CN115960744A

CN115960744A - 一种地衣芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115960744A
Application number: CN202210864870.8A
Authority: CN
Inventors: 彭启超; 张志鹏; 魏浩; 邓祖科; 李俊; 黄德龙; 金晶; 王莹; 吴书凤; 吴妍
Original assignee: Beijing Century Amms Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Beijing Century Amms Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本申请涉及农业微生物的技术领域，具体公开了一种地衣芽孢杆菌及其应用，所述地衣芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24738，保藏日期为2022年4月21日。以及上述地衣芽孢杆菌的培养方法、利用其制备的发酵液、菌悬液、促生微生物菌剂以及微生物肥料。上述地衣芽孢杆菌具有良好的IAA合成能力，还能够合成铁载体和蛋白酶，具有解磷解钾的作用，促进了农作物对营养物质的吸收，进而促进了农作物的生长与产量提升。上述地衣芽孢杆菌还具有良好的耐酸碱性和耐盐能力，与其他的功能菌的相容性良好，为其在不同农作物生长环境中的应用创造了条件。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本申请涉及农业微生物的技术领域，更具体地说，涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

土壤微生物是农业生态***中重要的组成部分，具有促生功能的微生物作为农业微生物的一部分，可直接或间接地促进农作物的生长生育，对农作物的高产种植具有重要的意义。促生菌通过不同的作用机制促进农作物生长，例如合成吲哚乙酸(IAA)。IAA是调节植物生长发育的主要激素，可以促进农作物对养分的吸收利用。菌株的IAA合成能力是衡量菌株促生能力的一个关键指标。此外，菌株也可以通过合成铁载体、蛋白酶和解磷、解钾等途径促进农作物生长。促生菌合成产物的量或种类也是衡量菌株促生能力和产业化的一个重要因素，促生菌合成产物的量越多或种类越丰富，其农业应用的潜力和价值就越突出。

微生物对酸碱、盐浓度的耐受度以及和其他菌株的相容性是菌株存活和功能表达的重要影响因素。环境胁迫耐受度低的微生物往往会发生休眠甚至死亡，难以表现其功能性，环境胁迫耐受度高的微生物更容易在土壤中存活和繁殖；与其他功能菌株相容性好的菌株，更容易与功能菌株复配而不产生拮抗，达到协同增效的作用，更有利于促进农作物生长并提升农作物产量。

地衣芽孢杆菌在农业农村部菌种安全分级目录中，其安全性较高，在农业中具有较大的应用潜力。但目前已有的地衣芽孢杆菌往往促生功能有限，或对极端环境的适应能力较差，限制了其在农业上的应用。

具有显著促生功能且环境适应性强的地衣芽孢杆菌更有利于其在土壤中的存活和繁殖，从而发挥其高效促生功能。挖掘和应用代谢产物丰富且环境耐受度更高的促生菌对农业的高产种植具有重要意义。

发明内容

为了提高地衣芽孢杆菌的促生作用以及对环境的耐受能力，本申请提供一种地衣芽孢杆菌及其应用。上述地衣芽孢杆菌的IAA分泌量高，并且具有分泌铁载体和蛋白酶以及解磷、解钾的能力，对农作物的促生效果十分明显；上述地衣芽孢杆菌还具有良好的耐酸碱性和耐盐性，对环境的适应能力极强；与其他菌株的相容性好，为其在农业上的应用创造了条件。

第一方面，本申请提供一种地衣芽孢杆菌，采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24738，保藏日期为2022年4月21日。

本申请中，上述地衣芽孢杆菌命名为Bacillus licheniformis S05。

本申请中，上述地衣芽孢杆菌是从海南省乐东黎族自治县的根际土壤中分离筛选获得的，分离获得的地衣芽孢杆菌具有良好的耐酸碱能力以及对高盐离子浓度的耐受性，且与其他的功能菌具有良好的相容性，能稳定地在土壤中存活繁殖，为其在不同农作物生长环境下的应用创造了条件。

本申请中，上述地衣芽孢杆菌具有良好的IAA合成能力，可达53.26μg/mL。此外，上述地衣芽孢杆菌还可以合成铁载体，从而与土壤中的难溶性铁形成铁-铁载体络合物，促进植物对营养元素的吸收与利用。上述地衣芽孢杆菌还具有蛋白酶合成能力，一方面，可以对肥料中的蛋白质进行分解，促进营养物质的吸收；另一方面，分泌的蛋白酶还可以对病原菌的细胞膜进行分解，抑制病原菌的同时也可以减少病原菌生理代谢对营养物质的消耗。上述地衣芽孢杆菌还具有解磷、解钾的作用，可以将土壤中难以被农作物吸收的磷元素和钾元素转化为容易被吸收的形式，从而提高农作物对元素的吸收利用效率。通过上述功能的相互配合，所述的地衣芽孢杆菌对农作物生长的促进作用十分明显。

