CN115976041A - 国兰开花调控基因sep1编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种国兰开花调控基因SEP1编码序列及其应用。本发明从中国兰花的墨兰品种‘白墨’的花器官cDNA中分离得到兰花花器官发育调控基因，提高其表达量后可造成拟南芥开花期显著提前，但不影响花器官形态结构；通过下游基因表达分析，发现该基因可正调控开花控制基因FT,SOC1,LFY1的表达，进一步表明该基因对植物开花的促进作用。本发明国兰开花调控基因可用于兰科植物开花调控分子机制的研究，以及植物开花性状的改良。

Description

国兰开花调控基因SEP1编码序列及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及国兰开花调控基因SEP1及其编码蛋白和应用。

背景技术

兰花是全球重要的花卉作物。兰属地生种大多原产中国，因此又称国兰，已有800多年的栽培历史，被列为中国十大名花之一，主要包括建兰、墨兰、春兰、蕙兰、莲瓣兰、豆瓣兰、寒兰和春剑等8大种类。然而目前国兰品种主要依靠野生资源驯化选育，适宜规模化、产业化的品种不多，杂交育种周期长、难度大且子代性状难以预期，现代分子生物技术育种手段严重滞后。

目前通过大规模基因发掘、重要性状功能性分子标记以及基因导入、敲除等构建高效分子育种技术体系，已在农作物育种中取得重大成效。开花特征是决定国兰观赏和经济价值并促进其产业发展的关键因素。随着基于多组学分子设计育种和基因编辑等新一代分子育种技术的快速发展和广泛应用，深入解析国兰开花决定的关键功能基因，将作为分子育种和定向改良的重要依据，具有广泛的产业应用前景和经济价值。

发明内容

本发明的目的在于：克服传统杂交育种存在的周期长、性状难以预期等问题，本发明通过运用最新的分子生物学手段，挖掘可运用于植物花型改良的基因资源，实现国兰开花的性状改良。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种国兰开花调控基因，它是从中国兰花的墨兰品种‘白墨’(Cymbidium sinense)的花器官cDNA中分离得到，其核苷酸序列由738个碱基组成，如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个目的是提供一种由上述的国兰开花调控基因编码的蛋白，由245个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个目的是提供一种包含上述的国兰开花调控基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌或转基因材料。

本发明的第四个目的是提供上述的国兰开花调控基因在植物开花性状改良中的应用。优选的，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前的改良。

本发明的第五个目的是提供上述的国兰开花调控蛋白在植物开花性状改良中的应用。优选的，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前的改良。

本发明的第六个目的是提供一种促进植物提前开花的方法，其包括以下步骤：构建过表达上述的国兰开花调控基因的重组表达载体，将重组表达载体转化到植物中。

优选的，所述的将重组表达载体转化到植物中，是将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染植物

本发明通过基因工程技术发现，所述国兰花器官发育调控基因在拟南芥中过量表达，能改变植物开花性状，使得开花期显著提前，但不影响花器官形态结构。因此，可将该基因及其编码的蛋白用于花期调控途径的研究，以及植物开花时间性状的改良。

本发明的有益效果为：

本发明从中国兰花的墨兰品种‘白墨’(Cymbidium sinense)的花器官cDNA中分离得到兰花花器官发育调控基因，提高其表达量后可造成拟南芥开花期显著提前，但不影响花器官形态结构；通过下游基因表达分析，发现该基因可正调控开花控制基因FT, SOC1,LFY1的表达，进一步表明该基因对植物开花的促进作用。本发明国兰开花调控基因可用于兰科植物开花调控分子机制的研究，以及植物开花性状的改良。

附图说明

图1为本发明实施例1中，CsSEP1与其他物种来源的进化树分析。

图2为本发明实施例1中，兰科植物SEP家族***发育树。As:Apostasiashenzhenica；At: Arabidopsis thaliana；Cs:Cymbidium sinense；Dc:Dendrobiumcatenatum；Pe:Phalaenopsis equestris；Os:Oryza sativa。

图3为本发明实施例2中，SEP1基因家族在墨兰不同发育阶段的组织表达模式分析。 FD1：花分生组织时期，FD2：花器官原基初期，FD3：花器官原基末期，FD4：花蕾期， FD5：开花期。

