CN113980957A - 基于CRISPR/Cas12a的单链DNA探针及检测目标核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开属于核酸检测技术领域，具体来说，本公开涉及一种基于CRISPR/Cas12a的单链DNA探针、用于检测目标核酸的组合物或试剂盒，以及检测目标核酸的方法。本公开的单链DNA探针，将其应用于基于Cas蛋白的DNA检测***中，能够有效缩短目标DNA的检测时间，提高DNA检测效率，解决目前基于CRISPR/Cas12a的DNA检测技术中存在的检测时间较长的问题，并且保持了较高的灵敏度、特异性和检测准确性，可用于病毒、细菌以及疾病相关基因等的核酸快速检测。
Description
技术领域
本公开属于核酸检测技术领域，具体来说，本公开涉及一种基于CRISPR/Cas12a的单链DNA探针、用于检测目标核酸的组合物或试剂盒，以及检测目标核酸的方法。
背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多数细菌及古细菌中抵御外源基因的一种获得性免疫方式。细菌或古细菌的CRISPR***能够生成对应的能识别入侵者基因组的CRISPR RNA(crRNA)，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白(CRISPR associated proteins)对外源基因的靶标序列进行识别和切割，从而抵抗病毒或质粒等的入侵。
已知的CRISPR/Cas***可以分为两类(第1类和第2类)，并进一步分为六种类型(I型～Ⅵ型)。其中，第1类***包括I型、III型和IV型，第2类***包括II型、V型以及VI型。常见的Cas9、Cas12、Cas13和Cas14蛋白都属于2类***，其中最广泛使用的CRISPR/Cas***是在Streptococcus pyogenes(Sp)中发现的II-A亚型，其编码SpCas9蛋白，该蛋白是用于基因组编辑的第一个Cas蛋白。第2类***由于其简便性和高效性，在核酸检测和诊断、基因编辑、基因筛选等方面得到了广泛的应用。
与Cas9蛋白不同，Cas12a的初级转录产物pre-crRNA由Cas12a自身加工，不需要tracrRNA的参与。Cas12a催化自身crRNA阵列加工成成熟的crRNA，从而能够同时靶向多个基因[1-2]。Cas12a特异性结合和切割目标双链DNA之后，其非特异性切割单链DNA(ssDNA)的酶活性被激活，将切割附近的任何单链DNA。目前，利用Cas12a的这种非特异性的酶切活性开发了一系列如DETECTR[3](DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)、HOLMES(an one-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System)等核酸检测***。由于Cas12a被目标DNA特异性激活后，能够非特异性地切割单链DNA，具有信号放大作用，因而利用Cas12a的核酸检测技术相较于传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。
目前，利用Cas12a蛋白的核酸检测技术所使用的信号报告探针为富含A、T碱基的ssDNA探针，基于该信号报告探针的核酸检测技术虽然具有较高的检测灵敏度，但在CRISPR/Cas12a的反应体系中需要较长的时间(一般超过20分钟)才能检测到明显的信号，不利于实现核酸的快速检测。
因此，优化CRISPR/Cas12a的核酸检测探针，以缩短检测时间，提高检测效率，建立灵敏、快速、便携、廉价的新型核酸检测技术，是当前亟需解决的重要问题。
引用文献：
[1]Fonfara I,Richter H,
M,et al.The CRISPR associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.Nature,2016,532(7600):517-521.
[2]Zetsche B,Heidenreich M,Mohanraju P,et al.Multiplex gene editingby CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.Nat Biotechnol,2017,35(1):31-34.
[3]Chen JS,Ma E,Harrington LB,et al.CRISPR-Cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science,2018,360(6387):436-439
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术存在的问题，例如，基于CRISPR/Cas12a的DNA检测技术存在检测时间长、检测效率低，不利于实现DNA的即时诊断的缺陷。为此，本公开提供了一种单链DNA探针，单链DNA探针在应用于基于Cas蛋白的DNA检测***中，能够有效缩短DNA检测的时间，提高DNA检测效率，解决目前基于CRISPR/Cas12a的DNA检测技术中存在的检测时间较长的问题，并且保持较高的灵敏度和特异性，对于实现目标DNA的即时、灵敏、便携、特异性检出具有重要意义。
用于解决问题的方案
本公开提供了一种单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针包含碱基A和碱基C，并且，所述碱基A和碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的80％-100％；
所述单链DNA探针被Cas蛋白切割后，释放出检测信号。
在一些实施方式中，根据本公开所述的单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针中碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的20％以上，优选40％以上；
可选地，所述单链DNA探针包含5-20个核苷酸，优选9-20个核苷酸，更优选9-11个核苷酸。
在一些实施方式中，根据本公开的单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针包含如下(i)-(ii)任一项所示的序列：
(i)如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中任一项所示的核苷酸序列；
(ii)与(i)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
优选地，所述单链DNA探针包含如下(iii)-(iv)任一项所示的序列：
(iii)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10中任一项所示的核苷酸序列；
(iv)与(iii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的单链DNA探针，其中，所述Cas蛋白为Cas12蛋白，优选为Cas12a蛋白；可选地，所述Cas12a蛋白为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。
在一些实施方式中，根据本公开所述的单链DNA探针，其中，所述检测信号为荧光检测信号、免疫检测信号或电化学检测信号；
可选地，所述单链DNA探针的5’端和3’端中的一端标记第一信号分子，所述单链DNA探针的5’端和3’端中的另一端标记第二信号分子；
可选地，所述第一信号分子和所述第二信号分子彼此独立地选自FAM、FITC、BHQ、Biotin或Digoxin，并且，所述第一信号分子与所述第二信号分子不同。
本公开还提供了一种用于检测目标核酸的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒包括根据本公开所述的单链DNA探针；
可选地，所述目标核酸是来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸；
优选地，所述病原体为病毒；优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肠道病毒71型(EV71)或柯萨奇病毒A16型(CVA16)。
在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒还包括Cas蛋白和crRNA；所述crRNA结合所述Cas蛋白，并且包含与所述目标核酸的靶序列至少部分互补的核苷酸序列；
优选地，所述Cas蛋白为Cas12蛋白，更优选为Cas12a蛋白；可选地，所述Cas12a蛋白为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。
