CN111088403A

CN111088403A - 一种用于检测非洲猪瘟病毒的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒

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Publication number: CN111088403A
Application number: CN202010071357.4A
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 王衡; 娄亚坤; 魏文康; 赵林萍; 付燕峰; 吕殿红; 龚浪; 温肖会; 翟颀
Original assignee: Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co ltd; South China Agricultural University; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co ltd; South China Agricultural University; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增的检测方法。本发明通过设计特异性引物以及探针，利用重组酶介导链替换核酸扩增技术，在恒温条件下对待检样品进行扩增，可在20min内完成对非洲猪瘟病毒的检测。本发明的试剂盒的灵敏性高，最低检出限为10copies/μL；特异性强，可为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。

Description

一种用于检测非洲猪瘟病毒的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟自1921年在肯尼亚首次报道后，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近，仅为1000千米左右；另外，我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位，每年种猪及猪肉制品进口总量巨大，与多个国家贸易频繁；而且，我国与其它国家的旅客往来频繁，旅客携带的商品数量多、种类杂。因此，非洲猪瘟传入我国的风险日益加大，一旦传入，其带来的直接以及间接损失将不可估量。对此，近年我国农业部发布了关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪和野猪的一种烈性、出血性传染病，其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，***、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术。RAA利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替传统的PCR热循环解链过程，在37℃恒温下，核酸可以进行快速扩增。同时，利用荧光探针的标记、生物素标记的引物和核酸内切酶酶切，可以实现定时定量的结果分析，通常20-30min就可以得到荧光检测结果。

目前实验室诊断非洲猪瘟的方法有红细胞吸附试验、直接/间接免疫荧光试验、动物接种试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验、间接酶联免疫蚀斑试验等；然而现有的技术方法操作复杂、对操作人员的技术要求高、时间长、不能批量检测样品，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒核酸恒温荧光扩增检测方法，利用RAA技术，在短时间内大批量迅速判定非洲猪瘟病毒。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种检测非洲猪瘟病毒核酸的引物组，所述引物组的核酸序列为：

ASFV-F：5’-CAAGGTTCACGTTCTCRTTAAACCAAAAGCGC-3’；

ASFV-R：

5’-CTTAATCCAGAGCGCAAGAGGGGGCTGATAG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TTAGGGGTTTGAGGY-3’。

根据本发明的实施例，ASFV-F和ASFV-R的最佳浓度均为300～350nM；根据本发明的优选的实施例，ASFV-F和ASFV-R的最佳浓度均为300nM。

本发明的第二方面，一种用于检测非洲猪瘟病毒的标记有THF残基的RAA-exo探针ASFV-P，所述探针的核酸序列为：

ASFV-P：5’-GGAYGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATG-3’。

根据本发明的实施例，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ1；所述探针的最佳浓度为200～250nM；优选的，所述探针的最佳浓度为200nM。

本发明的第三方面，提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的引物组和前面所述的探针。

根据本发明的实施例，试剂盒还包括荧光RAA反应单元、Buffer A、Buffer B，阴性对照以及阳性对照；Buffer A为水解缓冲液；Buffer B为醋酸镁。

根据本发明的实施例，所述荧光RAA反应单元含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干酶粉、dNTP。

根据本发明的实施例，所述醋酸镁的最佳浓度为280～320mM；优选的，醋酸镁的最佳浓度为280mM。

本发明的第四方面，提供一种检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用前面所述的引物组和所述探针进行荧光型RAA扩增，

获得扩增曲线，分析Ct值；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，分析Ct值，判断样品中是否有非洲猪瘟病毒。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增体系为：1μL的ASFV-F引物，1μL的ASFV-R引物，1μL的ASFV-P探针，42.5μL的水解缓冲液(Buffer A)混合，溶解RAA反应单元(冻干粉)；醋酸镁2.5μL(Buffer B)，DNA模板5μL。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增程序为：39～42℃，30秒，共40个循环，此处采集荧光信号。

根据本发明的实施例，步骤(3)中所述的结果判定方法为：若Ct值<35，判断为阳性；若Ct值≥40，判断为阴性；若35<Ct值<40，判为可疑，需重复检测进行确认。再次检测结果仍然是35<Ct值<40，应参照阴性对照Ct值，若阴性对照出峰时间Ct值≥40，则判断为阳性。

本发明的有益效果是：

本发明提供的试剂盒是利用等温扩增反应，在37～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，在20min内可实现非洲猪瘟病毒的检测，特异性强，灵敏性高。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制非洲猪瘟病毒的传播具有非常重要的意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1荧光型RAA引物组和探针的设计

根据非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株和中国分离的非洲猪瘟毒株p72基因序列，筛选保守区域，设计引物及探针。本发明经过大量筛选，筛选出一组扩增非洲猪瘟病毒基因序列灵敏度高和特异性强的引物对ASFV-F、ASFV-R和探针ASFV-P，其核苷酸序列如下：

ASFV-F：CAAGGTTCACGTTCTCRTTAAACCAAAAGCGC(SEQ ID NO:1)；

ASFV-R：

CTTAATCCAGAGCGCAAGAGGGGGCTGATAG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TTAGGGGTTTGAGGY(SEQ ID NO:2)；

ASFV-P：FAM-GGAYGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATG-BHQ1(SEQ ID NO:3)。

