CN115998770A - 拟鳞花软珊瑚提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种组合物在制备用于抗炎、皮肤美白、治疗皮肤伤口以及治疗过敏性皮炎的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物。
Description
技术领域
本发明是关于一种拟鳞花软珊瑚提取物的新用途,尤其是关于所述拟鳞花软珊瑚提取物在制备具有抗炎、皮肤美白、治疗皮肤伤口或治疗过敏性皮炎等功效的药物中的用途。
背景技术
海洋因为特殊的环境及丰富的资源,能够孕育一百万种的多细胞生物及十亿种的单细胞生物。这些生物富含特殊的生物活性,具有发展成药品、保健品以及药妆品的潜力。
珊瑚属于腔肠动物门,有9000余种,是海洋中最常见的生物之一,约占海洋生物种类的22.4%,是可以大量利用的海洋生物资源。软珊瑚目(Alcyonacea)俗称海扇、海鞭或海柳,是珊瑚动物中的一大分支。在对珊瑚化学成分的研究中,自从美国的Weinheiner等人于1969年从软珊瑚目中发现丰富的、具有独特结构和强烈生理活性的***素前体以来,吸引了众多天然产物化学家把研究对象从陆地生物转向海洋生物。大量被发现的海洋天然产物具有广泛的生物活性,主要作用于神经***、心血管***、免疫***等,且许多具有显著的抗肿瘤活性。
异位性皮炎是一种与免疫反应及炎症高度相关的慢性疾病。异位性皮炎是一种伴随有发痒的炎症性皮肤病,并且其为慢性疾病,并且其通常在婴儿期开始。异位性皮炎具有不断发痒的主要症状,并且具有没有特定原因的反复康复和恶化的性质。尽管最近对于异位性皮炎进行了许多研究,但是直到现在异位性皮炎的病因还不清楚。
根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的资料,2004年共有11亿烧烫伤患者,约为全球人口的七分之一。根据统计,在美国有约6百万人遭受创伤无法愈合的病症,所耗费的医疗资源估计超过一亿美元。因此,寻求促进伤口愈合的新药对于节省医疗成本和改善病患生活质量相当重要。
而各种软珊瑚纯化得到的天然化合物已经被证实具有许多种生物活性。因此软珊瑚极具研发潜力,在医疗应用上仍有许多研发空间。
发明内容
本发明是将拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)(在中国台湾地区称为仿穗软珊瑚)进行干燥后,再对其使用不同的有机溶剂(如乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇)或CO2超临界提取进行提取,以得到拟鳞花软珊瑚提取物PC。
在抗炎实验中,所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能抑制炎症因子环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达。这一结果显示所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能通过抑制炎症因子的表达来达到抗炎的功效。
在美白实验中,所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能降低斑马鱼体内黑色素的表达量。这一结果显示所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能通过抑制黑色素的表达来达到美白的功效。
在伤口愈合实验中,所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能缩短烧烫伤以及割伤的伤口愈合所需的时间。这一结果显示所述拟鳞花软珊瑚提取物PC能加速伤口的愈合速度。
在异位性皮炎实验中,所述拟鳞花软珊瑚提取物PC可以有效减缓异位性皮炎的炎症反应。在异位性皮炎小鼠模型中,PC可以有效缓解皮肤外观的病征,并缓解脾脏与***的肿大,以及降低IgE的浓度。在异位性皮炎的病理组织研究中可以观察到PC能有效抑制表皮增厚及肥大细胞浸润的情况。综合上述结果,PC可有效减缓异位性皮炎的临床病征,也可以有效缓解因异位性皮炎引起的免疫器官肿大,以及降低对于过敏原的反应。同时,因异位性皮炎而被破坏的皮肤屏障可以在PC治疗后得到有效改善。
本文中的术语“一”或“一种”是用来描述本发明的组分及成分。该术语仅为了描述方便并给予本发明的基本观念。该术语应被理解为包括一种或至少一种,以及除非明显地另有所指,在表示单数时也包括复数。在本申请中和“包含”一词一起使用时,术语“一”可意指一个或超过一个。
本申请所使用的术语“或”意指“和/或”,除非明确表示仅指另一个选择,或者除非其他的选择互相排斥。
本发明提供一种拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法,其包含用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、水、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚有机溶剂提取物。在一个优选的具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。根据本发明,CO2超临界提取分离天然营养成分的制备流程,主要是利用超临界状态的二氧化碳流体在高压、低温条件下从天然产物中提取出营养成分。在一个具体实施例中,所述CO2超临界提取的条件为:CO2:99%乙醇溶液的流速比=10 mL/min:1 mL/min;临界压力范围为150-400巴(bar);以及临界温度范围为20-60℃。在一个优选的具体实施例中,所述CO2超临界提取条件为:CO2:95%乙醇溶液的流速比=10 mL/min:1 mL/min;临界压力为250巴(bar);以及临界温度为40℃。经过CO2超临界提取后,物质会分成留在CO2超临界提取反应槽里的原料和提取出来的物质(有机溶剂层),收取所述有机溶剂层以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物。在另一个具体实施例中,对所述拟鳞花软珊瑚用CO2超临界提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物。
在另一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚在有机溶剂提取前,先经过了清洗、干燥和/或粉碎处理。在一个优选的具体实施例中,所述干燥处理为冷冻干燥处理。在一个更优选的具体实施例中,所述冷冻干燥处理的时间为12至36小时。
在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚在室温下用所述有机溶剂进行提取。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚用所述有机溶剂浸泡提取,再经过滤及减压浓缩,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物。