在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物或试剂盒，其中，所述crRNA的指导序列包含如下(v)-(vi)任一项所示的序列：
(v)如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；
(vi)与(v)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒还包括用于恒温核酸扩增所述目标核酸的核酸扩增单元；可选地，所述核酸扩增单元包含用于扩增所述目标核酸的扩增引物组；优选地，所述扩增引物组包含如下(a)-(c)组成中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的下游引物；
(b)包含如SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的下游引物；
(c)包含如SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的下游引物。
在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物或试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于检测所述单链DNA探针释放的检测信号的信号检测单元；可选地，所述信号检测单元为胶体金检测试纸。
根据本公开所述的单链DNA探针，或根据本公开所述的组合物或试剂盒在如下(d)-(f)中至少一种的用途：
(d)检测目标核酸，或制备用于检测目标核酸的试剂或试剂盒；
(e)作为或制备用于检测病原体感染的试剂或试剂盒；
(f)作为或制备用于检测疾病相关基因的试剂或试剂盒；
可选地，所述病原体选自病毒、细菌、真菌的至少一种；优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肠道病毒71型(EV71)或柯萨奇病毒A16型(CVA16)。
本公开还提供了一种检测目标核酸的方法，其中，所述方法包括使用根据本公开所述的单链DNA探针，或根据本公开所述的组合物或试剂盒对目标核酸进行检测的步骤；
可选地，所述目标核酸是来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸；
优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肠道病毒71型(EV71)或柯萨奇病毒A16型(CVA16)。
在一些实施方式中，根据本公开所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
混合步骤：将Cas12a蛋白、crRNA、单链DNA探针与待测样品接触，得到混合物体系；
判定步骤：获取所述混合物体系中的检测信号，根据所述检测信号判定所述待测样品中是否含有目标核酸；
可选地，所述方法还包括：在所述混合步骤之前，对所述待测样品进行核酸扩增的步骤。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开提供了一种单链DNA探针，将其应用于基于Cas蛋白的DNA检测***中，能够有效缩短DNA检测的时间，提高DNA检测效率，并且具有灵敏度高、特异性好、准确性高的优势，可用于病毒、细菌以及疾病相关基因等的快速检测。
在一些优选的实施方式中，本公开提供的单链DNA探针，将其应用于CRISPR/Cas12的检测体系，可在5-10min内实现对目标DNA检测。与目前常用的长度为5nt且富含A、T的CRISPR/Cas12a的检测探针相比，本公开中的单链DNA探针显著缩短了DNA检测时间，提高了检测效率。
在一些实施方式中，本公开提供的用于检测目标DNA的组合物或试剂盒，不依赖复杂的实验仪器、不需要对待测样品进行负责的前处理，具有检测时间较短、检测效率较高，且灵敏度和特异性较高的优势，在临床诊断、环境监测、食品安全检测等领域具有广泛的应用前景。
在一些优选的实施方式中，本公开中的单链DNA探针、包含单链DNA探针的组合物或试剂盒，能够快速、准确识别新型冠状病毒SARS-CoV-2、柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71等病毒核酸，对于遏制病毒传播和传染性疾病的蔓延具有重要意义。
在一些实施方式中，本公开中检测目标核酸的方法，操作简便、成本低、无需使用复杂大型设备，能够实现对目标核酸的即时、快速、灵敏、特异性检测，有利于病毒等病原体的快速检出，实现对传染性疾病或癌症等疾病的快速、早期诊断，对控制传染性疾病的传播，实现疾病的早发现、早治疗具有重要意义。
附图说明
图1示出了实施例1中针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的荧光报告实验结果；
图2示出了实施例1中针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的FAM试纸条实验结果；
图3示出了实施例1中针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的Digoxin试纸条实验结果；
图4示出了实施例2中针对不同单链DNA探针检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的荧光报告实验结果；
图5示出了实施例2中针对不同单链DNA探针检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FAM试纸条实验结果；
图6示出了实施例2中针对不同单链DNA探针检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的Digoxin试纸条实验结果；
图7示出了实施例3中试纸条的结构及检测目标核酸的原理示意图；
图8示出了实施例4中苏州CDC提供的柯萨奇病毒A16型临床样本的qPCR结果；
图9示出了实施例4中单链DNA探针10nt FQ-2用于柯萨奇病毒A16型临床样本荧光检测结果；
图10示出了实施例4中单链DNA探针10nt FB-2用于柯萨奇病毒A16型临床样本试纸条检测结果；
图11示出了实施例4中单链DNA探针10nt DB-2用于柯萨奇病毒A16型临床样本试纸条检测结果；
图12示出了实施例5中苏州CDC提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2临床样本的qPCR结果；
图13示出了实施例5中单链DNA探针10nt FQ-2用于新型冠状病毒SARS-CoV-2临床样本荧光检测结果；
图14示出了实施例5中单链DNA探针10nt FB-2用于新型冠状病毒SARS-CoV-2临床样本试纸条检测结果；
图15示出了实施例5中单链DNA探针10nt DB-2用于新型冠状病毒SARS-CoV-2临床样本试纸条检测结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
如本公开所使用的，术语“Cas蛋白”包括具有野生型核酸内切酶活性的Cas蛋白；与野生型Cas蛋白相比核酸内切酶活性更高的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段；保留或至少部分保留野生型Cas蛋白的核酸内切酶活性的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段。
如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含突变(即，取代、***和/或缺失)的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。***是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
本公开的“突变”可以选自“保守突变”、“半保守突变”。其中，术语“半保守突变”可以是保留部分蛋白功能的突变。术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。
如本公开所使用的，术语“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫***。
如本公开所使用的，术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，Cas蛋白与CRISPR序列共同构成CRISPR/Cas***Cas蛋白具有与核酸酶相关的功能结构域，通过识别PAM(protospacer adjacent motif)在特定位置切割靶序列。
