CN115927612A - 检测食管疾病 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测食管疾病。本文提供了用于食管疾病筛选的技术，特别地但不排他地涉及用于检测食管疾病(例如巴雷特食管、巴雷特食管发育异常等)的存在的方法、组合物和相关用途。此外，本技术提供了用于在通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得的样品中区分巴雷特食管和巴雷特食管发育异常以及巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的方法、组合物和相关用途。
Description
本申请是申请日为2016年3月23日的中国专利申请201680018938.3“检测食管疾病”的分案申请。
技术领域
本文提供了用于食管疾病筛选的技术，特别地但不排他地涉及用于检测食管疾病(例如巴雷特食管(Barrett’s esophagus)、巴雷特食管发育异常(Barrett’s esophagealdysplasia)等)的存在的方法、组合物和相关用途。此外，本技术提供了用于在通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得的样品中区分巴雷特食管和巴雷特食管发育异常以及巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的方法、组合物和相关用途。
背景技术
在巴雷特食管中，健康食管上皮被化生性柱状细胞(metaplastic columnarcells)代替，认为这是因为食管长期暴露于胃食管反流病(GERD)的反流的损伤的结果。已经确定了从巴雷特食管进展到食管腺癌的固有风险。在组织学上，这种进展包括从单独化生到低度发育异常，然后到高度发育异常，最后到腺癌的明确的顺序阶段。
没有发育异常的巴雷特食管的诊断不能导致特异性治疗。然而，当存在发育异常时，有强力证据表明内窥镜消融治疗可以防止随后转化为癌症。这种发育异常利用内窥镜通常不能与无发育异常的巴雷特区分开，定期随机活检和组织学评估是目前具有已证实的巴雷特的患者的监测方法。
很少证据支持抗分泌剂或抗反流手术阻止腺癌发生或导致巴雷特食管消退的假设(参见，例如，Haag S等，Gastrointest Endosc.Aug1999；50(2):229-40)。
在20世纪80年代初期至中期，组胺2(H2)-受体拮抗剂是治疗GERD最常用的药物。然而，使用西咪替丁或雷尼替丁进行了一些研究，没有记录到巴雷特食管的消退。
在20世纪80年代后期，引入了质子泵抑制剂(PPI)，并证明其在减少胃酸分泌方面更有效。即使如此，更好的酸抑制可以诱导巴雷特食管消退的假设并不乐观，并且在这方面进行的研究迄今为止都是不确定的。7名研究者中只有2名证明了一些消退。大部分不能检测到任何消退，尽管通过pH测试证明食管pH完全正常化。
目前，巴雷特食管的药物治疗的适应症-症状的控制和食管粘膜的治愈与GERD的相同。
巴雷特食管是大多数食管腺癌的前体病变(precursor lesion)，食管腺癌是恶性肿瘤，具有迅速上升的发病率和持续不良的结果。如上所述，已经表明食管腺癌的早期检测与较早阶段和增加的存活率相关。并且，利用随后的内窥镜消融检测发育异常可以预防食管腺癌。
明显需要用于检测巴雷特食管和相关疾病(例如巴雷特食管发育异常)的改善的方法。
发明内容
已经研究了将甲基化DNA作为大多数肿瘤类型的组织中潜在一类生物标志物。在许多情况下，DNA甲基转移酶在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛位点处向DNA添加甲基作为基因表达的表观遗传学控制。在生物学上引人注目的机制中，在肿瘤抑制基因的启动子区域中获得的甲基化事件被认为沉默表达，因此有助于肿瘤形成。DNA甲基化可能是比RNA或蛋白质表达在化学和生物学上更稳定的诊断工具(Laird(2010)Nat Rev Genet 11:191–203)。此外，在其他癌症如散发性结肠癌中，甲基化标志物提供了优异的特异性，并且比个体DNA突变更具广泛的信息性和灵敏度(Zou等(2007)Cancer Epidemiol Biomarkers Prev16:2686–96)。
当应用于动物模型和人细胞系时，CpG岛的分析产生了重要的发现。例如，Zhang和同事发现，来自相同CpG岛的不同部分的扩增子可能具有不同的甲基化水平(Zhang等(2009)PLoS Genet 5:e1000438)。此外，甲基化水平在高度甲基化序列和未甲基化序列之间双峰分布，进一步支持了DNA甲基转移酶活性的二元开关样模式(Zhang等(2009)PLoSGenet 5:e1000438)。体外小鼠组织和体外细胞系的分析表明，仅约0.3％的高CpG密度启动子(HCP，定义为在300个碱基对区域内具有>7％CpG序列)被甲基化，而低CpG密度(LCP，定义为在300个碱基对区域内具有<5％CpG序列)的区域倾向于以动态的组织特异性模式频繁地甲基化(Meissner等(2008)Nature 454:766–70)。HCP包括遍在的管家基因和高度调控的发育基因的启动子。其中，>50％甲基化的HCP位点是多个建立的标志物，例如Wnt 2、NDRG2、SFRP2和BMP3(Meissner等(2008)Nature 454:766–70)。
因此，本文提供了用于食管疾病筛选(例如监测)的技术，特别地但不排他地涉及用于检测食管疾病(例如巴雷特食管、巴雷特食管发育异常等)的存在的方法、组合物和相关用途。此外，本技术提供了用于在通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得的样品中区分巴雷特食管和巴雷特食管发育异常以及巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的方法、组合物和相关用途。
事实上，在开发本技术的过程中进行的实验将来自具有巴雷特食管的受试者的食管组织的DNA标志物的甲基化状态与来自对照受试者(例如，各组织类型的正常组织)的相同DNA标志物的甲基化状态以及来自具有巴雷特食管发育异常的受试者的相同DNA标志物的甲基化状态进行了比较(参见实施例1和5)。
鉴定了能够在食管组织中分类巴雷特食管(BE)和对照(例如，各组织类型的正常组织)的标志物和/或标志物组(例如，表1、7和/或8中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、2和5)。
鉴定了能够在食管组织中分类BE和巴雷特食管相关发育异常(BED)的标志物和/或标志物组(例如，表2、3、5和/或6中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、3和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中预测巴雷特食管相关低度发育异常(BE-LGD)、巴雷特食管相关发育异常高度发育异常(BE-HGD)和食管腺癌(EAC)的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中分类BE和BED的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
如本文所述，本技术提供了对食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)具有高辨别力的许多甲基化DNA标志物及其亚组(例如，2、3、4、5、6、7、10、15、25、50、100、150、180、190、194种标志物的组)。实验应用了候选标志物的选择过滤器，以鉴定提供高信噪比和低背景水平的标志物，以例如当用于筛选或诊断(例如，癌症筛选或诊断)目的而测定介质(例如，食管组织)时提供高特异性。
在一些实施方案中，本技术涉及评估生物样品中本文鉴定的一种或多种标志物的存在和甲基化状态。这些标志物包含如本文所讨论的一个或多个差异甲基化区域(DMR)，例如，如表1、2、3、5、6、7和8中所提供的。在本技术的实施方案中评估甲基化状态。因此，本发明提供的技术不限制测量基因的甲基化状态的方法。例如，在一些实施方案中，通过基因组扫描方法测量甲基化状态。例如，一种方法涉及限制性标志基因组扫描(Kawai等(1994)Mol.Cell.Biol.14:7421–7427)，另一个实例涉及甲基化敏感性任意引物PCR(Gonzalgo等(1997)Cancer Res.57:594–599)。在一些实施方案中，通过用甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA，然后对目标区域进行Southern分析(消化-Southern方法)来监测特定CpG位点的甲基化模式的变化。在一些实施方案中，分析甲基化模式的变化涉及基于PCR的过程，其涉及在PCR扩增之前用甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA(Singer-Sam等(1990)Nucl.AcidsRes.18:687)。此外，已经报告了利用亚硫酸氢盐处理DNA作为甲基化分析的起点的其他技术。这些包括甲基化特异性PCR(MSP)(Herman等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821–9826)和从亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化(Sadri和Hornsby(1996)Nucl.Acids Res.24:5058–5059；以及Xiong和Laird(1997)Nucl.Acids Res.25:2532–2534)。已经开发了用于检测基因突变的PCR技术(Kuppuswamy等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143–1147)和用于等位基因特异性表达的定量的PCR技术(Szabo和Mann(1995)Genes Dev.9:3097–3108；以及Singer-Sam等(1992)PCR MethodsAppl.1:160–163)。这样的技术使用内部引物，其与PCR产生的模板退火并立即终止待测定的单个核苷酸的5'。在一些实施方案中使用美国专利No.7,037,650中描述的使用“定量Ms-SNuPE测定”的方法。
在评估甲基化状态时，甲基化状态通常表示为在特定位点处(例如，在单个核苷酸处，在特定区域或基因座处，在更长的目标序列处，例如，多至约100bp、200bp、500bp、1000bp的DNA子序列或更长)甲基化的DNA的单个链相对于包含该特定位点的样品中的DNA的总群体的分数或百分比。通常，通过使用校准物的PCR测定未甲基化核酸的量。然后，用亚硫酸氢盐处理已知量的DNA，并且使用实时PCR或其他指数扩增(例如QuARTS测定)来确定所得甲基化特异性序列(例如，由美国专利No.8,361,720和美国专利申请公开No.2012/0122088和2012/0122106提供)。
例如，在一些实施方案中，方法包括通过使用外标物产生未甲基化靶的标准曲线。标准曲线由至少两个点构建，并将未甲基化DNA的实时Ct值与已知的定量标准相关联。然后，由至少两个点和外标物构建甲基化靶的第二标准曲线。该第二个标准曲线将甲基化DNA的Ct与已知的定量标准相关联。接下来，测定测试样品的甲基化和未甲基化群体的Ct值，并且由前两步产生的标准曲线计算DNA的基因组当量。由甲基化DNA的量相对于群体中DNA的总量来计算目标位点处甲基化的百分比，例如(甲基化DNA数)/(甲基化DNA数+未甲基化DNA数)×100。
本文还提供了用于实施所述方法的组合物和试剂盒。例如，在一些实施方案中，提供了对一种或多种标志物有特异性的试剂(例如，引物、探针)，其为单独的或成组的(例如，用于扩增多种标志物的引物对的组)。还可以提供用于进行检测测定的另外的试剂(例如用于进行QuARTS、PCR、测序、亚硫酸氢盐或其他测定的酶、缓冲液、阳性和阴性对照)。在一些实施方案中，提供了包含对于进行方法必要、充分或有用的一种或多种试剂的试剂盒。还提供了包含试剂的反应混合物。还提供了包含可以彼此添加和/或添加到测试样品中以完成反应混合物的多种试剂的主混合试剂组。
在一些实施方案中，本文描述的技术与被设计为执行由本文所述的方法提供的一系列算术或逻辑操作的可编程机器相关联。例如，本技术的一些实施方案与计算机软件和/或计算机硬件相关联(例如，在其中执行)。一方面，本技术涉及计算机，其包括存储器形式，用于执行算术和逻辑操作的元件，以及用于执行一系列指令(例如，本文提供的方法)以读取、操纵和存储数据的处理元件(例如，微处理器)。在一些实施方案中，微处理器是用于以下的***的一部分：确定甲基化状态(例如，一种或多个DMR的甲基化，例如表1中提供的DMR1-78；表2中提供的DMR 3、5、30、33、43、58、77和79-128；表3中提供的DMR 77、27、193、90、92、101和129-134；表5中提供的DMR 77、90和135；表6中提供的DMR 136-187；表7中提供的DMR 21和188-192；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187和193-229)；比较甲基化状态(例如，一种或多个DMR的甲基化，例如表1中提供的DMR 1-78；表2中提供的DMR 3、5、30、33、43、58、77和79-128；表3中提供的DMR 77、27、193、90、92、101和129-134；表5中提供的DMR 77、90和135；表6中提供的DMR 136-187；表7中提供的DMR 21和188-192；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187和193-229)；产生标准曲线；确定Ct值；计算甲基化的分数、频率或百分比(例如，一种或多个DMR的甲基化，例如表1中提供的DMR 1-78；表2中提供的DMR 3、5、30、33、43、58、77和79-128；表3中提供的DMR 77、27、193、90、92、101和129-134；表5中提供的DMR 77、90和135；表6中提供的DMR 136-187；表7中提供的DMR 21和188-192；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187和193-229)；鉴定CpG岛；确定测定或标志物的特异性和/或灵敏度；计算ROC曲线和相关AUC；序列分析；全部如本文所述或者是本领域已知的。
