CN116004922B

CN116004922B - 检测猪pcv2和pcv3的双重荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN116004922B
Application number: CN202310031214.4A
Authority: CN
Inventors: 龚自冶; 唐威; 张大生; 苏建
Original assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd; Hunan Tianxin Seed Industry Co ltd
Current assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd; Hunan Tianxin Seed Industry Co ltd
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2043-01-10
Also published as: CN116004922A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒和检测方法。本发明的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，同时还包含阴性对照，阳性对照，2X荧光PCR反应液和ddH₂O。本发明参考临床检测到的PCV2和PCV3毒株，设计了检测PCV2和PCV3的引物和探针，并组装成试剂盒，几乎能扩增出所有已知的PCV2和PCV3毒株。本发明的双重荧光PCR试剂盒具有灵敏度高、特异性高和重复性好等特性，对于临床上进行PCV2和PCV3鉴别诊断具有重要意义。

Description

检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒和检测方法。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus,缩写：PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有三个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多***衰竭综合征（Postweaning Multisystemic WastingSyndrome,PMWS）的主要病原。该病最早于1991年在加拿大发现，并很快在欧美及包括我国在内亚洲国家发生和流行。除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率为10%～30%不等，较严重的猪场在暴发该病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。PMWS已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。

2016年在美国发生急性死亡并伴有类似猪皮炎和肾病综合征临床症状且表现繁殖障碍的母猪体内分离出一种新型圆环病毒，猪圆环病毒3型（PCV3）。研究表明PCV3可能在繁殖障碍和猪皮炎和肾病综合征中起到一定的病原学上的作用。PCV3感染后在多种组织器官中广泛分布，较常见的病例变化的组织器官是心脏和肺脏的损伤。PCV3可导致类似PCV2感染发病的临床表现，如皮炎肾病综合征和母猪繁殖障碍，临床中要严格做好PCV2的疫苗免疫，且要加强PCV3的检测和监测。

PCV3是与PCV2遗传进化亲缘关系较远，且存在较大差异的新型猪圆环病毒，临床中PCV2疫苗无法对PCV3提供保护。因此对PCV2和PCV3鉴别诊断非常重要。

目前，PCV2的检测有国标GB/T 34745-2017和GB/T 35901-2018，但经过分析，很多优势的PCV2病毒毒株都无法用GB/T 34745-2017和GB/T 35901-2018的引物和探针检测出来。比如：GB/T 34745-2017和GB/T 35901-2018，都无法扩增NCBI号为MK015043的PCV2序列。同样，很多NCBI号（FJ644927和MW051676等）的PCV2毒株也无法用现有公布的专利（专利号CN202111401011）号PCV2检测试剂检测出来。专利号CN201010271159.9一样存在上述类似的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，其中，

PCV2引物序列：

SEQ ID NO.1: 5’- TCCTCCCGCCATACCATAAC -3’；

SEQ ID NO.2: 5’- CGAACGCAGTGCCGAGGCCTAC -3’；

PCV2探针序列：

SEQ ID NO.3: 5’- CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA -3’；

PCV3引物序列：

SEQ ID NO.5：5’- AGACCCCGCCCAAGGA -3’；

SEQ ID NO.6：5’- GAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTT -3’；

PCV3探针序列

SEQ ID NO.7：5’- ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC -3’。

所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，其中，荧光基团可选 FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas等，本发明的优选方案为FAM、ROX；淬灭基团可选TAMRA、BHQ（BHQ1、BHQ2、BHQ3）、MGB等，本发明的优选方案为BHQ1、BHQ2。

具体的，PCV2探针序列为：

Fam-5’- CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA -3’-BHQ1；

PCV3探针序列：ROX-5’- ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC -3’-BHQ2。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，引物和探针的浓度比为1-5：1；其中，引物浓度为100-200nM，探针浓度为20-200 nM。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒还包含阴性对照、阳性对照、2X荧光PCR反应液和ddH₂O。