如本公开所使用的，术语“crRNA”包含重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)，CRISPR转录形成长链的pre-CRISPR RNA(pre-crRNA)，pre-crRNA加工后得到包含一段重复区序列和一段间隔区序列的短的crRNA。在一些CRISPR/Cas***中，crRNA由Cas蛋白作用于pre-crRNA得到。在另外一些CRISPR/Cas***中，crRNA由Cas蛋白与tracrRNA(trans-activating crRNA)共同作用于pre-crRNA得到。
在不同的CRISPR/Cas***中，crRNA可以单独作为向导RNA(guide RNA，gRNA)引导Cas蛋白定位到位于PAM序列附近的靶序列，或者crRNA与tracrRNA合并向导RNA(guideRNA，gRNA)引导Cas蛋白定位到位于PAM序列附近的靶序列。
如本公开所使用，“crRNA的指导序列”是指crRNA中与目标核酸的靶序列杂交的序列，其对应由crRNA的间隔序列(spacer)形成。
如本公开所使用的，术语“靶序列”是指目标核酸中与crRNA互补或至少部分互补的核苷酸序列，Cas蛋白、crRNA与靶序列形成三元复合物后，Cas蛋白发挥对目标核酸中靶核酸链和/或非核苷酸链的特异性切割活性。在本公开中，“靶序列”与“靶核酸”可以互换地使用。
如本公开所使用的，术语“靶标链”(target strand)是指目标核酸中与crRNA杂交的核苷酸链；术语“非靶标链”(non-target strand)是指目标核酸中与crRNA不发生杂交配对的核苷酸链。
如本公开所使用的，术语“切割”可以是指使核苷酸链中磷酸二酯键断裂。对于断裂的类型可以是单链断裂或双链断裂。
如本公开所使用的，术语“病原体”是指可造成人或动植物感染疾病的微生物(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌)、寄生虫或其他媒介(微生物重组体包括杂交体或突变体)。
术语“感染性疾病”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或真菌感染。
如本公开所使用的，术语“COVID-19”的含义为新型冠状病毒肺炎(coronavirusdisease2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的新型肺炎。
如本公开所使用的，“SARS-CoV-2”属冠状病毒β属，是一种从未在人体中检测到的新毒株。该病毒潜伏期长，传染性极强，主要通过飞沫和接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶有被感染的可能。SARS-CoV-2的传播对全球的公共卫生体系、人民生命健康安全和国家经济发展形成了巨大威胁，准确、快速地识别SARS-CoV-2是控制疫情蔓延，遏制病毒由无症状感染者向密切接触者传播的关键。
如本公开所使用的，手足口病(HFMD)是一种肠道病毒感染，以手掌、足底、口腔黏膜及臀部等部位的斑丘疹及疱疹为主要特征，伴或不伴有发热的急性传染病由肠道病毒感染所致，具有很强的传染性。是儿童常见传染病，好发于5岁以下儿童。引起HFMD的肠道病毒有20多种(型)，主要有柯萨奇病毒A组16、4、5、6、7、9、10型，B组1、2、3、5型；埃可病毒和肠道病毒71型，属于小RNA病毒科肠道病毒属，其中以柯萨奇病毒A16型(CVA16)、肠道病毒71型(EV71)最为常见。
如本公开所使用的，术语“疾病”或“医学病症”是指对动物或植物体或其部分之一的正常状态的任何破坏，其中断或改变了生命功能的执行。通常表现为明显的体征和症状，通常是对以下方面的反应：(i)环境因素(如营养不良，工业危害或气候)；(ii)特定的感染因子(如细菌或病毒)；(iii)有机体的固有缺陷(作为遗传异常)；和/或(iv)这些因素的组合。
如本公开所使用的，“目标核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。生物样品是从任何生物体获得、***或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。在一些实施方式中，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液中获得的生物液体或从关节获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。在一些实施方式中，待测样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、***等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”、“重组核酸分子”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“互补的”或“杂交的”用于指与碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(它们是可互换的术语，指的是核苷酸序列)。例如，序列“CAGT”与序列“GTCA”互补。互补可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补是指一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则错配，核酸之间的“全部”或“完全”互补是指每个核酸碱基在碱基配对下均与另一个碱基匹配规则。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
如本文所用，术语“杂交”是指使用核酸链通过碱基配对与互补链结合以形成杂交复合物的任何过程来配对互补核酸。
如本公开所使用的，术语“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，并且是指可以是单链或双链的基因组或合成来源的DNA或RNA，和代表有义或反义链。
如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸***或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“个体”和“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
本文公开的方法可以在体外、离体、或体内进行，或者产品可以以体外、离体、或体内形式存在。术语“体外”是指在实验室条件或培养液中使用材料、生物物质、细胞和/或组织的实验；而术语“体内”是指使用完整多细胞有机体的实验和工序。在一些实施方式中，体内进行的方法可以在非人动物上进行。“离体”是指存在于有机体外或发生在有机体外，例如在人或动物体外的事件，例如可以在取自有机体的组织(例如整个器官)或细胞上存在或发生的事件。
单链DNA探针
本公开中的单链DNA探针包含碱基A和碱基C，并且，所述碱基A和碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的80％-100％；所述单链DNA探针被Cas蛋白切割后，释放出检测信号。
部分Cas蛋白(例如，Cas12a蛋白)在与crRNA、目标核酸的靶序列形成Cas蛋白-crRNA-靶序列的三元复合物后，会不加区分的切割存在于Cas蛋白周围的单链DNA链。利用Cas蛋白这种非特异性切割单链核酸链的酶活性，本公开中的单链DNA探针可以被Cas蛋白切割。并且，在切割后释放检测信号，通过检测由单链DNA探针释放的检测信号，能够实现对包含靶序列的目标核酸的检测。
本公开中的单链DNA探针包含碱基A和碱基C，并且碱基A和碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的80％-100％。示例性的，碱基A和碱基C的数量占单链DNA探针的碱基总数量的80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％等等。当单链DNA探针中的碱基A和碱基C的比例在80％-100％的范围内时，应用单链DNA探针检测目标核酸的检测时间缩短、检测效率提高，并且保持较高的灵敏度、特异性和检测准确性，能够实现对目标核酸的及时、快速、灵敏、特异性检测。
在一些实施方式中，单链DNA探针中碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的20％以上，优选40％以上。更优选40％-60％。示例性的，单链DNA探针中碱基C的比例为20％、24％、26％、28％、30％、33％、37％、39％、40％、41％、44％、45％、47％、49％、51％、55％、58％、60％等等。