本发明提供一种组合物在制备用于抗炎的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。
如本文所使用,术语“抗炎”包括但不限于治疗或处理发炎的病状。
在一个具体实施例中,所述抗炎包含抑制炎症因子。在一个优选的具体实施例中,所述炎症因子包含环氧化酶-2(COX-2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物抑制环氧化酶-2及诱导型一氧化氮合酶所引起的炎症。
本文中的“有效剂量”一词表示治疗剂量可在特定条件下预防、降低、阻止或逆转个体症状的发展,或者部分、完全缓解所述个体开始接受治疗时在特别情况下已经存在的症状。本领域技术人员也可以轻易地测定向个体施用所述拟鳞花软珊瑚提取物时适当的剂量和用法。例如,所述拟鳞花软珊瑚提取物可向所述个体施用一次或两次。当疗法包含多次施用时,施用至所述个体的所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量包含整个治疗期间施用的产物总量。
在一个具体实施例中,所述个体为动物,优选地为哺乳动物,更优选地为人类。
在抗炎方面,在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.5毫克/公斤体重至50毫克/公斤体重。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为1毫克/公斤体重至20毫克/公斤体重。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为2毫克/公斤体重至10毫克/公斤体重。
另一方面,本发明提供一种拟鳞花软珊瑚提取物在制备用于皮肤美白的组合物中的用途,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。
根据本发明,所述拟鳞花软珊瑚提取物能抑制黑色素生成或减少黑色素,以达到皮肤美白的功效。在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物抑制黑色素生成或减少黑色素。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物用于制备抑制黑色素生成或减少黑色素的组合物。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物用于制备抑制黑色素生成或减少黑色素的药品或化妆品。
在一个具体实施例中,其中所述组合物包含化妆材料组合物、食品添加物或医药组合物。在一个优选的具体实施例中,所述组合物包含化妆品组合物、食品或药物。因此,所述组合物可用于制备化妆品、食品或药物。在另一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物用于制备皮肤美白的医药品或化妆品。
在一个示例性实施例中,所述组合物可以是化妆品组合物。除了所述拟鳞花软珊瑚提取物之外,所述化妆品组合物可包含功能性添加物和化妆品组合物中通常包含的成分。所述功能性添加物可包括选自以下的成分:水溶性维生素、油溶性维生素、多肽(polypeptide)、多糖(polysaccharide)、神经鞘脂类(sphingolipid)和海藻提取物。除此之外,还可含有油、脂肪、润湿剂、润滑剂(emollient)、表面活性剂、有机或无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH值对照剂(pH controlagent)、酒精、着色剂、香料、血液循环促进剂、清凉剂、止汗剂或纯水等。
所述化妆品组合物的制剂没有特别限制,可根据目的适当选择。例如,可以制备成选自以下的一种或多种制剂:润肤乳(skin lotion)、软化剂(softener)、调色剂(toner)、收敛剂(astringent)、化妆水、乳液(milk lotion)、保湿乳液(moisturizing lotion)、滋养乳液(nourishing lotion)、按摩霜(massage cream)、滋养霜(nourishing cream)、保湿霜(moisturizing cream)、护手霜(hand cream)、粉底(foundation)、精华液(essence)、滋养精华(nourishing essence)、包装(pack)、肥皂、清洁泡沫(cleansing foam)、清洁乳液(cleansing lotion)、清洁霜(cleansing cream)、身体乳液(body lotion)和沐浴乳(bodycleanser),但不限于此。
本发明进一步提供一种通过抑制黑色素生成或减少黑色素来美白皮肤的方法,其包含对个体的皮肤施用有效剂量的组合物,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。
在另一个具体实施例中,所述个体为动物,优选地为哺乳动物,更优选地为人类。
根据本发明,所述组合物被施用于所述个体的皮肤上,以抑制或减少该皮肤部位的黑色素,以美白该处皮肤。在一个具体实施例中,所述组合物被制备为乳液、化妆水、精华液、防晒乳、隔离霜或面膜的形式。
在皮肤美白方面,在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为5 μg/ml至500 μg/ml。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为20 μg/ml至200 μg/ml。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为50 μg/ml至100 μg/ml。
本发明进一步提供一种组合物在制备用于治疗皮肤伤口的药物的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。
根据本发明,所述拟鳞花软珊瑚提取物能促进伤口的愈合速度。在一个具体实施例中,所述药物用以促进皮肤伤口愈合。所述皮肤伤口是因物理性、化学性或机械性等因素所产生,其中所述因素包括但不限于:创伤、烧烫伤、化学性灼伤、辐射伤害以及生理病变。在另一个具体实施例中,所述皮肤伤口包含因烧烫伤所造成的伤口或因割伤所造成的伤口。
在治疗皮肤伤口方面,在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.01至5 mg/ml。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.05至5 mg/ml。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.1至2 mg/ml。
