CN116023506B - Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用 - Google Patents

Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用，属于基因工程技术领域。所述ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清具有良好的免疫反应原性。利用获得的ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白作为包被抗原，建立了检测非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的ELISA检测方法；该检测试剂盒具有特异性强、敏感性高、重复性好和准确性高的特点，可以有效地检测非洲猪瘟病毒感染后产生的抗体情况，为非洲猪瘟的诊断、感染机制的研究、安全高效疫苗的研制提供重要帮助。

Description

ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种高度接触性传染病，其临床症状和病理变化与经典猪瘟非常相似，有着较高的发病率和死亡率。ASFV是线状双股DNA病毒，成熟病毒粒子呈20面体对称且具有囊膜，基因组的大小在不同毒株之间存在一定的差异性，总体介于170～190kb之间，基因组含有150多个开放阅读框，约编码100多种非结构蛋白和68种结构蛋白。非结构蛋白在病毒的复制与组装、调节宿主细胞机能、逃逸宿主天然免疫等方面发挥了重要作用。但有关ASFV非结构蛋白抗体检测方法相当较少，临床应用中大多都是针对非洲猪瘟病毒结构蛋白抗体的检测，严重制约了对非洲猪瘟病毒相关致病机制的深入研究和了解。
A238L蛋白是非洲猪瘟病毒重要的非结构蛋白，在病毒的感染过程中可调节宿主细胞的相关生物学功能，为非洲猪瘟病毒创造良好的生存空间。由于该蛋白含有1kb锚蛋白重复序列，因此被认为是1kb的类似物。在不同感染细胞中，该蛋白由于受不同细胞内环境的影响，使该蛋白分子量略有差异。Silk等研究显示A238L蛋白可同时存在于细胞质和细胞核中，并在感染后10～18h在细胞核中积累，能抑制NF-kappaB的激活，协助非洲猪瘟病毒逃逸宿主的天然免疫反应。另外A238L蛋白还可抑制活化T细胞核因子相关转录因子的激活，使宿主细胞的相关免疫功能丧失，促进非洲猪瘟病毒粒子的复制和转录。A238L蛋白在巨噬细胞内可通过抑制p65乙酰化和p300的活性，抑制诱导型一氧化氮合成酶基因的转录，从而减少炎症介质一氧化氮的产生，起到抗炎作用。但在对A238L蛋白分子相关作用机制的研究过程中，大多将非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L全基因序列进行了原核表达和真核表达，使表达的序列中含有与宿主蛋白无相互作用的序列存在，严重影响A238L蛋白分子与靶标分子序列的相互作用，不能准确显示A238L蛋白分子中与靶标蛋白分子相互作用位点；另外含有非作用序列可能会影响目的重组蛋白的表达量或造成目的重组蛋白不进行表达等。本项目技术对非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的优势抗原表位进行串联表达，剔除无相关作用序列，可充分呈现出该蛋白优势抗原表位，提高该蛋白与非洲猪瘟病毒抗体抗体的结合效率，作为包被抗原可准确检测到非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体，以判断非洲猪瘟病毒在猪群中的流行动态，以及非洲猪瘟病毒在猪体内的感染复制规律，将为非洲猪瘟的诊断、感染机制的研究、安全高效疫苗的研制提供重要帮助。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用，将ASFV非结构蛋白A238L蛋白的4个优势抗原表位进行串联，获得ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白，该融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清具有良好的免疫反应原性。该试剂盒利用ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白作为包被抗原，在检测猪血清中是否含有ASFV抗体时，具有特异性、敏感性、重复性和准确性好的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白，所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种编码上述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的核苷酸。
优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
本发明提供了一种含有上述核苷酸序列或表达载体的宿主菌。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括酶标板，所述酶标板包被有上述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
优选的，所述试剂盒还包括包被液、洗涤液和封闭液。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
构建上述的表达载体，然后将表达载体转化至宿主菌，对含有非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的宿主细胞诱导表达后，进行超声破碎、包涵体溶解和纯化，收集得到非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：
将上述的融合蛋白作为抗原免疫动物，在动物体内产生非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体。
