CN115991753A - 大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7和/或其基因在调控异黄酮方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7和/或其基因在调控异黄酮方面的应用”属于植物基因工程领域。本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用，以及基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮中的应用，并在此基础上进一步提供一种异黄酮的调控方法。本发明通过大量实验证实：过量表达该转录因子基因GmZFP7的转基因植株中总异黄酮含量显著上升，通过基因编辑敲除该基因GmZFP7的突变体植株中总异黄酮含量显著降低。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7和/或其基因在调控异黄酮方面的应用。
背景技术
异黄酮是植物中尤其是豆科植物中合成的一种重要次生代谢产物。异黄酮对动植物具有重要作用。在动物特别是人类中，其化学结构与***相似，并具有类***活性，在抗癌、改善骨质疏松、减少心脑血管疾病、预防和治愈妇女更年期综合症等方面具有重要的作用。在植物中，异黄酮在抵御病原菌侵染，作为信号分子诱导大豆结瘤和保证植物正常生长发育中发挥重要的作用。由于异黄酮在食品和保健品中的巨大应用价值而受到人们的普遍关注，大豆是异黄酮的主要天然来源，因此培育高异黄酮特用大豆品种是大豆营养品质育种的主要目标之一。
基因工程是改良作物性状的有效手段，目前利用基因工程提高大豆异黄酮含量主要通过修饰异黄酮合成酶结构基因及异黄酮竞争路径中关键酶基因来实现的，但转基因植株由于其黄酮、花青素等重要次生代谢产物代谢合成途径被阻断，从而造成转基因植株难以存活等问题。此外，目前鉴定出一些MYB类转录因子通过调控异黄酮合成通路上的关键酶基因表达水平，进而影响大豆异黄酮的积累水平，但目前鉴定的调控异黄酮含量的转录因子基因仍然很少，且缺乏深入的功能机制研究。
GmZFP7(基因座位号：Glyma.20G012700，基因登录号Gene ID:100792169)是编码大豆锌指蛋白7的基因，其编码的蛋白是大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7。关于该基因和蛋白的功能鉴定本领域未见报道，而关于该基因、蛋白与异黄酮含量之间的关系，本领域也从未报道过。
发明内容
基于本领域现有技术的上述空白，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7或其基因登录号为Gene ID:100792169的编码基因在调控异黄酮方面的应用
本发明的技术方案如下：
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用。
所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的编码基因GmZFP7的基因登录号为Gene ID:100792169。
所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
所述调控异黄酮指通过提高或降低植物体内大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、或，在植株体内过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7提高或降低植株中的异黄酮含量；
所述植株选自：大豆、烟草。
基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮中的应用。
基因GmZFP7的基因座位号为Glyma.20G012700；基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
基因GmZFP7通过激活异黄酮合成酶2的基因GmIFS2的表达、和/或，抑制黄烷酮-3-羟化酶1的基因GmF3H1的表达来调控异黄酮。
所述调控异黄酮指提高或降低植株中的异黄酮含量；
优选地，所述植株选自：大豆、烟草。
一种调控异黄酮的方法，其特征在于，通过调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达来调控异黄酮。
通过过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7来调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达。
所述过表达指：将基因GmZFP7连接表达载体PTF101-GFP或pGGP获得的重组过表达载体PTF101-GmZFP7-GFP或pGGP-GmZFP7转化植株；
优选地，将基因GmZFP7连接表达载体的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
