CN115975848A

CN115975848A - 一种热带芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115975848A
Application number: CN202210964216.4A
Authority: CN
Inventors: 吴妍; 黄德龙; 张志鹏; 邓祖科; 彭启超; 李俊
Original assignee: Beijing Century Amms Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Beijing Century Amms Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2022-07-30
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本申请涉及农业微生物的技术领域，具体公开了一种热带芽孢杆菌及其应用，所述热带芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24737，保藏日期为2022年4月21日。以及上述热带芽孢杆菌的培养方法、利用其制备的发酵液、促生菌悬液和促生微生物菌剂。上述热带芽孢杆菌具有合成IAA、铁载体和蛋白酶的能力，还具有解磷解钾的作用，能够促进农作物的生长以及结实，本申请发现了热带芽孢杆菌的新用途。上述热带芽孢杆菌还具有耐酸碱、耐盐以及耐高温的能力，为其在农业上的应用创造了条件。

Description

一种热带芽孢杆菌及其应用

技术领域

本申请涉及农业微生物的技术领域，更具体地说，涉及一种热带芽孢杆菌及其应用。

背景技术

热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，具有良好的稳定性，对温度、盐离子浓度、酸碱性、干燥、辐射、紫外线等均具有良好的抗逆作用，遇到极端环境时可以通过形成芽孢对不利条件进行抵抗。

芽孢杆菌属的菌株具有环境适应性强和储存周期长的特点，是目前应用最广泛的一类根际菌。另外，芽孢杆菌属的菌株还可以分泌多种酶类等具有生理活性的物质，因此具有重要的应用价值。已有研究表明，热带芽孢杆菌在生物降解方面具有潜力，能够降解吡啶和喹啉这两种难降解的有机化合物，也可以对城市垃圾中的木质素进行降解。也有研究表明热带芽孢杆菌具有修复底泥污染的作用，其合成的铁载体也使得菌株对重金属具有一定的耐受和络合能力，能提高不溶性重金属的溶解性，促进重金属胁迫下植物的生长，为丰富铁载体和微生物-植物联合修复重金属污染土壤的科学研究与应用实践提供了借鉴与参考。

但在现有研究中尚未发现关于热带芽孢杆菌在促进植物生长和溶解难溶性磷、钾等方面的报道，特别是在高盐、高温条件下促进植物生长、提高农作物抗逆性的报道。

发明内容

为了提供热带芽孢杆菌的新功能、丰富其应用场景，本申请提供一种热带芽孢杆菌及其应用。上述热带芽孢杆菌可以代谢合成吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、铁载体和蛋白酶等多种促生物质，还具有解磷解钾的功能，且对酸碱、盐浓度、温度的耐受度高，能稳定地在土壤中存活繁殖进而显著促进农作物的生长。

第一方面，本申请提供一种热带芽孢杆菌，采用如下技术方案：

一种热带芽孢杆菌，所述热带芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24737，保藏日期为2022年4月21日。

本申请中，上述热带芽孢杆菌命名为热带芽孢杆菌Bacillus tropicus S03。

本申请中，上述热带芽孢杆菌从海南省乐东黎族自治县的根际土壤中分离筛选得到，能够在4～11的pH值范围、50℃的高温条件以及15％的NaCl高盐溶液中很好地生长。该菌可以在多种农作物的生长环境中稳定地存活并繁殖，在农业上具有重要的应用意义。

本申请中，上述热带芽孢杆菌还具有良好的促生作用，其促生机理主要包括以下几个方面：(1)热带芽孢杆菌能够合成植物生长素IAA，促进植物细胞***，调节植物生长。(2)热带芽孢杆菌能够分泌铁载体，与土壤中难溶的铁形成铁-铁载体络合物，进而转化植物体内的营养元素，被植物所利用，促进植物对营养物质的吸收。(3)热带芽孢杆菌还可以分泌蛋白酶等活性物质，可以通过降解病原菌细胞膜以控制病害，并对肥料中的蛋白质进行分解，促进营养物质的吸收。(4)热带芽孢杆菌还具有解磷解钾的作用，可以将不易被吸收的磷元素和钾元素转化为容易被吸收的形式，提高农作物对磷、钾的吸收效率。