本发明提供了一种上述融合蛋白、核苷酸、表达载体或宿主菌在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用，将ASFV非结构蛋白A238L蛋白的4个优势抗原表位进行串联，获得ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白，该融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清具有良好的免疫反应原性。该试剂盒利用ASFV非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白作为包被抗原，建立的抗体检测试剂盒具有特异性强、敏感性高、重复性好和准确性高的特点，可以有效地检测非洲猪瘟病毒感染后产生的抗体，以判断非洲猪瘟病毒在猪群中的流行动态，以及非洲猪瘟病毒在猪体内的感染复制规律，将为非洲猪瘟的诊断、感染机制的研究、安全高效疫苗的研制提供重要帮助。
附图说明
图1为非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的4个优势抗原表位串联融合蛋白的扩增、载体构建、表达菌株构建的鉴定，其中M:DL2000 DNA Mark，泳道1为A238L-B基因序列PCR扩增结果，泳道2为Pet28a-A238L-B表达载体构建结果，泳道3为E.Coli BL21/Pet28a-A238L-B菌液鉴定结果。
图2为非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的4个优势抗原表位融合蛋白诱导表达纯化后SDS-PAGE电泳鉴定，其中，M：蛋白Marker；泳道1为表达纯化的非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的4个优势抗原表位融合蛋白。
图3为非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的4个优势抗原表位融合蛋白反应原性的鉴定，其中，M：蛋白Marker；泳道1为表达纯化的非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的4个优势抗原表位融合蛋白。
具体实施方式
为了能使非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L蛋白的优势抗原表位充分呈现出来，提高该蛋白抗原在检测中的特异性、敏感性和准确性，制备该蛋白的高效价抗体，将非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L蛋白的全基因序列进行分析，发现位于A238L蛋白中的4个优势抗原表位具有更好的免疫反应原性，且在不同基因型的非洲猪瘟病毒中高度保守，将非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L蛋白的4个优势抗原表位基因序列进行串联合成，因此，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白，所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种编码上述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的核苷酸。所述核苷酸序列优选的如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种含有上述核苷酸的表达载体。在本发明中，所述的表达载体的基础载体优选为Pet28a载体。
本发明提供了一种含有上述核苷酸或表达载体的宿主菌。在本发明中，所述宿主菌的出发菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)，所述大肠杆菌BL21(DE3)的来源没有特殊限定，采用本领域的市售产品即可。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白的抗原表位融合蛋白ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括酶标板，所述酶标板包被有上述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
在本发明中，所述试剂盒还优选的包括包被液、洗涤液和封闭液。所述的包被液优选为0.03～0.06mol/L碳酸盐缓冲液，pH优选为9.0～10.0。所述洗涤液为PBST溶液，所述PBST溶液为常规试剂，本发明对PBST溶液来源没有特殊限定，可以自行配置，也可以购买得到。所述封闭液优选为0.005～0.015g/mL的BSA。本发明中，该试剂盒检测方法的结果判定标准为：当阴性对照OD450nm平均值(N)小于0.25，阳性对照OD450nm平均值(P)大于0.65时，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)≥2.1时判定为阳性，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)＜2.1时判定为阴性。
本发明的试剂盒具有特异性强、敏感性高、重复性好和准确性高的特点，可以有效地检测非洲猪瘟病毒感染后产生的抗体，以判断猪中是否感染非洲猪瘟病毒。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
构建上述的表达载体，然后将表达载体转化至宿主菌，对含有非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的宿主细胞诱导表达后，进行超声破碎、包涵体溶解和纯化，收集得到非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