所述沉默表达指：将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP获得的重组沉默表达载体pGGP-GmZFP7-RNAi转化植株；
优选地，将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP的引物序列如SEQ ID NO.7-10所示；
所述敲除指：将JRH0645-GmZFP7基因编辑载体转化植株；
优选地，所述JRH0645-GmZFP7基因编辑载体以JRH0645(CaMV35s：Cas9)为原始载体，利用PCR将U6启动子、针对GmZFP7的gRNA和gRNA scaffold三部分串联后***XbaI酶切位点处构建而成；
优选地，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO.31所示。
本发明公开了一种大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7及其编码基因GmZFP7(基因座位号：Glyma.20G012700)在调控大豆异黄酮含量中的应用。GmZFP7转录因子具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该基因的开放阅读框具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。本发明的转录因子GmZFP7具有双功能转录因子活性，可以激活大豆异黄酮合成途径中的关键酶异黄酮合酶2基因(isoflavone synthase 2,IFS2)表达，同时抑制黄酮醇合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶1基因(flavanone 3-hydroxylase 1，F3H1)表达。
在大豆发状根中过量表达该转录因子的编码基因开放阅读框可显著提高大豆发状根中总异黄酮含量；抑制该转录因子的编码基因表达可显著降低大豆发状根中总异黄酮含量。在稳定转基因大豆植株中，过量表达该转录因子基因转基因植株叶片和种子中总异黄酮含量均显著上升，通过基因编辑敲除该基因的突变体植株叶片和种子中总异黄酮含量显著降低。本发明对培育不同水平异黄酮含量的大豆新品种具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明实验例第一部分材料方法第3节实验方法部分的基于GFP检测的基因过量表达载体pGGP-GmZFP7的结构示意图。
图2为本发明实验例第一部分材料方法第3节实验方法部分的基于GFP检测的基因沉默载体pGGP-GmZFP7-RNAi的结构示意图。
图3为本发明实验例第一部分材料方法第3节实验方法部分的植物表达载体PTF101-GmZFP7-GFP的结构示意图。
图4为本发明实验例第一部分材料方法第3节实验方法部分的植物表达载体pGreen-promoter-LUC的结构示意图。
图5为本发明实验例第一部分材料方法第3节实验方法部分的JRH0645-GmZFP7基因编辑载体图。
图6为本发明实验例第二部分实验结果第1节的LHD发状根中的异黄酮含量和GmZFP7相对表达量的柱形图；其中(A)为GmZFP7在发状根中的相对表达水平，(B)为GmZFP7过表达和沉默发状根中的总异黄酮相对含量。
图7为本发明实验例第二部分实验结果第2节的GmZFP7对GmIFS2和GmF3H1启动子活性的诱导调控的载体示意图和诱导水平柱形图；其中(A)为烟草瞬时表达载体示意图；(B)为GmZFP7对GmIFS2和GmF3H1启动子活性的诱导水平的柱形图。
图8为本发明实验例第二部分实验结果第3.1节的GmZFP7过量表达转基因株系的获得和检测结果，其中(A)为GmZFP7过量表达株系和对照株系；(B)为GmZFP7过量表达植株的BAR试纸条检测结果，图中显示3个GmZFP7过量表达株系GmZFP7-OE1、GmZFP7-OE2和GmZFP7-OE3均有抗除草剂基因阳性条带；(C)转基因叶片对草铵膦抗性效果图，其中阳性结果的叶片来自GmZFP7过量表达株系GmZFP7-OE2，GmZFP7-OE2和GmZFP7-OE3的叶片与之表型相近不再重复。
图9为本发明实验例第二部分实验结果第3.2节的GmZFP7过量表达转基因株系的表型鉴定的结果；其中(A)为过表达株系叶片中GmZFP7的基因表达量的柱形图；(B)为GmZFP7过量表达株系叶片中异黄酮含量变化的柱形图；(C)为GmZFP7过量表达株系种子中异黄酮含量变化的柱形图；(D)为过量表达株系叶片中GmIFS2和GmF3H1的表达量变化的柱形图。
图10为本发明实验例第二部分实验结果第3.3节的CRISPR/Cas9介导的GmZFP7敲除植株的筛选过程及结果；其中(A)为gRNA在GmZFP7中的位置和序列；(B)为CRISPR/Cas9序列的PCR检测电泳图；(C)为Williams82对照和GmZFP7敲除突变体幼苗；(D)为GmZFP7敲除突变体的筛选。