其中，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述阳性对照为质粒或假病毒，并且所述阳性对照包含PCV2扩增产物序列、PCV3扩增产物序列。

其中，所述PCV2阳性对照序列如SEQ ID NO.4所示：

TCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGGCTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCG；

所述PCV3阳性对照序列如SEQ ID NO.8所示：

ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGGCGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAATGGGAAAC。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述质粒为pUC57，所述假病毒类型MS2噬菌体或重组腺病毒中的一种。

根据本发明具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述质粒的浓度为1.0x10⁸-1.0x10⁹copy/ml，所述假病毒的浓度为1.0x10⁸-1.0x10⁹copy/ml。

本发明还提供检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒的使用方法，

(1)反应体系为20-50μL，每个反应孔包括2×荧光PCR反应液、待测样本（阴性对照或阳性对照）、ddH₂O等;

(2)反应条件为：50℃ 3min；95℃预变性 2min; 95℃变性 15s，60℃退火 30s收集荧光，40-45个循环。

(3)结果分析：

试验成立条件：阴性对照孔，FAM，ROX通道均无Ct值；阳性对照孔FAM，ROX通道的Ct值≤30.00。

结果判定：若FAM（ROX）Ct值≤38.00判定为阳性，38.00<若FAM（ROX）Ct值<40.00判定为可疑，其他情况判定为阴性；若FAM阳性说明有猪PCV2病原，若ROX阳性说明有猪PCV3病原。

本发明试剂盒适用的待测样本包括环境样、***拭子、猪的内脏组织或血液等。

本发明的有益效果：

本发明设计了针对PCV2和PCV3的引物和探针，并组装成试剂盒，检测所覆盖的PCV2和PCV3毒株范围广，同时扩增曲线的线性关系好，变异系数小，说明灵敏度高、特异性高和重复性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例3中浓度为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴和10³copy/μl阳性质粒的PCV2荧光定量PCR扩增曲线；

图2是根据图1扩增曲线做的标准方程，横坐标为模板浓度（10的N次方）,纵坐标对应的Ct值；

图3是实施例3中浓度为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴和10³copy/μl阳性质粒的PCV3荧光定量PCR扩增曲线；

图4是根据图3扩增曲线做的标准方程，横坐标为模板浓度（10的N次方）,纵坐标对应的Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例 1引物、探针和阳性对照

PCV2存在很多变异毒株，其中，NCBI中收录的毒株序列包括但不限于以下序列：

FJ644929，FJ644559，MK015043，KT719404，MW051676，OM274023.1，OM274022.1，OM274020.1，OM274019.1，OM274018.1，OM274017.1，OM858856.1，OM858855.1，OM858854.1，OP413469.1，OP413468.1，OP413467.1，OP413466.1，MW369443.1，OM743483.1，OM743482.1，OM743481.1，OM743479.1，OM743477.1，OM743476.1，OM743472.1，OM743468.1，OM743464.1，OM743461.1，OM743460.1，OM743459.1，OM743457.1，OM743456.1，OM681503.1，OM681502.1，OM681500.1，OM681497.1，OM681490.1，OM681488.1，OM681486.1，OM681482.1，OM681481.1，OM681480.1，OM6 81479.1，OM681477.1，OM681476.1，OM681475.1，OM681471.1，OM681470.1，OM681468.1，OM681466.1，OM681465.1，OM681463.1，OM681462.1，OM681459.1，OM681458.1，OM681457.1，OM681452.1，OM681451.1，OM677751.1，OM677749.1，OM677748.1，OM677747.1，OM677746.1，OM677744.1，OM677743.1，OM677742.1，OM677741.1，OM677738.1，OM677737.1，OM677736.1，OM677735.1，OM677734.1，OM677733.1，OM677732.1，OM677731.1，OM677730.1，OM677729.1，OM677728.1，OM677727.1，OM677726.1，OM677724.1，OM677723.1，OM677721.1，OM677720.1，OM677719.1，OM677717.1，OM677716.1，OM677714.1，OM677713.1，OM677712.1，OM677711.1，OM677710.1，OP441380.1，OM460170.1，OM288665.1，OM288664.1，OM288663.1，OM288662.1，OM288661.1，OM288660.1，OM288659.1，OM288658.1。