在一些实施方案中，微处理器或计算机在算法中使用甲基化状态数据来预测癌症的部位。
在一些实施方案中，软件或硬件组件接收多个测定的结果，并且基于多个测定的结果(例如，确定多个DMR的甲基化状态，例如表1、2、3、5、6、7、8中提供的DMR)确定指示癌症风险的单一值结果以向使用者报告。相关实施方案基于来自多个测定(例如，确定多种标志物的甲基化状态(例如，确定多个DMR的甲基化状态，例如表1、2、3、5、6、7、8中提供的DMR))的结果的数学组合(例如，加权组合、线性组合)计算风险因素。在一些实施方案中，DMR的甲基化状态定义了维度并且可以在多维空间中具有值且由多个DMR的甲基化状态定义的坐标是例如以向使用者报告的与食管疾病风险(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC的风险)相关的结果。
一些实施方案包括存储介质和存储器组件。存储器组件(例如，易失性和/或非易失性存储器)用于存储指令(例如，本文提供的过程的实施方案)和/或数据(例如，工件，例如甲基化测量、序列和与其相关的统计描述)。一些实施方案涉及还包括CPU、图形卡和用户界面(例如，包括输出设备如显示器和输入设备如键盘)中的一个或多个的***。
与本技术相关的可编程机器包括常规现有技术以及正在开发的或尚未开发的技术(例如，量子计算机、化学计算机、DNA计算机、光学计算机、基于自旋电子的计算机等)。
在一些实施方案中，本技术包括用于传输数据的有线(例如，金属电缆、光纤)或无线传输介质。例如，一些实施方案涉及通过网络(例如，局域网(LAN)、广域网(WAN)、自组织网络、互联网等)的数据传输。在一些实施方案中，可编程机器作为节点存在于这样的网络上，在一些实施方案中，可编程机器具有客户端/服务器关系。
在一些实施方案中，数据存储在计算机可读存储介质上，例如硬盘、闪存、光学介质、软盘等。
在一些实施方案中，本文提供的技术与多个可编程设备相关联，这些可编程设备一起操作以执行本文所述的方法。例如，在一些实施方案中，多个计算机(例如，由网络连接)可以并行工作以收集和处理数据，例如在集群计算或网格计算的实现中或依赖于通过常规网络接口如以太网、光纤或者无线网络技术连接到网络(私人、公共或互联网)的完整计算机(具有板载CPU、存储器、电源、网络接口等)的一些其他分布式计算机体系结构。
例如，一些实施方案提供了包括计算机可读介质的计算机。该实施方案包括耦合到处理器的随机存取存储器(RAM)。处理器执行存储在存储器中的计算机可执行程序指令。这样的处理器可以包括微处理器、ASIC、状态机或其他处理器，并且可以是多个计算机处理器中的任何一个，例如来自加利福尼亚州圣克拉拉市的英特尔公司的处理器，以及伊利诺斯州绍姆堡的摩托罗拉公司的处理器。这样的处理器包含介质或可以与介质通信，例如计算机可读介质，其存储当由处理器执行时使处理器执行本文所述的步骤的指令。
计算机可读介质的实施方案包括但不限于能够向处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其他存储或传输设备。合适介质的其他例子包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、ASIC、配置的处理器、所有光学介质、所有磁带或其他磁介质，或计算机处理器可以从其读取指令的任何其他介质。此外，各种其他形式的计算机可读介质可以向计算机发送或携带指令，包括有线和无线的路由器、私人或公共网络或其他传输设备或信道。指令可以包括来自任何合适的计算机编程语言的代码，包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl和JavaScript。
在一些实施方案中，计算机连接到网络。计算机还可以包括许多外部或内部设备，例如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器或其他输入或输出设备。计算机的实例是个人计算机、数字助理、个人数字助理、蜂窝电话、移动电话、智能电话、寻呼机、数字平板电脑、膝上型计算机、互联网设备和其他基于处理器的设备。通常，与本文提供的技术的方面相关的计算机可以是任何类型的基于处理器的平台，其在能够支持包含本文提供的技术的一个或多个程序的任何操作***(例如，MicrosoftWindows、Linux、UNIX、Mac OS X等)上操作。一些实施方案包括执行其他应用程序(例如，应用软件)的个人计算机。应用程序可以包含在存储器中，并且可以包括例如文字处理应用程序、电子表格应用程序、电子邮件应用程序、即时消息应用程序、演示文稿应用程序、互联网浏览器应用程序、日历/管理器应用程序以及能够由客户端设备执行的任何其他应用程序。
本文中描述的与本技术相关联的所有这样的组件、计算机和***可以是逻辑的或虚拟的。
因此，本文提供了与在获自受试者的样品中筛选BE的方法相关的技术，所述方法包括测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有BE的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有BE，其中所述标志物包含选自以下的差异甲基化区域(DMR)中的一个或多个碱基：表1中提供的DMR 1-78和/或表7中提供的DMR 21和188-193和/或；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187和193-229。
本文提供了与在获自受试者的样品中区分BE和BED的方法相关的技术，所述方法包括测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及当所述标志物的甲基化状态类似于在具有BE的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为具有BE，或者当所述标志物的甲基化状态类似于在具有BED的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为具有BED，其中所述标志物包含选自以下的差异甲基化区域(DMR)中的一个或多个碱基：表2中提供的DMR 3、5、30、33、43、77和79-128，表3中提供的DMR77、27、193、90、92、101、129-134，表5中提供的DMR 77、90和135，和/或表6中提供的DMR136-187。
本文提供了与在获自受试者的样品中区分BE-LGD、BE-HGD和BE-EAC的方法相关的技术，所述方法包括测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及当所述标志物的甲基化状态类似于在具有BE-LGD的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为具有BE-LGD，当所述标志物的甲基化状态类似于在具有BE-HGD的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为具有BE-HGD，或者当所述标志物的甲基化状态类似于在具有EAC的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时将所述受试者鉴定为具有EAC，其中所述标志物包含选自以下的差异甲基化区域(DMR)中的一个或多个碱基：表5中提供的DMR 77、90和135。
本技术不限于评估的甲基化状态。在一些实施方案中，评估样品中标志物的甲基化状态包括确定一个碱基的甲基化状态。在一些实施方案中，测定样品中标志物的甲基化状态包括测定多个碱基的甲基化程度。此外，在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的升高的甲基化。在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的降低的甲基化。在一些实施方案中，标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的不同的甲基化模式。
此外，在一些实施方案中，标志物是100个或更少碱基的区域，标志物是500个或更少碱基的区域，标志物是1000个或更少碱基的区域，标志物是5000个或更少碱基的区域，或在一些实施方案中，标志物是一个碱基。在一些实施方案中，标志物在高CpG密度启动子中。
本技术不受样品类型的限制。在一些实施方案中，样品是通过全食管拭抹或刷擦获得的食管组织(参见实施例1和表5)(参见实施例5和表8)。在一些实施方案中，样品是通过使用海绵胶囊装置获得的食管组织(参见实施例5和表8)。例如，在一些实施方案中，样品是粪便样品、组织样品(例如食管组织、胃组织、胰腺组织、胆管/肝组织和结肠直肠组织)、血液样品(例如血浆、血清、全血)、***物或尿液样品。
此外，本技术不限于用于确定甲基化状态的方法。在一些实施方案中，测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。在一些实施方案中，测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。在一些实施方案中，本技术使用大规模并行测序(例如，下一代测序)来确定甲基化状态，例如通过合成的测序、实时(例如单分子)测序、珠粒乳液测序、纳米孔测序等。
本技术提供了用于检测DMR的试剂，例如在一些实施方案中，提供了包含SEQ IDNO：1-50提供的序列的寡核苷酸的组。在一些实施方案中，提供了包含与在DMR中具有碱基的染色体区域互补的序列的寡核苷酸，例如对DMR的甲基化状态敏感的寡核苷酸。
本技术提供了多个标志物的组，例如，在一些实施方案中，标志物包含具有在表1、2、3、5、6、7和/或8中提供的注释的染色体区域，并且包括标志物(参见，表1、2、3、5、6、7、8)的标志物。此外，实施方案提供了分析来自表1、2、3、5、6、7和/或8的DMRNo.1-229中的一个或多个的DMR的方法。
提供了试剂盒实施方案，例如试剂盒包含：亚硫酸氢盐试剂；和对照核酸，所述对照核酸包含来自选自DMR 1-194(来自表1、2、3、5、6、7和/或8)的DMR的序列，并且有与不具有食管疾病的受试者(例如，不具有BE、BED、BE-LGD、BE-HGD和EAC的受试者)相关的甲基化状态。在一些实施方案中，试剂盒包含亚硫酸氢盐试剂和本文所述的寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含亚硫酸氢盐试剂；和对照核酸，所述对照核酸包含来自选自DMR 1-194(来自表1、2、3、5、6、7、8)的DMR的序列，并且有与具有食管疾病的受试者(例如，具有BE的受试者)(例如，具有BED、BE-LGD、BE-HGD和EAC的受试者)相关的甲基化状态。一些试剂盒实施方案包含用于从受试者获得样品(例如粪便样品)的样品收集器；用于从样品中分离核酸的试剂；亚硫酸氢盐试剂；以及本文所述的寡核苷酸。
本技术与组合物(例如反应混合物)的实施方案有关。在一些实施方案中提供了组合物，其包含含有DMR的核酸和亚硫酸氢盐试剂。一些实施方案提供了组合物，其包含含有DMR的核酸和本文所述的寡核苷酸。一些实施方案提供了组合物，其包含含有DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。一些实施方案提供了组合物，其包含含有DMR的核酸和聚合酶。
提供了用于在获自受试者的样品中筛选食管疾病(例如BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的另外的相关方法的实施方案，例如方法包括确定样品中在DMR中包含碱基的生物标志的甲基化状态，所述DMR是DMR 1-229中的一个或多个(来自表1、2、3、5、6、7、8)；将来自受试者样品的标志物的甲基化状态与来自不具有食管疾病的受试者的正常对照样品的标志物的甲基化状态进行比较；以及确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。在一些实施方案中，置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。方法的一些实施方案提供了以下步骤：使包含DMR的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自不具有癌症的受试者的包含DMR的核酸的核苷酸序列进行比较以鉴定两个序列中的差异；当年存在差异时将所述受试者鉴定为具有肿瘤。
本技术提供了用于在获自受试者的样品中筛选食管疾病(例如BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的***。***的示例性实施方案包括例如用于在获自受试者的样品中筛选食管疾病的***，所述***包括：分析组件，其被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为警告食管疾病相关甲基化状态(例如，没有食管疾病的甲基化状态；BE的甲基化状态；BED的甲基化状态；BE-LGD的甲基化状态；BE-HGD的甲基化状态；EAC的甲基化状态)的使用者。在一些实施方案中，由接收来自多个测定的结果(例如，确定多种标志物，例如1、2、3、5、6、7和/或8中提供的DMR的甲基化状态)以及基于多个结果计算待报告的值或结果的软件组件确定警报。一些实施方案提供了与本文提供的每个DMR相关联的加权参数的数据库，以用于计算值或结果和/或警报以向使用者(例如医师、护士、临床医师等)报告。在一些实施方案中，报告来自多个测定的所有结果，在一些实施方案中，使用一个或多个结果来基于来自多个测定的一个或多个结果的综合提供评分、值或结果，其指示受试者中的食管疾病的风险(例如，指示BE的风险；指示BED的风险；指示BE-LGD的风险；指示BE-HGD的风险；指示EAC的风险)。