在一些实施方式中，单链DNA探针包含5-20个核苷酸，优选9-20个核苷酸，更优选9-11个核苷酸。示例性的，组成单链DNA探针的核苷酸的数量为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个。
通过进一步对单链DNA探针中碱基C的数量，或者核苷酸的个数进行优选，可进一步缩短应用单链DNA探针检测目标核酸的检测时间，使单链DNA探针在20min之内实现对目标核酸的检测，进一步实现在5-10min内对目标核酸的检测。目前富含碱基T的单链DNA探针在应用于目标核酸检测时，普遍需要20min-1h的检测时间，本公开中的单链DNA探针可以显著缩短对目标核酸检测所需的检测时间。
在本公开中，组成单链DNA探针的核苷酸为脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。在一些实施方式中，单链DNA探针仅由脱氧核糖核苷酸组成。在另外一些实施方式中，组成单链DNA探针的核苷酸中还可以包含1个或若干个的核糖核苷酸，只要掺入的核糖核苷酸不影响Cas蛋白切割单链DNA探针，释放检测信号即可。
在一些实施方式中，单链DNA探针的碱基由A和C组成。在另外一些实施方式中，单链DNA探针的碱基还可以包括其它类型的碱基，例如：T、G、U或其衍生物(例如，I)中的一种或两种以上的组合。
在本公开中，Cas蛋白包括具有野生型核酸内切酶活性的Cas蛋白；与野生型Cas蛋白相比核酸内切酶活性更高的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段；保留或至少部分保留野生型Cas蛋白的核酸内切酶活性的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段。进一步的，Cas蛋白是具有V型CRISPR/Cas***中核酸内切酶活性的Cas蛋白。
在一些实施方式中，Cas蛋白为Cas12蛋白，例如，Cas12a蛋白、Cas12b蛋白等。在一些优选的实施方式中，Cas蛋白为Cas12a蛋白，Cas12a蛋白在crRNA的引导下识别并切割目标核酸的靶标链和/或非靶标链后，能够激发起非特异性切割单链核酸链的酶活性。利用这种非特异性切割的酶活性，可以通过切割单链核酸链后，释放检测信号，以实现对目标核酸的及时、灵敏的检测。同时，在检测过程中不需要使用大型、复杂的仪器设备，或是使用昂贵的材料，因此还具有成本低、操作简单等优势。
本公开中的Cas12a蛋白可以是不同物种来源的蛋白。在一些实施方式中，Cas12a蛋白是选自如下的一种或两种以上的组合：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。在另外一些实施方式中，Cas12a蛋白还可以来源于其他物种。
示例性的，Cas12a蛋白为Lachnospiraceae bacterium来源的LbCas12a蛋白，Acidaminococcus bacterium来源的AsCas12a蛋白，或者是Francisellanovicidabacterium来源的FnCas12a蛋白等等。其中，野生型LbCas12a蛋白的氨基酸序列可参考(GenBank:MW477886.1)，野生型AsCas12a蛋白的氨基酸序列可参考(GenBank:MW477885.1)，野生型FnCas12a蛋白的氨基酸序列可参考(GenBank:MW471125.1)。此外，Cas12a蛋白也可以是上述任一项所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分Cas12a蛋白活性的突变体、多肽、同系物等。需要说明的是，本公开中对Cas12a蛋白的来源及其序列不作具体限定，只要其能够满足识别和切割目标核酸后，产生非特异性切割单链DNA探针的酶活性，释放能够用于检测的检测信号即可。
在本公开中，单链DNA探针被Cas蛋白切割后，释放检测信号。示例性的，检测信号可以是通过荧光检测方法获取的荧光检测信号，通免疫检测的方法获取的免疫检测信号，或是通过电化学检测方法获取的电化学检测信号等等。
在一些实施方式中，单链DNA探针的5’端和3’端的一端标记第一信号分子，单链DNA探针的5’端和3’端的另一端标记第二信号分子。例如，单链DNA探针的5’端标记第一信号分子，3’端标记第二信号分子。或者，单链DNA探针的3’端标记第一信号分子，5’端标记第二信号分子。通过标记第一信号分子和第二信号分子，使单链DNA探针在被切割前后存在荧光信号、免疫信号(例如，胶体金信号)、电信号等的差异，产生可被识别的检测信号。
通过标记第一信号分子、第二信号分子使单链DNA探针被Cas蛋白切割后释放检测信号，单链DNA探针用于目标核酸检测具有检测结果易于判断，成本低、操作步骤简单，且不需要依赖昂贵、大型仪器的优点。
在一些具体的实施方式中，第一信号分子为荧光报告分子，第二信号分子为荧光淬灭分子；或者，第一信号分子为荧光淬灭分子，第二信号分子为荧光报告分子。当单链DNA探针被切割后，单链DNA探针释放出可检测的荧光检测信号。示例性的，荧光报告分子选自FAM或FITC。此外，荧光报告分子也可以是本领域中其他种类的荧光报告分子，例如VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX等等。在一些方式中，荧光淬灭分子为BHQ(例如BHQ1、BHQ2等)。此外，荧光淬灭分子也可以是本领域中其他种类的荧光报告分子，例如Tamra等。
在一些具体的实施方式中，第一信号分子和第二信号分子是用于免疫检测的免疫信号分子。在一些具体的实施方式中，第一信号分子和第二信号分子是用于胶体金检测的信号分子。示例性的，第一信号分子和第二信号分子彼此独立地选自Biotin或Digoxin，胶体金检测时，通过检测线和质控线不同的颜色显示，释放出检测信号。
在一些具体的实施方式中，单链DNA探针包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中任一项所示的核苷酸序列；或者是与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些优选的实施方式中，单链DNA探针包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10中任一项所示的核苷酸序列；或者是与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。
试剂盒或组合物
本公开提供了一种试剂盒或组合物，包含上述的单链DNA探针，本公开的试剂盒或组合物用于目标核酸的检测，具有检测时间短、检测效率高，且灵敏度高、特异性好的优势，能够实现对于病原体核酸、疾病相关基因或功能性核酸的即时、灵敏和特异性检出，在临床诊断、食品安全、环境监测等领域具有重要的应用价值。
在一些实施方式中，试剂盒或组合物检测的目标核酸是来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸。
在本公开中，病原体是指能够使人体或动物体致病的微生物，包括病毒、细菌、真菌等等。在一些具体的实施方式中，本公开中试剂盒或组合物检测的目标核酸是来源于病毒的核酸。其中，病毒可以是DNA病毒或RNA病毒。示例性的，病毒为冠状病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、细小病毒等等。本公开中的试剂盒或组合物用于病毒核酸检测，可以在20min以内，特别地在5-10min内实现对目标核酸的灵敏和特异性检出。在一些具体的实施方式中，目标核酸是来源于如下一种或两种以上组合的病毒的核酸：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CVA16)。
在本公开中，疾病相关基因是指在健康个体及患病个体之间差异性表达的基因，疾病相关基因可用于反应疾病发生、发展等进程。通过检测疾病相关基因，能够实现对疾病的早期筛查、诊断、预后、监测疾病进展等等。示例性的，疾病为肿瘤，疾病相关基因为与肿瘤发生、发展相关的肿瘤标志基因。
在本公开中，目标核酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。进一步的，目标核酸可以是双链核酸链或单链核酸链，例如，双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA等。
在一些实施方式中，本公开中的试剂盒或组合物还包括Cas蛋白和crRNA，其中，所述crRNA结合所述Cas蛋白，并且包含与所述目标核酸的靶序列至少部分的核苷酸序列。