PCV3也存在很多变异毒株，其中，NCBI中收录的毒株序列包括但不限于以下序列：

ON184737.1，MZ004438.1，OX326964.1，ON184728.1，ON184729.1，ON184730.1，ON184731.1，ON184732.1，ON184733.1，ON184734.1，ON184735.1，ON184736.1，ON184738.1，ON184739.1，ON184740.1，ON184743.1，ON184747.1，ON184748.1，ON184749.1，ON184750.1，ON184751.1，MZ747123.1，MZ747124.1，MZ747125.1，MZ667331.1，MZ667330.1，MZ667332.1，MZ667333.1，MZ667334.1，OL799306.1，OL619331.1，OL619332.1，OL619335.1，OL619336.1，OL619337.1，OL619338.1，OL619339.1，OL619339.1，OL619339.1，OL619339.1，OL619339.1，OL619339.1，OL619339.1，OM249966.1，OM032567.1，OM032566.1，OL956951.1，OL956950.1，OP066329.1，OP066328.1，OP066327.1，OP066326.1，OP066325.1，OP066324.1，OP066323.1，OP066322.1，OP066321.1，OP066320.1，OP066319.1，OP066318.1，OP066317.1，OP066316.1，OP066315.1，OP066314.1，ON989005.1，ON586851.1，CP110845.1，CP110836.1，CP090311.1，OL619374.1，OL619373.1，OL619372.1，OL619371.1，OL619370.1，OL619369.1，OL619368.1，OL619366.1，OL619365.1，OL619364.1，OL619363.1，OL619362.1，OL619361.1，OL619360.1，OL619359.1，OL619358.1，OL619357.1，OL619356.1，OL619355.1，OL619354.1，OL619352.1，OL619351.1，OL619348.1，OL619347.1，OL619346.1，OL619345.1，OL619344.1，OL619343.1，OL619342.1，OL619341.1，OL619340.1。

发明人根据上述序列，分别针对PCV2、PCV3设计多组引物，经过试验筛选，仅有以下引物、探针可以扩增得到上述毒株序列，其中，

PCV2引物、探针序列如下：

PCV2-ORF2-175F: 5’-TCCTCCCGCCATACCATAAC-3’；

PCV2-ORF2-175R: 5’-cgaacgcagtgccgaggcctac-3’；

PCV2-ORF2-175P: Fam-5’-CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA-3’-BHQ1；

PCV3引物、探针序列如下：

PCV3-ORF2-168F：5’-AGACCCCGCCCAAGGA-3’；

PCV3-ORF2-168R：5’-Gaagtggttggcgtgccagggctt-3’；

PCV3-ORF2-168P：ROX-5’-ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC-3’-BHQ2。

同时，本发明选择了SEQ ID NO.4序列，并将SEQ ID NO.4序列克隆在puc57载体上组装成PCV2的阳性对照pUC57-SEQ NO.4。同样的，本发明选择了SEQ ID NO.8序列，并将SEQID NO.8序列克隆在puc57载体上组装成PCV3的阳性对照pUC57-SEQ NO.8；

SEQ ID NO.4：

SEQ ID NO.8：

ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGGCGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAATGGGAAAC

实施例 2检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒

1、2x PCR反应液；采购自成都蓉为基因科技有限公司；

2、引物和探针用DEPC水稀释成10μM浓度。

PCV2引物探针序列：

PCV2-ORF2-175F: 5’-TCCTCCCGCCATACCATAAC-3’；

PCV2-ORF2-175R: 5’-CGAACGCAGTGCCGAGGCCTAC-3’；

PCV2-ORF2-175P: Fam-5’-CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA-3’-BHQ1；

