150nm，外泌体平均粒径为(66.41±15.81)nm，得率为2.5×10¹³个颗粒·L^-1，纯度为90％；UC获得的外泌体平均粒径为(68.87±18.04)nm，得率为2.4×10¹¹个颗粒·L^-1，纯度为25％。说明TFF+BE-SEC制备的外泌体得率更高，纯度更高。

如图4所示：采用HPLC检测外泌体样品中游离蛋白(粒径小于外泌体尺寸)含量。3种方法提取所得牛奶外泌体中在TSKgel G6000 PWXL柱上的保留时间均为8min。但TFF与BE-SEC提取的外泌体样品较UC所得样品的杂质峰(RT>8min)比例更小，TFF+BE-SEC所得终产物更体现为单一峰。

采用蛋白沉淀预处理牛奶加上TFF结合BE-SEC的纯化方法，能收获得率和纯度更高的外泌体样品，更重要的是TFF可实现样品从几升至上百升的初纯和浓缩，将TFF与BE-SEC结合，最终可实现牛奶外泌体的规模制备。

实施例2牛奶外泌体载药工艺——超声装载法

原理：由于超声能够打乱膜中脂质链的排列出现暂时性的小孔，因此对外泌体进行低频率的连续超声，声波引起包封空气膨胀，囊泡内压升高达到双分子层的弹性极限，磷脂层出现孔隙，由于膜外药物浓度高，渗透压的差异使得药物通过孔隙向脂质体内扩散。

操作步骤：

利用PKH67探索超声装载最优条件：PKH67与牛奶外泌体室温共孵育 30min后，细胞破碎仪分别摸索超声功率

150w/300w/450w/600w/800w/1000w/1200w，并探索超声时间

0s/50s/250s/500s/750s/20min/30min/1h/2h/4h/6h。超声后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数，及PKH67阳性率。根据超声装载优化后条件，探索超声体积，超声后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数，粒径及PKH67阳性率。

实验结果：

表1超声功率和超声时间对外泌体装载阳性率的影响

表2超声功率和超声时间对外泌体颗粒数(10¹⁰particals/mL)的影响

表3不同超声体积对外泌体装载的影响(600w超声500s)

不同功率超声后外泌体装载效率有很大区别，超声后阳性率在5％-90％之间；450W-1200W功率，超声时间超过20min，装载效率差距不明显，基本稳定在80％左右。随着超声时间延长，颗粒数有所下降。且可实现3ml-500ml 体系的装载规模，装载后颗粒数和装载阳性率比较稳定。

超声装载利拉鲁肽：

按照1×10¹¹个外泌体颗粒与5mg利拉鲁肽的比例混合，进行超声，超声后用Core700或QA柱进行纯化，超声前后溶液状态有明显变化，如图5所示：超声后的利拉鲁肽溶液(左，超声后有较多沉淀析出，溶液呈胶体状)及牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液(右)。

取利拉鲁肽25mg，及利拉鲁肽25mg与5×10¹¹个外泌体颗粒混合液超声，超声后过Core700，收集流穿。结果如图6～7所示，5mL Core700色谱柱，收集进样开始后2-4mL的流穿样品，此部分为装载利拉鲁肽的外泌体颗粒，游离利拉鲁肽吸附在色谱柱上，进而洗脱被去除。

取利拉鲁肽250mg，及利拉鲁肽250mg与5×10¹²个外泌体颗粒混合，超声，超声后经QA柱纯化，收集流穿和洗脱各组分样品。结果如图8～9所示，装载利拉鲁肽的外泌体和游离利拉鲁肽根据带电荷量的差异，在不同盐浓度分别被洗脱。

接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板，细胞培养24h后，将培养基更换为含有空白牛奶外泌体，或10⁵/mL,10⁶/mL,10⁷/mL,10⁸/mL,10⁹/mL,10¹⁰/mL的milk- 外泌体-liraglutide,，以及对应颗粒浓度的利拉鲁肽溶液培养5h。收样按照荧光素酶试剂盒说明书进行收样，没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细胞，裂解5min，收集细胞裂解液用1200rpm，离心5min，然后加入底物(孵育5min) 然后用酶标仪进行检测荧光。结果如图10和表4所示。

表4

实验结论：从原料药与牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液超声后的液体形状对比看出，在含有外泌体的时候，利拉鲁肽不会析出，而是负载到外泌体上。牛奶外泌体-利拉鲁肽混合液超声后，经过QA纯化，色谱图显示超声装载后样品在高盐洗脱中(电导率70.44Ms/cm)A260/A280吸收比例提高至1.88，外泌体经超声后双层膜被打破，此处为释放出的核酸内容物的吸收峰，超声时间延长后外泌体颗粒数有所下降。在经过core700或QA纯化后，按比例稀释给药处理细胞，能看到检测的荧光素酶表达情况呈剂量依赖。1×10¹⁰颗粒数牛奶外泌体-外泌体-利拉鲁肽处理细胞，显著提高细胞荧光素酶的表达量，说明实现了牛奶外泌体对利拉鲁肽的装载，并且仍具有生物活性。