第二方面，本申请提供上述地衣芽孢杆菌的培养方法，采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌的培养方法，所述地衣芽孢杆菌的培养方法包括：

将所述地衣芽孢杆菌接种在培养基中，在25～40℃下培养12～50h。

本申请中，上述地衣芽孢杆菌的培养基成分简单，培养方法操作容易，为其大规模生产及应用创造了条件。

在一些具体的实施方案中，所述培养的温度为25～28℃、25～30℃、25～37℃、28～30℃、28～37℃、28～40℃、30～37℃、30～40℃或37～40℃等。

在一个具体的实施方案中，所述培养的温度为25℃、28℃、30℃、37℃或40℃等。

在一些具体的实施方案中，所述培养的时间为12～15h、12～18h、12～20h、12～22h、12～24h、12～28h、12～30h、12～35h、12～40h、12～48h、15～18h、15～20h、15～22h、15～24h、15～28h、15～30h、15～35h、15～40h、15～48h、15～50h、18～20h、18～22h、18～24h、18～28h、18～30h、18～35h、18～40h、18～48h、18～50h、20～22h、20～24h、20～28h、20～30h、20～35h、20～40h、20～48h、20～50h、22～24h、22～28h、22～30h、22～35h、22～40h、22～48h、22～50h、24～28h、24～30h、24～35h、24～40h、24～48h、24～50h、28～30h、28～35h、28～40h、28～48h、28～50h、30～35h、30～40h、30～48h、30～50h、35～40h、35～48h、35～50h、40～48h、40～50h或48～50h等。

在一个具体的实施方案中，所述培养的时间为12h、15h、18h、20h、22h、24h、28h、30h、35h、40h、48h或50h等。

第三方面，本申请提供一种发酵液，采用如下技术方案：

一种发酵液，所述发酵液利用第一方面所述的地衣芽孢杆菌发酵得到。

第四方面，本申请提供一种菌悬液，采用如下技术方案：

一种菌悬液，所述菌悬液利用第一方面所述的地衣芽孢杆菌制备得到。

第五方面，本发明提供第一方面所述的地衣芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的菌悬液在制备促生微生物菌剂中的应用。

第六方面，本发明提供一种促生微生物菌剂，采用如下技术方案：

一种促生微生物菌剂，所述促生微生物菌剂包括第一方面所述的地衣芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液或第四方面所述的菌悬液。

优选地，所述促生微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于1亿/mL，或所述促生微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/g。

在一些具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂为液体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1～2亿/mL、1～3亿/mL、1～4亿/mL、1～5亿/mL、1～6亿/mL、1～7亿/mL、1～8亿/mL、1～9亿/mL、1～10亿/mL、2～3亿/mL、2～4亿/mL、2～5亿/mL、2～6亿/mL、2～7亿/mL、2～8亿/mL、2～9亿/mL、2～10亿/mL、3～4亿/mL、3～5亿/mL、3～6亿/mL、3～7亿/mL、3～8亿/mL、3～9亿/mL、3～10亿/mL、4～5亿/mL、4～6亿/mL、4～7亿/mL、4～8亿/mL、4～9亿/mL、4～10亿/mL、5～6亿/mL、5～7亿/mL、5～8亿/mL、5～9亿/mL、5～10亿/mL、6～7亿/mL、6～8亿/mL、6～9亿/mL、6～10亿/mL、7～8亿/mL、7～9亿/mL、7～10亿/mL、8～9亿/mL、8～10亿/mL或9～10亿/mL等。

在一个具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂为液体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1亿/mL、2亿/mL、3亿/mL、4亿/mL、5亿/mL、6亿/mL、7亿/mL、8亿/mL、9亿/mL或10亿/mL等。