PCV3引物探针序列：

PCV3-ORF2-168F：5’-AGACCCCGCCCAAGGA-3’；

PCV3-ORF2-168R：5’-GAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTT-3’；

PCV3-ORF2-168P：ROX-5’-ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC-3’-BHQ2；

3、阳性对照稀释：

PCV2阳性对照pUC57-SEQ NO.4，稀释成1.0x10⁸-1.0x10⁹次方copy/ml。

PCV3阳性对照pUC57-SEQ NO.8，稀释成1.0x10⁸-1.0x10⁹次方copy/ml。

4、试剂盒组装（50T）：

(1)一支荧光PCR反应液MIX（900μl）：含以下组分

（2）一支阴性对照（0.5ml：ddH₂O）

（3）一支阳性对照（0.5ml：含pUC57-SEQ NO.4，pUC57-SEQ NO.8）。

（4）一支ddH₂O（1ml）。

（5）使用说明书1份。

4、检测结果的判定标准：

1）质量控制：阴性对照：FAM通道检测无Ct值，ROX通道检测无Ct值；

阳性对照：FAM通道检测Ct值≤30.00，ROX通道检测Ct值≤30.00；

阴、阳性对照检测结果需同时成立，检测结果才是有效的。

2）结果判定：

以下情况可以直接判定：

备注：如果检测38.00<Ct值<40.00,需要进行复检，若复检有ct值，则判定为阳性；若无ct值，则判定为阴性。

实施例3验证猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒敏感性、特异性和重复性

1、样本的基因组DNA提取：

环境样、***拭子、猪的内脏组织或血液等基因组DNA提取方法，可以用手工提取，也可以用试剂盒或者核酸提取仪等。

2、线性、敏感性

各阳性样本，以10倍梯度稀释的阳性对照质粒作为模板，即10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴和10³copy/μl阳性质粒作为模板，根据实施例2的方法进行本实施例的检测，结果如表1所示：

PCV2的检测结果见图1和图2；PCV3的检测结果图3和图4。

结果表明,本发明方法的检测范围为10⁸-10³copy/μl,在此范围的病毒含量可以得到准确的结果，即该方法的敏感性可以检测到最低10copy的病毒含量的样品。

3、特异性

为了检测本发明试剂盒的特异性，根据实施例2的方法，利用本发明的试剂盒检测猪链球菌、放线杆菌、副猪嗜血杆菌、伪狂犬病毒、非洲猪瘟病毒、细小病毒、乙脑病毒等样本，结果如表2所示：

结果表明，检测上述病毒均得到阴性结果，表明本发明的试剂盒的特异性良好。

4、重复性试验

为了检测本发明试剂盒的重复性，利用本发明的试剂盒检测浓度为10⁶和10⁵的阳性对照。结果如表3所示：

由上表可以看出，变异系数很小，说明重复性好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，其中，

PCV2引物序列：

SEQ ID NO.1: 5’-TCCTCCCGCCATACCATAAC-3’；

SEQ ID NO.2: 5’-CGAACGCAGTGCCGAGGCCTAC-3’；

PCV2探针序列：

SEQ ID NO.3: Fam-5’-CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA-3’-BHQ1；

PCV3引物序列：

SEQ ID NO.5：5’-AGACCCCGCCCAAGGA-3’；

SEQ ID NO.6：5’-GAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTT-3’；

PCV3探针序列:

SEQ ID NO.7：ROX-5’-ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC-3’-BHQ2；

引物和探针的浓度比为1-5:1；其中，引物浓度为100-200nM，探针浓度为20-200nM;

所述试剂盒还包含阴性对照、阳性对照、2X荧光PCR反应液和ddH₂O;

所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O;

所述阳性对照为pUC57质粒，并且所述阳性对照包含PCV2扩增产物序列、PCV3扩增产物序列;

所述PCV2扩增产物序列为：

SEQ ID NO.4:

TCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGGCTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCG;

所述PCV3扩增产物序列为：

SEQ ID NO.8:

ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGGCGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAATGGGAAAC;

质粒的浓度为1.0×10⁸-1.0×10⁹copy/ml。