CN115927390B - 一种墨兰花器官发育基因CsPI1及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种墨兰花器官发育基因CsPI1及其编码蛋白与应用。本发明从墨兰中克隆得到了基因CsPI1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第93位到725位碱基所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的基因CsPI1在拟南芥中过量表达，在长日照下抑制营养生长，促进植物开花，使花期提前；能改变花器官的形态，使花蕾变短圆、表皮无毛或少毛；能改变植物萼片形态，使萼片先端圆润，萼片花瓣状；改变植物花瓣形态，使花瓣先端圆润，呈绽放型；改变角果的形态，使角果由细长型变成短圆柱型。因此，本发明提供的墨兰基因CsPI1在调控植物营养生长、生殖生长和花器官发育方面具有重要的理论及应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种墨兰花器官发育基因CsPI1及其编码蛋白和应用。
背景技术
墨兰是兰科兰属植物，其叶宽厚浓绿，花型千态万状，花香沁人心脾，花期恰逢中国传统节日春节，又称“报岁兰”，深受消费者青睐，是产业化生产规模最大的国兰。作为中国传统名花之一，墨兰的花型是决定经济价值的重要品质之一。在自然条件下，墨兰的花形态演化出丰富的多样性，每种花型会在演化过程中体现其典型形状特征，根据中国兰品种花型演化规律，墨兰花型有典型的单瓣类，即花部结构数7枚，譬如竹叶型、水仙型、梅型、蕊蝶型、百合型，多瓣类指花部数多于7枚者，以簇蕊多舌型、牡丹型为主(邓银霞,2008)。
兰花由七个花器官构成独特的结构：外轮三枚花萼，内轮两枚花瓣和一枚特化唇瓣，一个雄蕊和雌蕊合生的合蕊柱。兰科作为被子植物最大的科之一(CHRISTENHUSZ andBYNG,2016)和最为进化的类群之一(田敏et al.,2011)，其高度特化的花结构为人们研究兰科植物乃至整个被子植物的花器官发育及花形态建成提供了极好的材料。MADS-box是一类古老的基因家族(M and F,2001；CHRISTENHUSZ and BYNG,2016)，在兰科植物花器官发育中发挥重要的调控作用。研究表明，在经典花器官发育模型中，B类MADS-box基因的功能主要是调控花瓣和雄蕊的发育(S and M,1991)，随后发现B类基因功能向外轮延伸而使萼片转化为花瓣状器官(Akira et al.,2003)。近年来，有学者提出“兰花密码”模型，认为B类MADS-box基因分别以不同组合的差异表达决定花器官的发育。
花型是评价墨兰价值高低的一个重要指标，而萼片的形态直接决定墨兰花型，不同花型的墨兰品种观赏价值和价格相差甚远。近年来在市场上广泛流行的各种独特奇异花型备受欢迎，但目前优良品种仍是在自然变异下选育。如何利用分子生物技术深入研究花器官形态变异机制，在兰花的种质改良和品种优化的产业化发展上起到重要应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种在墨兰中表达的、可用于调控植物开花时间和花器官形态的基因CsPI1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第93位到725位碱基所示。
本发明的第二个目的是提供上述基因CsPI1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种含有基因CsPI1的重组植物表达载体。
所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的载体，如pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或GatewayTM系列载体。
本发明的第四个目的是提供CsPI1基因、及其编码的蛋白质和含有CsPI1基因的重组植物表达载体在抑制营养生长，促进生殖生殖，缩短开花时间，改变花器官形态的应用。
所述的调控植物花期，是通过提高所述基因CsPI1的表达，抑制营养生长，促进生殖生长，促进植物开花，缩短开花时间。
所述的改良植物花器官形态，是通过提高所述基因CsPI1的表达，改变植物萼片形态，使萼片先端圆润，向花瓣转化；改变植物花瓣形态，使花瓣先端圆润，呈绽放型；改变花蕾的形态，使花蕾更短圆且无毛；改变角果的形态，使角果由细长型变成短圆柱型。
本发明的第五个目的是提供一种提前植物花期的方法，其特征在于，将CsPI1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的基因CsPI1在植物中过表达。