在一些具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂为固体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为5～5.5亿/g、5～6亿/g、5～6.5亿/g、5～7亿/g、5～7.5亿/g、5～8亿/g、5～8.5亿/g、5～9亿/g、5～9.5亿/g、5～10亿/g、5.5～6亿/g、5.5～6.5亿/g、5.5～7亿/g、5.5～7.5亿/g、5.5～8亿/g、5.5～8.5亿/g、5.5～9亿/g、5.5～9.5亿/g、5.5～10亿/g、6～6.5亿/g、6～7亿/g、6～7.5亿/g、6～8亿/g、6～8.5亿/g、6～9亿/g、6～9.5亿/g、6～10亿/g、6.5～7亿/g、6.5～7.5亿/g、6.5～8亿/g、6.5～8.5亿/g、6.5～9亿/g、6.5～9.5亿/g、6.5～10亿/g、7～7.5亿/g、7～8亿/g、7～8.5亿/g、7～9亿/g、7～9.5亿/g、7～10亿/g、7.5～8亿/g、7.5～8.5亿/g、7.5～9亿/g、7.5～9.5亿/g、7.5～10亿/g、8～8.5亿/g、8～9亿/g、8～9.5亿/g、8～10亿/g、8.5～9亿/g、8.5～9.5亿/g、8.5～10亿/g、9～9.5亿/g、9～10亿/g或9.5～10亿/g等。

在一个具体的实施方案中，所述促生微生物菌剂为固体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为5亿/g、5.5亿/g、6亿/g、6.5亿/g、7亿/g、7.5亿/g、8亿/g、8.5亿/g、9亿/g、9.5亿/g或10亿/g等。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的地衣芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液或第六方面所述的促生微生物菌剂在制备微生物肥料中的应用。

本申请中，上述促生微生物菌剂与常规肥料混合使用，产生了协同增益的效果。常规肥料中含有丰富的氮、磷以及钾元素，但缺少生物类促生物质，且磷元素和钾元素的吸收效率并不高，对农作物生长的促进作用并不明显。与促生微生物菌剂混合后，菌剂中的地衣芽孢杆菌可以合成并分泌IAA、铁载体以及蛋白酶等生物类促生物质，同时还可以将肥料中的不易吸收的磷元素、钾元素转化为更容易被吸收的形式，从而提高了肥料的利用效率，显著促进了农作物的生长。

第八方面，本发明提供了一种微生物肥料，采用如下技术方案：

一种微生物肥料，所述微生物肥料包括第一方面所述的地衣芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液或第六方面所述的促生微生物菌剂。

第九方面，本申请提供第一方面所述的地衣芽孢杆菌、第三方面所述的发酵液、第四方面所述的菌悬液、第六方面所述的促生微生物菌剂或第八方面所述的微生物肥料在农作物培育中的应用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请中的地衣芽孢杆菌对农作物的生长具有良好的促进作用：IAA合成能力可达53.26μg/mL，促进了根的生长，提升了对营养物质的运输能力；其还可以分泌铁载体和蛋白酶，提高了对铁元素以及蛋白类物质的吸收与利用，此外还具有一定的防控病害的作用；上述地衣芽孢杆菌还具有解磷解钾的作用，提高了农作物对于磷元素和钾元素的利用效率。通过上述作用的相互配合，使农作物植株更为茁壮，产量以及果实品质也有提升。

2.本申请中的地衣芽孢杆菌还具有良好的环境耐受能力：在4～11的pH值范围内的生长基本不受影响，具有良好的耐酸碱性；在5％～17.5％的NaCl浓度下能够正常生长，在20.0％的NaCl浓度下可以存活，具有较强的耐盐性；在25～40℃下可以进行正常的生理代谢。上述特性使其更容易在土壤中存活、繁殖，从而更好地发挥其功能，为其在不同农作物生长环境中的应用创造了条件。另外，所述地衣芽孢杆菌与其他菌种还具有良好的相容性，为其与其他功能菌制成复合产品提供了基础。

3.本申请中的地衣芽孢杆菌属于农业农村部菌种安全分级目录第一级菌株，菌株安全，生产工艺简单、生产周期短且原料成本低，适合工业化生产，在农作物高产、健康种植中具有较大的应用潜力。

4.上述地衣芽孢杆菌还可以与常规的肥料混合制成微生物肥料，上述微生物肥料中含有丰富氮、磷、钾等无机营养元素，还含有IAA、铁载体以及蛋白酶等生物类促生物质，配合地衣芽孢杆菌的解磷解钾作用，将肥料中不易吸收的磷元素、钾元素转化为更容易被吸收的形式，从而提高了肥料的利用效率，协同增益，对农作物生长的促进作用十分显著。