图4为本发明实施例2中，SEP1基因家族在墨兰不同花器官中表达模式分析。

图5为本发明实施例3中，转基因拟南芥表型分析。WT表示野生型；35S:CsSEP1表示转基因拟南芥植株。

图6为本发明实施例3中，转基因拟南芥抽薹时间比较分析。WT表示野生型；line2、line3、line9分别表示三个独立的T2代转基因植物株系。

图7为本发明实施例3中，转基因拟南芥开花相关基因表达分析。CK表示野生型对照植株，line2、line3、line9分别表示三个独立的T2代转基因植物株系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1 CsSEP1基因的克隆以及序列分析

1、RNA的提取

取墨兰栽培品种‘白墨’花器官组织2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总 RNA，并反转录成cDNA(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesisKit)。

2、目的基因CsSEP1的获得

以CsSEP1-F1：5’-TTTATGGGGAGGGGGAGAG-3’(SEQ ID NO:3)和CsSEP1-R1：5’-GCCTCACATCCAACCTGAAA-3’(SEQ ID NO:4)为引物，以上步骤1所得cDNA为模板，利用Ex-Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.)进行PCR，按照下列条件：94℃4min，然后 34cycles(94℃40s、59.5℃40s、72℃1.5min、72℃10min)。从琼脂糖凝胶中回收PCR 产物，然后连接pMD19-T载体(TaKaRa Biotechnology Co.)并送华大基因研究院进行测序。测序结果分析发现扩增片段含有目的基因CsSEP1的完整CDs序列，由738个碱基组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为墨兰花器官发育调控基因(CsSEP1基因)，其编码的蛋白的氨基酸序列由245个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示，命名为墨兰花器官发育调控蛋白(CsSEP1蛋白)。获得的含有CsSEP1-pMD19-T的大肠杆菌目前保存于广东省农业科学院环境园艺研究所。

所述的CsSEP1基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示： ATGGGGAGGGGGAGAGTGGAGTTGAGGAGGATTGAGAACAAGATAAACAGGCAAGT GACTTTTGCGAAGAGGAGGAATGGGTTGTTGAAGAAGGCTTATGAGCTATCGGTGCTC TGCGATGCGGAGGTTGCGCTGATCGTCTTCTCCAACCGCGGCAGACTATTTGAGTTCT GCAGCAGCAGTAGCATGGCAACAACCCTTGAGAGGTACCAAAAGTGCAGCTATAATG CATCTGACTCCATGGTTCCATCCAAGGATACACAGCACAGTTATCAGGAGTACTTAAAG CTGAAAGCAAAAGTGGAATATCTACAACTGTCTCAAAGGAATCTTCTAGGAGAGGACC TAGTTGAATTAAGCAGCAAGGAACTGGAGGAACTTGAGCTCCAATTAGAAATGTCTCT GAAACATATCAGGTCAACAAAGACTCAATTGATGCTCGATCAGCTCTGTGATCTCAAA AGAAAGGAGCAAATCTTGCATGAAGCTAACAGAGCTTTAAAAAGAAAGTTGCAGGAA GATGGACCAGAGATTCCCCTGGAGCTGACCTGGCCTGGTGGAGGCGCTAATGGGTCAT GTGAACGTCACCAGCCTCAACCAGATGAATTATTCTTTCAGCCCCTGCCTTGTGACCCT TCTTTGCAAATTGGGTATAGTCCAATCTATATAGATCAACAGTTGAACACAGGATCAAC ATCCGCACATAATATTAATGGCTTCTTTTCAGGTTGGATGTGA。

所述的CsSEP1基因的编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：MGRGRVELRRIENKINRQVTFAKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSNRGRLF

EFCSSSSMATTLERYQKCSYNASDSMVPSKDTQHSYQEYLKLKAKVEYLQLSQRNL LGEDLVELSSKELEELELQLEMSLKHIRSTKTQLMLDQLCDLKRKEQILHEANRALKRKL QEDGPEIPLELTWPGGGANGSCERHQPQPDELFFQPLPCDPSLQIGYSPIYIDQQLNTGSTS AHNINGFFSGWM。