实施例2

(1)标准样品的制备

人工合成ASFV参考基因Ⅱ型中国分离毒株(登录号：AF270706)p72基因全长，将其连入pUC57载体中，获得非洲猪瘟靶序列的载体，即非洲猪瘟病毒的阳性对照。

(2)阳性对照的荧光型RAA检测

以步骤(1)制备的阳性标准品，用实施例1所述引物组ASFV-F、ASFV-R和所述探针ASFV-P在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光型RAA扩增，以不含非洲猪瘟病毒基因片段的pUC57质粒为阴性对照。

反应体系为：1μL的ASFV-F引物，1μL的ASFV-R引物，1μL的ASFV-P探针，42.5μL的水解缓冲液(Buffer A)混合，溶解RAA反应单元(冻干粉)；醋酸镁2.5μL(Buffer B)，DNA模板5μL；本发明荧光RAA反应单元含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干酶粉、dNTP。

反应程序为：39℃，30秒，40个循环，采集荧光信号，得到Ct值。

(3)结果判定：分析Ct值，判断样品中是否有非洲猪瘟病毒。发现本实施出现了典型的扩增曲线，出峰时间≤15min(Ct值≤30)，则判定样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性。

实施例3

(1)提取待检样本猪脾脏、肌肉等组织样本、全血样本、饲料样本、污水、粪便样本的DNA。

(2)以提取的DNA为模板，用实施例2所述的引物组和所述探针进行荧光型RAA扩增，以实施例2的重组质粒为阳性对照，以不含非洲猪瘟病毒基因片段的质粒为阴性对照；

反应体系为：1μL的ASFV-F引物，1μL的ASFV-R引物，1μL的ASFV-P探针，42.5μL的水解缓冲液(Buffer A)混合，溶解RAA反应单元(冻干粉)；醋酸镁2.5μL(Buffer B)，DNA模板5μL；反应程序为：42℃，30秒，40个循环，采集荧光信号，得到Ct值。

(3)结果判定：

阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤15min(Ct值≤30)；

阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥0min(Ct值≥40)；

待检样品出现典型的扩增曲线且：

a.若出峰时间≤17.5min(Ct值<35)，判断为阳性；

b.若出峰时间≥20min(Ct值≥40)，判断为阴性；

c.若17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，判为可疑，需重复检测进行确认。

再次检测结果仍然是17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，应参照阴性对照出峰时间(Ct值)，若阴性对照出峰时间≥20min(Ct值≥40)，则判断样品非洲猪瘟病毒核酸为阳性。

下面对本发明的方法进一步检测灵敏性和特异性。

灵敏性试验

用ddH₂O将实施例2中的重组质粒(浓度为10⁶copies/μL)进行倍比稀释，分别为10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍，以不含非洲猪瘟病毒基因片段的pUC57质粒为阴性对照，按试剂盒的反应体系配制试剂和设置反应程序。

结果显示，本试剂盒的最低检出限为10copies/μL，表明本试剂盒有较高的灵敏度。

特异性试验

提取猪瘟病毒核酸、圆环病毒核酸、细小病毒核酸、***病毒核酸、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒核酸、伪狂犬病毒核酸，以实施例2中的重组质粒为阳性对照，以不含非洲猪瘟病毒基因片段的质粒为阴性对照，分别为模板进行恒温扩增检测，按试剂盒体系配制试剂和设置反应程序。

结果显示，检测结果中，仅有非洲猪瘟病毒重组质粒有Ct值；其它样品均无Ct值，因此判断其它样品均为阴性。

综上所述，本发明的试剂盒灵敏性较高，最低检出限小于10copies/μL；本发明的试剂盒有良好的特异性，因此本发明的试剂盒可以用于非洲猪瘟病毒感染的检测和预防。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所、华南农业大学、郑州中道生物技术有限公司

<120> 一种用于检测非洲猪瘟病毒的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaggttcac gttctcrtta aaccaaaagc gc 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttaatccag agcgcaagag ggggctgata g 31

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaygcaacg tatctggaca taagacgtaa tg 32

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的恒温荧光扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：

ASFV-F：5’-CAAGGTTCACGTTCTCRTTAAACCAAAAGCGC-3’；

ASFV-R：5’-CTTAATCCAGAGCGCAAGAGGGGGCTGATAG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TTAGGGGTTTGAGGY-3’。

2.一种用于检测非洲猪瘟病毒的标记有THF残基的RAA-exo探针ASFV-P，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

ASFV-P：5’-GGAYGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATG-3’。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

4.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光RAA反应单元、Buffer A、Buffer B，阴性对照以及阳性对照；Buffer A为水解缓冲液；Buffer B为醋酸镁。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光RAA反应单元含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干酶粉、dNTP。

7.一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述探针进行荧光型RAA扩增，获得扩增曲线；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有非洲猪瘟病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增体系为：1μL的ASFV-F引物，1μL的ASFV-R引物，1μL的ASFV-P探针，Buffer A 42.5μL混合，溶解RAA反应单元；Buffer B2.5μL，DNA模板；其中，Buffer A为水解缓冲液；Buffer B为醋酸镁，所述RAA反应单元为冻干粉。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增程序为：39～42℃，30秒，共40个循环，采集荧光信号。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的结果判定方法：若Ct值<35，判断为阳性；若Ct值≥40，判断为阴性；若35<Ct值<40，判为可疑，需重复检测；再次检测结果是35<Ct值<40，应参照阴性对照Ct值，若阴性对照出峰时间Ct值≥40，则判断为阳性。