实施例3牛奶外泌体载药工艺——电穿孔法

原理：电穿孔是微生物学技术，其中将电场施加到细胞以增加细胞膜的渗透性，从而允许化学品，药物或DNA被引入细胞。

操作步骤：

利用PKH67探索电穿孔装载药物最优条件：PKH67与牛奶外泌体室温共孵育30min后，电穿孔仪按电压100-500v，电容100-500uF进行实。电转后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数，粒径及PKH67阳性率。

取利拉鲁肽25mg，及利拉鲁肽25mg与5×10¹¹个外泌体颗粒混合液进行电转，电转后过core700除去游离的利拉鲁肽，收集流穿。

接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板，细胞培养24h后，将培养基更换为含有空白牛奶外泌体，或10⁵/mL,10⁶/mL,10⁷/mL,10⁸/mL,10⁹/mL,10¹⁰/mL的 milk-外泌体-liraglutide,，以及对应颗粒浓度的利拉鲁肽溶液培养5h。收样按照荧光素酶试剂盒说明书进行收样，没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细胞，裂解5min，收集细胞裂解液用1200rpm，离心5min，然后加入底物(孵育5min)然后用酶标仪进行检测荧光。

实验结果如图11～14、表5～7所示：

表5电压对外泌体装载的影响

电压V	阳性率％	<![CDATA[浓度颗粒数×10<sup>10</sup>/mL]]>
			0	7.12	8.55
100	8.2	2.8
			200	28.5	2.52
300	39	2.26
			400	62.9	1.56
500	59.5	2.14

表6电容对外泌体装载的影响

电容uF	阳性率％	<![CDATA[浓度颗粒数×10<sup>10</sup>/mL]]>
			0	6.35	8.55
100	46.8	3.2
			200	51.8	3.78
300	71.2	2.78
			400	69.8	2.96
500	57.1	2.11

表7

实施例4牛奶外泌体载药工艺——共孵育法

原理：利用物质间的相互作用力，使得药物吸附在药物载体上。

操作步骤：

利用PKH67探索共孵育装载药物最优条件：PKH67与牛奶外泌体室温共孵育30min后，样品置于4℃，37℃，50℃共孵育30min，1h，2h，500rpm摇晃。共孵育后的样品利用NanoFCM检测样品颗粒数，粒径及PKH67阳性率。

取利拉鲁肽25mg，及利拉鲁肽25mg与5×10¹¹个外泌体颗粒混合液进行共孵育共孵育后的样品过Core700除去游离的利拉鲁肽，收集流穿。

实验结果如图14～17、表8～10所示。

表8孵育温度对外泌体装载的影响

温度	阳性率％	<![CDATA[浓度颗粒数×10<sup>10</sup>/mL]]>
			4℃	7.12	8.55
37℃	8.2	3.18
			42℃	28.5	3.32
50℃	49	3.26
			60℃	22.9	1.56

表9孵育时长对外泌体装载的影响

时长	阳性率％	<![CDATA[浓度颗粒数×10<sup>10</sup>/mL]]>
			0.5h	32.1	3.6
1h	46.8	3.78
			2h	29.8	3.78
4h	21.2	2.78
			8h	9.8	1.96

表10共孵育法细胞药效

实验结论：在经过core700纯化后，按比例稀释给药处理细胞，能看到检测的荧光素酶表达情况呈剂量依赖。1×10¹⁰颗粒数牛奶外泌体-外泌体-利拉鲁肽处理细胞，显著提高细胞荧光素酶的表达量，说明实现了牛奶外泌体对利拉鲁肽的装载，并且仍具有生物活性。

实施例5牛奶外泌体装载不同T2DM药物

目前，市面上具有多种治疗二型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM) 的药物，如德谷胰岛素，地特胰岛素，利拉鲁肽，索马鲁肽，以及已在国外上市的Tirzepatide。本发明实现了牛奶外泌体装载不同的T2DM药物，从而可将这些药物的给药方式从注射该为口服，解决市面上无口服糖尿病药物的困境。

操作：

1)根据4.2介绍的牛奶外泌体的载药方式，选择电穿孔方法，利用牛奶外泌体分别装载德谷胰岛素，地特胰岛素，利拉鲁肽，索马鲁肽，Tirzepatide，并经过core700柱纯化；