在本公开中，Cas蛋白包括具有野生型核酸内切酶活性的Cas蛋白；与野生型Cas蛋白相比核酸内切酶活性更高的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段；保留或至少部分保留野生型Cas蛋白的核酸内切酶活性的Cas蛋白突变体、同系物或其多肽片段。在一些实施方式中，Cas蛋白为Cas12蛋白，例如，Cas12a蛋白、Cas12b蛋白等。在一些优选的实施方式中，Cas蛋白为Cas12a蛋白。本公开中的Cas12a蛋白可以是不同物种来源的蛋白。在一些实施方式中，Cas12a蛋白是选自如下的一种或两种以上的组合：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。在另外一些实施方式中，Cas12a蛋白还可以来源于其他物种。本公开中的Cas蛋白可以是天然分离的蛋白，或是通过重组工程技术获得的表达蛋白。
在本公开中，靶序列是来源于目标核酸的部分序列，通过结合并识别目标核酸的靶序列，能够实现对目标核酸的特异性检测。
Cas蛋白(例如，Cas12a蛋白)在crRNA的引导下，识别目标核酸中位于PAM序列附近的靶序列，crRNA通过碱基互补配对的方式与目标核酸中的靶标链杂交，并且结合Cas蛋白形成Cas蛋白-crRNA-靶序列的三元复合物，Cas蛋白特异性切割目标核酸中的靶标链和/或非靶标链。同时，三元复合物形成后，会激发Cas蛋白非特异性切割单链核酸的酶活性，释放出可检测的检测信号，实现对目标核酸的定性、定量检测。
在一些实施方式中，本公开中的组合物或试剂盒还包括用于扩增所述目标核酸的核酸扩增单元。其中，核酸扩增单元可以通过本领域中任意的核酸扩增技术实现对目标核酸的扩增，例如，基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)，或者是PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)等等。
在一些实施方式中，核酸扩增单元包括用于扩增所述目标核酸的扩增引物组。扩增引物组基于目标核酸的序列进行设计，通过扩增目标核酸，能够放大目标核酸的检测信号，使检测结果易于判读，实现对目标核酸的定性、定量检出。在另外一些实施方式中，核酸扩增单元还可以包括用于核酸扩增的酶(例如，DNA聚合物、重组酶等)、用于核酸扩增的反应缓冲液，或者其他核酸扩增反应所需使用的组分。
在一些具体的实施方式中，目标核酸为来源于SARS-CoV-2的病毒核酸。crRNA的指导序列包含如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：14所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。扩增引物组包含如SEQ IDNO：12所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的下游引物。
本公开中用于检测SARS-CoV-2病毒核酸的试剂盒或组合物能够实现在5-10min内实现对SARS-CoV-2的即时、灵敏和特异性检出，对于控制病毒传播，遏制疾病蔓延具有重要意义。并且，组合物或试剂盒所需材料成本低，无需使用大型复杂的仪器设备，或经过复杂的前处理过程，适合大规模推广和应用。
在一些具体的实施方式中，目标核酸为来源于柯萨奇病毒A16型(CVA16)的病毒核酸。crRNA的指导序列包含如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：17所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。扩增引物组包含如SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的下游引物。
本公开中用于检测CVA16病毒核酸的试剂盒或组合物能够实现在5-10min内实现对CVA16的即时、灵敏和特异性检出，对于手足口病(HFMD)等疾病的诊断具有重要意义。并且，组合物或试剂盒所需材料成本低，无需使用大型复杂的仪器设备，或经过复杂的前处理过程，适合大规模推广和应用。
在一些具体的实施方式中，目标核酸为来源于肠道病毒71型(EV71)的病毒核酸。crRNA的指导序列包含如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：20所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列。扩增引物组包含如SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的下游引物。
本公开中用于检测EV71病毒核酸的试剂盒或组合物能够实现在5-10min内实现对EV71的即时、灵敏和特异性检出，对于手足口病(HFMD)等疾病的诊断具有重要意义。并且，组合物或试剂盒所需材料成本低，无需使用大型复杂的仪器设备，或经过复杂的前处理过程，适合大规模推广和应用。
在一些实施方式中，本公开中的试剂盒还包括用于检测所述单链DNA探针释放的检测信号的信号检测单元。检测信号单元依据检测信号的类型进行设计，可以是荧光信号检测单元、免疫信号检测单元或电化学信号检测单元等等。
在一些具体的实施方式中，信号检测单元为免疫信号检测单元。具体的，信号检测单元为胶体金检测试纸。胶体金检测试纸可以根据本领域中常规的胶体金试纸进行设计，通过待测样品在胶体金检测试纸上流过后，胶体金检测试纸的显色情况，实现对待测样品中是否含有目标核酸的结果判定。
示例性的，胶体金检测试纸包括沿待测样品的流向顺次搭接的样品垫、结合垫和层析垫。其中，结合垫上包被有胶体金颗粒标记的第一抗体，第一抗体与第一信号分子和第二信号分子中的一种相互结合。层析垫上设置有检测线(T线)和质控线(C线)。T线的位置包被有第三信号分子，第三信号分子与第一信号分子和第二信号分子中的另一种相互结合。C线的位置标记与第一抗体特异性结合的第二抗体。当待测样品加入样品垫后，依次流向结合垫和层析垫，在结合垫上，第一抗体与单链DNA探针一端的第一信号分子或第二信号分子结合。例如，第一抗体结合第一信号分子。然后继续流向层析垫，在层析垫的T线位置会根据待测样品中是否含有目标核酸呈现不同的显色结果，具体如下：
当待测样品中含有目标核酸时，Cas蛋白与crRNA、目标核酸的靶序列结合形成三元复合物，Cas蛋白非特异性切割单链DNA探针。T线位置的第三信号分子无法通过第二信号分子捕获与第一抗体偶联的胶体金颗粒。因此，T线位置无颜色显示。
当待测样品中不含有目标核酸时，Cas蛋白无法与crRNA、目标核酸的靶序列结合形成三元复合物，单链DNA探针未经过切割，T线位置的第三信号分子通过结合第二信号分子，在T线位置上形成第三信号分子-单链DNA探针-第一抗体-胶体金的复合物。因此，T线位置显示胶体金颜色。
进一步的，待测样品流经C线时，位于C线位置处的第二抗体与第一抗体结合，使C线呈现胶体金的颜色。
在一些更为具体的实施方式中，第一信号分子和第二信号分子中的一种为地高辛(Digoxin)，另外一种为生物素(Biotin)。例如，第一信号分子为Digoxin，第二信号分子为Biotin。结合垫上为标记有胶体金颗粒的第一抗体，第一抗体具体地为地高辛抗体，结合垫上地高辛抗体结合单链DNA探针的地高辛信号分子，使两者偶联在一起后继续流向层析垫。层析垫的T线上包被链霉亲和素，链霉亲和素结合生物素实现不同的颜色显示，释放出目标核酸检测的检测信号。
在一些实施方式中，本公开提供了单链DNA探针、组合物或试剂盒在如下(d)-(f)至少一种中的用途：
(d)检测目标核酸，或制备用于检测目标核酸的试剂或试剂盒；
(e)作为或制备用于检测病原体感染的试剂或试剂盒；
(f)作为或制备用于检测疾病相关基因的试剂或试剂盒。
检测目标核酸的方法
本公开提供的检测目标核酸的方法，包括使用上述的单链DNA探针、组合物或试剂盒对目标核酸进行检测的步骤。
进一步的，检测目标核酸的方法还包括如下步骤：
混合步骤：将Cas12a蛋白、crRNA、单链DNA探针与待测样品接触，得到混合物体系；
判定步骤：获取所述混合物体系中的检测信号，根据所述检测信号判定所述待测样品中是否含有目标核酸。
在一些实施方式中，所述方法还包括：在所述混合步骤之前，对所述待测样品进行核酸扩增的步骤。
本公开中提供的检测目标核酸的方法，操作步骤简单，不需要复杂的样品处理步骤或使用大型仪器，具有成本低、检测效率高，特异性和灵敏度高的优势，对于实现病毒核酸的即时检测、疾病基因检测等临床诊断领域具有广阔的应用前景。
在一些实施方式中，本公开中的检测方法用于检测来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸。
其中，病原体包括病毒、细菌、真菌等等。在一些具体的实施方式中，本公开中试剂盒或组合物检测的目标核酸是来源于病毒的核酸。其中，病毒可以是DNA病毒或RNA病毒。示例性的，病毒为冠状病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、细小病毒等等。在一些具体的实施方式中，目标核酸是来源于如下一种或两种以上组合的病毒的核酸：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CVA16)。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