在***的一些实施方案中，样品包含含有DMR的核酸。在一些实施方案中，***还包括用于分离核酸的组件，用于收集样品的组件，例如用于收集粪便样品的组件。在一些实施方案中，***包含含有DMR的核酸序列。在一些实施方案中，数据库包含来自不具有食管疾病的受试者的核酸序列。还提供了核酸，例如核酸的组，每个核酸具有包含DMR的序列。在一些实施方案中，核酸的组，其中每个核酸具有来自不具有食管疾病的受试者的序列。相关***实施方案包括如所述的核酸的组和与该核酸的组相关的核酸序列的数据库。一些实施方案还包括亚硫酸氢盐试剂。而且，一些实施方案还包括核酸测序仪。
在某些实施方案中，提供了用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管的方法，其包括a)从受试者获得包含DNA的样品；b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.1-78、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185和187-229提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：i)不具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及e)当i)和ii)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
在某些实施方案中，提供了用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管发育异常的方法，其包括a)从受试者获得包含DNA的样品；b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMR No.3、5、30、33、43、58、77、79-187提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：i)具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及e)当i)和ii)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管发育异常。
在某些实施方案中，提供了用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管低度发育异常的方法，其包括a)从受试者获得包含DNA的样品；b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：i)不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，iii)具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和iv)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及e)当i)、ii)、iii)和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管低度发育异常。
在某些实施方案中，提供了用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管高度发育异常的方法，其包括a)从受试者获得包含DNA的样品；b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：i)不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，iii)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和iv)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及e)当i)、ii)、iii和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管高度发育异常。
在某些实施方案中，提供了用于在获自受试者的样品中检测食管腺癌的方法，其包括a)从受试者获得包含DNA的样品；b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMR No.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：i)不具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异，ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，iii)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和iv)具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及e)当i)、ii)、iii和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有食管腺癌。
在一些实施方案中，一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
在一些实施方案中，CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
在一些实施方案中，确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。在一些实施方案中，通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
在一些实施方案中，通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
在一些实施方案中，样品包含食管组织。在一些实施方案中，食管组织通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得
基于本文包含的教导，对于相关领域的技术人员来说，额外的实施方案将是明显。
附图说明
图1：来自没有发育异常和具有不同严重程度的发育异常的BE亚组的组织DNA中的3个标志物的组(DIO3、MAX20.218、NDRG4)(表5)的阳性率(实施例I、III、III和IV)。
图2：来自阶段2(内窥镜刷研究)的BE病例和正常(N1)对照中甲基化DNA标志物水平(PCR拷贝/20ng DNA)(实施例V)。
图3：来自阶段2的顶部甲基化DNA标志物的命中矩阵，突出了互补性(内窥镜刷研究)(实施例V)。
图4：来自阶段3(胶囊海绵研究)的BE病例和正常(N1)对照中甲基化DNA标志物水平(PCR拷贝/30ng DNA)(实施例V)。
详述
巴雷特食管(BE)是食管腺癌(EAC)的最强风险因素和唯一已知的前体，食管腺癌是致死性恶性肿瘤，当症状发作后检测时具有差的存活率(5年<20％)(见Nelsen EM,等,The Surgical clinics of North America 2012；92:1135-54)。食管腺癌的发病率在过去三十年在人群中增加了近600％(参见，Hur C,等,Cancer 2013；119:1149-58)。BE从无发育异常，到低度发育异常(LGD)，到高度发育异常(HGD)到癌进展以逐步方式到EAC。这种化生到发育异常到癌的顺序已经促使多个国家的胃肠病学会推荐在具有多种风险因素的高风险患者中筛选BE，随后进行内窥镜监测(取决于发育异常的等级)，以在早期检测发育异常或癌的进展(参见Spechler SJ,等,Gastroenterology 2011；140:e18-52；Wang KK,等,AmJ Gastroenterol 2008；103:788-97；Fitzgerald RC,等,Gut 2014；63:7-42)。已经开发了LGD、HGD和早期癌的内窥镜治疗，并且显示出在BE受试者中有效降低癌的发病率并且改善存活率(参见例如，Prasad GA,等,Gastroenterology 2007；132:1226-33；Prasad GA,等,Gastroenterology 2009；ShaheenNJ,等,N Engl J Med 2009；360:2277-88；Phoa KN,等,JAMA 2014；311:1209-17)。
BE的筛选目前使用常规镇静内窥镜检查(sEGD)进行，其显示在BE患者中食管的正常鳞状内层被化生柱状上皮代替。然而，镇静内窥镜检查在直接和间接成本方面是昂贵的，不适合广泛应用。它也与潜在并发症有关(参见Sami SS,等,Clinical gastroenterologyand hepatology:the official clinical practice journal of the AmericanGastroenterologicalAssociation 2015；13:623-34)。其他技术，如未镇静的经鼻内窥镜检查(uTNE)具有与sEGD相当的准确性和较低成本，但仍然不太被供应商认为是广泛适用的工具(参见Sami SS,等,The American journal of gastroenterology 2015；110:148-58；Peery AF,等,Gastrointestinal endoscopy 2012；75:945-953e2；Atkinson M,等,Gastroenterology&hepatology 2007；4:426-7)。尽管uTNE设备有足够的访问权限，但咨询医生对uTNE的使用仍然有限(参见，Atkinson M,等,TheAmericanjournalofgastroenterology 2008；103:92-7)。缺少准确的风险分层工具来确定BE风险和靶筛选工作是广泛适用的BE筛选的另外的限制(参见Sami SS,等,Clinical gastroenterologyand hepatology:the official clinical practice journal of the AmericanGastroenterologicalAssociation 2015；13:623-34)。
除了利用高分辨率白光成像和先进成像技术仔细检查BE段以外，目前使用每1-2cm的BE段的四象限随机活检进行发育异常的内窥镜检查。虽然这已经得到GI协会的推荐(参见例如Spechler SJ,等,Gastroenterology 2011；140:e18-52；Wang KK,等,Am JGastroenterol 2008；103:788-97；FitzgeraldRC,等,Gut 2014；63:7-42)，在实际胃肠病学家中依从这些推荐的依然很少(参见，Abrams JA,等,Clin Gastroenterol Hepatol2009)。实际上，依从性随着BE段长度的增加而减小，导致增加错误发育异常的发生率。BE中发育异常检测的其他挑战包括BE中发育异常的不连续分布(参见Cameron AJ,等,Am JGastroenterol 1997；92:586-91)，其导致抽样误差，发育异常分级时病理学家之间差的观察者间一致性，以及在检测普遍性发育异常或癌中目前监测策略的相对差的灵敏度(参见Sharma P,等,Gastroenterology 2004；127:310-30)。团体中先进成像技术的使用仍然不清楚，仅三分之一的从业胃肠病学家报告在BE监测中经常使用(参见Singh M,等,Gastrointestinal endoscopy 2013；78:689-95)。最近已经在BE筛选中研究了一种细绳上的海绵装置(参见Kadri SR,等,Bmj 2010；341:c4372)。这种装置由连接到细绳的压缩在明胶胶囊中的聚氨酯泡沫海绵组成。胶囊被患者吞咽。胶囊的明胶壳溶解于胃液中，释放出作为球体的泡沫装置，然后用连接的细绳将其拉出，提供近端胃和食管的刷擦/细胞样品。然后可以对这些样品进行生物标志物研究以检测BE。已经在英国利用这种装置进行了两项大型多中心研究，其使用在免疫组织化学中检测到的三叶因子3(对BE上皮细胞有特异性的蛋白质)作为BE标志物，证明了这种方法的可行性、安全性和准确性(参见Kadri SR,等,Bmj2010；341:c4372；Ross-Innes CS,等,PLoS medicine 2015；12:e1001780)。据报道，对于圆周长度>1cm的BE段，这种标志物在BE检测中的灵敏度和特异性为73％和94％。此外，这种胶囊海绵装置已经安全地用于在Mayo Clinic Rochester在具有嗜酸性食管炎的受试者中进行的研究中(参见，Katzka DA,等,Clinical gastroenterology and hepatology:theofficial clinical practice journal of theAmericanGastroenterologicalAssociation 2015；13:77-83e2)。已经描述了对BE上皮(具有和没有发育异常)有特异性的甲基化DNA标志物(参见Kaz AM,等,Cancer letters 2014；342:193-9；Ahlquist DA,等,Clinical gastroenterology and hepatology:the officialclinical practice journal of the American Gastroenterological Association2012；10:272-7 e1)。