在本发明中，构建上述的表达载体，所述表达载体的基础载体优选为Pet28a载体，将编码上述非洲猪瘟病毒非结构蛋白的优势抗原表位融合蛋白的核苷酸，命名为A238L-B基因序列，连接至Pet28a载体中的BamH l和Xho l酶切位点之间，即得到Pet28a-A238L-B。
在本发明中，上述表达载体构建好后，将表达载体转化至宿主菌，所述转化方式优选为热应激转化，所述宿主菌的出发菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)，即得E.Coli BL21/pET28a-A238L-B。
在本发明中，对含有非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的宿主细胞诱导表达后，进行超声破碎、包涵体溶解和纯化，收集得到非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。所述诱导表达优选地采用终浓度为0.5～1.5mmol/L IPTG诱导。所述的超声破碎的条件优选为350～450W功率，超声破碎时间3～7s，间隔时间4～6s，超声25～35min。所述纯化优选的包括His-Bind树脂和透析，当His-Bind树脂纯化时，依次用漂洗液C、漂洗液D洗涤和洗脱液洗脱，所述漂洗液C优选为7～9mol/L尿素，0.05～0.15mol/LNaH2PO4，0.005～0.015mol/L Tris-cl pH6.3；所述漂洗液D优选为7～9mol/L尿素，0.05～0.15mol/L NaH2PO4，0.005～0.015mol/L Tris-cl pH5.9；所述洗脱液优选为7～9mol/L尿素，0.05～0.15mol/L NaH2PO4，0.005～0.015mol/L Tris-cl pH4.5。本发明通过上述制备得到的非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的纯度高达95％，与非洲猪瘟阳性血清具有良好的免疫反应原性。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：
将上述的融合蛋白作为抗原免疫动物，在动物体内产生非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体。本发明生非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的效价高，融合蛋白产生兔子血清抗体效价为1：128 000。
本发明提供了一种上述融合蛋白、核苷酸、表达载体或宿主菌在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。在本发明中，所述产品包括试剂盒或试剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的制备
(1)非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白基因序列的筛选及合成
本实施例采用生物信息学方法对GenBank中非洲猪瘟分离株Pig/HLJ/2018(MK333180)A238L蛋白二级结构的亲水性、抗原性、氨基酸生物表面可及性进行综合分析，筛选出4个优势抗原表位肽段，即A238L蛋白N’端第15～46区段32个氨基酸序列(N’-IKKHIRNGNLTLFEEFFKTDPWIVNRCDKNGS-C’，SEQ ID No.3)、第65～100区段36个氨基酸序列(N’-FEQESYPGEIINPHRRDKDGNSALHYLAEKKNHLIL-C’，SEQ ID No.4)、第144～159区段16个氨基酸序列(N’-GADPTQKDYHRGFTAW-C’，SEQ ID No.5)、第195～203区段9个氨基酸序列(N’-TGGLRKSPK-C’，SEQ ID No.6)。N’端第15～46区段32个氨基酸对应的基因序列为(5’-attaaaaaacatattagaaatgggaatcttacactatttgaggaattttttaaaacagatccgtggattgtcaatagatgcgataaaaatggatcc-3’，96bp，SEQ ID No.7)，第65～100区段36个氨基酸对应的基因序列为(5’-tttgaacaagaatcttatcctggagaaataattaaccctcataggagggataaagatggaaactctgctttacattatttagctgagaaaaaaaatcatttaatcctg-3’，108bp，SEQ ID No.8)，第144～159区段16个氨基酸对应的基因序列为(5’-ggagcagatccgactcaaaaagactatcatagaggttttactgcttgg-3’，48bp，SEQ ID No.9)，第195～203区段9个氨基酸对应的基因序列为(5’-accggtggtttaagaaaaagcccaaaa-3’，27bp，SEQ ID No.10)。该4个优势抗原表位的氨基酸序列所对应的基因序列送上海生物工程有限公司进行串联合成，获得非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如下(SEQ IDNo.1)：
N’-IKKHIRNGNLTLFEEFFKTDPWIVNRCDKNGSFEQESYPGEIINPHRRDKDGNSALHYLAEKKNHLILGADPTQKDYHRGFTAWTGGLRKSPK-C’，93个氨基酸序列。
所述非洲猪瘟病毒抗原表位融合蛋白的核苷酸序列如下(SEQ ID No.2)：
5’-attaaaaaacatattagaaatgggaatcttacactatttgaggaattttttaaaacagatccgtggattgtcaatagatgcgataaaaatggatcctttgaacaagaatcttatcctggagaaataattaaccctcataggagggataaagatggaaactctgctttacattatttagctgagaaaaaaaatcatttaatcctgggagcagatccgactcaaaaagactatcatagaggttttactgcttggaccggtggtttaagaaaaagcccaaaa-3’，279bp。