附图说明

图1为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的菌落形态图片。

图2为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的菌体形态图片(放大倍数＝1000倍)。

图3为实施例2中具有IAA合成能力的菌株的***发育树的构建结果图片。

图4为实施例3中地衣芽孢杆菌S05的铁载体合成能力的测定结果图片。

图5为实施例3中地衣芽孢杆菌S05的蛋白酶合成能力的测定结果图片。

图6为实施例3中地衣芽孢杆菌S05的解磷能力的测定结果图片。

图7为实施例3中地衣芽孢杆菌S05的解钾能力的测定结果图片。

图8为实施例4中地衣芽孢杆菌S05的菌株相容性的测定结果图片。

图9为实施例7中不同组别辣椒植株的培养结果图片。

图10为实施例8中不同组别辣椒的果实的实物图片。

具体实施方式

本申请提供一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌命名为Bacilluslicheniformis S05，所述地衣芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24738，保藏日期为2022年4月21日。

本申请还提供了上述地衣芽孢杆菌的培养方法，具体包括：

将所述地衣芽孢杆菌接种在培养基中，在25～50℃下培养18～50h。

具体地，所述培养基包括LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基或发酵培养基。

具体地，所述LB培养基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl 10g/L。

具体地，所述牛肉膏蛋白胨培养基包括牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0g/L和琼脂15g/L，pH为7.2～7.5。

具体地，所述发酵培养基包括葡萄糖12g/L、胰蛋白胨8g/L、酵母粉8g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.5g/L和碳酸钙2g/L。

本申请还提供一种发酵液，所述发酵液利用上述地衣芽孢杆菌发酵得到。

本申请还提供一种菌悬液，所述菌悬液利用上述地衣芽孢杆菌制备得到。

本发明还提供一种促生微生物菌剂，所述促生微生物菌剂包括上述的地衣芽孢杆菌、发酵液或菌悬液。

具体地，所述促生微生物菌剂为液体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于1亿/mL。

具体地，所述促生微生物菌剂为固体，其中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/g。

本申请还提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括上述的地衣芽孢杆菌、发酵液、菌悬液或促生微生物菌剂。

以下结合实施例1～9以及附图1～10对本申请的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种具有IAA合成能力的菌株的分离方法。该具有IAA合成能力的菌株是从农作物根际土壤中分离得到的，分离步骤如下：

(1)菌株分离：

LB固体培养基的配置：

称取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g和琼脂15g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

LB液体培养基的配置：

称取蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 10g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

称取10g收集的根际土壤，加入到装有90mL无菌水的锥形瓶中，150rpm震荡30min，静置2h。

取静置上清液，依照10^-2～10^-5的浓度梯度进行稀释。稀释后，每个浓度梯度吸取100μL溶液涂布在LB固体培养基表面，在28℃下培养24h。

待培养基表面长出单菌落后，根据菌落形态、颜色和大小进行选取，在固体培养基上进行纯化保存，共分离获得15株细菌，分别命名为S01、S02、S03、……和S15。

(2)初筛：

Salkowski显色液的配置：

取10mL 0.5mol/L的FeCl₃溶液，加入到500mL 35％高氯酸中，混合均匀，备用。

将分离纯化后的菌株接种于含质量浓度为100mg/L的L-色氨酸的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下摇床培养24h，取50μL菌悬液滴加于LB固体培养基表面，同时加入等量Salkowski显色液进行显色反应。

以滴加50μL IAA(50mg/L)的LB固体培养基作为阳性对照。固体培养基于室温、避光条件下放置30min后进行观察，颜色变红者表示能够合成IAA。

(3)复筛：

将筛选菌株接种于LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下摇床培养24h后取出，4000rpm离心15min，取4mL上清液与等体积Salkowski显色剂混合，25℃避光反应30min，测定在OD₅₃₀ nm处的数值，根据IAA标准曲线回归方程计算菌液中IAA含量。

IAA标准曲线的制作方法如下：配制质量浓度分别为0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL和60μg/mL的IAA标准溶液，并与Salkowski显色剂按照体积比为1:1混合，室温避光30min，分别测量在OD₅₃₀ nm处的数值，以蒸馏水与Salkowski显色剂按照体积比为1:1的混合液进行相同的操作作为空白对照。

菌株的筛选结果如表1所示。

表1菌株筛选结果

由表1可以看出，分离的15株菌株中有8株发生了显色反应，说明这8株可代谢合成IAA，其中S05的IAA合成量最高，可达53.26μg/mL，显著高于其他菌株，具有很大的促生潜力。