第二方面，本申请提供上述热带芽孢杆菌的培养方法，采用如下技术方案：

一种热带芽孢杆菌的培养方法，所述热带芽孢杆菌的培养方法包括：

将所述热带芽孢杆菌接种在培养基中，在25～50℃下培养18～50h。

本申请中，上述热带芽孢杆菌的培养基成分简单，培养方法技术成熟，培养成本低，为其在农业上的应用创造了条件。

在一些具体的实施方案中，所述培养的温度为25～28℃、25～30℃、25～37℃、25～40℃、25～45℃、28～30℃、28～37℃、28～40℃、28～45℃、28～50℃、30～37℃、30～40℃、30～45℃、30～50℃、37～40℃、37～45℃、37～50℃、40～45℃、40～50℃或45～50℃等。

在一个具体的实施方案中，所述培养的温度为25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、45℃或50℃等。

在一些具体的实施方案中，所述培养的时间为18～20h、18～22h、18～24h、18～28h、18～30h、18～35h、18～40h、18～48h、20～22h、20～24h、20～28h、20～30h、20～35h、20～40h、20～48h、20～50h、22～24h、22～28h、22～30h、22～35h、22～40h、22～48h、22～50h、24～28h、24～30h、24～35h、24～40h、24～48h、24～50h、28～30h、28～35h、28～40h、28～48h、28～50h、30～35h、30～40h、30～48h、30～50h、35～40h、35～48h、35～50h、40～48h、40～50h或48～50h等。

在一个具体的实施方案中，所述培养的时间为18h、20h、22h、24h、28h、30h、35h、40h、48h或50h等。

第三方面，本申请提供一种发酵液，采用如下技术方案：

一种发酵液，所述发酵液利用第一方面所述的热带芽孢杆菌发酵得到。

第四方面，本申请提供一种促生菌悬液，采用如下技术方案：

一种促生菌悬液，所述促生菌悬液包括第一方面所述的热带芽孢杆菌和/或第三方面所述的发酵液。

优选地，所述促生菌悬液中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×10⁸cfu/mL。

在一些具体的实施方案中，所述促生菌悬液中热带芽孢杆菌的有效活菌数为(1～2)×10⁸cfu/mL、(1～3)×10⁸cfu/mL、(1～4)×10⁸cfu/mL、(1～5)×10⁸cfu/mL、(1～6)×10⁸cfu/mL、(1～7)×10⁸cfu/mL、(1～8)×10⁸cfu/mL、(1～9)×10⁸cfu/mL、(2～3)×10⁸cfu/mL、(2～4)×10⁸cfu/mL、(2～5)×10⁸cfu/mL、(2～6)×10⁸cfu/mL、(2～7)×10⁸cfu/mL、(2～8)×10⁸cfu/mL、(2～9)×10⁸cfu/mL、(3～4)×10⁸cfu/mL、(3～5)×10⁸cfu/mL、(3～6)×10⁸cfu/mL、(3～7)×10⁸cfu/mL、(3～8)×10⁸cfu/mL、(3～9)×10⁸cfu/mL、(4～5)×10⁸cfu/mL、(4～6)×10⁸cfu/mL、(4～7)×10⁸cfu/mL、(4～8)×10⁸cfu/mL、(4～9)×10⁸cfu/mL、(5～6)×10⁸cfu/mL、(5～7)×10⁸cfu/mL、(5～8)×10⁸cfu/mL、(5～9)×10⁸cfu/mL、(6～7)×10⁸cfu/mL、(6～8)×10⁸cfu/mL、(6～9)×10⁸cfu/mL、(7～8)×10⁸cfu/mL、(7～9)×10⁸cfu/mL或(8～9)×10⁸cfu/mL等。

在一个具体的实施方案中，所述促生菌悬液中热带芽孢杆菌的有效活菌数为1×10⁸cfu/mL、2×10⁸cfu/mL、3×10⁸cfu/mL、4×10⁸cfu/mL、5×10⁸cfu/mL、6×10⁸cfu/mL、7×10⁸cfu/mL、8×10⁸cfu/mL或9×10⁸cfu/mL等。

第五方面，本申请提供了第一方面所述的热带芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的促生菌悬液在制备促生微生物菌剂中的应用。