(2)非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白表达载体的构建
根据上述筛选合成的非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白基因序列，命名为A238L-B基因序列，设计引物A238L-B-F和A238L-B-R并送上海生物工程有限公司进行合成。其中引物A238L-B-F加有EcoRI限制性酶切位点(下划线标出)以及保护性碱基；引物A238L-B-R加有XhoI限制性酶切位点(下划线标出)以及保护性碱基，以合成的A238L-B基因序列(279bp)为模板进行PCR扩增。
A238L-BF：5’-cggaattcattaaaaaacatattagaaatg-3’(SEQ ID No.11)；
A238L-BR：5’-ggctcgagttttgggctttttcttaaac-3’(SEQ ID No.12)。
A238L-B基因序列的PCR扩增体系为50μL：合成的模板2μL 5×PrimeSTAR Buffer10μL，100μmol/L A238L-BF/R引物各1μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5U/μLPrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31.5μL。PCR反应条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃50s，52℃20s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸10min。结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收A238L-B基因序列的特异性目的片段(见图1)。
将纯化回收的A238L-B基因序列用EcoRI和XhoI双酶切，同时用EcoRI和XhoI双酶切质粒载体Pet28a，然后将A238L-B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。体系如下：A238L-B序列(EcoRI-XhoI酶切)4μL，Pet28a(EcoRI-XhoI酶切)4μL，10×连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，4℃连接16小时，然后热应激转化到BL21(DE3)感受态中，涂布添加有终浓度50μg/mL卡那霉素LB平板上，37℃培养16小时，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，提取质粒进行鉴定。PCR鉴定筛选获得含有质粒Pet28a-A238L-B的BL21(DE3)菌株BL21(DE3)(E.Coli BL21/Pet28a-A238L-B)(见图1)。
(3)非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的表达、纯化及反应原性
挑取E.Coli BL21/pET28a-A238L-B单菌落过夜培养后，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，240rpm振荡培养2h，OD600nm至0.8～1.0，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，转移至37℃，240rpm振荡培养6h，离心收集菌体。将得到的菌体重悬于PBS中，加入溶菌酶终浓度为1mg/mL，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(400W功率，超声破碎时间5s，间隔时间5s，超声30min)，4℃10000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。然后将包涵体溶解于结合缓冲液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/LTris-CL，pH8.0)，包涵体溶解后，4℃10000rpm离心15min，取上清，与His-Bind树脂与结合缓冲液预先平衡结合1h，弃掉过滤液，用漂洗液C(8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH6.3)进行洗涤过滤两次，再用漂洗液D(8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH5.9)进行洗涤过滤4次，最后用洗脱液收集目的蛋白(8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH4.5)。His-Bind树脂纯化后的重组蛋白放入预先处理好的半透膜(100℃水中煮沸10min)中，并在其中加入终浓度为1mg/mL的还原型谷胱甘肽，在4℃环境下，分别在含有4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的pH8.5的PBS中缓慢透析，透析完后收集纯化的A238L-B蛋白，测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳鉴定。
结果如下图2所示，成功获得了特异性的非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白条带(约33.0kd)，该非洲猪瘟病毒抗原表位融合蛋白的纯度为95％。