本发明还提供一种组合物在制备用于治疗过敏性皮炎的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
在一个具体实施例中,所述有机溶剂为乙醇。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物为拟鳞花软珊瑚乙醇提取物。
在另一个具体实施例中,所述超临界提取为CO2超临界提取。
如本文所使用,术语“过敏性皮炎”是指以过敏反应为主要原因的皮肤疾病的总称,以慢性的发痒及脸、颈、肘和/或膝的发疹为特征。就过敏性皮炎而言,例如,接触性皮炎、异位性皮炎等。“接触性皮炎”是指由于外来抗原与皮肤接触所导致发病的湿疹性炎症疾病,例如,接触过敏性皮炎、光接触性皮炎、全身性接触皮炎和接触性荨麻疹。同时,就抗原而言,例如,金属过敏原(钴、镍等)、植物过敏原(漆树、樱草等)和食物过敏原(芒果、银杏等)。“异位性皮炎(atopic dermatitis,AD)”是指许多患者具有异位性倾向的皮肤疾病。以重复地恶化、缓解的左右对称的全身性湿疹为特征,例如,弥漫性神经性皮炎、异位性湿疹、异位性神经性皮炎、贝尼耶痒疹(Besnier prurigo)、婴儿急性湿疹、屈曲部湿疹、儿童四肢湿疹、儿童异位性湿疹、儿童干燥性湿疹、儿童湿疹、成人异位性皮炎、内因性湿疹、儿童皮炎和慢性儿童湿疹。
在一个具体实施例中,所述过敏性皮炎包含接触性皮炎或异位性皮炎。在一个优选的具体实施例中,所述过敏性皮炎包含异位性皮炎。在一个更优选的具体实施例中,所述异位性皮炎包含弥漫性神经性皮炎、异位性湿疹、异位性神经性皮炎、贝尼耶痒疹、婴儿急性湿疹、屈曲部湿疹、儿童四肢湿疹、儿童异位性湿疹、儿童干燥性湿疹、儿童湿疹、成人异位性皮炎、内因性湿疹、儿童皮炎或慢性儿童湿疹。
在另一个具体实施例中,所述药物抑制异位性皮炎的病征,包含泛红、肿胀、脱皮或皮肤干燥。
在一个具体实施例中,所述药物降低因所述异位性皮炎造成的IgE表达量上升的情况。
在另一个具体实施例中,所述药物改善因所述异位性皮炎造成的脾脏或***肿大的情况。
在一个具体实施例中,所述药物改善因所述异位性皮炎造成的肥大细胞浸润的情况。
在另一个具体实施例中,所述药物改善因所述异位性皮炎造成的皮肤屏障受损的情况。在一个优选的具体实施例中,所述药物通过上调精胺酸酶-1(Arginase-1)、密封蛋白-1(Claudin-1)、丝聚蛋白(Filaggrin)以及上皮钙粘蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)来改善因所述异位性皮炎造成的皮肤屏障受损的情况。
在治疗过敏性皮炎方面,在一个具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.01至5 mg/ml。在一个优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.05至5 mg/ml。在一个更优选的具体实施例中,所述拟鳞花软珊瑚提取物的有效剂量范围为0.1至2 mg/ml。
在一个具体实施例中,上述药物进一步包含药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)。如本文所使用,术语“药学上可接受的载体”是通过特定组合施用及特定方法施用组合物所决定的。如本文所用的“载体”一词包括但不限于任何及所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂等渗透和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液或胶体等。用于药物活性物质的这些介质和试剂在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不兼容,其用于治疗的组合就需要被考虑。补充的活性成分也可掺入组合物中。术语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物施用于受试者时不产生过敏或类似的不良反应。以蛋白质作为活性物质的水组合物制备在本领域中是已知的。通常,这类组合物被制备为液体溶液、锭剂、胶囊或悬浮液注射剂;也可以制备为可用于注射剂的可溶解或悬浮液的固体形式。在另一个具体实施例中,所述药学上可接受的载体包含皮肤学上可允许的介质。“皮肤学上可允许的介质”是指在生物学上适合的物质,如盐类、酯类和/或酰胺类的成分。也就是说这类物质,其与所选择的有效成分一起用时,在对个体施用时不会引起不期望的生物学作用。另外,其是与含其的药剂组分中的任何成分都不会发生有害的交互作用的物质。同样地,文中的“皮肤学上可允许的盐”或“皮肤学上可允许的酯”是在生物学上适合的盐或酯。
根据本发明,上述组合物(包含所述拟鳞花软珊瑚提取物)及药学上可接受的载体的配制可能经由无菌的水溶液或分散体、水悬浮液、油乳化液、油包乳化液中的水、特定点的乳化液、长停留乳化液、黏性乳化液、微乳液、纳米乳液、微脂粒、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒、微汞及数种可持续释放的天然或合成聚合物。药学上可接受的载体及所述拟鳞花软珊瑚提取物也可以被配置成气雾剂、片剂、丸剂、胶囊、无菌粉末、栓剂、洗剂、霜剂、软膏剂、糊剂、凝胶、水凝胶、或其他可用于组合物输送的制剂。
另外,本发明所述的组合物包含施用于局部和区域的组合物。本文所用的术语“局部”涉及使用本文所述的组合物掺入合适的药用载体并将其施用在皮肤的某处,例如过敏性皮炎的患部,以实施局部作用。因此,此类局部施用的组合物包含其中通过与待处理皮肤表面直接接触的来自外部施用的化合物的药物形式。用于此目的的常规药物形式包含软膏剂、抹剂、乳膏、洗发剂、乳液、糊剂、凝胶、喷剂、气溶胶等,并且可以根据待治疗的身体部位以贴片或敷料形式施用。术语“软膏剂”包含具有油性基质、水溶性基质和乳液型基质的制剂(包含乳膏),所述基质如凡士林、羊毛脂、聚乙二醇类以及这些组合的混合物。
本发明的药物可进一步包含药学上可接受的载体,在本发明相关领域已知的治疗方式可通过许多不同途径施用于个体。在一些实施例中,所述组合物(包含所述拟鳞花软珊瑚提取物)及药学上可接受的载体会经由外用、静脉、肌肉、皮下、局部、口服或吸入施用。所述药物将会通过消化及循环***被传递到目标处。
附图说明
图1为拟鳞花软珊瑚提取物PC对于脂多糖(LPS)诱发RAW264.7细胞炎症模型中的炎症因子(诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及环氧化酶-2(COX-2))蛋白的表达量的影响。图1A显示PC对炎症因子的蛋白质印迹法的结果。图1B显示给予PC治疗后可以使LPS诱发的iNOS蛋白表达降低。图1C显示给予PC治疗后可以使LPS诱发的COX-2蛋白表达降低。
图2为拟鳞花软珊瑚提取物PC在斑马鱼美白试验中的结果。经量化的黑色素数值,以对照组作为100%,计算黑色素百分比。结果显示,在熊果苷(Arbutin)、PTU及PC组中黑色素比例较低,表示PC具有美白活性。