以下结合具体的实施例进行说明，其中试剂以及样品等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。所涉及的实验操作可按照《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002)中所述条件和方法进行，并可按照商业化的酶、试剂盒的厂商说明来进行。其它未详细描述的试验方法如无特殊说明，均为本领域的技术人员所熟知的常规方法。
下述实施例中的扩增引物、crRNA、单链DNA探针合成于苏州金唯智生物科技有限公司；RT-RPA试剂盒购于杭州众测生物科技有限公司；LbCas12a蛋白由6His-MBP-TEV-huLbCpf1质粒(Addgene plasmid#90096)表达并纯化。
本公开的技术方案基于如下原理，获得待测样品的核酸，比如，可以通过试剂盒提取病毒中核酸，利用RT-RPA对靶核酸进行扩增。利用可以与靶核酸配对的crRNA引导Cas蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas12a蛋白激活单链DNA探针的切割活性，从而切割体系里的单链DNA探针；单链DNA探针的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链DNA探针被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链DNA探针的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。
实施例1：采用不同的单链DNA作为探针利用Cas12a检测肠道病毒71型
1、RT-RPA扩增肠道病毒71型的VP1基因，引物设计如下：
EV71-VP1-RPA-F:CAAAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACT
EV71-VP1-RPA-R:CAACTAATCCTGCCCTACTGAAGAAACTATCAA。
2、EV71 crRNA的指导序列为：AGCTTGGAGTGCTGGAACCTTG。
3、候选单链DNA探针序列如下表1所示：
表1
| Probe | Sequence(5’-3’) | 5’ | 3’ | SEQ ID NO： |
| 5nt FQ-1 | TTATT | FAM | BHQ | SEQ ID NO：1 |
| 5nt FQ-2 | ACCCA | FAM | BHQ | SEQ ID NO：2 |
| 10nt FQ-1 | TTATTATTAT | FAM | BHQ | SEQ ID NO：3 |
| 10nt FQ-2 | AACACCACAA | FAM | BHQ | SEQ ID NO：4 |
| 5nt FB-1 | TTATT | FAM | Biotin | SEQ ID NO：5 |
| 5nt FB-2 | ACCCA | FAM | Biotin | SEQ ID NO：6 |
| 10nt FB-1 | TTATTATTAT | FAM | Biotin | SEQ ID NO：7 |
| 10nt FB-2 | AACACCACAA | FAM | Biotin | SEQ ID NO：8 |
| 5nt DB-1 | TTATT | Digoxin | Biotin | SEQ ID NO：9 |
| 10nt DB-2 | AACACCACAA | Digoxin | Biotin | SEQ ID NO：10 |
| 20nt DB-2 | AATGGAACACCACAAGGTAA | Digoxin | Biotin | SEQ ID NO：11 |
4、最优单链DNA探针的确定
CRISPR/Cas12a荧光检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针FQ，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应12min过程中酶标仪读板。如图1所示，针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的荧光报告结果，可见10nt FQ-2探针的检测效率最高。
CRISPR/Cas12a FAM试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针FB，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10-15min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图2所示，针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的FAM试纸条报告结果，可见10nt FB-2探针的检测效率最高。
CRISPR/Cas12a Digoxin试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针DB，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mMNaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图3所示，针对不同单链DNA探针检测肠道病毒71型的Digoxin试纸条报告结果，可见10nt DB-2探针的检测效率最高。
实施例2：采用不同的单链DNA作为探针利用Cas12a检测SARS-CoV-2
1、RT-RPA扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因，引物设计如下：
SARS-CoV-2-ORF1ab-RPA-F:TAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACAC
SARS-CoV-2-ORF1ab-RPA-R:
AAAAACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGG
2、SARS-CoV-2crRNA的指导序列：CACTTAAAAACACAGTCTGT。
3、候选单链DNA探针序列同实施例1
4、最优单链DNA探针的确定
CRISPR/Cas12a荧光检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针FQ，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应12min过程中酶标仪读板。如图4所示，针对不同单链DNA探针检测SARS-CoV-2的荧光报告结果，可见10nt FQ-2探针的检测效率最高。
CRISPR/Cas12a FAM试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针FB，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应5-10min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图5所示，针对不同单链DNA探针检测SARS-CoV-2的FAM试纸条报告结果，可见10nt FB-2探针的检测效率最高。
CRISPR/Cas12a Digoxin试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针DB，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mMNaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应5-10min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图6所示，针对不同单链DNA探针检测SARS-CoV-2的Digoxin试纸条报告结果，可见10nt DB-2探针的检测效率最高。
实施例3：试纸条的制备
本发明中实验的试纸条为实验室自行制备的试纸条，图7为本发明制备的试纸条的结构示意图。
试纸条制备流程如下：
1、AuNPs与抗FITC抗体偶联
将1ml AuNPs溶液用0.1M的K2CO3调节pH至8.5-9.0，加入1mg/ml的anti-FITC的抗体10μl，4℃孵育1h，再加入20μl20％的BSA和10μl 10％的PEG2000混匀，4℃孵育30min，反应钝化没有结合抗体的AuNP表面部位。离心弃去上清液，沉淀用包含有5％BSA和0.025％Tween-20的PBS溶液重悬，4℃避光保存。
2、免疫层析试纸条的准备