本发明的第六个目的是提供一种改良植物花器官形态的方法，其特征在于，将CsPI1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的基因CsPI1在植物中过表达。
优选地，所述CsPI1基因是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中的，所述的植物为拟南芥。
本发明在墨兰中克隆得到花器官发育基因CsPI1，通过转基因功能鉴定证实在拟南芥中超量表达CsPI1基因，能抑制拟南芥的营养生长，促进生殖生殖，使花期提前；能改变花器官的形态，使花蕾变圆、表皮无毛或少毛；能改变植物萼片形态，使萼片先端圆润，萼片花瓣状；改变植物花瓣形态，使花瓣先端圆润，呈绽放型；改变角果的形态，使角果由细长型变成短圆柱型。因此，本发明提供的墨兰CsPI1基因调控植物营养生长、生殖生长和花器官发育方面具有非常重要的理论及应用价值。
附图说明
图1是通过Real-time PCR检测CsPI1基因在墨兰营养生长期各器官(根、假鳞茎、叶)和花芽分化初期、小排铃期、盛花期中各器官(根、茎、叶、花蕾)中的表达量，纵坐标代表相对表达量的高低。
图2是通过Real-time PCR检测CsPI1基因在墨兰花发育5个时期：分化初期、小排铃期、大排铃期、始花期和盛花期的花蕾中的表达量，纵坐标代表相对表达量的高低。
图3是通过Real-time PCR检测CsPI1基因在始花期各花器官(萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱)中的表达量，横坐标中Sepal代表萼片，Petal代表花瓣，Lip代表唇瓣，Column代表合蕊柱，纵坐标代表相对表达量的高低。
图4是表达载体pCAMBIA1301-35s-CsCOL4转化农杆菌的PCR鉴定图，其中M为Marker2000、1为筛选到的阳性克隆用基因特定引物鉴定、2为筛选的同一阳性克隆用基因特定引物和载体引物鉴定、3为筛选的同一阳性克隆用载体通用引物鉴定。
图5是转基因(CsPI1)拟南芥的PCR鉴定图，其中M为Marker 2000、1为野生型拟南芥、2-4为CsPI1转基因拟南芥株系。
图6是长日照下CsPI1转基因拟南芥和野生型拟南芥开花比较图，其中WT为野生型拟南芥、1-3为CsPI1转基因拟南芥株系。
图7是长日照下CsPI1转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片比较图，其中WT为野生型拟南芥、CsPI1-1、CsPI1-2、CsPI1-3为三个CsPI1转基因拟南芥株系。
图8是长日照下CsPI1转基因拟南芥和野生型拟南芥花器官形态比较图，其中WT为野生型拟南芥、CsPI1-OE为CsPI1超表达转基因拟南芥株系。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。
实施例1：墨兰CsPI1基因的克隆
以墨兰品种“企剑白墨”(Cymbidium sinense.‘Qi Jian Bai Mo’)为试验材料，植物材料在温室正常条件下生长(L/D，12h/12h；25-30℃)。
RNA提取：用Trizol reagent(购自Invitrogen公司)进行试验材料花蕾的总RNA提取，整个操作过程严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明。
逆转录：采用诺唯赞的反转录试剂盒逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行。
基因的克隆：以逆转录的墨兰花蕾cDNA第一链为模板，以CsPI1-F1：ATGGGACGTGGAAAGATAGAGATC和CsPI1-R1：CTTGTTTCCCTGCAAGTTGG为引物，进行常规PCR扩增，根据诺唯赞的高保真DNA聚合酶试剂(Phanta Max DNA Polymerase)产品说明书，对CsPI1全长进行克隆。加样体系参照酶的说明书，PCR反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共进行34个循环，然后72℃延伸5min。将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并进行目的条带回收，方法按照柱式PCR产物纯化试剂盒(SanPrep Column PCR Product Kit)产品说明书(生工生物工程股份有限公司)进行操作。将回收目的片段，连接于T载体上，方法参考擎科生物科技有限公司T载体试剂盒(pClone007Blunt Simple Vector Kit)产品说明书，构建带有目的片段的T载体连接产物。取5μl连接产物，转到大肠杆菌DH5α感受态细胞(唯地生物)中，加800ml LB，复苏1h，涂于含50mg/L卡那抗生素(Kan)的LB平板上，37℃过夜。挑取白色克隆，在LB+Kan(50mg/L)液体培养基中扩增培养，送交测序。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第93位到725位碱基，长633bp，将此开放阅读框命名为CsPI1基因，其编码211个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