第六方面，本申请提供一种促生微生物菌剂，采用如下技术方案：

一种促生微生物菌剂，所述促生微生物菌剂包括第一方面所述的热带芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的促生菌悬液。

优选地，所述促生微生物菌剂中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/mL。

在一些具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂中热带芽孢杆菌的有效活菌数为5～5.5亿/mL、5～6亿/mL、5～6.5亿/mL、5～7亿/mL、5～7.5亿/mL、5～8亿/mL、5～8.5亿/mL、5～9亿/mL、5～9.5亿/mL、5～10亿/mL、5.5～6亿/mL、5.5～6.5亿/mL、5.5～7亿/mL、5.5～7.5亿/mL、5.5～8亿/mL、5.5～8.5亿/mL、5.5～9亿/mL、5.5～9.5亿/mL、5.5～10亿/mL、6～6.5亿/mL、6～7亿/mL、6～7.5亿/mL、6～8亿/mL、6～8.5亿/mL、6～9亿/mL、6～9.5亿/mL、6～10亿/mL、6.5～7亿/mL、6.5～7.5亿/mL、6.5～8亿/mL、6.5～8.5亿/mL、6.5～9亿/mL、6.5～9.5亿/mL、6.5～10亿/mL、7～7.5亿/mL、7～8亿/mL、7～8.5亿/mL、7～9亿/mL、7～9.5亿/mL、7～10亿/mL、7.5～8亿/mL、7.5～8.5亿/mL、7.5～9亿/mL、7.5～9.5亿/mL、7.5～10亿/mL、8～8.5亿/mL、8～9亿/mL、8～9.5亿/mL、8～10亿/mL、8.5～9亿/mL、8.5～9.5亿/mL、8.5～10亿/mL、9～9.5亿/mL、9～10亿/mL或9.5～10亿/mL等。

在一个具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂中热带芽孢杆菌的有效活菌数为5亿/mL、5.5亿/mL、6亿/mL、6.5亿/mL、7亿/mL、7.5亿/mL、8亿/mL、8.5亿/mL、9亿/mL、9.5亿/mL或10亿/mL等。

第七方面，本申请提供第一方面所述的热带芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的促生菌悬液或第六方面所述的促生微生物菌剂在制备微生物肥料中的应用。

本申请中，上述促生菌悬液和促生微生物菌剂既可单独使用，对农作物的生长产生促进作用，也可以与常规肥料混合使用，产生协同增益的效果。常规肥料中含有丰富的氮、磷以及钾元素，但缺少生物类的促生物质，且磷元素和钾元素的存在形式并不利于农作物的吸收。与促生微生物菌剂混合后，一方面，菌剂中的热带芽孢杆菌可以分泌IAA、铁载体以及蛋白酶等生物类促生物质，另一方面，热带芽孢杆菌可以将肥料中不易被吸收的磷、钾元素转化更容易被吸收的形式，提高了农作物的元素吸收效率，对农作物生长的促进作用十分显著。

第八方面，本申请提供第一方面所述的热带芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的促生菌悬液或第六方面所述的促生微生物菌剂在农作物培育中的应用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请中的热带芽孢杆菌的IAA合成量可达35.65mg/mL以上，可以促进农作物的生长，并且可以合成分泌铁载体和蛋白酶等多种促生物质，提高了农作物对营养物质的吸收能力，还能在一定程度上对病害进行防控；上述热带芽孢杆菌还具有解磷解钾的作用，提高了对磷、钾元素的利用效率，对农作物植株的生长以及产量的提升具有显著的促进作用。

2.本申请中的热带芽孢杆菌对酸碱、盐浓度、高温环境等耐受度较高，能够在4～11的pH值范围、50℃的高温条件以及15％的NaCl高盐溶液中生存并***，对不良环境的抵抗能力较强，减少了相关产品在运输的过程中因受到温度、天气等环境因素的影响而降低功能菌种活性的弊端，保证了产品的质量。此外，不同农作物生长环境的差异较大，强大的环境耐受能力也为其在不同的培养环境、不同农作物的培育中的应用提供了基础。

3.本申请中的热带芽孢杆菌可以单独使用，也可以与普通肥料联合使用，从而提高肥料的利用效率，协同增益，促进农作物的生长及结实。目前尚未有关于热带芽孢杆菌促进植物生长的相关报道，本申请丰富了热带芽孢杆菌的功能，填补了其在农业应用方面的空白，为后续的相关研究奠定了基础。