图3为给予不同剂量拟鳞花软珊瑚提取物PC治疗的大鼠烫伤伤口愈合的外观。实验结果显示,各组的伤口都会随着天数而愈合,低剂量PC治疗组在第8天开始从伤口边缘逐渐脱去死皮。比例尺为1 cm。
图4为给予拟鳞花软珊瑚提取物PC后,对皮肤烫伤伤口的治疗情况。图4A为各组伤口面积(以百分比呈现)与受伤后天数的曲线图。图4B为将对照组每天的伤口面积分别与媒介物组、低剂量PC组及高剂量PC组相减,并作成与受伤后时间的曲线图,数值越大表示伤口面积越小。图4C为用图4B中曲线下面积做出的AUC,数值越大表示愈合越好。结果显示,给予拟鳞花软珊瑚提取物治疗后,烫伤伤口愈合情形显著好于对照组,又以低剂量PC组伤口愈合恢复情况最好。利用单因素方差分析(one way ANOVA)进行数据统计分析,并以邓肯法(Duncan's Method)进行多重组间差异比较。*表示与受伤组比较,P<0.05;#表示与媒介物组比较,P<0.05。n:数量;w:伤口数量。
图5为给予拟鳞花软珊瑚提取物24天后,皮肤烫伤伤口的病理切片。(A):对照组;(B):受伤组;(C):媒介物组;(D):低剂量PC组;(E):高剂量PC组。将石蜡组织切片用苏木精-伊红染色(HE stain)进行染色,以观察伤口组织受伤情况,照片为10倍放大图。实验结果显示,受伤组(图5B)的表皮层上方仍有脱离不完全的结痂。而媒介物组(图5C)、低剂量PC组(图5D)、高剂量PC组(图5E)已形成较厚的表皮。
图6为给予拟鳞花软珊瑚提取物后,皮肤割伤伤口的外观。实验结果显示,各组的伤口都会随着天数而愈合,低剂量PC组及高剂量PC组的伤口愈合速度显著高于媒介物组。比例尺为23 μm。
图7为给予拟鳞花软珊瑚提取物后,对皮肤割伤伤口的治疗情况。图7A为各组伤口面积(以百分比呈现)与受伤后天数的曲线图。图7B为将媒介物组每天的伤口面积分别与低剂量PC组及高剂量PC组相减,并作成与受伤后时间的曲线图,数值越大表示伤口面积越小。图7C为用图7B中曲线下面积做出的AUC,数值越大表示愈合越好。结果显示,给予拟鳞花软珊瑚提取物治疗后,割伤伤口愈合情况显著好于媒介物组,又以低剂量PC组伤口愈合恢复情况最好。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。*表示与媒介物组比较,P<0.05。n:数量;w:伤口数量。
图8为给予拟鳞花软珊瑚提取物13天后,皮肤割伤伤口的病理切片。(A):对照组;(B):媒介物组;(C):低剂量PC组;(D):高剂量PC组。将石蜡组织切片用苏木精-伊红染色进行染色,以观察伤口组织受伤情况,照片为10倍放大图。实验结果显示,割伤13天后,低剂量PC组(图8C)及高剂量PC组(图8D)中表皮层明显增厚,并已发育完整。
图9为拟鳞花软珊瑚提取物PC对小鼠异位性皮炎外观的影响。DNCB诱发异位性皮炎后,在AD组及AD-V组中的小鼠皮肤外观产生泛红、肿胀、痂皮、增厚及干燥的病症,给予低剂量和高剂量PC以及克立硼罗(crisaborole)治疗后,可以观察到上述的病状皆有明显改善。
图10为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎外观的皮炎分数(dermatitisscores)的影响。图10A显示皮炎的分数,评分项目包含泛红、肿胀、渗液/痂皮、增厚、干燥等五项,每项为0-3分,总分最低为0分,最高为15分。图10B为AD-V为比较组,将每天的分数分别与其他各组相减,并作成与治疗后时间的关系图,正的数值越大表示治疗效果越好。图10C为用图10B中曲线下面积做出的AUC,正的数值越大表示恢复程度越好。实验结果显示,在给予低剂量和高剂量PC以及克立硼罗治疗后,分数显著下降。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#表示与AD-V组相比,p<0.05。n:数量。
图11为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎的脾脏重量的影响。经统计分析后,AD组及AD-V组中脾脏重量明显增加,给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗后,可以有效抑制异位性皮炎造成的脾脏肿大。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#表示与AD-V组相比,p<0.05。比例尺为1 cm。
图12为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎的***重量的影响。经统计分析后,AD组及AD-V组中***重量明显增加,给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以有效抑制异位性皮炎造成的***肿大。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#表示与AD-V组相比,p<0.05。比例尺为1 cm。
图13为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎的血清中IgE浓度的影响。经统计分析后,AD组及AD-V组中血清中IgE明显增加,给予高剂量PC及克立硼罗治疗后,血清中IgE的浓度都显著下降;然而低剂量PC则无显著影响。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#与AD-V组相比,p<0.05。
图14为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎的影响。图14A显示AD组及AD-V组的表皮层有大量角质细胞堆积造成表皮层增生。给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后表皮层的过度增生被明显抑制。照片为100倍放大图,比例尺为100 μm。图14B显示通过组织切片图测量表皮层厚度,经统计分析后,AD组及AD-V组的表皮厚度明显增加,给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,表皮层过度增生的状况会被抑制。利用单因素方差分析进行数据统计分析,并以邓肯法进行多重组间差异比较。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#表示与AD-V组相比,p<0.05。
图15为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎中肥大细胞浸润的影响。图15A显示AD组及AD-V组中真皮层有大量肥大细胞浸润,给予高剂量PC及克立硼罗治疗后可以有效抑制肥大细胞浸润的情况;然而低剂量PC则无显著影响。比例尺为50 μm。图15B显示经统计分析后,AD组及AD-V组中肥大细胞数量明显增加,给予高剂量PC及克立硼罗治疗后可以有效抑制肥大细胞的浸润;然而低剂量PC则无明显效果。$表示与对照组相比,p<0.05;*表示与AD组相比,p<0.05;#表示与AD-V组相比,p<0.05。