实施例2：墨兰CsPI1基因表达模式分析
取墨兰营养生长期的根、茎和叶，取花芽分化初期、花序小排铃期和盛花期的根、茎、叶和花蕾，用Trizol reagent(Invitrogen)分别提取这些材料的总RNA，用DNase I(Takara)处理除去基因组DNA。测定OD260后定量取出2μg RNA，然后再使用诺唯赞的反转录试剂盒进行逆转录反应(方法参考说明书)。将cDNA稀释5倍，根据诺唯赞公司的荧光定量qPCR试剂盒(ChamQTM Universal SYBR qPCR Mix)产品说明书，使用荧光定量PCR仪(LightCycler480 II，Roche)进行qPCR检测，引物序列为CsPI1-F2：TTGCACCATCAGCAATTGGC和CsPI1-R2：TCATTGGCATCTGAGCTGCA，内参引物ACT-F：TTTATGAGGGTT ATGCGCTTCC，ACT-R：ATTTCCCGTTCCGCAGTAGTT，对CsPI1在墨兰花发育不同时期不同花器官中的表达量进行实时荧光定量PCR检测。
qPCR反应体系(20μl)入下：
反应程序如下：①95℃预变性30sec；②PCR反应40个循环：95℃5sec，56℃10sec，72℃2min；④95℃2sec，56℃15sec；⑤95℃continuous；⑥40℃30sec。
所得数据使用ABI 7500Real-time PCR system软件进行处理分析。结果显示在营养生长期中，CsPI1在假鳞茎的表达量最高，根和叶的表达量相对较低；进入生殖期后，CsPI1在根、茎、叶表达水平大幅度降低，相反，CsPI1在不同时期的花蕾中均显著高于营养器官，并在小排铃期达到峰值(图1)。进一步研究CsPI1在花芽初始分化期、小排铃期、大排铃期、始花期和盛花期花蕾中的表达水平，发现该基因从花芽开始发育至开花呈持续上升趋势，在始花期时表达量最高，而在盛花期其表达量急剧下降(图2)。分析了CsPI1在“企剑白墨”不同花器官中的表达特性，结果显示CsPI1在唇瓣中高水平表达，其次是合蕊柱，在花萼和花瓣中少量表达(图3)。可见，CsPI1在花器官发育中起重要调控作用。
实施例3：墨兰CsPI1基因在拟南芥中的超表达及转基因植株的表型鉴定
(1)目的基因CsPI1超表达载体的构建
以前面逆转录得到的cDNA为模板，使用诺唯赞的高保真DNA聚合酶试剂(PhantaMax DNA Polymerase)进行扩增，反应体系按产品说明书，扩增引物为：
CsPI1-F3：atttggagaggacagggtaccATGGGACGTGGAAAGATAGAGATC；
CsPI1-R3：caccatggtactagtgtcgacCTTGTTTCCCTGCAAGTTGG。
反应程序为95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，共进行34个循环，然后72℃延伸5min。
扩增产物经琼脂糖电泳，胶回收测序，确定得到CsPI1基因。用KpnI和SalI酶切表达载体pCAMBIA1301，再根据同源重组连接试剂盒(ClonExpress One Step Cloning Kit)产品说明书，将目的基因和线性化的载体重组连接，pCAMBIA1301重组反应体系(20μl)如下：
37℃反应30min，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α并鉴定阳性单克隆，构建获得含有目的基因CsPI1基因的表达载体pCAMBIA1301-35s-CsPI1。
(2)将重组质粒pCAMBIA1301-35s-CsPI1转化到农杆菌GV3101