图11为本发明实验例第二部分实验结果第3.4节的GmZFP7突变体的表型鉴定结果；其中(A)为Gmzfp7突变体叶片中总异黄酮含量的柱形图；(B)为Gmzfp7突变体种子总异黄酮含量的柱形图；(C)为Gmzfp7突变体叶片中GmZFP7的表达量变化的柱形图；(D)为Gmzfp7突变体叶片中GmIFS2和GmF3H1的表达量变化的柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和实验例对本发明的详细内容做进一步具体描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
第1组实施例、本发明转录因子GmZFP7的新应用
本组实施例提供氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用。
在具体的实施例中，所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的编码基因GmZFP7的基因登录号为Gene ID:100792169。
在更具体的实施例中，所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述调控异黄酮指通过提高或降低植物体内大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、或，在植株体内过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7提高或降低植株中的异黄酮含量；
优选地，所述植株选自：大豆、烟草。
在一些具体的实施例中，调控异黄酮指提高或降低植株的根、叶、种子中的异黄酮含量。
第2组实施例、本发明基因GmZFP7的新应用
本组实施例提供基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮中的应用。
在一些实施例中，基因GmZFP7的基因座位号为Glyma.20G012700；基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在另一些实施例中，基因GmZFP7通过激活异黄酮合成酶2的基因GmIFS2的表达、和/或，抑制黄烷酮-3-羟化酶1的基因GmF3H1的表达来调控异黄酮。
在具体的实施例中，所述调控异黄酮指提高或降低植株中的异黄酮含量；更具体地，调控异黄酮指提高或降低植株的根、叶、种子中的异黄酮含量。
优选地，所述植株选自：大豆、烟草。
第3组实施例、本发明调控异黄酮的方法
本组实施例提供一种调控异黄酮的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：通过调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达来调控异黄酮。
在进一步的实施例中，通过过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7来调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达。
在具体的实施例中，所述过表达指：将基因GmZFP7连接表达载体PTF101-GFP或pGGP获得的重组过表达载体PTF101-GmZFP7-GFP或pGGP-GmZFP7转化植株；
优选地，将基因GmZFP7连接表达载体的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
所述沉默表达指：将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP获得的重组沉默表达载体pGGP-GmZFP7-RNAi转化植株；
优选地，将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP的引物序列如SEQ ID NO.7-10所示；
所述敲除指：将JRH0645-GmZFP7基因编辑载体转化植株；
优选地，所述JRH0645-GmZFP7基因编辑载体以JRH0645(CaMV35s：Cas9)为原始载体，利用PCR将U6启动子、针对GmZFP7的gRNA和gRNA scaffold三部分串联后***XbaI酶切位点处构建而成；优选地，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO.31所示。
实验例、本发明GmZFP7蛋白及其基因调控异黄酮含量的验证
一、材料方法
1.实验材料
大豆品种：鲁黑豆2号(LHD)、Williams82
本氏烟草
K599农杆菌感受态细胞(购自庄盟生物科技有限公司)
大肠杆菌DH5α(购自庄盟生物科技有限公司)
Trans-T1大肠杆菌感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)
EHA105农杆菌感受态细胞(购自庄盟生物科技有限公司)
ENA105(psoup)感受态细胞(购自庄盟生物科技有限公司)
KOD FX高保真酶
BAR快速检测试纸条
18％草铵膦(德国拜耳)