用15mm×4mm的玻璃纤维膜作为样品垫，8mm×4mm的聚酯纤维膜作为结合垫，在NC膜(25mm×4mm)上适当的位置用喷金仪喷涂适量的链霉亲和素(检测线)和抗鼠IgG Fc二抗(对照线)，37℃干燥1-2h。结合垫则加入适量的AuNP-FITC抗体悬液，在37℃干燥1h。最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸互相重叠2mm依次粘贴在PVC衬底上组装成一个完整的试纸条。图7为本发明的试纸条的结构示意图，其中，链霉亲和素为检测条带(test band)，二抗为对照条带(control band)，阴性结果应为两条带，阳性应为只在二抗对照条带显色。
实施例4：采用优化的单链DNA作为探针利用Cas12a检测柯萨奇病毒CVA16临床样
本
1、RT-RPA扩增柯萨奇病毒CVA16的VP1基因，引物设计如下：
CVA16-VP1-RPA-F:CCATCACTCCACGCAGGAGACAGCCATTGGG
CVA16-VP1-RPA-R:CACAATGCCCACCACGGGTACACAGAATACAG
2、CVA16 crRNA的指导序列为：
TTTAGCCGTGCTGGTCTTGTCAGCATCAT。
3、优化的单链DNA探针序列：10nt FQ-2、10nt FB-2、10nt DB-2
4、单链DNA探针10nt FQ-2用于柯萨奇病毒CVA16临床样本荧光检测
CRISPR/Cas12a荧光检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt FQ-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mMTris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10min后酶标仪读板。如图9所示，最优单链DNA探针10nt FQ-2检测柯萨奇病毒CVA16临床样本的荧光报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图8)；
5、单链DNA探针10nt FB-2用于柯萨奇病毒CVA16临床样本试纸条检测
CRISPR/Cas12a FAM试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt FB-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应15min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图10所示，最优单链DNA探针10nt FB-2检测柯萨奇病毒CVA16临床样本的FAM试纸条报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图8)。
6、单链DNA探针10nt DB-2用于柯萨奇病毒CVA16临床样本试纸条检测
CRISPR/Cas12a Digoxin试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt DB-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图11所示，最优单链DNA探针10ntFB-2检测柯萨奇病毒CVA16临床样本的Digoxin试纸条报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图8)。
实施例5：采用优化的单链DNA作为探针利用Cas12a检测SARS-CoV-2临床样本
1、RT-RPA扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因，引物设计如下：
SARS-CoV-2-ORF1ab-RPA-F：TAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACAC
SARS-CoV-2-ORF1ab-RPA-R：AAAAACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGG
2、SARS-CoV-2crRNA的指导序列为：CACTTAAAAACACAGTCTGT。
3、优化的单链DNA探针序列：10nt FQ-2、10nt FB-2、10nt DB-2
4、单链DNA探针10nt FQ-2用于SARS-CoV-2临床样本检测
CRISPR/Cas12a荧光检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt FQ-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mMTris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10min后酶标仪读板。如图13所示，最优单链DNA探针10nt FQ-2检测SARS-CoV-2临床样本的荧光报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图12)；
5、单链DNA探针10nt FB-2用于SARS-CoV-2临床样本检测
CRISPR/Cas12a FAM试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt FB-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应15min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图14所示，最优单链DNA探针10nt FB-2检测SARS-CoV-2临床样本的FAM试纸条报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图12)。
6、单链DNA探针10nt DB-2用于SARS-CoV-2临床样本检测
CRISPR/Cas12a Digoxin试纸条检测的10μl反应体系，包括200ng纯化的LbCas12a、5pM单链DNA探针10nt DB-2，200ng crRNA和1μl RT-RPA的样品，反应缓冲液为100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL BSA、pH 7.5。37℃反应10min，加入100μl的分析缓冲液，枪头混匀后***试纸条反应2-3min。如图15所示，最优单链DNA探针10ntFB-2检测SARS-CoV-2临床样本的Digoxin试纸条报告结果，与苏州CDC的qPCR结果一致(图12)。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州***医学研究所
苏州市疾病预防控制中心
<120> 基于CRISPR/Cas12a的单链DNA探针及检测目标核酸的方法
<130> 6514-2153166I
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 1
ttatt 5
<210> 2
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 2
accca 5
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 3
ttattattat 10
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 4
aacaccacaa 10
<210> 5
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 5
ttatt 5
<210> 6
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 6
accca 5
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 7
ttattattat 10
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 8
aacaccacaa 10
<210> 9
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 9
ttatt 5
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 10
aacaccacaa 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链DNA探针序列
<400> 11
aatggaacac cacaaggtaa 20
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-Cov-2-ORF1ab-RPA-F引物序列