附图说明

图1为实施例1中菌株S03的IAA显色试验的结果图片。

图2为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的菌落形态图片。

图3为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的菌体形态图片(放大倍数＝1000倍)。

图4为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的***发育树的构建结果图片。

图5为实施例3中热带芽孢杆菌S03的铁载体合成能力的测定结果图片。

图6为实施例3中热带芽孢杆菌S03的蛋白酶合成能力的测定结果图片。

图7为实施例3中热带芽孢杆菌S03的解磷能力的测定结果图片。

图8为实施例3中热带芽孢杆菌S03的解钾能力的测定结果图片。

图9为实施例7中不同组别小油菜幼苗的培养结果图片。

图10为实施例8中不同组别番茄幼苗的培养结果图片。

具体实施方式

本申请提供一种热带芽孢杆菌，所述热带芽孢杆菌命名为Bacillus tropicusS03，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24737，保藏日期为2022年4月21日。

本申请还提供上述热带芽孢杆菌的培养方法，具体包括：

具体地，所述培养基包括LB培养基、King B培养基、牛肉膏蛋白胨培养基或发酵培养基。

具体地，所述LB培养基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl 10g/L。

具体地，所述King B培养基包括蛋白胨20.0g/L、磷酸钾1.5g/L和硫酸镁1.5g/L，pH值为7.2±0.2。

具体地，所述牛肉膏蛋白胨培养基包括牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0g/L和琼脂15g/L，pH为7.2～7.5。

具体地，所述发酵培养基包括葡萄糖12g/L、胰蛋白胨8g/L、酵母粉8g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.5g/L和碳酸钙2g/L。

本申请还提供一种发酵液，所述发酵液利用上述的热带芽孢杆菌发酵得到。

本申请还提供一种促生菌悬液，所述促生菌悬液包括上述的热带芽孢杆菌和/或发酵液。

具体地，所述促生菌悬液中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×10⁸cfu/mL。

本申请提供一种促生微生物菌剂，所述促生微生物菌剂包括上述的热带芽孢杆菌、发酵液或促生菌悬液。

具体地，所述促生微生物菌剂中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/mL。

以下结合实施例1～9以及附图1～10对本申请的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种具有IAA合成能力的菌株的分离方法。该具有IAA合成能力的菌株是从农作物根际土壤中分离得到的，分离步骤如下：

(1)菌株分离：

LB固体培养基的配置：

称取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g和琼脂15g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

称取10g收集的根际土壤，加入到装有90mL无菌水的锥形瓶中，200rpm震荡30min，静置2h。

取静置上清液，依照10^-2～10^-5的浓度梯度进行稀释。稀释后，每个浓度梯度吸取100μL溶液涂布在LB固体培养基表面，在28℃下培养24h。

待培养基表面长出单菌落后，根据菌落形态、颜色和大小进行选取，在固体培养基上进行纯化保存。

(2)初筛：

Salkowski显色液的配置：

取10mL 0.5mol/L的FeCl₃溶液，加入到500mL 35％高氯酸中，混合均匀，备用。

King B固体培养基的配置：

称取蛋白胨20.0g、磷酸钾1.5g、硫酸镁1.5g和琼脂15g，加水溶解，调节pH值为7.2±0.2，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将分离纯化后的菌株采用四区划线的方法接种于King B固体培养基的表面，28℃下培养24h，加入1mL左右的Salkowski显色液进行显色反应。

以滴加50μL IAA(50mg/L)的King B固体培养基作为阳性对照。上述固体培养基于室温、避光条件下放置30min后进行观察，颜色变红者表示能够合成IAA。

经过筛选，菌株S03的培养基颜色变红，表明可以合成IAA。菌株S03的IAA显色试验的结果图片如图1所示。

(3)复筛：

LB液体培养基的配置：

称取蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 10g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

将筛选菌株S03接种于LB液体培养基中，在28℃、200rpm条件下摇床培养24h后取出，4000rpm离心15min，取4mL上清液与等体积Salkowski显色剂混合，25℃避光反应30min，测定在OD₅₃₀nm处的数值，根据IAA标准曲线回归方程计算菌液中的IAA含量。