2)接种GLP-1R-CHO细胞至96孔板，细胞培养24h后，将培养基更换为含有空白牛奶外泌体，或10⁵/mL,10⁶/mL,10⁷/mL,10⁸/mL,10⁹/mL,10¹⁰/mL的装载不同药物的牛奶外泌体,，培养5h。收样按照荧光素酶试剂盒说明书进行收样，没孔加入100ul细胞裂解液进行裂解细胞，裂解5min，收集细胞裂解液用1200rpm，离心5min，然后加入底物(孵育5min)然后用酶标仪进行检测荧光。

实验结果如图18、表11所示：

表11外泌体装载不同药物的细胞药效

实验结论：

从结果上看，负载不同药物的牛奶外泌体均能使细胞释放GLP，并且具剂量依赖性。说明本发明能实现对不同类型的蛋白多肽类药物的装载。

实施例6牛奶外泌体舌下给药

原理：本发明利用舌下粘膜未角质化，毛细血管丰富，血流速度快的特点，针对牛奶外泌体经过胃肠道易被胃酸破坏，导致装载的药物生物利用度低，以及利拉鲁肽口服会被降解等问题，将装载利拉鲁肽的牛奶外泌体制成舌下片，实现利拉鲁肽口服给药，并且可通过舌下粘膜吸收，通过颈静脉和上腔静脉直接进入血液循环，起效迅速；并且服药时无需用水，置于舌下含化，服用方便，口感好。

实验操作：

A.将PKH67标记的牛奶外泌体，分别尝试灌胃，舌下给药，以及制备肠溶胶囊给药；

B.给药后，采集不同时间点的小鼠血液，利用纳米流式检测血液中的阳性颗粒数，确定外泌体的入血吸收效果。

结果如图19～20、表12～14所示：

表12灌胃给药数据

表13舌下给药数据

表14肠溶胶囊数据

	mean	SD
			0min	<![CDATA[4.58×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[2.67×10<sup>7</sup>]]>
30min	<![CDATA[6.10×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[1.89×10<sup>7</sup>]]>
			1h	<![CDATA[1.53×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[9.87×10<sup>6</sup>]]>
2h	<![CDATA[1.53×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[8.22×10<sup>6</sup>]]>
			3h	<![CDATA[3.05×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[1.24×10<sup>7</sup>]]>
4h	<![CDATA[6.86×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[2.78×10<sup>7</sup>]]>
			5h	<![CDATA[1.30×10<sup>8</sup>]]>	<![CDATA[9.18×10<sup>6</sup>]]>
8h	<![CDATA[1.53×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[7.35×10<sup>6</sup><!-- 12 -->]]>
			22h	<![CDATA[9.92×10<sup>7</sup>]]>	<![CDATA[3.22×10<sup>7</sup>]]>

通过灌胃给小鼠PKH67标记的牛奶外泌体，不同时间点采集血液检测阳性颗粒，每只小鼠灌胃4×10¹¹颗粒，5min时检测到颗粒最高，小鼠血液中检测到2×10⁹阳性颗粒，因此，相当于有0.5％的外泌体进入到了血液中。当舌下给PKH67标记的牛奶外泌体时，5min检测到的阳性颗粒数最多，约为2× 10¹⁰阳性颗粒，相当于有5％的外泌体进入到了血液。而尝试肠溶胶囊给药，在小鼠血液中，给药组的阳性颗粒数并未显著增加。因此，舌下给药的生物利用度明显高于灌胃给药的生物利用度。

实施例7牛奶外泌体舌下片剂

实验操作：装载利拉鲁肽的牛奶外泌体冻干粉，与崩解剂，填充剂，粘合剂，润滑剂，矫味剂混合后，制备成舌下片。每1000片利拉鲁肽牛奶外泌体舌下片中，主药的含量为10⁵-10¹⁷颗粒数，崩解剂的含量为1-50g，填充剂的含量为20-400g；矫味剂0-50g，粘合剂5-100g，润滑剂1g-10g；

所选用的崩解剂：微晶纤维素，交联羧甲基纤维素钠，交联聚乙烯吡咯烷酮，羧甲基淀粉钠，低取代羟丙基纤维素，淀粉，吐温，十二烷基硫酸钠中的仍一种或两种以上的混合物；

所选用的填充剂：微晶纤维素，微晶纤维素-甘露醇，微晶纤维素-微粉硅胶，乳糖，淀粉，改性淀粉，甘露醇，山梨醇，木糖醇，赤藓糖，海藻糖，预胶化淀粉，糖粉，葡萄糖，糊精，硫酸钙中的任一种或两种以上的混合物。