3、CsSEP1基因序列分析

将墨兰CsSEP1基因在NCBI中进行同源序列搜索，用软件MEGA进行同源序列得编码氨基酸比对并构建进化树。结果显示，CsSEP1在不同物种中得保守性较高，均具有 MADS-box基因保守的MADS结构域和K结构域。其中与蕙兰MADS1(KC148540)，春兰MADS-box(MF46208)，春兰SEP2(KX347447)有99％同源性，与AP1/FUL基因 KX347442有98.9％同源性，与石斛兰中DcMADS2(XM_020822814)、蝴蝶兰SEP2(KF673858) 有88％同源性，与蝴蝶兰CMB1-ike MADS-box基因有87％同源性，与花生中SEP1基因 XM_025799117，118等有81％的同源性(图1)。

进一步通过墨兰全基因组测序数据分析，在基因组水平获得4个SEP基因，同时也在其它的国兰种类包括建兰、春兰、寒兰等中通过转录组测序和基因克隆同样获得4个SEP基因。与其他已进行基因组测序的兰科植物相比，发现拟兰中有3个、蝴蝶兰和石斛兰均有5个SEP基因(图2)。序列分析发现不同旁系同源基因之间存在序列差异，尤其在C末端

实施例2 CsSEP1在兰花中的表达模式

1、RNA的提取

取墨兰栽培品种‘白墨’不同花器官发育阶段以及开花时期的萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱四轮花器官等不同部位的植物组织各2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总 RNA，取其中2μL采用反转录试剂盒Thermo Scientific RevertAid First StrandcDNASynthesis Kit反转录成cDNA。

2、定量PCR

利用引物CsSEP1QRT-F：5’-TGATCGTCTTCTCCAACCGC-3’(SEQ ID NO:5)和CsSEP1QRT-R：5’-CCTCCAGTTCCTTGCTGCTTA-3’(SEQ ID NO:6)，对兰花不同组织中 CsSEP1基因表达量进行实时定量PCR检测。采用Actin QRT-F：5’-ATGTCGCCATCCAAG CTGTT-3’(SEQID NO:7)和Actin QRT-R：5’-CACGTCCAGCAAGGTCAAGA-3’(SEQ ID NO:8)作为引物，扩增Actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(VazymeBiotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。

3、表达分析

用icycler realtime detection system software(version 7.0)对PCR结果进行分析。将国兰花发育过程从茎尖分生组织转变为花分生组织开始到完全开花分为花分生组织时期、花器官原基初期、花器官原基末期、花蕾期和开花期5个阶段，通过实时荧光定量PCR检测 CsSEP1基因在花芽不同发育阶段的表达量，发现其在花芽开始发育到花朵开放之前的4个阶段中表达量差异不显著，维持在较低水平，而在盛开的花中，表达量有显著提升，增加约5.5倍(图3)。进一步对开花期的墨兰萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱四轮花器官进行表达量检测，发现CsSEP1在外轮萼片和花瓣中的表达量较高，在内轮唇瓣和合蕊柱中表达量降低(图4)。

实施例3拟南芥中CsSEP1基因的功能分析

1、转化拟南芥高表达载体构建

利用引物CsSEP1-F1：5’-TTTATGGGGAGGGGGAGAG-3’(SEQ ID NO:3)和CsSEP1-R1：5’-GCCTCACATCCAACCTGAAA-3’(SEQ ID NO:4)扩增出墨兰CsSEP1基因的CDs序列(即CsSEP1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，并克隆至 pMD19-Tvector(Takara)，送华大基因测序。测序无误之后，使用EcoRI和SacI双酶切 (Thermo Fisher Scientific)，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的 pBI121载体上命名为pBI-SEP1。

2、转化拟南芥植物

2.1农杆菌GV3101的转化

1)将-80℃保存的感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约1μg质粒(pBI-SEP1)，轻柔混匀，冰上放置30min。

2)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次。加入1mL LB于28℃恒温振荡培养4～6h，200rpm。

3)菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min。弃上清，用100μL的LB培养液重悬农杆菌沉淀。

4)把所有混合物涂板到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素的LB板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，由此得到转化有pBI-SEP1的农杆菌。

2.2花序侵染法转化拟南芥。

用OD＝0.3～0.5的转化有pBI-SEP1的农杆菌液侵泡拟南芥花序2～3s后取出，避光密封 16小时后，移至生长室中继续生长。大约3～4周后，收集种子贮藏于4℃，黑暗条件。