实施例2

本实施例提供上述具有IAA合成能力的菌株的鉴定过程。

对实施例1分离得到的具有IAA合成能力的菌株S05分别进行形态学鉴定、分子生物学鉴定和***发育鉴定。

形态学鉴定

牛肉膏蛋白胨培养基的配置：

称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g和琼脂15g，加水溶解，调节pH为7.2～7.5，再加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将具有IAA合成能力的菌株S05采用四区划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基表面，30℃培养48h后观察菌落形态，并进行革兰氏染色观察其菌体形态。

具有IAA合成能力的菌株的菌落形态图如图1所示。通过48h培养后观察，由图1可以看出，菌株S05的菌落呈乳白色，边缘不整齐但接近圆形，且菌落较小。

具有IAA合成能力的菌株的菌体形态图如图2所示。革兰氏染色后在显微镜下观察，由图2可以看出，菌株S05为革兰氏阳性菌，呈杆状，可单个或成对出现。

分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序技术和菌落PCR技术对微生物的种类进行鉴定。

将分离筛选出的S05菌株接种于LB固体培养基表面，培养过夜后，挑取不同的新鲜单菌落分别置于1.5mL离心管中，加入10μL|S2裂解液(购自北京擎科生物技术有限公司)，震荡混匀，室温静置20min，随后稀释20倍，震荡混匀，12000rpm离心2min，取上清液作为模板，进行PCR扩增。

扩增引物如下：

27F(SEQ ID No.1)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

1492R(SEQ ID No.2)：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

扩增试剂：2×EasyTaq SuperMix(购自北京擎科生物技术有限公司)。

扩增程序如下：

94℃ 5min；

94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 90s；循环35次；

72℃ 7min，4℃保存。

菌落PCR的反应体系如表2所示。

表2菌落PCR的反应体系

试剂	使用量(μL)
		2×EasyTaq SuperMix	15
27F(10μM)	1.5
		1492R(10μM)	1.5
模板	5
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	7
总体积	30

琼脂糖凝胶的配方如表3所示。

表3琼脂糖凝胶的配方

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化胶块。将纯化后的产物进行Sanger测序，获得正反向测序结果，其16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。

***发育鉴定

利用DNAMAN软件对所得数据进行拼接，并在www.ezbiocloud.net数据库中进行16S rDNA序列的比对，通过Mega 5.0软件采用Neighbor-Joining法，Bootstrap置信值估算重复次数1000次，构建***发育进化树，确定菌株S05在***发育树中的位置，***发育树的构建结果如图3所示。根据图3，鉴定比对结果表明S05菌株为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

将上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis S05于2022年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏编号为CGMCC No.24738。

实施例3

本实施例提供上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis S05的铁载体合成能力、蛋白酶合成能力、解磷能力和解钾能力的测定方法。

铁载体合成能力测定

0.1mol/L磷酸盐缓冲液的配置方法：

称取磷酸二氢钠5.91g、磷酸氢二钠24.27g、氯化铵2.50g、磷酸二氢钾0.75g和氯化钠1.25g，加去离子水定容至1L。

含铁载体CAS的培养基的配置方法：

称取CAS(购自上海麦克林生化科技有限公司)60.5mg、十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)72.9mg、1mmol/L FeCl₃·6H₂O(10mmol/L HCl配制)10mL、0.1mol/L磷酸盐缓冲液50mL和琼脂9.0g，加去离子水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

铁载体合成能力的测定方法：

将活化后的地衣芽孢杆菌S05接种于蓝色的含铁载体CAS的培养基中，28℃下培养48h。若细菌合成铁载体，螯合培养基中的铁(三价铁)，则菌落周围产生淡红色晕圈。

图4为地衣芽孢杆菌S05的铁载体合成能力的测定结果图片。如图4所示，地衣芽孢杆菌S05能够合成铁载体，其晕圈直径可达28.5mm，说明地衣芽孢杆菌S05可以通过合成铁载体促进植物对铁的吸收及利用，进一步促进农作物的生长。

蛋白酶合成能力测定

蛋白酶检测培养基的配制方法：

称取胰蛋白胨5.00g、酵母提取物3.00g、葡萄糖1.00g和琼脂15.00g，加蒸馏水溶解，调节pH为7.0，再加蒸馏水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，将脱脂牛奶按体积比为10％的比例加入培养基中，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后的地衣芽孢杆菌S05接种到蛋白酶检测培养基表面，28℃下培养48h，观察是否有溶解圈出现。