B5培养基基础盐以及相应的维生素和MS培养基基础盐以及相应的维生素均购自北京西美杰科技有限公司，一次性无菌塑料皿购自北京博源弘达生物科技有限公司，植物基因组DNA快速提取试剂盒(天根生物技术有限公司)
植物RNA提取试剂盒购自金佰特生物科技有限公司
反转录试剂盒购自全式金生物技术有限公司。
AS(乙酰丁香酮)、MES、MgCl2
蛋白质快速提取试剂盒(康为生物技术有限公司)
Dual-Glo Luciferase Assay System试剂盒
2.主要仪器设备
PCR扩增仪(Bio-RAD)、电泳仪(DYY-6C)、台式恒温振荡器(THZ-D)、高速冷冻离心机(SiGMR)、高速台式离心机(SIGMR 3-30K)、凝胶成像分析仪(Tanon 3500)、恒温培养箱等(LRH-250A)、手持荧光仪和Bio-Rad MyiQ单色荧光实时定量PCR仪、LUYOR-3260RBflashlight荧光蛋白观测镜和Bio-Rad MyiQ单色荧光实时定量PCR仪、SYNERGY H1全功能酶标仪。
3.实验方法
1)基因克隆
从LHD第一片真叶中提取RNA，利用反转录试剂盒将叶片RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板、GmZF-F/R为引物克隆GmZF1转录因子完整编码区(CDs)，用于后续载体构建。同时利用植物基因组DNA提取试剂盒按照说明提取LHD的基因组DNA，以此为模板克隆基因IFS2(Glyma.13G173500)、F3H1(Glyma.02G048400)基因上游1500bp-2000bp的启动子区域。
2)载体构建
大豆发状根实验以pGFPGUSplus(pGGP)植物表达载体为原始载体，通过对该载体进行BglⅡ和BstEⅡ双酶切，将该载体上的GUS基因片段替换为所需的目的基因片段。分别构建用于发根转化的过量表达载体pGGP-GmZFP7(图1)和抑制表达载体pGGP-GmZFP7-RNAi(图2)。
烟草中双荧光素酶实验以PTF101-GFP和pGreen-0800II为原始载体，构建GmZFP7植物过量表达载体PTF101-GmZFP7-GFP(图3)和信号载pGmIFS2/pGmF3H1-LUC信号载体(图4)。
大豆基因编辑载体以JRH0645(CaMV35s：Cas9)为原始载体，利用PCR将U6启动子、针对GmZFP7的gRNA和gRNA scaffold三部分串联后***XbaI酶切位点处，构建JRH0645-GmZFP7基因编辑载体(图5)。U6启动子和gRNA scaffold是原始载体JRH0645(CaMV35s：Cas9)中的已有元件序列。
相关引物见表1。
表1
3)农杆菌K599感受态细胞的转化
将构建好的质粒加入100μL刚冻融的K599感受态细胞中，轻轻混匀，转移到电击杯中进行电击转化。加入500μL不含抗生素的YEP液体培养基，移液枪吹打2-3次混匀，将混合液转移到1.5mL离心管中，在200rpm，28℃摇床上震荡3h。取适量菌液涂在含有相应抗生素的YEP固体平板上，28℃恒温培养箱中培养36-48h。
4)发状根诱导培养
(a)种子灭菌：选取健康的种子于培养皿中，采用氯气灭菌法(烧杯中加80mL次氯酸钠及5mL浓盐酸)，培养皿及大豆种子共同放于干燥器中密闭灭菌16-18h左右。
(b)种子萌发：将以上灭菌种子种植于萌发培养基中，置于25℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发。
(c)菌液制备：取保存的菌液在YEP液体培养基中进行两次活化，28℃，200rpm恒温摇床摇至OD600为0.6-0.8左右。
(d)外植体获得：取萌发4-7d的大豆种子，自下胚轴1-2mm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。用刀片在子叶节处轻轻划5-7处伤口，即为外植体。
(e)外植体侵染：将菌液离心(6000rpm，10min)并用液体共培养基重新调OD600至0.6-0.8，侵染子叶15-20min。
(f)共培养：将子叶转移到铺有无菌滤纸的固态共培养基上。25℃，黑暗培养3天，(g)发根诱导培养：将共培养后的外植体用带有抗生素的双蒸水清洗3-5次后，移入发根诱导培养基，25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养。
(h)发状根检测：将诱导培养皿在荧光显微镜照射，在视野中呈现绿色荧光的为阳根，对阳性根以及阴性根进行统计并取样。
5)农杆菌EHA105、EHA105(pSoup)感受态细胞转化和烟草瞬时转化
取100uL感受态细胞加质粒DNA，混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟进行热击转化。加入无抗生素的LB液体培养基，于28℃震荡培养2-3小时。5000rpm离心1min收菌，留取100uL上清，轻轻吹打重悬菌块涂布于响应抗生素的LB板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。当菌液OD600值介于0.6～1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。用2mL Induction medium轻柔重悬，然后再次离心收集菌液。所得沉淀用1mL Induction medium重悬。室温放置1～4小时测OD值，根据实验需要，配置侵染液。用注射器将侵染液注射进生长6～8周的本氏烟草叶片中，暗处理12小时后置于培养箱中培养48-72小时。