2.3拟南芥转化子筛选

1)配制质量分数0.1％的氯化汞溶液。

2)将收集的种子放到1.5mL的Eppendorf管中，加1mL的体积分数75％的酒精摇匀，在Blood Tube Rotator上旋转5min。用质量分数0.1％的氯化汞消毒5分钟。

3)离心，6000rpm，2min。弃上清液，加入1mL的灭菌水，混匀，在Blood TubeRotator 上旋转2min。重复3次。

4)去上清液，用1mL的无菌水悬浮种子，平铺于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基表面。封板，于4℃黑暗春化3天后移入组织培养室(16h L/8h D)光照，23℃条件。

5)待苗长出绿色子叶后观察统计绿色子叶幼苗数目。并去除粘附在根上的培养基，移至基质中培养。

6)经60天左右的生活周期，得到转基因拟南芥第一代种子。收获T二代纯合种子(转基因植株)用于后续试验。

3、转基因拟南芥CsSEP1表达量分析

为了确定CsSEP1基因在拟南芥中的生物学功能，以拟南芥野生型和上步骤2所得转化子(T二代纯合种子生长后的转基因植株)cDNA为模板，采用引物CsSEP1QRT-F：5’-TGATCGTCTTCTCCAACCGC-3’(SEQ ID NO:5)和CsSEP1QRT-R：5’-CCTCCAGTTCCTTGC TGCTTA-3’(SEQ ID NO:6)检测转基因拟南芥中CsSEP1基因的表达量。按照下列程序： 95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQReal-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照Hiscript ⅡQRTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。结果发现在获得的转基因植株中CsSEP1的表达量均提高，选取其中三个株系用于后续表型分析。

4、转基因拟南芥表型分析

收获的T2代纯合转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50μg/mL卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗培养2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下培养。对转基因植株进行表型分析，发现SEP1高表达后开花期显著提前。在同等生长条件下，抽薹时间较野生型植株提前13-20天，器官形态发育正常，与野生型相比无明显改变，表明SEP1主要影响开花时间，对花器官形态发育无影响(图5，6)。

5、SEP1对开花基因的表达调控

为了确定CsSEP1基因在植物开花调控途径中的作用，以上述拟南芥野生型和转基因植株为材料，选取生长4周的植物叶片，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，取其中2μL采用反转录试剂盒Thermo Scientific RevertAid First StrandcDNASynthesis Kit 反转录成cDNA。检测转基因拟南芥中开花通路FT,SOC1,LFY1基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。所用引物分别为AtFTQRT-F/R(AtFTQRT-F：5’-TGGAGACGTTCTTGATCCGTT -3’(SEQ ID NO:9)和AtFTQRT-R：5’-TGAGGGTTGCTAGGACTTGG-3’(SEQ ID NO:10))， AtSOC1QRT-F/R(AtSOC1QRT-F：5’-TCGCCAGCTCCAATATGCAA-3’(SEQ IDNO:11) 和AtSOC1QRT-R：5’-TCTGTTGCAGCTCCTCGATT-3’(SEQ ID NO:12))，AtLFYQRT-F/R(AtLFYQRT-F：5’-AGACGCCGTCATTTGCTACT-3’(SEQ ID NO:13)和AtLFYQRT-R：5’-CTGCGTCCCAGTAACCACTT-3’(SEQ ID NO:14))，结果发现在转基因株系中，开花正调控因子FT,SOC1,LFY1的表达量均显著提高，进一步验证SEP1基因对开花的促进作用(图7)。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种国兰开花调控基因，其特征在于，所述的国兰开花调控基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.一种国兰开花调控蛋白，其特征在于，所述的国兰开花调控蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的国兰开花调控蛋白，其特征在于，所述国兰开花调控蛋白是由权利要求1所述的国兰开花调控基因编码。

4.一种包含权利要求1所述的国兰开花调控基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌或转基因材料。

5.权利要求1所述的国兰开花调控基因在植物开花性状改良中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前的改良。

7.权利要求2或3所述的国兰开花调控蛋白在植物开花性状改良中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前的改良。

9.一种促进植物提前开花的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建过表达权利要求1所述的国兰开花调控基因的重组表达载体，将重组表达载体转化到植物中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，是将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染植物。

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