取1μl重组质粒表达载体pCAMBIA1301-35s-CsPI1与农杆菌GV3101感受态细胞混匀，冰上放置5min。然后液氮速冻5min后，迅速转到37℃放置5min。加700μl无抗生素的LB培养基，在28℃中，180rpm转速中培养3h。室温6000rpm离心1min，吸走多于上清液，留下100μl上清进行重悬，用涂布器均匀涂布在含有Kan(50mg/L)的LB固体培养基平板上，将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物使用了3对引物鉴定，如图4所示，1为目的基因引物，CsPI1-F1：ATGGGACGTGGAAAGATAGAGATC和CsPI1-R1：CTTGTTTCCCTGCA AGTTGG，扩增的总长度633bp；2为载体和目的基因上的嵌合引物，CsPI1-F2：atttggagag gacagggtaccATGGGACGTGGAAAGATAGAGATC和M13F：ACTGGCCGTCGTTTTAC，扩增总长度1332bp；3为载体上的通用引物M13F：ACTGGCCGTCGTTTTAC和M13R：CAGG AAACAGCTATGAC，扩增的总长度2201bp。
由此可以确定表达载体pCAMBIA1301-35s-CsPI1转入了1的农杆菌GV3101中。选取阳性克隆进行后续的侵染实验。
(3)利用花序侵染法转化拟南芥
挑取一个阳性克隆，接种于LB+Kan(卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的液体培养基中，28℃200rpm振荡培养24-36h，使OD600＝0.8左右。
将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，15min离心收集菌种，再用同等体积的渗透培养基(1/2MS+0.5g/L MES+5％ Sucrose，pH5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达到0.02％(200μl/L)。所述的MS培养基是本领域常用培养基，其配方参考(Murashige T and Skoog F,1962)。
取刚开花的拟南芥植株(花苞)于此溶液中浸泡1min。斜置晾干多余的菌液。
将浸染菌液的拟南芥花序盖膜保湿，黑暗培养8小时左右，再揭膜置于光照下正常管理至成熟收获种子。
(4)转基因植株的分子鉴定
收集当代转基因植株种子(T0代)，灭菌(10％NaClO 10min，灭菌水漂洗6次)后播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS固体培养基上筛选。将生长10天左右的绿色抗性植株转栽到盆钵里，基质为泥炭土与蛭石比为3:1(体积比)。单株收集T1代种子。将该种子种植于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上，统计分离比，选取符合3存活:1死亡分离比的转基因株系植株移栽至钵里进行栽培。收集T2代种子，将该种子种植于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上，种子在培养基上全部为绿苗，则T2代种子为纯合系。
用PCR检测单***株系中目的基因的表达。引物序列如下：CsPI1-F1：ATGGGACGTGGAAAGATAGAGATC，CsPI1-R1：CTTGTTTCCCTGCAAGTTGG。
鉴定结果如图5所示，其中M为Marker 2000、1为野生型拟南芥对照、2-4为CsPI1转基因拟南芥株系。结果表明，pCAMBIA1301-35s-CsPI1重组质粒已经***到拟南芥基因组中，由此而获得转入CsPI1超表达的转基因拟南芥
(5)转基因植株进行表型鉴定
将转基因拟南芥T2代植株和野生型拟南芥同等条件下进行培养，在长日照(16小时的光照/8小时的黑暗)下，超表达CsPI1的拟南芥植株与野生型植株表型有明显差异，如图6所示，转基因35S::CsPI1拟南芥株系在长日照条件下表现为早花，比对照提前约6d开花，表明超表达CsPI1会促进拟南芥开花。同时发现转基因35S::CsPI1拟南芥的营养生长受到抑制，转基因35S::CsPI1拟南芥莲座叶较野生型的叶片小且少(图7)。转基因35S::CsPI1拟南芥的花器官的形态与野生型相比发生了明显变化，野生型的拟南芥花蕾长椭圆形，有少量单毛；萼片是绿色，长圆卵形，顶端钝、基部成囊状紧密包裹花瓣；野生型拟南芥的花瓣长圆条形，先端钝圆，基部线形；角果呈细长状。而转基因35S::CsPI1拟南芥花蕾形状偏圆球状，表皮毛较野生型的少且不明显的；萼片变成白绿色拉长的花瓣状萼片，顶端圆润，基部呈绽放型，无包裹花瓣；花瓣先端圆润，基部呈绽放型；角果呈圆柱状(图8)。
由上述结果分析表明，本发明的CsPI1基因是一个花器官发育基因，在长日照下在拟南芥中过量表达该基因抑制了营养生长，促进了生殖生长，使植物提前开花；过量表达该基因还改变了花蕾、萼片、花瓣、角果的形态，从而影响植株的花器官的发育。
SEQ ID NO.1(CsPI1核苷酸序列)