6)烟草叶片荧光信号Luc、Ren的检测
待烟草注射取注射后48-72小时后，用荧光蛋白观测镜观测叶片注射部位是否有GFP荧光信号，取GFP信号强的烟草叶片0.5g用液氮研磨，提取叶片中的胞浆可溶性蛋白置于冰上备用。取出-20℃保存的Dual-Glo Luciferase Assay System试剂盒置于冰上解冻，将试剂盒中Dual-Glo Luciferase Substrate和Dual-Glo Luciferase Buffer混合置于冰上称为Buffer-Luc备用；Dual-Glo Stop&Glo Buffer和Dual-Glo Stop&Glo Substrate混合后置于冰上称为Buffer-Ren备用。.取烟草中提取的胞浆蛋白和Buffer-Luc加入酶标板中用移液器吹打混匀后用SYNERGY H1全功能酶标仪检测Luc的活性，Luc检测完成后再在上述混合体系中加入75uL Buffer-Ren并吹打混匀以终止Luc反应，开始Ren反应并检测。
7)大豆遗传转化
种子灭菌：选择大豆品种Williams82，氯气灭菌法灭菌，完成后将装有种子的培养皿置于超净台中吹15min以去除残留氯气。
种子萌发：取灭菌完成的大豆种子脐朝下种于萌发培养基中。密封后于25℃，16h光照，8h黑暗条件下培养16h。
菌液制备：取农杆菌菌液40—60μL均匀涂抹到YEP+Rif+载体相应抗生素的固体培养基上，于28℃黑暗培养箱中倒置培养48h；活化后用双蒸水重悬后重新均匀地涂抹在含相应抗生素的培养基上，密封后倒置在28℃黑暗培养箱中24h后使用重悬液重悬至OD600值0.6-0.8，用于后续侵染。
子叶节外植体的制备：去种皮，把两片子叶分开，用刀轻拨掉子叶，在子叶节连接处轻轻划几刀。将处理好的种子放进菌液中，侵染1.5h。
共培养：将准备好的子叶节外植体放入事先准备好的菌液中浸泡1.5h，将浸泡菌液的子叶节外植体凸面朝下放置在铺有灭菌滤纸的CCM培养基上，密封后置于22℃条件下黑暗培养5天。
恢复诱导培养：取出共培养5天后的外植体，使用不含蔗糖和琼脂的液体诱导培养基清洗外植体4-5次后用滤纸吸干表面的水分，以45°倾斜角***诱导培养基中。密封保存并置于25℃培养间，16h光照，8h黑暗，培养7天。
筛选诱导培养：取恢复培养后的大豆外植体，切除过长的下胚轴以及丛生芽，切掉部分胚根，保留约0.5cm，以45°倾斜角***筛选培养基中。密封置于25℃培养间，16h光照，8h黑暗条件下培养21天。
伸长继代培养：取筛选培养21天的外植体，切去部分下胚轴，45°斜***伸长培养基中。于25℃、16h光照、8h黑暗条件下密封培养，首次伸长培养21天，其后伸长继代培养可15天一次，可重复继代2-3次。将伸长继代培养后的转基因幼苗洗净移栽即可。
8)转基因植株的Bar鉴定
筛选主要以BAR试纸条和草铵膦喷施或涂抹两种方法进行。
BAR快速检测试纸条：取少量叶片于1.5mL离心管中，少量加水破碎叶片组织，将BAR试纸条***叶片碎片中等待约3min，等试纸条远液面端出现条带时即为液面以浸满试纸条，此时可观察检测结果。
草铵膦喷施或涂抹：18％草铵膦，稀释1000倍后涂抹在叶片表面并做好标记，3-5天即可观察。
9)基因编辑植株的PCR测序鉴定
对于基因编辑植株，除Bar基因的相关检测外，主要采用对CRISPR-Cas9基因的PCR扩增和测序的方法检测。取转基因植株开花期叶片，使用天根公司生产的植物全基因组DNA提取试剂盒提取叶片中的全基因组DNA。对CRISPR基因编辑植株进行Cas9检测和下游编辑基因检测。PCR引物见表2。
表2.CRISPR编辑植株检测引物
10)异黄酮的提取与检测方法
使用旋风磨(研钵)将待测组织研磨成粉末，称取0.02g粉末到2mL离心管中，加入1mL含有70％(v/v)乙醇和0.1％(v/v)乙酸的额提取液后置于摇床摇动混合12h。取混合完全的提取液于4℃，2700g离心10分钟后取上清，上清液使用孔径为0.2μm的过滤器(YMC，Kyoto，Japan)过滤。使用Agilent 1260HPLC***(Agilent Technologies，Santa Clara，California，USA)测定异黄酮含量。定量分析选用YMC ODS AM-303色谱柱(250mm×4.6mmI.D.，S-5μm，