本文提供了用于食管疾病筛选的技术，特别地但不排他地涉及用于检测食管疾病(例如巴雷特食管、巴雷特食管发育异常等)的存在的方法、组合物和相关用途。此外，本技术提供了在通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得的样品中区分巴雷特食管和巴雷特食管发育异常以及巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的方法、组合物和相关用途。
对于本文所述的技术，所使用的章节题目仅用于组织目的，而不应以任何方式解释为限制主题。
在各个实施方案的详细描述中，为了说明的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，这些各个实施方案可以在具有或不具有这些具体细节的情况下实施。在另一些情况下，结构和设备以框图形式显示。此外，本领域技术人员可以容易地理解，其中呈现和实施方法的具体顺序是说明性的，并且预期顺序可以变化，并且仍然保持在本文公开的各个实施方案的精神和范围内。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页都通过引用整体并入本文用于所述目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述的各个实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。当引入的参考文献中的术语的定义似乎与本教导中提供的定义不同时，以本教导中提供的定义为准。
定义
为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。在整个详述中阐述了其他定义。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本文中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本文中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本文所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在……中”中的含义包括“在……中”和“在……上”。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”通常是指任何核糖核酸或脱氧核糖核酸，其可以是未修饰的或经修饰的DNA或RNA。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。如本文所用，术语“核酸”还包括含有一个或多个经修饰碱基的如上所述的DNA。因此，为了稳定性或由于其他原因具有经修饰骨架的DNA是“核酸”。如本文所用，术语“核酸”包括核酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂的细胞)的DNA特征的化学形式。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个，优选多于三个，通常多于十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切的大小将取决于许多因素，这些因素又依赖于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
如本文所使用的，核酸的术语“基因座”或“区域”是指核酸的子区域，例如染色体上的基因、单核苷酸、CpG岛等。
术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5'-A-G-T-3'与序列3'-T-C-A-5'互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
术语“基因”是指包含产生RNA或多肽或其前体所必需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。功能性多肽可以由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的期望活性或功能性质(如酶活性、配体结合、信号转导等)即可。当用于提及基因时，术语“部分”是指该基因的片段。片段的大小可以从几个核苷酸到整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可以包含基因的片段或整个基因。
术语“基因”还包括结构基因的编码区，并且包括在5'和3'末端与编码区相邻定位的序列，例如在任一端约1kb的距离，使得基因对应于全长mRNA的长度(例如，包括编码、调节、结构和其他序列)。位于编码区的5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译或非翻译序列。位于编码区3'或下游并存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译或3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。在一些生物体(例如真核生物)中，基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“***区”或“***序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可以包含调节元件，如增强子。内含子从核或初级转录物中删除或“剪出”，因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中起作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包含位于RNA转录物上存在的序列的5'和3'末端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区域可能含有调节序列，如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3'侧翼区域可以包含指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。
当提及基因时，术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因特征的基因。当提及基因产物时，术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因产物的特征的基因产物。用于受试者的术语“天然存在”是指在自然界中可以找到受试者的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，其可以从天然来源分离并且没有在实验室中被人为有意修饰。野生型基因通常是在群体中最常见的基因或等位基因，因此被任意地指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相比之下，当提及基因或基因产物时，术语“修饰的”或“突变体”分别指当与野生型基因或基因产物相比时显示序列和/或功能性质的修饰(例如，改变的特征)的基因或基因产物。应注意，天然存在的突变体可以被分离；这些通过与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征的事实来确定。
术语“等位基因”是指基因的变异；变化包括但不限于变体和突变体、多态性位点和单核苷酸多态性位点、移码和剪接突变。等位基因可能在人群中自然发生，或者可能在群体的任何特定个体的生命周期中出现。
因此，当用于提及核苷酸序列时，术语“变体”和“突变体”是指与另一个通常相关的核苷酸酸序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。“变异”是两个不同核苷酸序列之间的差异；通常，一个序列是参考序列。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特例。它与非特异性模板复制(例如，依赖于模板的但不依赖于特异性的模板的复制)进行对比。这里的模板特异性区别于复制的保真度(例如合成适当的多核苷酸序列)和核苷酸(核糖或脱氧核糖核酸)特异性。模板特异性经常用“靶”特异性来描述。靶序列在某种意义上是尝试从其他核酸中挑选出的“靶”。扩增技术主要设计用于这种挑选。
核酸的扩增通常是指产生多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝，通常从少量的多核苷酸(例如，单个多核苷酸分子，10至100个拷贝的多核苷酸分子，可能完全相同或不完全相同)开始，其中扩增产物或扩增子通常可检测。多核苷酸的扩增包括各种化学和酶的过程。在聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链反应(LCR；参见例如美国专利No.5,494,810)期间从一个或几个拷贝的靶或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。其他类型的扩增包括但不限于等位基因特异性PCR(参见例如美国专利No.5,639,611)、组装PCR(参见例如美国专利No.5,965,408)、解旋酶依赖性扩增(参见例如，美国专利No.7,662,594)、热启动PCR(参见例如美国专利No.5,773,258和5,338,671)、序列间特异性PCR、反向PCR(参见例如Triglia，等(1988)NucleicAcids Res.,16:8186)、连接介导的PCR(参见例如Guilfoyle，R等，Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利No.5,508,169)、甲基化特异性PCR(参见，例如Herman等(1996)PNAS 93(13)9821-9826)、微引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(参见例如Schouten,等,(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57)、多重PCR(参见例如Chamberlain,等,(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio,等,(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden,等,(2008)BMC Genetics 9:80)、嵌套式PCR、重叠延伸PCR(参见例如Higuchi,等,(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367)、实时PCR(参见例如Higuchi,等等,(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi,等,(1993)Biotechnology 11:1026-1030)、逆转录PCR(参见例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193)、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR(参见例如Don,等,Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker,等,(1996)Biotechniques 20(3)478-485)。多核苷酸扩增也可以使用数字PCR完成(参见例如Kalinina,等,Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利公开No.WO05023091A2；美国专利申请公开No.20070202525)。
术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利No.4,683,195,4,683,202和4,965,188的方法，其描述了一种用于增加基因组DNA混合物中靶序列的片段浓度而不进行克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。
在大多数扩增技术中通过酶的选择实现了模板特异性。扩增酶是在使用它们的条件下仅在核酸的非均质混合物中处理核酸的特定序列的酶。例如，在Q-β复制酶的情况下，MDV-1RNA是复制酶的特异性模板(Kacian等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:3038[1972])。其他核酸不会被这种扩增酶复制。类似地，在T7 RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶对其本身的启动子具有严格的特异性(Chamberlin等,Nature,228:227[1970])。在T4 DNA连接酶的情况下，酶不会连接两个寡核苷酸或多核苷酸，其中在连接处寡核苷酸或多核苷酸底物与连接模板之间存在错配(Wu和Wallace(1989)Genomics 4:560)。最后，发现热稳定性模板依赖性DNA聚合酶(例如Taq和Pfu DNA聚合酶)由于其在高温下作用的能力而显示出对引物结合并因此限定的序列的高度特异性；高温导致有利于引物与靶序列杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件(H.A.Erlich(编辑),PCR Technology,Stockton Press[1989])。