IAA标准曲线的制作方法如下：配制质量浓度分别为0、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL和120μg/mL的IAA标准溶液，并与Salkowski显色剂按照体积比为1:1混合，室温避光30min，分别测量在OD₅₃₀nm处的数值，以蒸馏水与Salkowski显色剂按照体积比为1:1的混合液进行相同的操作作为空白对照。

经测定，分离得到菌株S03发生了显色反应，说明其可以合成IAA，含量可达35.65μg/mL。

实施例2

本实施例提供上述具有IAA合成能力的菌株的鉴定过程。

对实施例1分离得到的具有IAA合成能力的菌株S03分别进行形态学鉴定、分子生物学鉴定、***发育鉴定和全基因组序列分析。

形态学鉴定

牛肉膏蛋白胨培养基的配置：

称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g和琼脂15g，加水溶解，调节pH为7.2～7.5，再加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将具有IAA合成能力的菌株S03采用四区划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基表面，30℃培养48h后观察菌落形态，并进行革兰氏染色观察其菌体形态。

具有IAA合成能力的菌株的菌落形态图如图2所示。通过48h培养后观察，由图2可以看出，菌株S03的菌落呈乳白色，菌落呈圆形，且菌落较大。

具有IAA合成能力的菌株的菌体形态图如图3所示。革兰氏染色后在显微镜下观察，由图3可以看出，菌株S03为革兰氏阳性菌，呈长杆状，可单个或成对出现。

分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序技术和菌落PCR技术对微生物的种类进行鉴定。

将分离筛选得到的S03菌株接种于LB固体培养基表面，培养24h后，挑取1个新鲜单菌落置于1.5mL离心管中，加入10μL S2裂解液(购自北京擎科生物技术有限公司)，震荡混匀，室温静置20min，随后稀释20倍，震荡混匀，12000rpm离心2min，取上清液作为模板，进行PCR扩增。

扩增引物如下：

27F(SEQ ID No.1)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

1492R(SEQ ID No.2)：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

扩增试剂：2×EasyTaq SuperMix(购自北京擎科生物技术有限公司)。

扩增程序如下：

94℃ 5min；

94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 90s；循环35次；

72℃ 7min，4℃保存。

菌落PCR的反应体系如表1所示。

表1菌落PCR的反应体系

试剂	使用量(μL)
		2×EasyTaq SuperMix	15
27F(10μM)	1.5
		1492R(10μM)	1.5
模板	5
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	7
总体积	30

琼脂糖凝胶的配方如表2所示。

表2琼脂糖凝胶的配方

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化胶块。将纯化后的产物进行Sanger测序，获得正反向测序结果，其16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。

***发育鉴定

利用DNAMAN软件对所得数据进行拼接，并在www.ezbiocloud.net数据库中进行16S rDNA序列的比对，通过Mega 5.0软件采用Neighbor-Joining法，Bootstrap置信值估算重复次数1000次，构建***发育进化树，确定菌株S03在***发育树中的位置，***发育树的构建结果如图4所示。根据图4，鉴定比对结果表明S03菌株为热带芽孢杆菌(Bacillustropicus)。

全基因组序列分析

将菌株S03接种于LB液体培养基中，在28℃、200rpm条件下摇床培养24h，4000rpm离心15min收集菌体，委托北京擎科生物技术有限公司完成全基因组测序。

将测序的结果上传至www.ezbiocloud.net与https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#，进行ANI值与dDDH值的计算，计算结果表明，ANI值为99.74，dDDH值为98.1，证明菌株S03为热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)。

将上述热带芽孢杆菌Bacillus tropicus S03于2022年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏编号为CGMCC No.24737。

实施例3

本实施例提供上述热带芽孢杆菌Bacillus tropicus S03的铁载体合成能力、蛋白酶合成能力、解磷能力和解钾能力的测定方法。

铁载体合成能力测定

0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配制方法：

称取磷酸二氢钠5.91g、磷酸氢二钠24.27g、氯化铵2.50g、磷酸二氢钾0.75g和氯化钠1.25g，加去离子水定容至1L。

含铁载体CAS的培养基的配制方法：

称取CAS(购自上海麦克林生化科技有限公司)60.5mg、十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA，购自北京索宝来科技有限公司)72.9mg、1mmol/L FeCl₃·6H₂O(10mmol/LHCl配制)10mL、0.1mol/L磷酸盐缓冲液50mL和琼脂9.0g，加去离子水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