所选用矫味剂：甜菊甙，糖粉，甘草甜素，阿司帕坦，三氯蔗糖，甜蜜素，索马甜，糖精等一种或两种以上的混合物。

所选用的粘合剂：纯化水，淀粉浆，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆，糊精，明胶浆，***胶浆，海藻酸钠和糖浆中的一种或两种以上的混合物。

所用润滑剂：硬脂酸，硬脂酸镁，硬脂酸钙，微粉硅胶，滑石粉，氢化植物油，聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，十二烷基硫酸钠，十二万级硫酸镁，富马酸硬质酸钠中的任一种或两种以上的混合物。

最优配方如下：1×10¹⁵颗粒外泌体-利拉鲁肽，4g交联羧甲基纤维素钠， 80g甘露醇，25g纯化水，3.5g硬脂酸镁，按下述制备步骤进行制备

制备步骤如下：

第一步：将所述的主药冷冻干燥，过筛80-120目；

第二步：将填充剂，崩解剂，矫味剂，润滑剂烘干，粉碎，过筛80-120 目预处理；

第三步：将预处理的主药，填充剂，矫味剂和崩解剂混合均匀；

第四步：将粘合剂加入混匀的上述无聊中，制成软材，制粒，干燥；

第五步：干颗粒加入润滑剂混匀，再进行压片得到成品。

实施例8

将1×10¹³颗粒数主药利拉鲁肽牛奶外泌体加入甘露醇0.6g，冷冻干燥后，与填充剂55g微晶纤维素，1g崩解剂羧甲基纤维素钠，1g润滑剂硬脂酸镁进行烘干，粉碎，过筛混合，制成软材，用20目网筛制粒，并风干至水分≤3％，再加入润滑剂，进行总混，最后压片得到利拉鲁肽牛奶外泌体舌下片。

实施例9

实验操作：

采用电穿孔方法，将德谷胰岛素，地特胰岛素，利拉鲁肽，索马鲁肽， Tirzepatide装载到牛奶外泌体并进行纯化，获得载药外泌体，并按照上述制剂配方制备舌下片；

每只小鼠舌下给药1×10¹¹颗粒数的舌下片，注射葡萄糖后，检测小鼠对糖耐受效果。

结果如图21、表15所示：

表15

结果分析：

通过利用牛奶外泌体，可实现多种降血糖药物的装载。载药的外泌体通过口服给药，能够在15min内实现明显的降血糖效果。并且能够维持血糖的稳定，提高小鼠对糖的耐受反应。

实施例10

采用电穿孔方法，将利拉鲁肽(不限于利拉鲁肽，也包括德谷胰岛素，地特胰岛素，索马鲁肽，Tirzepatide)装载到牛奶外泌体并进行纯化，获得载药外泌体，并按舌下片最优配方制备舌下片，此处以装载利拉鲁肽的牛奶外泌体的结果为例进行说明。

糖尿病小鼠舌下给不同浓度的装载利拉鲁肽的牛奶外泌体，检测小鼠的随机血糖。

结果如图22、表16所示：

表16

结论：从随机血糖的结果上看，装载利拉鲁肽的外泌体能明显降低血糖。

实施例11

采用电穿孔方法，将利拉鲁肽(不限于利拉鲁肽，也包括德谷胰岛素，地特胰岛素，索马鲁肽，Tirzepatide)装载到牛奶外泌体并进行纯化，获得载药外泌体，并制备舌下片，此处以装载利拉鲁肽的牛奶外泌体的结果为例进行说明；

糖尿病小鼠禁食6h后，口腔给不同浓度的装载利拉鲁肽的牛奶外泌体，检测小鼠的空腹血糖。

结果如图23、表17所示：

表17

结论：从空腹血糖的结果上看，装载利拉鲁肽的外泌体能明显降低血糖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.牛奶外泌体在制备药物载体中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括蛋白质药物。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包括利拉鲁肽。

4.牛奶外泌体作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包括蛋白质药物。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述药物包括利拉鲁肽。

7.如权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为口服给药。

8.如权利要求4至7任一项所述的应用，其特征在于，所述疾病包括II型糖尿病。

9.口服药物，其特征在于，包括有效成分和作为药物载体的牛奶外泌体。

10.如权利要求1～8任一项所述的应用或如权利要求9所述的口服药物，其特征在于，所述牛奶外泌体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、前处理；

步骤2、初步纯化、浓缩；

步骤3、精纯；

所述前处理包括去除脂肪和/或去除蛋白；

所述初步纯化、浓缩采用切向流超滤；

11.治疗疾病的方法，其特征在于，以牛奶外泌体为药物载体，担载药物施用于动物体。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物包括蛋白质药物。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述药物包括利拉鲁肽。

14.如权利要求11至13任一项所述的方法，其特征在于，所述药物的给药途径为口服给药。

15.如权利要求11至14任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病包括II型糖尿病。