如本文所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性切割测定(例如，INVADER测定,Hologic,Inc.)，并且描述于例如美国专利No.5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等,PNAS,USA,97:8272(2000)和US 2009/0253142)；酶错配切割方法(例如，Variagenics，美国专利No.6,110,684、5,958,692、5,851,770)；聚合酶链式反应；支化杂交方法(例如，Chiron，美国专利No.5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802)；滚环复制(例如美国专利No.6,210,884、6,183,960和6,235,502)；NASBA(例如美国专利No.5,409,818)；分子信标技术(例如美国专利No.6,150,097)；电子传感器技术(Motorola，美国专利No.6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573)；循环探针技术(例如美国专利No.5,403,711、5,011,769和5,660,988)；Dade Behring信号扩增方法(例如美国专利No.6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614)；连接酶链反应(Barnay Proc.Natl.Acad.SciUSA 88,189-93(1991))；和夹心杂交方法(例如美国专利No.5,288,609)。
术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。
术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测***中可检测，包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光***。本发明不意图限制于任何特定的检测***或标签。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
如本文所用，“甲基化核酸分子”是指含有一个或多个甲基化核苷酸的核酸分子。
如本文所用，核酸分子的“甲基化状态”、“甲基化特征”和“甲基化情形”是指在核酸分子中一个或多个甲基化核苷酸碱基的存在或不存在。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子被认为是甲基化的(例如，核酸分子的甲基化状态是甲基化的)。不含任何甲基化核苷酸的核酸分子被认为是未甲基化的
特定核酸序列(例如，本文所述的基因标志物或DNA区域)的甲基化状态可以指示序列中每个碱基的甲基化状态或可以指示序列中碱基子集(例如，一个或多个胞嘧啶)的甲基化状态，或者可以指示关于序列内区域甲基化密度的信息，而提供或不提供序列内甲基化发生的位置的精确信息。
核酸分子中的核苷酸位点的甲基化状态是指核酸分子中特定位点处的甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，当核酸分子中第7个核苷酸处存在的核苷酸是5-甲基胞嘧啶时，核酸分子中第7个核苷酸处的胞嘧啶的甲基化状态是甲基化的。类似地，当核酸分子中第七核苷酸处存在的核苷酸是胞嘧啶(而不是5-甲基胞嘧啶)时，核酸分子中第七核苷酸处的胞嘧啶的甲基化状态是未甲基化的。
甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。当希望将样品中的序列的甲基化状态与阈值或参考值进行比较时，这是特别有用的。
如本文所用，“甲基化频率”或“甲基化百分比(％)”是指相对于分子或基因座未甲基化的情况的数目，分子或基因座甲基化的情况的数目。
因此，甲基化状态描述了核酸(例如，基因组序列)的甲基化状态。此外，甲基化状态是指特定基因组位点处的核酸片段的与甲基化相关的特征。这些特征包括但不限于该DNA序列中的任何胞嘧啶(C)残基是否是甲基化的，甲基化C残基的位置，核酸的任何特定区域中甲基化C的频率或百分比，以及甲基化中的等位基因差异，例如由于等位基因来源的差异。术语““甲基化状态”、“甲基化特征”和“甲基化情形”还指生物样品中核酸的任何特定区域的甲基化C或未甲基化C的相对浓度、绝对浓度或模式。例如，如果核酸序列中的胞嘧啶(C)残基是甲基的，则其可以称为“高甲基化”或具有“增加的甲基化”，而如果DNA序列内的胞嘧啶(C)残基序列不是甲基化的，则其可以称为“低甲基化”或具有“降低的甲基化”。同样，如果核酸序列中的胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如，来自不同的区域或不同的个体等)相比是甲基化的，则认为该序列与另一核酸序列相比是高甲基化的或具有增加的甲基化。或者，如果DNA序列中的胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如，来自不同的区域或不同的个体等)相比不是甲基化的，则认为该序列与另一核酸序列相比是低甲基化的或具有降低的甲基化。另外，本文所用的术语“甲基化模式”是指核酸区域上的甲基化和未甲基化核苷酸的集合位点。当整个区域上甲基化和未甲基化核苷酸的数量相同或相似，但是甲基化和未甲基化核苷酸的位置不同时，两个核酸可能具有相同或相似的甲基化频率或甲基化百分数，但是具有不同的甲基化模式。当序列的甲基化的程度(例如一个相对于另一个具有升高的或降低的甲基化)、频率或模式不同时，认为序列是“差异甲基化”的或具有“甲基化差异”或“不同的甲基化状态”。术语“差异甲基化”是指与癌症阴性样品中核酸甲基化的水平或模式相比，癌症阳性样品中核酸甲基化水平或模式的差异。其也可能指手术后癌症复发的患者与没有复发的患者之间的水平或模式差异。差异甲基化和DNA甲基化的特定水平或模式是预后和预测性生物标志物，例如一旦确定了正确的切断或预测特征。
甲基化状态频率可用于描述个体的群体或来自单个个体样品。例如，具有50％的甲基化状态频率的核苷酸位点是在50％的情况下是甲基化的，在50％的情况下是未甲基化的。这样的频率可以用于例如描述个体的群体或核酸集合中核苷酸位点或核酸区域甲基化的程度。因此，当第一群体或核酸分子库中的甲基化与第二群体或核酸分子库中的甲基化不同时，第一群体或库的甲基化状态频率不同于第二群体或库的甲基化状态频率。这样的频率也可以用于例如描述单个个体中核苷酸位点或核酸区域甲基化的程度。例如，这样的频率可用于描述来自组织样品的细胞组在核苷酸位点或核酸区域甲基化或未甲基化的程度。
如本文所用，“核苷酸位点”是指核酸分子中核苷酸的位置。甲基化核苷酸的核苷酸位点是指核酸分子中甲基化核苷酸的位置。
通常，人DNA的甲基化发生在包含相邻的鸟嘌呤和胞嘧啶的二核苷酸序列上，其中胞嘧啶位于鸟嘌呤的5'(也称为CpG二核苷酸序列)。在人基因组中CpG二核苷酸中的大多数胞嘧啶是甲基化的，然而在特定的CpG二核苷酸富集的基因组区域(被称为CpG岛)中一些保持未甲基化(参见例如Antequera等(1990)Cell 62:503–514)。
如本文所用，“CpG岛”是指含有相对于总基因组DNA，包含增加数量的CpG二核苷酸的基因组DNA的富含G:C的区域。CpG岛可以是至少100、200或更长的碱基对，其中该区域的G:C含量为至少50％，并且观察到的CpG频率与预期频率的比率为0.6；在一些情况下，CpG岛可以是至少500个碱基对的长度，其中该区域的G:C含量为至少55％)，并且观察到的CpG频率与预期频率的比率为0.65。观察到的CpG频率相对于预期频率可以根据Gardiner-Garden等(1987)J.Mol.Biol.196:261–28中提供的方法计算。例如，可以根据公式R＝(A×B)/(C×D)计算观察到的CpG频率相对于预期频率，其中R是观察到的CpG频率与预期频率的比率，A是分析序列中CpG二核苷酸的的数量，B是分析序列中核苷酸的总数，C是分析序列中C核苷酸的总数，D是分析序列中G核苷酸的总数。甲基化状态通常在CpG岛中，例如在启动子区确定。应当理解，但是人基因组中的其他序列也倾向于DNA甲基化，例如CpA和CpT(参见例如Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5237–5242；Salmon和Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204:340–351；Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.13:2827–2842；Nyce(1986)Nucleic Acids Res.14:4353–4367；Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145:888-894)。
如本文所用，作为核酸分子的甲基化状态的函数修饰核酸分子的核苷酸的试剂或者甲基化特异性试剂是指可以以反映核酸分子的甲基化状态的方式改变核酸分子的核苷酸序列的化合物或组合物或其他试剂。用这样的试剂处理核酸分子的方法可以包括使核酸分子与试剂接触，外加如果需要的另外的步骤，以实现核苷酸序列的期望变化。核酸分子的核苷酸序列的这种变化可导致其中每个甲基化核苷酸被修饰成不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列的这种变化可导致其中每个未甲基化核苷酸被修饰成不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列的这种变化可导致其中每个未甲基化的所选核苷酸(例如，每个未甲基化的胞嘧啶)被修饰成不同的核苷酸的核酸分子。使用这种试剂来改变核酸核苷酸序列可导致其中为甲基化核苷酸的每个核苷酸(例如每个甲基化胞嘧啶)被修饰成不同核苷酸的核酸分子。如本文所用，使用修饰所选核苷酸的试剂是修饰核酸分子中四种通常存在的核苷酸(DNA的C、G、T和A，以及RNA的C、G、U和A)中的一种核苷酸的试剂，使得试剂修饰一种核苷酸而不修饰其他三种核苷酸。在一个示例性实施方案中，这种试剂修饰未甲基化的所选核苷酸以产生不同的核苷酸。在另一个示例性实施方案中，这种试剂可以去除未甲基化的胞嘧啶核苷酸。示例性试剂是亚硫酸氢盐。
如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
术语“MS AP-PCR”(甲基化敏感性任意引物聚合酶链式反应)是指本领域公认的技术，其允许使用富含CG的引物对基因组进行全局扫描，以集中于最可能含有CpG二核苷酸的区域，由Gonzalgo等(1997)Cancer Research 57:594–599描述。
术语“MethyLightTM”是指本领域公认的基于荧光的实时PCR技术，由Eads等(1999)Cancer Res.59:2302–2306描述。
术语“HeavyMethylTM”是指其中覆盖位于扩增引物之间或由扩增引物覆盖的CpG位置的甲基化特异性阻断探针(本文也称为阻断剂)能够对核酸样品进行甲基化特异性选择性扩增的测定。
术语“HeavyMethylTM MethyLightTM”测定是指HeavyMethylTM MethyLightTM测定，其为MethyLightTM测定的变化形式，其中MethyLightTM测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针相结合。
术语“Ms-SNuPE”(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)是指由Gonzalgo&Jones(1997)NucleicAcids Res.25:2529–2531描述的本领域公认测定。
术语“MSP”(甲基化特异性PCR)是指由Herman等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821–9826和美国专利No.5,786,146描述的本领域公认的甲基化测定。
术语“COBRA”(组合亚硫酸氢盐限制性分析)是指由Xiong&Laird(1997)NucleicAcids Res.25:2532–2534描述的本领域公认的甲基化测定。
术语“MCA”(甲基化CpG岛扩增)是指Toyota等(1999)Cancer Res.59:2307–12和WO00/26401A1描述的本领域公认的甲基化测定。
如本文所用，“所选核苷酸”是指核酸分子中四种通常存在的核苷酸(DNA的C、G、T和A，以及RNA的C、G、U和A)中的一种核苷酸，并且可以包括通常存在的核苷酸的甲基化衍生物(例如，当C是所选核苷酸时，甲基化和未甲基化的C都包括在所选核苷酸的含义内)，而甲基化所选核苷酸特别地指甲基化的通常存在的核苷酸，未甲基化的所选核苷酸特别地指未甲基化的通常存在的核苷酸。
术语“甲基化特异性限制酶”或“甲基化敏感性限制酶”是指根据其识别位点的甲基化状态选择性消化核酸的酶。在如果识别位点不是甲基化的或是半基化的则特异性切割的限制酶的情况下，如果识别位点是甲基化的，则切割不发生或者以显著降低的效率发生。在如果识别位点是甲基化的则特异性切割的限制酶的情况下，如果识别位点不是甲基化的，则切割不发生或者以显著降低的效率发生。优选甲基化特异性限制酶，其识别序列含有CG二核苷酸(例如识别序列如CGCG或CCCGGG)。对于一些实施方案，进一步优选的是如果该二核苷酸中的胞嘧啶在碳原子C5处被甲基化，则不切割的限制酶。
如本文所用，“不同核苷酸”是指与所选核苷酸化学不同的核苷酸，通常使得不同核苷酸具有与所选核苷酸不同的沃森-克里克碱基配对性质，因此与所选核苷酸互补的通常存在的核苷酸和与不同核苷酸互补的通常存在的核苷酸不相同。例如，当C是所选核苷酸时，U或T可以是不同核苷酸，其通过C与G的互补以及U或T与A的互补扩增。如本文所用，与所选核苷酸互补或与不同核苷酸互补的核苷酸是指在高严格条件下，与所选核苷酸或不同核苷酸碱基配对的核苷酸，其亲和力高于互补核苷酸与四种通常存在的核苷酸中的三种的碱基配对。互补的实例是在DNA(例如，A-T和C-G)和RNA(例如，A-U和C-G)中的沃森-克里克碱基配对。因此，例如，在高严格条件下，和G碱基与G、A或T配对相比，G碱基以更高亲和力与C配对，因此，当C是所选核苷酸时，G是与所选核苷酸互补的核苷酸。