铁载体合成能力的测定方法：

将活化后的热带芽孢杆菌S03接种于蓝色的含铁载体CAS的培养基中，28℃下培养48h。若细菌合成铁载体，螯合培养基中的铁(三价铁)，则菌落周围产生淡红色晕圈。

图5为热带芽孢杆菌S03的铁载体合成能力的测定结果图片。如图5所示，热带芽孢杆菌S03能够合成铁载体，其晕圈直径可达3.85cm，说明热带芽孢杆菌S03具有良好的铁载体合成能力，可以促进农作物对于铁元素的吸收与利用。

蛋白酶合成能力测定

蛋白酶检测培养基的配制方法：

称取胰蛋白胨5.00g、酵母提取物3.00g、葡萄糖1.00g和琼脂15.00g，加蒸馏水溶解，调节pH为7.0，再加蒸馏水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，将脱脂牛奶按体积比为10％的比例加入培养基中，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后的热带芽孢杆菌S03接种到蛋白酶检测培养基表面，28℃下培养48h，观察是否有溶解圈出现。

图6为热带芽孢杆菌S03的蛋白酶合成能力的测定结果图片。如图6所示，热带芽孢杆菌S03具有良好的蛋白溶解能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径可达3.3cm。

解磷能力测定

解磷培养基的配置方法：

称取葡萄糖10g、磷酸钙5g、硫酸铵0.1g、氯化钾0.2g、硫酸镁0.25g、七水氯化镁5g和琼脂15g，加蒸馏水溶解，调节pH为6.8～7.0后，加蒸馏水定容至1L，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后的热带芽孢杆菌S03接种到解磷培养基表面，28℃下培养48h，观察有无溶解圈出现。

图7为热带芽孢杆菌S03的解磷能力的测定结果图片。如图7所示，热带芽孢杆菌S03具有解磷能力，溶解有机磷的溶解圈直径可达1.9cm。

解钾能力测定

解钾培养基的配置方法：

称取蔗糖10g、酵母粉0.5g、七水合硫酸镁0.5g、硫酸铵1g、磷酸氢二钠2g、碳酸钙1g、钾长石粉1g和琼脂15g，加去离子水溶解，调节pH为7.0，再加去离子水定容至1L，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后热带芽孢杆菌S03接种到解钾培养基表面，28℃下培养48h，观察有无油滴状溶解圈的出现。

图8为热带芽孢杆菌S03的解钾能力的测定结果图片。如图8所示，热带芽孢杆菌S03具有解钾能力，油滴状溶解圈的直径可达1.3cm。

实施例4

本实施例提供上述热带芽孢杆菌Bacillus tropicus S03的酸碱耐受度、盐浓度耐受度和高温耐受度的测定方法。

酸碱耐受度测定

将活化后的热带芽孢杆菌S03分别接种到pH值依次为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的LB液体培养基中，180rpm、28℃下振荡培养24h，测定不同pH值的培养基的OD₆₀₀数值，结果如表3所示。

表3热带芽孢杆菌S03酸碱耐受度的测定结果

由表3可以看出，热带芽孢杆菌S03在4～11的pH值范围内的生长基本不受影响，表明其具有非常强的耐酸碱性，为其在不同土壤环境中的应用创造了条件。

盐浓度耐受度测定

将活化后的热带芽孢杆菌S03分别接种到NaCl浓度依次为5.0％、10.0％、12.5％、15.0％、17.5％和20.0％的LB液体培养基中，180rpm、37℃下振荡培养24h，测定不同盐浓度的培养基的OD₆₀₀数值，结果如表4所示。

表4热带芽孢杆菌S03盐浓度耐受度的测定结果

由表4可以看出，热带芽孢杆菌S03可以在5％～15％的NaCl浓度下生长正常，在17.5％的NaCl浓度下生长状态一般，在20％的NaCl浓度下无法进行***增殖，表明热带芽孢杆菌S03具有一定的耐盐性。