SDS-PAGE电泳结束后进行Western-Blot鉴定蛋白的免疫原性，预先裁好与胶条同样大小的硝酸纤维素膜(NC)和滤纸，浸入电转缓冲液中。将凝胶卸下，在转移缓冲液中平衡后，按顺序铺上膜、胶和滤纸，即滤纸—NC膜—凝胶—滤纸，并用干净的玻棒轻轻滚过夹层，以消除各层之间的气泡。封紧后放入电转槽，加入电转液，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h。转移完毕后取下NC膜，用TBST洗膜，5min×3次；将NC膜放入5％脱脂乳中，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用TBST洗膜，5min×3次；加入一抗即用TBST稀释(1:100)的非洲猪瘟抗体阳性猪血清，平稳摇动，室温1h，弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪酶标二抗，用TBST按1﹕50000比例稀释，平稳摇动，室温1h，弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次。将用二抗作用过的NC膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，终止反应并进行拍照保存。
Western-blot分析结果显示见图3，非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白能被非洲猪瘟病毒阳性血清所识别，与非洲猪瘟病毒阳性血清具有良好的免疫反应原性。
实施例2非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白ELISA抗体检测试剂盒在血清学检测中的应用
利用实施例1制备得到的非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的优势抗原表位融合蛋白，建立检测非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法：
将非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L的优势抗原表位融合蛋白用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.6)稀释成2.0μg/mL，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃包被过夜；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干后以封闭液(0.01g/mL的BSA)100μL/孔于37℃封闭2h；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干，每孔加入100μL 1:100稀释的待检猪血清，同时设立非洲猪瘟病毒抗体阳性对照样品两个孔(100μL/孔)，阴性对照样品两个孔(100μL/孔)，37℃温育30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST 300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μL 1:50000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，37℃作用30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST 300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μL TMB单组份显色液，避光显色10min；最后每孔加入100μL 2mol/LH2SO4终止显色，用酶标仪测定OD450nm值。
该试剂盒检测方法的结果判定标准为：当阴性对照OD450nm平均值(N)小于0.25，阳性对照OD450nm平均值(P)大于0.65时，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)≥2.1时判定为阳性，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)＜2.1时判定为阴性。
①该试剂盒检测方法特异性的测定
用上述检测方法对猪蓝耳病毒抗体、猪圆环病毒抗体、经典猪瘟病毒抗体、猪***病毒抗体、猪伪狂犬病毒抗体、猪乙脑病毒抗体、猪细小病毒抗体、副猪嗜血杆菌抗体、猪2型链球菌抗体阳性猪血清进行检测，结果见表1.
表1该试剂盒对常见猪病阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为1.197，阴性对照OD450nm的平均值为0.214，S/N≥2.1时为阳性，S/N＜2.1时判为阴性，“—”：结果为阴性。
表1结果表明，对猪蓝耳病毒抗体、猪圆环病毒抗体、经典猪瘟病毒抗体、猪***病毒抗体、猪伪狂犬病毒抗体、猪乙脑病毒抗体、猪细小病毒抗体、副猪嗜血杆菌抗体、猪2型链球菌抗体阳性猪血清检测结果均为阴性，说明该试剂盒具有良好的特异性。
②该检测方法敏感性的测定
取6份非洲猪瘟抗体阳性猪血清按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600进行稀释，分别用上述建立的检测非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法和西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒进行检测，检测结果见表2和表3。
表2本实施例的试剂盒对不同稀释比例阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为1.298，阴性对照OD450nm的平均值为0.227，S/N≥2.1时为阳性，S/N＜2.1时判为阴性，“+”：结果为阳性，“—”：结果为阴性。
表3西班牙INGENASA试剂盒对不同稀释比例阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为0.134，阴性对照OD450nm的平均值为1.817，样品阻断率(％)＝(阴性对照OD值-样品OD值)/(阴性对照OD值-阳性对照OD值)×100％，样品阻断率(％)≥50％时为阳性，样品阻断率(％)≤40％时判为阴性，“+”：结果为阳性，“—”：结果为阴性。