如本文所用，给定标志物的“灵敏度”是指报告高于区分肿瘤和非肿瘤样品的阈值的DNA甲基化值的样品的百分比。在一些实施方案中，阳性定义为报告高于阈值(例如，与疾病相关的范围)的DNA甲基化值的组织学确认的肿瘤，假阴性定义为报告低于阈值(例如，与疾病相关的范围)的DNA甲基化值的组织学确认的肿瘤。因此，灵敏度的值反映了从已知患病样品获得的给定标志物的DNA甲基化测量在疾病相关测量范围内的可能性。如这里所定义的，计算的灵敏度值的临床相关性表示当应用于具有病症的受试者时给定标志物将检测到临床病症的存在的可能性的估计。
如本文所用，给定标志物的“特异性”是指报告低于区分肿瘤和非肿瘤样品的阈值的DNA甲基化值的非肿瘤样品的百分比。在一些实施方案中，阴性定义为报告低于阈值(例如，与无疾病相关的范围)的DNA甲基化值的组织学证实的非肿瘤样品，假阳性定义为报告高于阈值(例如，与无疾病相关的范围)的DNA甲基化值的组织学证实的非肿瘤样品。因此，特异性值反映了从已知非肿瘤样品获得的给定标志物的DNA甲基化测量在非疾病相关测量范围内的可能性。如这里所定义的，所计算的特异性值的临床相关性表示当应用于没有病症的患者时给定标志物将检测到临床病症的不存在的可能性的估计。
如本文所用，术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。特别是指接收器工作特性(ROC)曲线下的面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率对假阳性率的图。它显示了取决于所选择的切割点的灵敏度和特异性之间的折中(灵敏度的任何增加都伴随着特异性的降低)。ROC曲线下的面积(AUC)是诊断测试精度的度量(面积越大越好；最优值为1；随机测试将在对角线上显示一个面积为0.5的ROC曲线；参考：J.P.Egan.(1975)SignalDetection Theory and ROC Analysis,Academic Press,NewYork)。
如本文所用，术语“肿瘤”是指“组织的异常质量，其生长超过了正常组织的生长并且与正常组织的生长不成正比”，参见例如Willis RA,“The Spread of Tumors in theHuman Body”,London,Butterworth&Co,1952。
如本文所用，术语“腺瘤”是指腺体起源的良性肿瘤。虽然这些生长是良性的，但随着时间的推移，它们可能会进一步恶化。
术语“前癌”或“前肿瘤”及其等同物是指正在经历恶性转化的任何细胞增殖性疾病。
肿瘤、腺瘤、癌症等的“部位”或“区域”是肿瘤、腺瘤、癌症等所在的受试者身体中的组织、器官、细胞类型、解剖区域、身体部位等。
如本文所用，术语“食管疾病”是指与食管和/或食管组织相关的疾病类型。食管疾病的例子包括但不限于巴雷特食管(BE)、巴雷特食管发育异常(BED)、巴雷特食管低度发育异常(BE-LGD)、巴雷特食管高度发育异常(BE-HGD)和食管腺癌(EAC)。
如本文所用，“诊断”测试应用包括检测或鉴定受试者的疾病状态或病症，确定受试者将接触给定疾病或病症的可能性，确定具有疾病或病症的受试者响应于治疗的可能性，确定具有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)，以及确定治疗对具有疾病或病症的受试者的影响。例如，诊断可以用于检测受试者接触肿瘤的存在或可能性，或者该受试者对化合物(例如，药物，例如药剂)或其他治疗有利地响应的可能性。
如本文所用，术语“标志物”是指能够通过例如基于甲基化状态区分疾病相关细胞(例如，与疾病相关的非癌细胞)(与疾病相关的癌细胞)和正常细胞来诊断疾病(例如，非癌性疾病)(例如，癌性疾病)的物质(例如，核酸或核酸区域)。
当用于指核酸时，如在“分离的寡核苷酸”中，术语“分离的”是指从在其天然来源中通常与其关联的至少一种污染物核酸鉴定和分离的核酸序列。分离的核酸以与自然界中发现的形式或设置不同的形式存在。相比之下，非分离的核酸，如DNA和RNA，在自然界存在的状态下发现。非分离核酸的实例包括：在相邻基因附近的宿主细胞染色体上发现的给定DNA序列(例如，基因)；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特异性mRNA序列，其在细胞中作为与编码大量蛋白质的许多其他mRNA的混合物发现。然而，编码特定蛋白质的分离的核酸通过实例包括通常表达蛋白质的细胞中的这种核酸，其中核酸处于与天然细胞不同的染色***置，或者侧翼为与天然发现的不同的核酸序列。分离的核酸或寡核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸或寡核苷酸用于表达蛋白质时，寡核苷酸将至少包含有义或编码链(即寡核苷酸可能是单链的)，但可含有正义和反义链(即，寡核苷酸可以是双链的)。在从其天然或典型环境分离后，分离的核酸可以与其他核酸或分子组合。例如，分离的核酸可以存在于其被放置于其中的宿主细胞中，例如用于异源表达。
术语“纯化的”是指从其天然环境中移出、分离或分开的核酸或氨基酸序列的分子。因此，“分离的核酸序列”可以是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含、优选地至少75％不含或更优选地至少90％不含与其天然缔合的其他组分。如本文所用，术语“纯化的”或“以纯化”还指从样品中除去污染物。除去污染蛋白质导致样品中目标多肽或核酸的百分比增加。在另一个实例中，重组多肽在植物、细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞中表达，并且通过除去宿主细胞蛋白来纯化所述多肽；因此样品中重组多肽的百分比增加。
术语“包含”给定多核苷酸序列或多肽的组合物广泛地是指包含给定多核苷酸序列或多肽的任何组合物。组合物可以包含含有盐(例如NaCl)、洗涤剂(例如SDS)和其他组分(例如Denhardt's溶液、干乳、鲑鱼***DNA等)的水溶液。
术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一个意义上，其可以指动物细胞或组织。在另一个意义上，其意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从植物或动物(包括人)获得并包含流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品等。这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。在一些实施方案中，样品包括食管组织。在一些实施方案中，样品包含通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得的食管组织。
如本文所用，在一些情况下使用的“远程样品(remote sample)”是指从不是样品的细胞、组织或器官来源的位点间接收集的样品。例如，当在粪便样品(例如，不是从胰腺直接取得的样品)中评估源自胰腺的样品材料时，样品是远程样品。
如本文所使用的，术语“患者”或“受试者”是指进行由本技术提供的各种测试的生物体。术语“受试者”包括动物，优选哺乳动物，包括人。在优选的实施方案中，受试者是灵长类动物。在更优选的实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送***。在反应测定的情况下，这种递送***包括允许将反应试剂(例如，合适的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或辅助材料(例如缓冲液、用于进行测定的书面说明等)从一个位置存储、运输或递送到另一个位置的***。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关反应试剂和/或辅助材料的外壳(例如盒)。如本文所用，术语“分离试剂盒(fragmented kit)”是指包括两个或更多个分开的容器的递送***，所述容器各自包含总试剂盒组分的子部分。容器可以一起或分开地递送到预期的接收器。例如，第一容器可以包含用于测定的酶，而第二容器包含寡核苷酸。术语“分离试剂盒”旨在包括根据Federal Food,Drug,and Cosmetic Act的第520(e)节规定的含有分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。实际上，包括两个或更多个分开的容器，每个容器包含总试剂盒成分的子部分的任何递送***均包括在术语“分离试剂盒”内。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中包含反应测定的所有组分(例如，在容纳每种期望组分的单个盒中)的递送***。术语“试剂盒”包括分离试剂盒和组合试剂盒两者。
本技术的实施方案
巴雷特食管是大多数食管腺癌的前体病变，食管腺癌是恶性肿瘤，具有迅速上升的发病率和持续不良的结果。已经表明食管腺癌的早期检测与较早阶段和增加的存活率相关。巴雷特食管的早期检测可能使患者能够进入监测程序，这可能允许在早期阶段检测肿瘤进展，以能够进行内窥镜或手术治疗，并改善结果。巴雷特食管和食管腺癌的筛选受到缺乏广泛适用的工具，以及缺乏可与筛选工具结合使用的生物标志物的限制。通过内窥镜和新的非内窥镜方法筛选的可接受性和可行性已经在人群中得到证实。非内窥镜筛选方法，例如吞咽的细胞学刷或粪便DNA检测，提供了用于在普通人群中鉴定巴雷特食管的内窥镜检查的潜在成本效益的替代方案。最近，已经发现几种异常甲基化的基因可以作为巴雷特食管的高度鉴别标志物。事实上，对具有和不具有巴雷特病患者的存档冷冻食管活检进行的研究显示，一组肿瘤相关基因可潜在地可用于区分巴雷特食管和鳞状粘膜。(参见例如Yang Wu,等,DDW Abstract 2011)。
已知发育异常在巴雷特食管中以零散方式分布，导致以四象限活检进行的常规内窥镜监测的“抽样误差”。已知常规内窥镜监测利用小于BE段的10％的活检样品。已知利用常规监测的内窥镜医师的依从性很差。虽然在三级护理中心进行的研究中，较新的内窥镜技术已被证明能提高发育异常检测的产率，但其在团体中的适用性仍然不确定。对较大的粘膜表面积的取样(如拭抹或刷擦)的方法可能会增加发育异常和肿瘤的产率，特别是如果与发育异常/肿瘤的分子标志物结合时。这可能最终允许BE受试者的非活检(通过拭抹或刷擦)或非内窥镜监测节省大量潜在成本。
因此，本文提供了用于食管疾病筛选的技术，特别地但不排他地涉及用于检测食管疾病(例如巴雷特食管、巴雷特食管发育异常等)的存在的方法、组合物和相关用途。此外，本技术提供了用于在通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得的样品中区分巴雷特食管和巴雷特食管发育异常以及巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的方法、组合物和相关用途。
事实上，在开发本技术的过程中进行的实验将来自具有巴雷特食管的受试者的食管组织的DNA标志物的甲基化状态与来自对照受试者(例如，各组织类型的正常组织)的相同DNA标志物的甲基化状态以及来自具有巴雷特食管发育异常的受试者的相同DNA标志物的甲基化状态进行了比较(参见实施例1-4)。
鉴定了能够在食管组织中分类巴雷特食管(BE)和对照(例如，各组织类型的正常组织)的标志物和/或标志物组(例如，表1、7和/或8中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、2和5)。
鉴定了能够在食管组织中分类BE和巴雷特食管相关发育异常(BED)的标志物和/或标志物组(例如，表2、3、5和/或6中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、3和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中预测巴雷特食管相关低度发育异常(BE-LGD)、巴雷特食管相关发育异常高度发育异常(BE-HGD)和食管腺癌(EAC)的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中分类BE和BED的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
虽然本文的公开内容涉及某些示例的实施方案，但是应当理解，这些实施方案是通过实例而非限制的方式呈现的。
方法包括在分离自受试者的活检样品中确定至少一种甲基化标志物的甲基化状态，其中标志物的甲基化状态的变化指示食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的存在或类别。具体实施方案涉及包含差异甲基化区域(DMR，例如，DMR 1-229，参见表1、2、3、5、6、7、8)的标志物，其用于诊断(例如，筛选)食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)，包括在疾病的癌前期阶段(例如，BE对比于BED)的早期检测。
本技术的标志物在检测或区分食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)方面特别有效，因此提供了用于所述疾病的早期检测、分类和治疗的改善的手段。
除了其中分析包含本文提供的并且列在表1、2、3、5、6和/或7中的DMR(例如，来自表1、2、3、5、6、7和/或8的DMR 1-229)的至少一种标志物、标志物的区域或标志物的碱基的甲基化分析的实施方案以外，本技术还提供了在食管组织中的包含含有DMR的至少一种标志物、标志物的区域或标志物的碱基的标志物组，其用于检测食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)。
本技术的一些实施方案基于包含DMR的至少一种标志物、标志物的区域或标志物的碱基的CpG甲基化状态的分析。