高温耐受度测定

将活化后的热带芽孢杆菌S03分别接种到25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的LB液体培养基中，180rpm、37℃下振荡培养24h，测定不同pH的培养基的OD₆₀₀数值，结果如表5所示。

表5热带芽孢杆菌S03高温耐受度的测定结果

由表5可以看出，热带芽孢杆菌S03在25～50℃下的生长基本不受影响，表明热带芽孢杆菌S03具有非常强的高温耐受性，为其在农业上的应用创造了条件。

实施例5

本实施例制备上述热带芽孢杆菌S03的菌悬液，制备方法如下：

(1)菌种活化：将保存的热带芽孢杆菌S03接种于LB固体培养基表面，在28℃下培养24h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基表面，在28℃下培养24h。

(2)菌悬液制备：刮取两环步骤(1)中活化后的热带芽孢杆菌S03，接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm下摇瓶培养30h，得到菌悬液。

实施例6

本实施例制备上述热带芽孢杆菌S03的液体菌剂，制备方法如下：

发酵培养基的配置：

称取玉米粉15g、花生粕5g、大豆蛋白胨5g、硫酸铵8g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.5g、FeCl₃ 0.05g和碳酸钙1g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

(2)一级种子液制备：刮取两环步骤(1)中活化后的热带芽孢杆菌S03，接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm下摇瓶培养24h，得到一级种子液。

(3)二级种子液制备：将一级种子液按照1％～8％(v:v)的比例接种于装有LB液体培养基的发酵罐中发酵培养，发酵条件为转速180rpm、温度28℃、通气量1:(0.8～1.2)、灌压0.04～0.06MPa，培养24h，得到二级种子液。

(4)发酵液培养：将二级种子液按照5％～10％(v:v)的比例接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养，发酵条件为转速150rpm～180rpm、温度28℃、通气量1:(0.8～1.2)、灌压0.04～0.06MPa，培养20～30h，得到热带芽孢杆菌S03的液体菌剂。

实施例7

本实施例验证实施例5制备的热带芽孢杆菌S03的菌悬液对小油菜幼苗的促生能力，步骤如下：

将双层滤纸放入培养皿中，然后将实施例5制备的热带芽孢杆菌S03的菌悬液均匀加入到滤纸上，菌悬液渗透双层滤纸为宜，最后加入15粒准备好的小油菜种子，培养7天。使用蒸馏水替代热带芽孢杆菌S03的菌悬液对小油菜菜籽进行相同的操作作为对照(CK)。

对小油菜幼苗的根鲜重、地上部分鲜重以及地上部分的高度进行测量，取平均值作为最终的测定结果。

测定结果如表6所示，不同组别小油菜幼苗的培养结果图片如图9所示。

表6热带芽孢杆菌S03的菌悬液对小油菜幼苗促生能力的测定结果

结合图9和表6中的数据，可以看出，使用热带芽孢杆菌S03的菌悬液浸种对小油菜幼苗的生长具有明显的促进作用，使用1×10⁸cfu/mL的热带芽孢杆菌S03的菌悬液浸种可使小油菜幼苗根鲜重提高38.71％，使地上部分鲜重提高26.51％，使幼苗地上部分高度提高32.32％。表明上述热带芽孢杆菌S03具有良好的促进农作物生长的效果。

实施例8

本实施例验证实施例6制备的热带芽孢杆菌S03的液体菌剂对番茄幼苗的促生能力，步骤如下：

采用内直径为15cm、高20cm的塑料盆栽专用盆，每盆装土2kg，将长势良好的番茄苗移栽至盆中，缓苗10天，幼苗恢复到健康长势后开展试验。

试验设置在北京世纪阿姆斯生物工程公司试验大棚，将番茄苗随机进行分组。试验设置2个处理组，每个处理组重复3次，进行番茄的促生效果验证，试验处理组分别为：

处理1：盆栽中添加20mL热带芽孢杆菌S03的液体菌剂(有效活菌数≥5.0亿/mL)；

处理2：盆栽中添加等量蒸馏水，作为对照。

20天后，测定番茄幼苗的株高与茎粗，测定结果如表7所示，不同组别番茄幼苗的培养结果图片如图10所示。

表7热带芽孢杆菌S03的液体菌剂对番茄幼苗促生能力的测定结果

处理组	株高(cm)	茎粗(mm)
			处理1	15.8	4.67
处理2	10.77	4.12

结合图10和表7中的数据，可以看出，在苗期，处理1的番茄株高和茎粗要明显优于处理2，施用热带芽孢杆菌S03的液体菌剂的处理1的番茄株高较处理2提升了46.70％，番茄茎粗较处理2提升了13.35％。上述结果表明使用热带芽孢杆菌S03的液体菌剂在促进番茄苗期的生长方面具有显著的优势，能很好地增加农作物的种植效益。