)。流动相A和B分别由溶于蒸馏水中的0.1％乙酸和乙腈组成。溶剂流速为1.0mL.min-1，进样量为10μL，使用13-30％乙腈(v/v)的70分钟线性梯度。紫外检测器的波长设置为260nm，柱温设置为35℃。大豆异黄酮标准样品是由染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷、丙二酰基染料木苷、丙二酰基黄豆苷、丙二酰基黄豆黄苷、乙酰基黄豆苷、乙酰基染料木苷、乙酰基黄豆黄苷、染料木素、大豆黄素和黄豆黄素12种组分构成，取浓度为200μg·mL-1的每个标准样品等量混合，制备混合标准样品放于-20℃备用。根据12种异黄酮标准样品的保留时间和最大吸收光谱进行定性分析，以260nm处波长的紫外吸收值为标准，参照孙君明等(2011)方法(Sun J,Sun B,Han F,Yan S,Yang H and Kikuchi A.Rapid HPLC method fordetermination of 12isoflavone components in soybean seeds.AgriSci China,2011,10(1):101-105.)计算样品中异黄酮各组分、甙元及总含量。
11)qRT-PCR分析
利用Real-time PCR对沉默和过量表达载体基因在大豆发状根中的表达量情况进行检测，以GmActin-11-like基因为内参基因，按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex taqⅡ说明书进行操作。所用引物序列见表3。基因表达量的计算方法采用2-ΔΔCT法计算。
表3
二、实验结果
1.GmZFP7过量表达和沉默显著改变大豆发状根中异黄酮含量
在鲁黑豆2号中，通过pGGP-GmZFP7载体过量表达GmZFP7后，转基因发状根中GmZFP7的相对表达量提高1-2420倍，总异黄酮含量提高13％-29％。通过pGGP-GmZFP7-RNAi载体沉默GmZFP7后，GmZFP7的相对表达量降低81-88％，总异黄酮含量降低18-28％。表明GmZFP7过量表达和沉默显著改变大豆发状根中总异黄酮含量(图6)。
2.GmZFP7显著激活异黄酮合成通路结点酶异黄酮合成酶2(GmIFS2)基因表达，同时抑制与之竞争共同底物的黄烷酮-3-羟化酶1(GmF3H1)基因表达
以CaMV35s:Ren为内参，以PTF101-GFP载体为对照进行实验，通过检测pGreen载体中Luc酶活来判断转录因子GmZFP7对GmIFS1、GmIFS2和GmF3H1启动子的调控。结果显示，表达GmZFP7后，GmIFS1启动子的启动活性未发生显著变化，GmIFS2启动子的启动活性提高了3.3倍，而GmF3H1启动子的启动活性则降低了60％(图7)。结果表明，GmZFP7通过激活异黄酮合成通路中关键结点酶异黄酮合成酶2(GmIFS2)基因表达，同时抑制与之竞争共同底物的黄烷酮-3-羟化酶1(GmF3H1)基因表达，提高异黄酮含量。
3.大豆稳定转化植株总异黄酮表型表明，通过修饰GmZFP7可以显著改变大豆叶片和种子中的异黄酮含量。
3.1GmZFP7过量表达植株的获得和鉴定
通过大豆子叶节遗传转化方法，将GmZFP7过量表达载体PTF101-GmZFP7-GFP和对照载体PTF101-GFP转入大豆品种Williams82中(图8)，对所获得的过表达株系通过Bar试纸条检测、草铵膦涂抹筛选和GmZFP7的qPCR检测，共筛选到具有Bar基因和草铵膦抗性的GmZFP7的T4代过量表达纯合株系3个，带有空载体PTF101-GFP的株系3个作为对照，检测结果如图8。
3.2过量表达GmZFP7可提高大豆叶片和种子中的异黄酮含量
选取稳定遗传的转基因T4代植株的叶片和种子，检测GmZFP7的基因表达量和总异黄酮含量。在GmZFP7的3个过量表达株系OE1、OE2和OE3中，GmZFP7的相对表达量较对照提高了17-125倍(图9A)，3个过表达株系的GmZFP7基因表达量差异较大，可能的原因在于转入的GmZFP7***基因组的拷贝数不同所致，但3个过表达株系相比对照株系而言，均为显著提高表达量。
同时叶片和种子中总异黄酮含量均显著提高，其中叶片中提高35％-39％，种子中总异黄酮显著提高7％-19％(图9B,C)。在发状根和烟草瞬时表达实验的基础上，我们检测了转基因植株GmIFS2和GmF3H1相对表达量的变化，在3个过量表达株系的叶片中，GmIFS2的相对表达量提高了2.0-2.8倍，而GmF3H1的表达量则降低了40％-80％(图9D)。以上结果表明，GmZFP7可以通过提高异黄酮通路中GmIFS2的表达并且抑制黄酮醇通路中GmF3H1的表达来调节苯丙烷代谢途径的代谢流向来提高异黄酮含量。
3.3 CRISPR/Cas9介导的GmZFP7敲除植株筛选
根据GmZFP7的序列特点，利用CRISPR-P2.0在线设计并筛选出合适的sgRNA靶序列GGTTTGAACTTAGACCTTGGTCT(SEQ ID NO.31)(红色字体为PAM)(图10A)。对T0-T1代转基因编辑植株首先进行Bar基因筛选和Cas9基因分子鉴定并单株播种收获(图10B)，从T2代3个株系基因编辑材料中筛选双峰杂合编辑材料31株，其中纯合突变体4株，编辑类型相同，均为单碱基***(图10C,D)。
3.4 GmZFP7敲除显著降低转基因植株叶片和种子中的异黄酮含量