图5为地衣芽孢杆菌S05的蛋白酶合成能力的测定结果图片。如图5所示，地衣芽孢杆菌S05具有良好的蛋白溶解能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径可达21.1mm。

解磷能力测定

解磷培养基的配置方法：

称取葡萄糖10g、磷酸钙5g、硫酸铵0.1g、氯化钾0.2g、硫酸镁0.25g、七水氯化镁5g和琼脂15g，加蒸馏水溶解，调节pH为6.8～7.0后，加蒸馏水定容至1L，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后的地衣芽孢杆菌S05接种到解磷培养基表面，28℃下培养48h，观察有无溶解圈出现。

图6为地衣芽孢杆菌S05的解磷能力的测定结果图片。如图6所示，地衣芽孢杆菌S05具有解磷能力，溶解有机磷的溶解圈直径可达29.8mm。

解钾能力测定

解钾培养基的配置方法：

称取蔗糖10g、酵母粉0.5g、七水合硫酸镁0.5g、硫酸铵1g、磷酸氢二钠2g、碳酸钙1g、钾长石粉1g和琼脂15g，加去离子水溶解，调节pH为7.0，再加去离子水定容至1L，于121℃高压灭菌30min。将灭菌后的培养基冷却至50℃，混匀后倒入培养皿，冷却后备用。

将活化后地衣芽孢杆菌S05接种到解钾培养基表面，28℃下培养48h，观察有无油滴状溶解圈的出现。

图7为地衣芽孢杆菌S05的解钾能力的测定结果图片。如图7所示，地衣芽孢杆菌S05具有解钾能力，油滴状溶解圈的直径可达11.8mm。

实施例4

本实施例提供上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis S05的酸碱耐受度、盐浓度耐受度和菌株相容性的测定方法。

酸碱耐受度测定

将活化后的地衣芽孢杆菌S05分别接种到pH值依次为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的LB液体培养基中，180rpm、37℃下振荡培养24h，测定不同pH值的培养基的OD₆₀₀数值，结果如表4所示。

表4地衣芽孢杆菌S05酸碱耐受度的测定结果

由表4可以看出，地衣芽孢杆菌S05在4～11的pH值范围内的生长基本不受影响，表明其具有非常强的耐酸碱性，为其在不同农作物生产环境中的应用创造了条件。

盐浓度耐受度测定

将活化后的地衣芽孢杆菌S05分别接种到NaCl浓度依次为5.0％、10.0％、12.5％、15.0％、17.5％和20.0％的LB液体培养基中，180rpm、37℃下振荡培养24h，测定不同NaCl浓度的培养基的OD₆₀₀数值，结果如表5所示。

表5地衣芽孢杆菌S05盐浓度耐受度的测定结果

由表5可以看出，地衣芽孢杆菌S05可以在5％～17.5％的NaCl浓度下正常生长，在20.0％的NaCl浓度下生长状态一般，但仍可以存活，表明地衣芽孢杆菌S05具有较高的耐盐性。

菌株相容性测定

将地衣芽孢杆菌S05和本实验室筛选分离保存的代表性功能菌枯草芽孢杆菌KC-06、解淀粉芽孢杆菌JDF-03和贝莱斯芽孢杆菌DPT-03(保藏编号为CGMCC No.20317)进行菌株相容性试验。

将上述菌株分别进行活化，在LB固体培养基表面互相接触划线培养。结果如表6和图8所示。

表6地衣芽孢杆菌S05的相容性测定结果

菌株相容性测定中，“+”表示菌株间完全不拮抗，“o”表示菌株微拮抗，但不抑制相互生长，“-”表示菌株拮抗，且抑制相互生长。

图8为地衣芽孢杆菌S05的菌株相容性的测定结果图片。

由表6和图8可知，地衣芽孢杆菌S05与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的相容性较好，不产生拮抗。菌株相容性决定了该菌株与其他功能菌株在复配条件下的功能表达，菌株相容性好更有利于其在土壤中的生存和繁殖，也有助于菌株复合的产业化研究。

实施例5

本实施例制备上述地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂，制备方法如下：

发酵培养基的配置：

称取葡萄糖12g、胰蛋白胨8g、酵母粉8g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.5g和碳酸钙2g，加水定容至1000mL，于121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

(1)菌种活化：将保存的地衣芽孢杆菌S05通过划线接种于LB固体培养基表面，在37℃下培养22～28h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基表面，在37℃下培养22～28h。