图16为拟鳞花软珊瑚提取物PC对于异位性皮炎中精胺酸酶-1(Arginase-1)的影响。图16A为100倍放大图,图16B为400倍放大图。实验结果显示,给予DNCB诱导异位性皮炎后,精胺酸酶-1的表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使精胺酸酶-1回升。100倍放大图的比例尺为100 μm,400倍放大图的比例尺为50 μm。
图17为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎中密封蛋白-1(Claudin-1)的影响。图17A为100倍放大图,图17B为400倍放大图。实验结果显示,给予DNCB诱导异位性皮炎后,密封蛋白-1的表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使密封蛋白-1表达量回升。100倍放大图的比例尺为100 μm,400倍放大图的比例尺为50 μm。
图18为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎中丝聚蛋白(Filaggrin)的影响。图18A为100倍放大图,图18B为400倍放大图。实验结果显示,给予DNCB诱导异位性皮炎后,丝聚蛋白表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使丝聚蛋白表达量回升。100倍放大图的比例尺为100 μm,400倍放大图的比例尺为50 μm。
图19为拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎中上皮钙粘蛋白(E-cadherin)的影响。实验结果显示,给予DNCB诱导异位性皮炎后,上皮钙粘蛋白表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使上皮钙粘蛋白表达量回升。比例尺为100 μm。
具体实施方式
本发明包括但不限于上述与下文的说明。实施方法如下所示。
养殖型拟鳞花软珊瑚的提取:
本发明使用的是人工养殖的拟鳞花软珊瑚(
Paralemnalia thyrsoides)。
本发明选用乙醇对拟鳞花软珊瑚进行提取,详细的提取流程如下:先将拟鳞花软珊瑚(湿重4075.0 g)冷冻干燥24小时,得到干重580 g。干燥的珊瑚在室温下以2 L乙醇溶剂浸泡并震荡4次,每次30分钟,得到的提取液以减压浓缩剂进行浓缩,得到拟鳞花软珊瑚提取物PC 50.487 g,计算提取率为8.7%(干重)或1.24%(湿重)。
另外,上述提取步骤中,所述乙醇溶剂可改用其他有机溶剂进行替换,例如使用乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇进行提取,或者将乙醇提取步骤改成超临界提取(如CO2超临界提取),都可以得到与PC相同成分的提取物。
上述CO2超临界提取条件为:CO2:95%乙醇溶液的流速比=10 mL/min:1 mL/min;临界压力为250巴(bar);以及临界温度为40℃。
离体实验的材料和方法:
抗炎作用
利用脂多糖(LPS)诱发小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞株来进行拟鳞花软珊瑚提取物PC的离体抗炎效果。在6公分培养皿中培养适量细胞数目的RAW 264.7细胞,再给予LPS及待测物,16-18小时后收集细胞,并进行蛋白质印迹法。通过评估炎症反应指标蛋白(诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及环氧化酶-2(COX-2))的表达量,如果待测物可抑制指标蛋白的表达量,即可推断其具有抗炎的潜力。以单独加入脂多糖(LPS)组为100%,最后以β-肌动蛋白(β-actin)作为内对照组。
活体实验的材料和方法:
1. 斑马鱼美白实验
安全性试验的实验品为野生型(wild-type)斑马鱼,饲养在水循环***中,根据性别分开饲养于缸中,以便配对时取用,鱼缸皆连通水循环过滤***,光周期为14小时光照及10小时黑暗,温度调控在26±1℃。
将公母鱼在产卵配对内盒配对,公母鱼只数为4:3或3:2,外盒使用3L饲养缸,隔日早上收集鱼卵,并放入含有汉克缓冲液(Hank’s buffer)的培养皿中,放入28℃恒温培养箱中,经过9小时后,挑除形态异常的卵以确定鱼卵品质;取100 μl含汉克缓冲液的3颗鱼卵加入96孔盘的小格中,再加入100 μl试验样品后,放入恒温培养箱,给药48小时后,以实体显微镜观察记录仔鱼形态,并使用MS-222麻醉及2%甲基纤维素(methyl cellulose)将鱼只固定在凹坡片上,拍摄鱼体,并以鱼体身上的黑色素为标准。在拍摄鱼只时固定显微镜倍率,利用Image J软件计算鱼体的黑色素,将其量化成像素数值,以对照组作为100%,计算其他组的黑色素百分比,若所占的黑色素百分比较低则代表其可能具有美白功效。实验组分别为对照组、阳性对照组(20 M熊果苷(Arbutin)及200 μM苯基硫脲(1-pheny1-2-thiourea,PTU))及拟鳞花软珊瑚提取物,所有样品皆溶于1%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)/汉克缓冲液,每组n值均≥12。
2. 烧烫伤、割伤模型
400-450克的Wistar大白鼠的公鼠饲养在光周期维持12小时光照/12小时黑暗的环境下,大白鼠可以自由取用饮水及食物。并以空调***控制饲养环境的温度和湿度,使环境温度保持在23℃。在烫伤实验中,将大白鼠在2.5%异氟醚(isoflurane)麻醉下进行背部除毛,选定烧烫伤位置。将要烧烫伤的位置的皮肤拉紧,将在干浴槽预热至165℃的铜块(2x 2 cm)紧密接触10秒以制造伤口,形成全层皮肤的烧烫伤口。过程中适时移动铜块以确保烫出完整四边形,过程中勿额外施加压力以确保每次给予的压力相同。而在割伤实验中,将大鼠麻醉后剔除背部毛发,再用剪刀剪下半径一公分的圆形皮肤。
每日相同时间取相同剂量的药膏均匀敷于伤口上。药膏配置为取1克的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)(high viscosity, Sigma-Aldrich Co, USA)和80克的超纯水用磁石搅拌成凝胶。然后加入不同浓度的拟鳞花软珊瑚提取物,用磁石搅拌配置成为药膏。每日将大鼠麻醉后,用数字相机(Coolpix P6000, Nikon, Japan)在相同条件下(光圈7.2、快门1/60秒)拍摄一系列照片,拍摄后测量记录大鼠体重。最后以病理组织切片、苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin stain,HE stain)、免疫染色进行观察。