对从T2代转基因植株阳性中筛选到的纯合敲除突变体Gmzfp7植株进行单株收获。选取T3代植株并检测叶片和种子中的总异黄酮含量和相关基因的相对表达量。Gmzfp7突变体叶片和种子中的总异黄酮含量均显著降低(图11A,B)。qPCR检测结果显示，突变体中GmZFP7表达水平未发生显著变化，GmIFS2的表达量显著降低，GmF3H1的表达量显著提高，与前述结果一致，表明GmZFP7可以通过提高异黄酮通路中GmIFS2的表达并且抑制黄酮醇通路中GmF3H1的表达来改变苯丙烷代谢流向从而提高总异黄酮含量。
Claims (10)
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用。
2.根据权利要求1所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用，其特征在于，所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的编码基因GmZFP7的基因登录号为Gene ID:100792169。
3.根据权利要求1或2所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7在调控异黄酮方面的应用，其特征在于，所述大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，所述调控异黄酮指通过提高或降低植物体内大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、或，在植株体内过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7提高或降低植株中的异黄酮含量；
和/或，所述植株选自：大豆、烟草。
4.基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮中的应用。
5.根据权利要求4所述的基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮方面的应用，其特征在于，基因GmZFP7的基因座位号为Glyma.20G012700；基因GmZFP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求4或5所述的基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮方面的应用，其特征在于，基因GmZFP7通过激活异黄酮合成酶2的基因GmIFS2的表达、和/或，抑制黄烷酮-3-羟化酶1的基因GmF3H1的表达来调控异黄酮。
7.根据权利要求4或5所述的基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7在调控异黄酮含量方面的应用，其特征在于，所述调控异黄酮指提高或降低植株中的异黄酮含量；
和/或，所述植株选自：大豆、烟草。
8.一种调控异黄酮的方法，其特征在于，通过调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达来调控异黄酮。
9.根据权利要求8所述的一种调控异黄酮的方法，其特征在于，通过过表达或沉默表达或敲低表达或敲除大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的基因GmZFP7来调控氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大豆C2H2型锌指蛋白类转录因子GmZFP7的水平、和/或，调控基因登录号为Gene ID:100792169的基因GmZFP7的表达。
10.根据权利要求9所述的一种调控异黄酮的方法，其特征在于，所述过表达指：将基因GmZFP7连接表达载体PTF101-GFP或pGGP获得的重组过表达载体PTF101-GmZFP7-GFP或pGGP-GmZFP7转化植株；
和/或，将基因GmZFP7连接表达载体的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；
所述沉默表达指：将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP获得的重组沉默表达载体pGGP-GmZFP7-RNAi转化植株；
和/或，将基因GmZFP7的RNAi序列连接载体pGGP的引物序列如SEQ ID NO.7-10所示；
所述敲除指：将JRH0645-GmZFP7基因编辑载体转化植株；
和/或，所述JRH0645-GmZFP7基因编辑载体以JRH0645(CaMV35s：Cas9)为原始载体，利用PCR将U6启动子、针对GmZFP7的gRNA和gRNA scaffold三部分串联后***XbaI酶切位点处构建而成；
和/或，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO.31所示。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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