(2)一级种子液制备：刮取两环步骤(1)中活化后的地衣芽孢杆菌S05，接种于LB液体培养基中，37℃、120～150rpm下摇瓶培养18～24h，得到一级种子液。

(3)二级种子液制备：将一级种子液按照5％～8％(v:v)的比例接种于装有LB液体培养基的发酵罐中发酵培养，发酵条件为转速150～180rpm、温度37℃、通气量1:(0.8～1.2)、灌压0.04～0.06MPa，培养12～18h，得到二级种子液。

(4)发酵液培养：将二级种子液按照5％～10％(v:v)的比例接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养，发酵条件为转速150rpm～180rpm、温度37℃、通气量1:(0.8～1.2)、灌压0.04～0.06MPa，培养20～30h，得到地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂。

实施例6

本实施例制备上述地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂，制备方法如下：

将实施例5制备的地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂，通过陶瓷膜过滤去除上清液，随后向沉淀物中缓慢加入硅藻土或沸石粉作为载体基质，搅拌均匀后进行喷雾干燥，通过雾化器(65℃左右)分散和高温空气(180℃)迅速蒸干，料液中的固体物质经旋风分离器收集，得到地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂。

实施例7

本实施例验证实施例5制备的地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂对辣椒的促生能力，步骤如下：

采用内直径为15cm、高20cm的塑料盆栽专用盆，每盆装土2kg，将长势良好的辣椒苗移栽至盆中，缓苗10天，幼苗恢复到健康长势后开展试验。

试验分为3个处理组，处理1：盆栽中添加10mL地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂(有效活菌数≥1.0亿/mL)，浇水30mL；处理2：盆栽中添加10mL发酵培养基(不含菌)，浇水30mL；处理3(对照组)：只加等量清水，每个处理组设置5组重复。

30天后，将植株取下，用水冲洗干净，不同组别辣椒植株的培养结果图片如图9所示。

将植株分为地上部分和地下部分两个部分。测定根长、茎高、茎粗、地上部分干重和地下部分干重，测定结果如表7所示。

表7地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂对辣椒促生能力的测定结果

处理组	株高(cm)	茎粗(mm)	根长(mm)	地上干重(g)	地下干重(g)
						处理1	56.21	3.65	15.98	5.36	1.51
处理2	51.65	3.12	14.39	4.26	1.28
						处理3	47.52	2.93	13.32	4.13	1.22

结合图9和表7中的数据，可以看出地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂对辣椒幼苗的促生效果非常显著，处理1的株高较处理2提高8.83％，较处理3提高18.29％；茎粗较处理2提高16.99％，较处理3提高24.57％；根长较处理2提高11.05％，较处理3提高19.97％；地上干重较处理2提高25.82％，较处理3提高29.78％；地下干重较处理2提高17.97％，较处理3提高23.77％。上述结果表明施用地衣芽孢杆菌S05的液体菌剂能明显促进辣椒生长，株高、茎粗、根长、地上干重和地上干重均有明显的增加，植株长势健壮。

实施例8

本实施例将实施例6制备的地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂与肥料混合，制成微生物肥料，并对微生物肥料的促生能力进行验证，步骤如下：

试验地址设置在北京平谷，每个处理区域的土地面积为30m²。试验共设3个处理组，每个处理组重复3次，随机选取处理区域，处理组分别为：

处理1：复合肥料(15-15-15，N+P₂O₅+K₂O，总养分≥45％)40kg+40kg地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂(有效活菌数≥5.0亿/g，有效菌种名称：地衣芽孢杆菌)；

处理2：复合肥料(15-15-15，N+P₂O₅+K₂O，总养分≥45％)40kg+40kg市售微生物菌剂(有效活菌数≥5.0亿/g，有效菌种名称：地衣芽孢杆菌)；

处理3：复合肥料(15-15-15，N+P₂O₅+K₂O，总养分≥45％)40kg。

将上述各组肥料分别施用于对应处理区域的土地中，将长势良好的辣椒苗移栽至土地中，每个区域内种植6株，缓苗10天，幼苗恢复到健康长势后开展试验。分别对各组辣椒在苗期的株高和茎粗、在开花结果期的株高和茎粗以及收获期的单果重和产量进行测量，测量结果如表8所示。