利用软件计算每一张照片的每公分为多少像素。Spot软件(DiagnosticInstruments, Inc., Sterling Heights, MI, USA)可以提供所圈选的伤口面积,再利用上面的比例推算出实际伤口面积。
3. 诱发异位性皮炎(AD)的动物模型
本发明使用的实验动物组如下:(1)对照组(control组):剃毛但无诱发疾病的正常小鼠;(2)纯受伤组(AD组):剃毛后给予2, 4-二硝基氯苯(2, 4-dinitirochlorobenzene,DNCB)诱发异位性皮炎(AD)的小鼠,诱发面积约为1.6 mm2;(3)受伤组(AD vehicle(AD-V)组):剃毛后给予DNCB诱发AD后,伤口区域每天只涂抹1%甲基纤维素基质,面积约为1.6 mm2;(4)低剂量PC组(PC-L):剃毛后给予DNCB诱发AD后,伤口区域每天给予拟鳞花软珊瑚提取物PC(10 μg),面积约为1.6 mm2;(5)高剂量PC组(PC-H):剃毛后给予DNCB诱发AD后,伤口区域每天给予拟鳞花软珊瑚提取物PC(40 μg),面积约为1.6 mm2;(6)克立硼罗组(Cris):剃毛后给予DNCB诱发AD后,伤口区域每天给予克立硼罗(crisaborole,Cris)200 μg,面积约为1.6 mm2。
用2.5%异氟醚麻醉小鼠后剔除其背部毛发。然后给予4次DNCB并均匀涂抹于皮肤(面积约0.8 cm2)诱发AD(每次每只给予200 μl),使小鼠皮肤出现AD的疾病表征。待皮肤外观复原后(4周),准备进行第2次诱发,再次去除毛发,并分别于剃毛后第1、3、5、7天以2%DNCB均匀涂抹于皮肤,使其出现AD表征,之后于第9、11、13天以0.2% DNCB刺激以维持AD表征,于第9-15天每天涂抹100 μl的媒介物(vehicle)、不同浓度的拟鳞花软珊瑚提取物PC或克立硼罗。于第16天牺牲,进行心脏采血并收集皮肤组织、脾脏及***。
4. 皮肤观察以及皮炎评分依据
小鼠麻醉后用数字相机(Coolpix P6000, Nikon, Japan)在相同条件下(光圈6.4、快门1/80秒)拍摄伤口愈合情况。每天拍摄一次伤口照片,来观察伤口外观变化情况。
利用四个皮肤表面症状来评估皮炎临床上的严重性:泛红(redness)、肿胀(swelling)、结痂/渗液(oozing/crusting)、皮肤厚度(skin thickening)、干燥(dryness)等项目,各项目中0分为无病征;1分为轻度;2分为中度;3分为严重。依据不同程度的症状去比对并做出评分。分数越高即代表皮炎的严重程度越严重。
5. 皮肤样品收集与组织学分析
接受烫伤、割伤后的大鼠及诱发后的小鼠在实验设计天数给予人道牺牲,利用手术剪刀将异位性皮炎区域仔细取下,在4℃环境下静置于4%***固定一晚,接下来进行固定组织的脱水与渗蜡处理,利用组织自动处理***(Tissue-Tek, Sakura FinetekJapan Co., Ltd, Japan)将皮肤组织进行脱水及渗蜡,然后用石蜡组织包埋机(TissueEmbedding, EC780-1, EC780-2, Csa Microm)将组织包埋成石蜡块(paraffin block)。然后用石蜡切片机进行组织切片后,使用苏木精-伊红染色(HE stain)、甲苯胺蓝染色(Toluidine Blue)或免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)进行染色。完成后用封片胶封片,再将样品玻片置于光学显微镜(Leica DM-6000B, Leica, Germany)下观察,用SPOT数字影像撷取***(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, USA)拍摄以记录切片结果。
6. 器官称重
如果产生炎症或免疫相关的疾病,***及脾脏会肿大(swell)。因此,在小鼠牺牲时,收取这两个器官拍照,并称量其重量。
7. 分析血清中的IgE浓度
牺牲时收取动物的血液,以离心机3000 rpm离心10分钟后,吸取分离的血清。根据厂商的操作方法进行实验,适当的稀释血清,使用IgE ELISA试剂盒(Catalog # 88-50460-22, Thermo, USA)检测血清中的IgE含量。
8. 肥大细胞的染色
肥大细胞是使用10%(W/V)甲苯胺蓝(toluidine blue)进行染色。进行甲苯胺蓝(T3260, Sigma-Aldrich, USA)染色步骤时,先将石蜡切片浸泡于二甲苯20分钟两次后,依序浸泡于100%酒精1分钟、95%酒精1分钟、75%酒精1分钟和50%酒精1分钟,再利用流动水水洗3~5分钟。将石蜡切片泡入10%(W/V)甲苯胺蓝15秒钟,用50%酒精把多余的染色剂清洗掉,再利用流动水水洗5分钟,并将玻片晾干再以封片胶封片。最后将样品玻片置于光学显微镜下观察,利用SPOT数字影像撷取***拍摄以记录切片结果。
9. 免疫组织化学染色法
使用免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)进行染色步骤时,将石蜡切片浸泡在二甲苯20分钟两次后,依序浸泡于100%酒精1分钟、95%酒精1分钟、75%酒精1分钟和50%酒精1分钟,然后利用流动水水洗5分钟。用免疫组化笔(Liquid Blocker)在玻片***画一圈,过程中须保持组织处于湿润的状态。将石蜡切片用TTBS溶液(Tris-TweenBuffered Saline;20 mM T-HCl,137 mM NaCl,0.1% Tween 20,pH7.4)润洗三次(每次8分钟)。将蛋白酶K(Proteinase K)(P2308, Sigma-Aldrich, USA)用TE缓冲液(50 mM TrisBase,1mM EDTA)稀释10倍,将样本覆盖稀释后的蛋白酶K于37℃中震荡30分钟,然后用TTBS溶液润洗三次(每次8分钟),再加入3% H2O2覆盖样本10分钟,再以TTBS溶液润洗三次。用Rodent Block M(RBM961, Biocare Medical, USA)覆盖样本,室温震荡30分钟。移除Rodent Block M后以TTBS溶液润洗三次,加入针对目标蛋白作用的一级抗体(如精胺酸酶-1(Arginase-1)、密封蛋白-1(Claudin-1)、丝聚蛋白(Filaggrin)和上皮钙粘蛋白(E-cadherin)),使其在4℃下震荡一晚。隔天使用TTBS溶液润洗三次,加入针对先前所使用的一级抗体的二级抗体,在室温震荡30分钟后,将样本覆盖于TTBS液中,清洗三次,然后利用DAB染色液(SK-4100, Vector Laboratories, Inc., USA)显色,之后利用流动水水洗5分钟,将玻片依序浸泡于75%、95%、100%酒精各30秒,二甲苯1分钟后,用封片胶封片。最后将完成的样本玻片置于光学显微镜下观察,用SPOT数字影像撷取***拍摄以记录切片结果。
10. 实验数据分析