在一些实施方案中，本技术提供了使用亚硫酸氢盐技术和一种或多种甲基化测定的组合来确定包含DMR(例如表1、2、3、5、6、7、8中提供(例如DMR1-229))的至少一种标志物中CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可以是甲基化的或未甲基化的(也可以分别称为上甲基化和下甲基化)。然而，本发明的方法适合于分析非均质性质的生物样品，例如远程样品(例如，血液、器官流出物或粪便)的背景中的低浓度肿瘤细胞，或者来自其的生物材料。因此，当在这样的样品中分析CpG位置的甲基化状态时，可以使用定量测定以确定特定CpG位置的甲基化水平(例如，百分比、分数、比率、比例或程度)。
根据本技术，确定包含DMR的标志物中CpG二核苷酸序列的甲基化状态可用于诊断和表征食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)。
标志物的组合
在一些实施方案中，本技术涉及评估含有来自表1、2、3、5、6、7、8的两个或更多个DMR(例如，来自DMRNo.1-194的两个或更多个DMR)的标志物组合的甲基化状态。在一些实施方案中，评估多于一种标志物的甲基化状态增加了用于鉴定受试者中食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的筛选或诊断的特异性和/或灵敏度。
通过标志物的各种组合来预测各种癌症，例如通过与预测的特异性和灵敏度相关的统计技术鉴定的。本技术提供了用于鉴定某些癌症的预测组合和验证的预测组合的方法。
在一些实施方案中，标志物(例如，包含DMR)的组合预测肿瘤的位点。
例如，鉴定了能够在食管组织中分类巴雷特食管(BE)和对照(例如，各组织类型的正常组织)的标志物和/或标志物组(例如，表1、7和/或8中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、2和5)。
鉴定了能够在食管组织中分类BE和巴雷特食管相关发育异常(BED)的标志物和/或标志物组(例如，表2、3、5和/或6中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1、3和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中预测巴雷特食管相关低度发育异常(BE-LGD)、巴雷特食管相关发育异常高度发育异常(BE-HGD)和食管腺癌(EAC)的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
鉴定了能够在通过全食管拭抹或刷擦获得的样品中分类BE和BED的标志物和/或标志物组(例如，表5中提供的具有注释的染色体区)(参见实施例1和4)。
用于分析甲基化状态的方法
用于分析核酸中5-甲基胞嘧啶的存在的最常用方法是基于Frommer等描述的用于检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐法(Frommer等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827–31)或其变化形式。映射5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐法是基于观察到胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶与亚硫酸氢离子(也称为亚硫酸氢盐)反应。反应通常按照以下步骤进行：首先，胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应形成磺化胞嘧啶。接下来，磺化反应中间物自发脱氨基得到磺化尿嘧啶。最后，磺化尿嘧啶在碱性条件下脱磺酸基形成尿嘧啶。检测是可能的，因为尿嘧啶与腺嘌呤形成碱基对(因此表现为像胸腺嘧啶)，而5-甲基胞嘧啶与鸟嘌呤形成碱基对(因此表现为像胞嘧啶)。这使得通过例如亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg G,&Clark S,Bioessays(1994)16:431–36；Grigg G,DNA Seq.(1996)6:189–98)或甲基化特异性PCR(MSP)(如美国专利No.5,786,146中所公开的)可以区分甲基化胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶。
一些常规技术涉及包括在琼脂糖基质中封闭待分析的DNA从而防止DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐仅与单链DNA反应)并且用快速透析替代沉淀和纯化步骤的方法(Olek A,等(1996)“A modified and improved method for bisulfite based cytosinemethylation analysis”NucleicAcids Res.24:5064-6)。因此可以分析单个细胞的甲基化状态，说明所述方法的实用性和灵敏度。用于检测5-甲基胞嘧啶的常规方法的概述由Rein,T.,等(1998)NucleicAcids Res.26:2255提供。
亚硫酸氢盐技术通常包括在亚硫酸氢盐处理之后扩增已知核酸的短的特异性片段，然后通过测序(Olek&Walter(1997)Nat.Genet.17:275–6)或引物延伸反应(Gonzalgo&Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529–31；WO 95/00669；美国No.6,251,594)测定产物，以分析单个胞嘧啶位置。一些方法使用酶消化(Xiong&Laird(1997)NucleicAcidsRes.25:2532–4)。通过杂交的检测也已经在本领域中描述(Olek等，WO 99/28498)。此外，已经描述了使用亚硫酸氢盐技术用于单个基因的甲基化检测(Grigg&Clark(1994)Bioessays16:431–6,；Zeschnigk等(1997)Hum Mol Genet.6:387–95；Feil等(1994)NucleicAcidsRes.22:695；Martin等(1995)Gene 157:261–4；WO 9746705；WO 9515373)。
多种甲基化测定程序是本领域已知的，并且可以与根据本技术的亚硫酸氢盐处理结合使用。这些测定允许测定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸(例如，CpG岛)的甲基化状态。这样的测定法包括亚硫酸氢盐处理的核酸的测序、PCR(用于序列特异性扩增)、Southern印迹分析和使用甲基化敏感性限制酶。
例如，通过使用亚硫酸氢盐处理，简化了基因组测序以分析甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布(Frommer等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827–1831)。另外，从亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化可用于评估甲基化状态，例如Sadri&Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24:5058–5059所述，或者如被称为COBRA(组合亚硫酸氢盐限制性分析)的方法所体现的(Xiong&Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532–2534)。
COBRATM分析是用于确定少量基因组DNA中特定基因座处DNA甲基化水平的定量甲基化测定(Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997)。简言之，限制酶消化用于揭示亚硫酸氢钠处理的DNA的PCR产物中的甲基化依赖性序列差异。首先，根据Frommer等描述的程序(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831,1992)通过标准亚硫酸氢盐处理将甲基化依赖性序列差异引入基因组DNA。然后使用对目标CpG岛有特异性的引物进行亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR扩增，然后进行限制性内切核酸酶消化、凝胶电泳和使用特异性标记的杂交探针的检测。原始DNA样品中的甲基化水平在DNA甲基化水平的整个宽谱上以线性定量方式由消化的和未消化的PCR产物的相对量表示。此外，本技术可以可靠地应用于从显微解剖的石蜡包埋的组织样品获得的DNA。
用于COBRATM分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于COBRATM的试剂盒中发现)可以包括但不限于：用于特异性基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；限制酶和适当的缓冲液；基因杂交寡核苷酸；对照杂交寡核苷酸；寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液和DNA回收组分。
优选地，诸如“MethyLightTM”(基于荧光的实时PCR技术)(Eads等,Cancer Res.59:2302-2306,1999)、Ms-SNuPETM(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821-9826,1996；美国专利No.5,786,146)和甲基化CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等,Cancer Res.59:2307-12,1999)单独使用或与这些方法中的一种或多种组合使用。
“HeavyMethylTM”测定是基于亚硫酸氢盐处理的DNA的甲基化特异性扩增来评估甲基化差异的定量方法。覆盖位于扩增引物之间或由扩增引物覆盖的CpG位置的甲基化特异性阻断探针(“阻断剂”)使得能够对核酸样品进行甲基化特异性选择性扩增。
术语“HeavyMethylTM MethyLightTM”测定是指HeavyMethylTM MethyLightTM测定，其为MethyLightTM测定的变化形式，其中MethyLightTM测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针相结合。HeavyMethylTM测定也可与甲基化特异性扩增引物组合使用。
用于HeavyMethylTM分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中发现)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛、或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；阻断寡核苷酸；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
MSP(甲基化特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任何CpG位点的组的甲基化状态，而不依赖于甲基化敏感性限制酶的使用(Herman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996；美国专利No.5,786,146)。简言之，DNA被亚硫酸氢钠修饰，亚硫酸氢钠将未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后用对甲基化和未甲基化DNA有特异性的引物扩增产物。MSP只需要少量的DNA，对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可以在从石蜡包埋样品中提取的DNA上进行。用于MSP分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于MSP的试剂盒中发现)可以包括但不限于：特异性基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸，以及特异性探针。
MethyLightTM测定是采用基于荧光的实时PCR(例如
)的高通量定量甲基化测定，其在PCR步骤后不需要进一步操作(Eads等,Cancer Res.59:2302-2306,1999)。简言之，MethyLightTM方法从基因组DNA的混合样品开始，将其根据标准程序(将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶的亚硫酸氢盐方法)在亚硫酸氢钠反应中转化成甲基化依赖性序列差异的混合库。然后在“偏差”的反应中进行基于荧光的PCR，例如用与已知CpG二核苷酸重叠的PCR引物。序列鉴别发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平。
MethyLightTM测定用作核酸如基因组DNA样品中的甲基化模式的定量测试，其中序列鉴别发生在探针杂交水平。在定量版本中，PCR反应在与特定推定的甲基化位点重叠的荧光探针的存在下提供甲基化特异性扩增。通过其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的反应来提供输入DNA的量的无偏对照。或者，通过用不覆盖已知甲基化位点的对照寡核苷酸(例如，HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的版本)或用覆盖潜在的甲基化位点的寡核苷酸探测偏差PCR库来实现基因组甲基化的定性测试。
MethyLightTM方法与任何合适的探针(例如
探针，
探针等)一起使用。例如，在一些应用中，将双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理，并经受使用