表8不同组别肥料对辣椒的促生效果的评价结果

不同组别辣椒的果实的实物图片如图10所示。

结合图10和表8中的数据，可以看出，在苗期，处理1的辣椒株高和茎粗要明显优于处理2和处理3，说明使用含有地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂的微生物肥料在促进辣椒苗期的生长方面具有显著的优势。在开花结果期，处理1的辣椒茎粗要明显优于处理2和处理3，但株高在3个处理组间的差异性不大，说明含有地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂的微生物肥料能明显提高辣椒茎杆的粗壮程度。在收获期时，施用含有地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂的微生物肥料的辣椒单果重和产量上均具有显著的优势，单果重较处理2高7.12％，较处理3高15.34％；在产量上较处理2高9.16％，较处理3高18.75％。综上可以看出，使用含有地衣芽孢杆菌S05的固体菌剂的微生物肥料在促进辣椒幼苗生长、增加开花结果期植株的粗壮程度以及后期增加辣椒产量方面均具有明显的优势，能显著增加农作物的种植效益。

实施例9

本实施例比较本申请中的地衣芽孢杆菌S05、贝莱斯芽孢杆菌DPT-03(CGMCCNo.20317)、地衣芽孢杆菌XW02(保藏编号为CCTCC NO:M 2020872)和地衣芽孢杆菌LLH-6(保藏编号为CCTCC NO:M 2020162)的IAA合成能力、铁载体合成能力、蛋白酶合成能力、解磷能力和解钾能力，具体步骤参见上文，结果如表9所示。

表9不同菌株的生理代谢特性的检测结果

由表9可以看出，地衣芽孢杆菌S05在合成IAA方面具有明显的优势，合成量明显高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03、地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6。在铁载体合成能力方面，地衣芽孢杆菌S05的铁载体合成量高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03，但略低于地衣芽孢杆菌XW02，地衣芽孢杆菌LLH-6不具备铁载体合成能力。在蛋白酶的合成上，地衣芽孢杆菌S05的蛋白酶合成能力略微弱于地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6，贝莱斯芽孢杆菌DPT-03不具备蛋白酶合成能力。在解磷和解钾能力上，地衣芽孢杆菌S05要显著优于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03、地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6。

综上，地衣芽孢杆菌S05在合成IAA和活化土壤养分(即解磷和解钾)上具有明显的优势，在促进农作物生长和提高肥料利用率上具有巨大的潜力。其还具备铁载体和蛋白酶的合成能力，通过上述作用的相互配合，可以显著促进农作物的生长并提高产量。

本实施例还对上述地衣芽孢杆菌S05、贝莱斯芽孢杆菌DPT-03、地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6的酸碱耐受度以及盐浓度耐受度进行了测试，设置pH值为4.0、7.0和11.0，设置NaCl浓度为5％、12.5％和17.5％，具体步骤参见上文，结果如表10所示。

表10不同菌株的酸碱耐受度和盐浓度耐受度的检测结果

由表10可以看出，在酸碱耐受度上，在pH为4的酸性条件下，地衣芽孢杆菌S05的OD₆₀₀数值要高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03，但与地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6的差别不大；在pH为11的碱性条件下，地衣芽孢杆菌S05的OD₆₀₀数值要高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03、地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6。在盐浓度耐受度上，在NaCl浓度为5％和12.5％的条件下，4种菌株间的差别较小，但在17.5％的NaCl浓度下，地衣芽孢杆菌S05的OD₆₀₀数值要高于贝莱斯芽孢杆菌DPT-03、地衣芽孢杆菌XW02和地衣芽孢杆菌LLH-6，耐盐性较强。上述结果说明地衣芽孢杆菌S05在高盐碱条件下的优势较为突出，在盐碱土壤上也具有较好的应用潜力。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24738，保藏日期为2022年4月21日。

2.一种权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的培养方法包括：

将所述地衣芽孢杆菌接种在培养基中，在25~40℃下培养12~50 h。

3.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌发酵得到。

4.一种菌悬液，其特征在于，所述菌悬液利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌制备得到。

5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4所述的菌悬液在制备促生微生物菌剂中的应用。

6.一种促生微生物菌剂，其特征在于，所述促生微生物菌剂包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液或权利要求4所述的菌悬液。

7.根据权利要求6所述的促生微生物菌剂，其特征在于，所述促生微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于1亿/mL，或所述促生微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数不低于5亿/g。

8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液或权利要求6~7任一项所述的促生微生物菌剂在制备微生物肥料中的应用。

9.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液或权利要求6~7任一项所述的促生微生物菌剂。

10.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液、权利要求6~7任一项所述的促生微生物菌剂或权利要求9所述的微生物肥料在农作物培育中的应用。