所有实验数据皆以平均值±平均值标准误差(mean±SEM)的方式呈现。两组间的数据比较,通过t检验(t-test)进行统计分析。多组间的数据比较,则利用单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)进行数据统计分析,并根据邓肯法(Duncan'sMethod)进行多组间差异性比较。当P值小于0.05时,表示组间有显著差异。
实验结果:
1. 抗炎蛋白的表达量
图1为拟鳞花软珊瑚提取物PC对于脂多糖(LPS)诱发RAW264.7细胞炎症模型中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及环氧化酶-2(COX-2)蛋白表达量的影响。利用LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症,图1A为拟鳞花软珊瑚提取物PC对炎症蛋白的影响的蛋白质印迹法的结果。图1B为iNOS蛋白表达量,将LPS单独组预设为100%,在给予PC治疗后可以有效降低LPS造成的iNOS上升。图1C为COX-2蛋白表达量,将LPS单独组预设为100%,在给予PC治疗后可以有效降低LPS造成的COX-2上升。
2. PC对于斑马鱼美白的功效
经量化的黑色素数值,以对照组作为100%,计算黑色素百分比。如图2所示,熊果苷、PTU及拟鳞花软珊瑚提取物PC组中的黑色素比例较低,表示其具有美白活性。经统计分析,与对照组相比PC组黑色素显著下降。
3. PC对伤口愈合的功效
3.1 PC对大鼠烫伤伤口愈合的影响
烫伤实验分为四组:对照组为纯受伤(injury)组,媒介物(vehicle)组为1%羧甲基纤维素,PC治疗组分为低剂量PC组及高剂量PC组,均将拟鳞花软珊瑚提取物PC溶于1%羧甲基纤维素中,低剂量PC组为每个伤口给予10 μg拟鳞花软珊瑚提取物,高剂量PC组为每个伤口给予40 μg拟鳞花软珊瑚提取物。实验结果显示,各组的伤口都会随着天数而愈合,低剂量治疗组在第8天开始从伤口边缘逐渐脱去死皮(图3)。由伤口面积曲线图(图4A)也可以观察到,伤口会随着时间逐渐恢复,但相较于媒介物组的面积曲线,低剂量PC组中伤口面积曲线图显示出更快速缩小伤口面积的情况。为了进一步观察受伤组与治疗组之间的差异,将受伤组面积曲线与治疗组相减(图4B),可以观察到更明显的愈合面积差。高剂量PC组虽然比媒介物组愈合更快速,但伤口面积缩小率仍比低剂量PC组低(图4B)。然后利用图4B中面积差曲线图做积分得到曲线下面积(area under curve,AUC)(图4C),数值越大表示愈合面积越大。媒介物组的伤口也会随时间自动愈合,但伤口面积愈合明显较为缓慢。因此在伤口外观及曲线图的观察中可以确认给予拟鳞花软珊瑚提取物PC治疗的组会比对照组更能有效促进伤口愈合。
本发明进一步利用病理组织染色(HE染色)分析烫伤后给予拟鳞花软珊瑚提取物PC对于受伤组织的影响。如图5所示,烫伤24天后,受伤组(图5B)的表皮层上方仍有脱离不完全的结痂。而媒介物组(图5C)、低剂量PC组(图5D)以及高剂量PC组(图5E)已形成较厚的表皮。
3.2 PC对大鼠割伤伤口愈合的影响
每日分别给予媒介物(1%羧甲基纤维素)、低剂量PC(10 μg拟鳞花软珊瑚提取物)以及高剂量PC(40 μg拟鳞花软珊瑚提取物)进行治疗,并且每隔两日拍照纪录,持续观察至割伤后第13天(图6)。图7A显示了各组伤口面积(以百分比呈现)与受伤后天数的曲线图。如图7B所示,将媒介物组每天的伤口面积分别与其他各组相减,并作成与受伤后时间的曲线图,数值越大表示伤口面积越小。如图7C所示,将图7B中各组的曲线取积分得到曲线下面积(AUC)并作图,数值越大表示伤口愈合效果越佳。实验结果显示,低剂量PC组及高剂量PC组的伤口愈合速度显著高于媒介物组,而AUC定量结果同样也显示低剂量PC组及高剂量PC组的治疗效果显著优于媒介物组。
本发明进一步利用病理组织染色(HE染色)分析割伤后给予拟鳞花软珊瑚提取物对于受伤组织的影响。如图8所示,割伤13天后,低剂量PC组(图8C)和高剂量PC组(图8D)中表皮层明显增厚,并已发育完整。
4. PC对异位性皮炎的功效
4.1 PC对小鼠异位性皮炎外观的影响
如图9所示,利用影像纪录伤口外观,并根据伤口外观征状程度进行评分。根据下列5种症状分别评分:泛红、肿胀、干燥、出血/结痂、增厚,依照症状程度分级:0(无症状)、1(轻度)、2(中度)以及3(重度)。每种症状最高分为3分,总分最高为15分,计算至动物牺牲前。此伤口的严重程度的评分可以作为皮炎分数(dermatitis scores)。如图10所示,实验结果的分数统计为:AD组:10.6±0.75;AD-V组:10±0.91;PC-L组:5.71±0.29;PC-H组:6.57±0.65;Cris组:7±0.79。在给予低和高剂量PC以及克立硼罗治疗后皆有显著效果,然而治疗组之间无统计学上的差异。
4.2 脾脏重量
拟鳞花软珊瑚提取物PC对DNCB诱导异位性皮炎的脾脏重量的影响(图11)。实验结果可以观察到DNCB诱发疾病后,AD组的脾脏大小明显增加,在给予低剂量和高剂量PC以及克立硼罗治疗后,脾脏皆有明显变小的现象。经过测量,对照组:93.27±9.76 mg,AD组:462.87±47.57 mg;AD-V组:523.18±37.03 mg;PC-L组:251.67±32.94 mg;PC-H组:287.58±43.48 mg;以及Cris组:328.24±24.99 mg。统计结果显示,给予低剂量和高剂量PC以及克立硼罗治疗可以抑制异位性皮炎造成的脾脏肿大。
4.3 ***重量
拟鳞花软珊瑚提取物PC对DNCB诱导异位性皮炎的***重量的影响(图12)。实验结果可以观察到,DNCB诱发疾病后,AD组的***大小明显增加,在给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,***皆有明显变小的现象。经过测量后,对照组:10.75±1.58 mg;AD组:27.35±3.07 mg;AD-V组:27.84±1.87 mg;PC-L组:20.67±0.55 mg;PC-H组:17.10±1.58 mg;以及Cris组:22.30±0.92 mg。统计结果显示,给予高剂量PC可以抑制异位性皮炎造成的***肿大,虽然低剂量PC及克立硼罗有治疗效果,但无统计学上的差异。
4.4 血清中的IgE浓度
拟鳞花软珊瑚提取物PC对DNCB诱导异位性皮炎血清中IgE浓度的影响(图13)。实验数据显示,DNCB诱发疾病后,AD组及AD-V组血液中的IgE浓度显著上升,而在给予药物治疗后,血清中IgE的浓度在高剂量PC组及克立硼罗组显著下降。对照组:0.89±0.13 mg/ml;AD组:31.62±2.42 mg/ ml;AD-V组:31.09±1.69 mg/ml;PC-L组:30.20±2.18 mg/ml;PC-H组:24.49±1.29 mg/ml;以及Cris组:25.214±2.81 mg/ml。统计结果显示,给予高剂量PC及克立硼罗治疗对AD血清中IgE的浓度上升有抑制效果;然而低剂量PC对血清中IgE的浓度没有抑制效果。