实施例9

本实施例比较本申请中的热带芽孢杆菌S03、贝莱斯芽孢杆菌DPT-03(CGMCCNo.20317)和地衣芽孢杆菌XW02(保藏编号为CCTCC NO:M 2020872)的IAA合成能力、铁载体合成能力、蛋白酶合成能力、解磷能力和解钾能力，具体步骤参见上文，结果如表8所示。

表8不同菌株的生理代谢特性的检测结果

由表8可以看出，热带芽孢杆菌S03在合成IAA、铁载体、蛋白酶、以及解磷、解钾等方面具有明显的优势，合成量显著高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03和地衣芽孢杆菌XW02，可以促进农作物对于难溶铁、磷、钾以及蛋白等营养元素的吸收，说明热带芽孢杆菌S03在促进农作物生长和提高肥料利用率方面具有巨大的潜力，通过上述作用的相互配合，可以显著促进农作物的生长并提高产量。

本实施例还对上述热带芽孢杆菌S03、贝莱斯芽孢杆菌DPT-03和地衣芽孢杆菌XW02的酸碱耐受度以及盐浓度耐受度进行了测试，设置pH值为4.0、7.0和11.0，设置NaCl浓度为5％、12.5％和17.5％，具体步骤参见上文，结果如表9所示。

表9不同菌株的酸碱耐受度和盐浓度耐受度的检测结果

由表9可以看出，在酸碱耐受度上，在pH为4、7和11的酸碱条件下，热带芽孢杆菌S03的OD₆₀₀数值均显著高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03与地衣芽孢杆菌XW02，具有良好的耐酸碱性；在盐浓度耐受度上，在NaCl浓度为5％和12.5％的条件下，对比贝莱斯芽孢杆菌DPT-03与地衣芽孢杆菌XW02，热带芽孢杆菌S03的OD₆₀₀数值也具有明显的优势，虽然在NaCl浓度为17.5％时，热带芽孢杆菌S03的OD₆₀₀数值低于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03与地衣芽孢杆菌XW02，但其仍可以存活。上述结果说明热带芽孢杆菌S03在酸性以及碱性条件下的生长优势较为突出，具有一定的耐盐性，为其在不同农作物生长环境中的利用创造了条件。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种热带芽孢杆菌，其特征在于，所述热带芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24737，保藏日期为2022年4月21日。

2.一种权利要求1所述的热带芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述热带芽孢杆菌的培养方法包括：

将所述热带芽孢杆菌接种在培养基中，在25~50℃下培养18~50 h。

3.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液利用权利要求1所述的热带芽孢杆菌发酵得到。

4.一种促生菌悬液，其特征在于，所述促生菌悬液包括权利要求1所述的热带芽孢杆菌和/或权利要求3所述的发酵液。

5.根据权利要求4所述的促生菌悬液，其特征在于，所述促生菌悬液中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于1×10⁸ cfu/mL。

6.权利要求1所述的热带芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4~5任一项所述的促生菌悬液在制备促生微生物菌剂中的应用。

7.一种促生微生物菌剂，其特征在于，所述促生微生物菌剂包括权利要求1所述的热带芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4~5任一项所述的促生菌悬液。

8.根据权利要求7所述的促生微生物菌剂，其特征在于，所述促生微生物菌剂中热带芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/mL。

9.权利要求1所述的热带芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4~5任一项所述的促生菌悬液或权利要求7~8任一项所述的促生微生物菌剂在制备微生物肥料中的应用。

10.权利要求1所述的热带芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4~5任一项所述的促生菌悬液或权利要求7~8任一项所述的促生长微生物菌剂在农作物培育中的应用。