CCCTTCTTCGCTGTGCTCCTTTTGCGTCTTTGCGCTTCTGTTCTTGAGATCTATTGCGGTC
TTTTTTTCATCCTGCTCGGTTTTGAGTGGAGATGGGACGTGGAAAGATAGAGATCAAAC
GGATCGAGAACTCAACAAACCGGCAAGTAACCTTCTCGAAGAGACGGAATGGAATCAT
GAAGAAGGCGAAGGAGATCAGCGTGCTCTGCGACGCCCAGGTCTCGCTTGTTATCTTTT
CCAGCCTTGGAAAGATGTTTGAGTATTGTAGCCCCTCCACCACGTTGTCCAAGATACTGG
AGAAATACCAGCAAAACTCGGGCAAGAAACTCTGGGACGCAAAACACGAGAACTTGA
GCGCGGAGATCGATCGGATCAAGAAGGAAAATGATAACATGCAGATCGAGCTCAGGCAT
TTGAAAGGGGAAGATCTGAACTCTCTTAACCCAAAAGAGCTTATCCCGATTGAGGAAAC
GCTCCAGAATGGTCTTACTAGTGTTCGGAATAAACAGATGGACTTCTTGAAGATGCTAAA
AAAGAATGAAAGAATGCTGGAAGAGGAAAATAAAAGGCTCACATACCTATTGCACCATC
AGCAATTGGCAATGGAAGGGAGTATGAGAGAACTGGACATCGGGTATCACCAGAAAGAT
AGGGAATATGCAGCTCAGATGCCAATGACCTTTCGTGTTCAACCCATTCAGCCCAACTTG
CAGGGAAACAAGTAACACTGTTAACGCCTTACTACTTTCCTCTTAGTTATATGAATTATAA
TATTAGCTTTTTAGCAGTTTCATATGAATATGAAAAACTTGTGCTGATGATTATGACATATG
TGCGTGCTACTGATATTGGTATTGTAACTGCTTGTTGATTGACAATACAATGTATTTTGGC
CTACTGTCTTTGGCTTGAGCACTGTTCAATTAGTAGTGGATATATACTTGTGCAGTATTTT
TGTTAAGGGTTTTCTGCTAATTCATCTTGASEQ ID NO.2(CsPI1氨基酸序列)
MGRGKIEIKRIENSTNRQVTFSKRRNGIMKKAKEISVLCDAQVSLVIFSSLGKMFEYCSPSTT
LSKILEKYQQNSGKKLWDAKHENLSAEIDRIKKENDNMQIELRHLKGEDLNSLNPKELIPIE
ETLQNGLTSVRNKQMDFLKMLKKNERMLEEENKRLTYLLHHQQLAMEGSMRELDIGYHQ
KDREYAAQMPMTFRVQPIQPNLQGNK。
Claims (4)
1.基因CsPI1或其编码的蛋白质在调控植物花期和改良植物花器官形态中的应用，所述的基因CsPI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第93位到725位碱基所示，所述的调控植物花期，是通过提高所述基因CsPI1的表达，抑制营养生长，促进生殖生长，促进植物开花，缩短开花时间；
所述的改良植物花器官形态，是通过提高所述基因CsPI1的表达，改变植物萼片形态，使萼片先端圆润，向花瓣转化；改变植物花瓣形态，使花瓣先端圆润，呈绽放型；改变花蕾的形态，使花蕾更短圆且无毛；改变角果的形态，使角果由细长型变成短圆柱型。
2.一种提前植物花期的方法，其特征在于，将CsPI1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的CsPI1在植物中过表达，所述的基因CsPI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第93位到725位碱基所示。
3.一种改良植物花器官形态的方法，其特征在于，将CsPI1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的CsPI1在植物中过表达，所述的基因CsPI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第93位到725位碱基所示。
4.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于，所述CsPI1基因是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中的，所述的植物为拟南芥。
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