4.5 AD皮肤的病理影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对DNCB诱导异位性皮炎病理切片的影响(图14A)。小鼠诱发异位性皮炎并合并给予PC治疗后,于第16天取下皮肤进行组织病理切片,分析定量表皮层厚度。AD病变组的表皮层因为异位性皮炎导致角质层不当增生,造成表皮增厚,给予低剂量及高剂量PC或临床用药克立硼罗治疗后,都有明显的抑制角质层增厚的情况。如图14B所示,经统计分析后,对照组:18.08±2.43 mm;AD组:122.8±12.98 mm,AD-V组:165.83±24.86 mm;PC-L组:64.63±8.22 mm;PC-H组:83.75±12.59 mm;以及Cris组:60.63±2.28mm。在给予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后皆有显著效果,但治疗组之间并无统计学上的差异。
4.6 AD皮肤组织中肥大细胞表达量的影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对异位性皮炎中肥大细胞浸润的影响(图15A)。将石蜡组织切片用甲苯胺蓝染色进行染色,以观察伤口肥大细胞浸润情况,图15A中偏紫色的(箭头处)为肥大细胞。实验结果显示,由DNCB诱发AD后,AD组及AD-V组的肥大细胞浸润较多;给予高剂量PC及克立硼罗治疗后可以有效减缓肥大细胞的浸润,而低剂量PC则无明显的治疗效果。经统计分析后(图15B),对照组:6.70±1.71 细胞/mm2;AD组:58.90±4.61 细胞/mm2;AD-V组:53.96±4.99 细胞/mm2;PC-L组:58.01±8.21 细胞/mm2;PC-H组:33.82±6.32 细胞/mm2;以及Cris组:39.18±0.85 细胞/mm2。在给予高剂量PC及克立硼罗治疗后皆有显著效果,而低剂量PC则无效果,但治疗组间无统计学上的差异。
4.7 AD皮肤组织中精胺酸酶-1(Arginase-1)表达量的影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对于异位性皮炎中精胺酸酶-1的影响(图16)。在异位性皮炎下,精胺酸酶-1表达量会下降,在组织趋于恢复正常时,精胺酸酶-1表达量会上升。实验结果显示,AD组与AD-V组中,表皮层的精胺酸酶-1的表达量下降,在施予低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使精胺酸酶-1表达量回升。
4.8 AD皮肤组织中密封蛋白-1(Claudin-1)表达量的影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对于异位性皮炎中密封蛋白-1的影响(图17)。在异位性皮炎的状态下,皮肤屏障被破坏,造成密封蛋白-1下降。实验结果显示,在AD组与AD-V组中,表皮层的密封蛋白-1的表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使密封蛋白-1表达量回升。
4.9 AD皮肤组织中丝聚蛋白(Filaggrin)表达量的影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对于异位性皮炎中丝聚蛋白的影响(图18)。在异位性皮炎的状态下,皮肤屏障被破坏,造成丝聚蛋白下降。实验结果显示,在AD组与AD-V组中,表皮层的丝聚蛋白的表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使丝聚蛋白表达量回升。
4.10 AD皮肤组织中上皮钙粘蛋白(E-cadherin)表达量的影响
拟鳞花软珊瑚提取物PC对于异位性皮炎中上皮钙粘蛋白的影响(图19)。在异位性皮炎的状态下,皮肤屏障被破坏,而上皮钙粘蛋白的表达可以评估皮肤屏障的完整性。实验结果显示,在AD组与AD-V组中,表皮层的上皮钙粘蛋白的表达量下降,在施用低剂量和高剂量PC及克立硼罗治疗后,可以使上皮钙粘蛋白表达量回升。
本发明适当地描述可以在本文未具体公开的要素或限制下实施。已被用于描述的术语并不旨在限制。使用这些术语和除此之外的任何等效物的表达和描述是没有差别的,但应当认识到本发明的权利要求是可能修改的。因此,虽然本发明已说明实施例和其他情况,本文中所公开的内容可以被本领域技术人员进行修改和变化,并且这样的修改和变化被认为是在本发明的权利要求范围之内的。
Claims (15)
1.一种组合物在制备用于抗炎的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述抗炎包含抑制炎症因子。
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述炎症因子包含环氧化酶-2及诱导型一氧化氮合酶。
4.一种拟鳞花软珊瑚提取物在制备用于皮肤美白的组合物中的用途,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
5.根据权利要求4所述的用途,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物抑制黑色素生成或减少黑色素。
6.根据权利要求4所述的用途,其中所述组合物包含化妆品组合物、食品或药物。
7.一种组合物在制备用于治疗皮肤伤口的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
8.根据权利要求7所述的用途,其中所述皮肤伤口包含因烧烫伤所造成的伤口或因割伤所造成的伤口。
9.一种组合物在制备用于治疗过敏性皮炎的药物中的用途,其中所述组合物包含拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述拟鳞花软珊瑚提取物的制备方法包含:用有机溶剂或超临界提取对拟鳞花软珊瑚进行提取,以得到所述拟鳞花软珊瑚提取物,其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或异丙醇。
10.根据权利要求9所述的用途,其中所述过敏性皮炎包含异位性皮炎。
11.根据权利要求10所述的用途,其中所述药物降低因所述异位性皮炎造成的IgE表达量上升的情况。
12.根据权利要求10所述的用途,其中所述药物改善因所述异位性皮炎造成的皮肤屏障受损的情况。
13.根据权利要求12所述的用途,其中所述药物通过上调精胺酸酶-1、密封蛋白-1、丝聚蛋白以及上皮钙粘蛋白来改善因所述异位性皮炎造成的皮肤屏障受损的情况。
14.根据权利要求1、4、7或9中任一项所述的用途,其中所述有机溶剂为乙醇。
15.根据权利要求1、4、7或9中任一项所述的用途,其中所述超临界提取为CO2超临界提取。
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