<400> 12
taatgaccct gtgggtttta cacttaaaaa cac 33
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-Cov-2-ORF1ab-RPA-R引物序列
<400> 13
aaaaacgatt gtgcatcagc tgactgaagc atggg 35
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-Cov-2 crRNA的指导序列
<400> 14
cacttaaaaa cacagtctgt 20
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CVA16-VP1-RPA-F引物序列
<400> 15
ccatcactcc acgcaggaga cagccattgg g 31
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CVA16-VP1-RPA-R引物序列
<400> 16
cacaatgccc accacgggta cacagaatac ag 32
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CVA16 crRNA的指导序列
<400> 17
tttagccgtg ctggtcttgt cagcatcat 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EV71-VP1-RPA-F引物序列
<400> 18
caaaacacac aggtgagcag tcatcgact 29
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EV71-VP1-RPA-R引物序列
<400> 19
caactaatcc tgccctactg aagaaactat caa 33
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EV71 crRNA的指导序列
<400> 20
agcttggagt gctggaacct tg 22
Claims (13)
1.一种单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针包含碱基A和碱基C，并且，所述碱基A和碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的80％-100％；
所述单链DNA探针被Cas蛋白切割后，释放出检测信号。
2.根据权利要求1所述的单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针中碱基C的数量占所述单链DNA探针的碱基总数量的20％以上，优选40％以上；
可选地，所述单链DNA探针包含5-20个核苷酸，优选9-20个核苷酸，更优选9-11个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的单链DNA探针，其中，所述单链DNA探针包含如下(i)-(ii)任一项所示的序列：
(i)如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11中任一项所示的核苷酸序列；
(ii)与(i)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
优选地，所述单链DNA探针包含如下(iii)-(iv)任一项所示的序列：
(iii)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10中任一项所示的核苷酸序列；
(iv)与(iii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的单链DNA探针，其中，所述Cas蛋白为Cas12蛋白，优选为Cas12a蛋白；可选地，所述Cas12a蛋白为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。
5.根据权利要求1-4任一项所述的单链DNA探针，其中，所述检测信号为荧光检测信号、免疫检测信号或电化学检测信号；
可选地，所述单链DNA探针的5’端和3’端中的一端标记第一信号分子，所述单链DNA探针的5’端和3’端中的另一端标记第二信号分子；
可选地，所述第一信号分子和所述第二信号分子彼此独立地选自FAM、FITC、BHQ、Biotin或Digoxin，并且，所述第一信号分子与所述第二信号分子不同。
6.一种用于检测目标核酸的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒包括根据权利要求1-5任一项所述的单链DNA探针；所述目标核酸是来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸；
优选地，所述病原体为病毒；优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16型。
7.根据权利要求6所述的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒还包括Cas蛋白和crRNA；所述crRNA结合所述Cas蛋白，并且包含与所述目标核酸的靶序列至少部分互补的核苷酸序列；
优选地，所述Cas蛋白为Cas12蛋白，更优选为Cas12a蛋白；可选地，所述Cas12a蛋白为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a。
8.根据权利要求7所述的组合物或试剂盒，其中，所述crRNA的指导序列包含如下(v)-(vi)任一项所示的序列：
(v)如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；
(vi)与(v)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
9.根据权利要求6所述的组合物或试剂盒，其中，所述组合物或试剂盒还包括用于恒温核酸扩增所述目标核酸的核酸扩增单元；可选地，所述核酸扩增单元包含用于扩增所述目标核酸的扩增引物组；优选地，所述扩增引物组包含如下(a)-(c)组成中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的下游引物；
(b)包含如SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：16所示核苷酸序列的下游引物；
(c)包含如SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的上游引物，和包含如SEQ ID NO：19所示核苷酸序列的下游引物。
10.根据权利要求6-9任一项所述的组合物或试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于检测所述单链DNA探针释放的检测信号的信号检测单元；可选地，所述信号检测单元为胶体金检测试纸。
11.根据权利要求1-5任一项所述的单链DNA探针，或根据权利要求6-10任一项所述的组合物或试剂盒在如下(d)-(f)中至少一种的用途：
(d)检测目标核酸，或制备用于检测目标核酸的试剂或试剂盒；
(e)作为或制备用于检测病原体感染的试剂或试剂盒；
(f)作为或制备用于检测疾病相关基因的试剂或试剂盒；
可选地，所述病原体选自病毒、细菌、真菌的至少一种；优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16型。
12.一种检测目标核酸的方法，其中，所述方法包括使用根据权利要求1-5任一项所述的单链DNA探针，或根据权利要求6-10任一项所述的组合物或试剂盒对目标核酸进行检测的步骤；
可选地，所述目标核酸是来源于病原体的核酸或来源于疾病相关基因的核酸；
优选地，所述病毒选自冠状病毒、肠道病毒的至少一种；更优选地，所述病毒选自新型冠状病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16型。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
混合步骤：将Cas12a蛋白、crRNA、单链DNA探针与待测样品接触，得到混合物体系；
判定步骤：获取所述混合物体系中的检测信号，根据所述检测信号判定所述待测样品中是否含有目标核酸；
可选地，所述方法还包括：在所述混合步骤之前，对所述待测样品进行核酸扩增的步骤。
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