表2和表3结果发现，本发明的试剂盒血清效价为1:400～1:800，西班牙INGENASA公司生产的试剂盒检测的血清最高效价为1:50，与西班牙INGENASA公司生产的试剂盒的抗体效价相比，本发明试剂盒检测非洲猪瘟病毒阳性血清的敏感性显著提高，更能确切监测非洲猪瘟病毒在猪群中的流行动态，为非洲猪瘟病毒的早期诊断和检测提供重要帮助。
③该试剂盒重复性测定
3.1)该试剂盒批内重复性测定
利用同一批次的试剂盒检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清15份，非洲猪瘟抗体阴性血清15份。对30份血清样本中每份样品进行3次重复检测。
表4同一批次试剂盒检测猪血清样品3次重复的结果
表4结果显示批内变异系数在0.49％～6.96％之间，说明该试剂盒的批内重复性良好。
3.2)批间可重复性试验
利用不同批次的试剂盒检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清15份，非洲猪瘟抗体阴性血清15份。对30份猪血清样本中每份血清同时进行3个批次检测方法的检测。
表5不同批次试剂盒检测猪血清的结果
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表5结果表明，批间变异系数在0.37％～8.84％之间，说明该试剂盒的批间重复性良好。
④与同类试剂盒的临床应用比较试验
将上述试剂盒与西班牙INGENASA公司生产的试剂盒进行了比较，检测100份临床猪血清。
结果表明，用本发明的非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白ELISA抗体检测试剂盒检测100份血清，结果阳性率为48.00％(48/100)，阴性率为52.00％(52/100)；用西班牙INGENASA公司生产的试剂盒检测的阳性率为41.00％(41/100)，阴性率为59.00％(59/100)；两者阳性符合率为85.42％(41/48)，阴性符合率为88.14％(52/59)，总符合率为93.00％(93/100)。
实施例3高效价非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的制备
从广东省医学实验动物中心购买三只健康清洁级新西兰大白兔，雌性，体重1.5～2kg，选取其中两只兔子免疫表达纯化的非洲猪瘟病毒非结构蛋白A238L优势抗原表位融合蛋白，另外一只兔子作为阴性对照。免疫接种采用背部皮下多点注射方式进行，首次免疫将表达纯化的非洲猪瘟病毒抗原表位融合蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，免疫组的每只兔子接种1mL，接种的蛋白含量为180μg/只，阴性对照组免疫PBS和弗氏完全佐剂乳化的混合剂1mL/只。后续免疫时将相应的抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，按同样的免疫剂量和方法进行，每次免疫间隔15天，第三次免疫后的第10天采血分离血清测定抗体效价。用表达纯化的非洲猪瘟病毒抗原表位融合蛋白(2.0μg/mL)包被ELISA平板(100μL/孔)，4℃过夜，用PBST洗涤3次，用0.01g/mL的BSA按100μL/孔进行封闭，37℃作用2h后，用PBST洗涤3次，将三只兔子血清用PBS由1:1000依次进行倍比稀释，100μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次；HRP标记的山羊抗兔酶标二抗1:50000进行稀释，100μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次；将TMP单组分底物按100μL/孔加入，于37℃下显色10min，用2M的硫酸终止液终止反应，100μL/孔。用酶标检测仪读取OD450nm值。
表6非洲猪瘟病毒抗原表位融合蛋白抗体效价的测定
表6结果表明，当实验兔子的血清稀释到1:128 000时，免疫的两只兔子所对应的OD450nm值仍是阴性对照兔子OD450nm值的2.1倍，所以本次免疫抗原表位的兔子血清抗体效价为1：128 000。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.含有权利要求2或3所述核酸的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸或权利要求4所述表达载体的宿主菌。
6.一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标板，所述酶标板包被有权利要求1所述非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被液、洗涤液和封闭液。
8.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建权利要求4所述的表达载体，然后将表达载体转化至宿主菌，对含有非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白的宿主细胞诱导表达后，进行超声破碎、包涵体溶解和纯化，收集得到非洲猪瘟病毒非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白。
9.一种抗非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的优势抗原表位融合蛋白作为抗原免疫动物，在动物体内产生非洲猪瘟病毒非结构蛋白抗体。
10.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述核酸、权利要求4所述表达载体或权利要求5所述宿主菌在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。
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