探针，例如利用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸和
探针的两组PCR反应中的一组。
探针用荧光“报告物”和“淬灭剂”分子双重标记，并被设计为对于相对高GC含量的区域具有特异性，使得其在PCR循环中在比正向引物或反向引物高约10℃的温度下解链。这使得
探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。随着Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新的链，其最终到达退火的
探针。Taq聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将通过消化
探针释放荧光报道分子来替换
探针，以使用实时荧光检测***定量检测其现在未消逝的信号。
用于MethyLightTM分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中发现)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；
或
探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；和Taq聚合酶。
QMTM(定量甲基化)测定是用于基因组DNA样品中甲基化模式的替代定量测试，其中序列鉴别发生在探针杂交水平。在该定量版本中，PCR反应在与特定推定的甲基化位点重叠的荧光探针的存在下提供无偏的扩增。通过其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的反应来提供输入DNA的量的无偏对照。或者，通过用不覆盖已知甲基化位点的对照寡核苷酸(例如，HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的版本)或用覆盖潜在的甲基化位点的寡核苷酸探测偏差PCR库来实现基因组甲基化的定性测试。
在扩增过程中，QMTM方法可以与任何合适的探针(例如
探针，
探针)一起使用。例如，将双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理，并经受无偏的引物和
探针。
探针用荧光“报告物”和“淬灭剂”分子双重标记，并被设计为对于相对高GC含量的区域具有特异性，使得其在PCR循环中在比正向引物或反向引物高约10℃的温度下解链。这使得
探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。随着Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新的链，其最终到达退火的
探针。Taq聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将通过消化
探针释放荧光报道分子来替换
探针，以使用实时荧光检测***定量检测其现在未消逝的信号。用于QMTM分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于QMTM的试剂盒中发现)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；
或
探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；和Taq聚合酶。
Ms-SNuPETM技术是基于DNA的亚硫酸氢盐处理然后单核苷酸引物延伸来评估特定CpG位点的甲基化差异的定量方法(Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)。简言之，基因组DNA与亚硫酸氢钠反应，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而保持5-甲基胞嘧啶不变。然后使用对亚硫酸氢盐转化的DNA有特异性的PCR引物进行期望靶序列的扩增，分离所得产物并用作目的CpG位点处的甲基化分析的模板。可以分析少量的DNA(例如，显微切割的病理切片)，并避免使用限制酶来确定CpG位点的甲基化状态。
用于Ms-SNuPETM分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于Ms-SNuPETM的试剂盒中发现)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如特异性基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、亚硫酸氢盐处理DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝胶提取试剂盒；阳性对照引物；用于特定基因座的Ms-SNuPETM引物；反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应)；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液和DNA回收组分。
约化表示亚硫酸氢盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS)开始于亚硫酸氢盐处理核酸以将所有未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，然后进行限制酶消化(例如，通过识别包含CG序列的位点的酶如MspI)以及偶联至衔接子配体后片段的完整测序。限制酶的选择富集了CpG致密区域的片段，减少了在分析过程中可能映射到多个基因位置的冗余序列的数量。因此，RRBS通过选择用于测序的限制性片段的子集(例如，通过使用制备性凝胶电泳的大小选择)来降低核酸样品的复杂性。与全基因组亚硫酸氢盐测序相反，限制酶消化产生的每个片段都含有至少一个CpG二核苷酸的DNA甲基化信息。因此，RRBS富集了样品的启动子、CpG岛和在这些区域中具有高频率的限制酶切割位点的其他基因组特征，因此提供了评估一个或多个基因组基因座的甲基化状态的测定。
用于RRBS的典型方案包括用限制酶如MspI消化核酸样品，填充突出端和A尾，连接衔接子，亚硫酸氢盐转化和PCR的步骤。参见例如等(2005)“Genome-scale DNAmethylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution”NatMethods 7:133–6；Meissner等(2005)“Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis”Nucleic AcidsRes.33:5868–77。
在一些实施方案中，使用定量等位基因特异性实时靶和信号扩增(QuARTS)测定来评估甲基化状态。在每个QuARTS测定中依次发生三个反应，包括在初级反应中的扩增(反应1)和靶探针裂解(反应2)；和在次级反应中的FRET切割和荧光信号产生(反应3)。当用特异性引物扩增靶核酸时，具有侧翼序列(flap sequence)的特异性检测探针与扩增子松散结合。靶结合位点上特异性侵入性寡核苷酸的存在通过在检测探针和侧翼序列之间切割导致裂解酶释放侧翼序列。侧翼序列与相应FRET盒的非发夹部分互补。因此，侧翼序列在FRET盒上作为侵入性寡核苷酸起作用，并且在FRET盒荧光团和淬灭剂之间实现切割，产生荧光信号。切割反应每个靶可以切割多个探针，因此每个侧翼释放多个荧光团，提供指数信号放大。QuARTS可以通过使用具有不同染料的FRET盒来在单个反应孔中检测多种靶。参见例如Zou等(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novelmethylation specific technology”Clin Chem 56:A199；美国专利申请序列No.12/946,737、12/946,745、12/946,752和61/548,639。
术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，其如本文公开的用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述处理的方法是本领域已知的(例如，PCT/EP2004/011715)。优选的是，在例如但不限于正烷基二醇或二甘醇二甲醚(DME)的变性溶剂的存在下或在二噁烷或二噁烷衍生物的存在下进行亚硫酸氢盐处理。在一些实施方案中，变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。在一些实施方案中，在清除剂，例如但不限于色满衍生物如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色满2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物如没食子酸(参见PCT/EP2004/011715)的存在下进行亚硫酸氢盐反应。优选在30℃至70℃的反应温度下进行亚硫酸氢盐转化，由此在反应期间短时间将温度升高至超过85℃(参见PCT/EP2004/011715)。亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前纯化。这可以通过本领域已知的任何方式进行，例如但不限于超滤，例如通过MicroconTM柱(由MilliporeTM制造)。纯化根据修改的制造商的方案进行(参见例如PCT/EP2004/011715)。
在一些实施方案中，使用根据本发明的引物寡核苷酸组(例如参见表4和9)和扩增酶来扩增经处理的DNA的片段。多个DNA片段的扩增可以在同一个反应容器中同时进行。通常，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。扩增子的长度通常为100至2000个碱基对。
在方法的另一个实施方案中，包含DMR(例如，表1、2、3、5、6、7、8中提供的DMR1-229)的标志物内或附近的CpG位置的甲基化状态可以通过使用甲基化特异性引物寡核苷酸检测。这种技术(MSP)已经在Herman的美国专利No.6,265,171中描述。使用甲基化状态特异性引物扩增亚硫酸氢盐处理的DNA允许区分甲基化和未甲基化核酸。MSP引物对含有至少一个与亚硫酸氢盐处理的CpG二核苷酸杂交的引物。因此，所述引物的序列包含至少一个CpG二核苷酸。对未甲基化DNA有特异性的MSP引物在CpG中的C位置的位置处含有“T”。
通过扩增获得的片段可携带直接或间接可检测的标记。在一些实施方案中，标记是荧光标记、放射性核素或具有可在质谱仪中检测的典型质量的可分离分子片段。当所述标记是质量标记时，一些实施方案提供具有单个正或负净电荷的标记的扩增子，从而允许在质谱仪中具有更好的可检测性。可以通过例如基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI)或使用电喷雾质谱法(ESI)进行检测和可视化。
分离适合于这些测定技术的DNA的方法是本领域已知的。特别地，一些实施方案包括如美国专利申请序列No.13/470,251(“Isolation ofNucleicAcids”)所述分离核酸。
方法
在本技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：
1)使获自受试者的核酸(例如基因组DNA，例如分离自体液如粪便样品、血液样品或组织样品(例如食管组织))与区分至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述至少一种标志物包含DMR(例如，表1中提供的DMR1–78；表7中提供的DMR 21、188-193；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187、193-229)以及
2)检测巴雷特食管的缺少(例如，具有大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性)。
在本技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：
1)使获自受试者的核酸(例如基因组DNA，例如分离自体液如粪便样品、血液样品或组织样品(例如食管组织))与区分至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述至少一种标志物包含DMR(例如，表1中提供的DMR1–78；表7中提供的DMR 21、188-193；表8中提供的DMR 2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187、193-229)以及
2)检测巴雷特食管的存在(例如，具有大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性)。
在本技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：
1)使获自受试者的核酸(例如基因组DNA，例如分离自体液如粪便样品、血液样品或组织样品(例如食管组织))与区分至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述至少一种标志物包含DMR(例如，表2中提供的DMRNo.3、5、30、33、43、58、77和79-128；表3中提供的DMRNo.77、27、193、90、92、101和129-134；表5中提供的DMR No.77、90和135；以及表6中提供的DMRNo.136-187)以及
2)分类为巴雷特食管或巴雷特食管发育异常(例如，具有大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性)。
在本技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：
1)使获自受试者的核酸(例如基因组DNA，例如分离自食管组织(例如通过全食管拭抹或刷擦获得的食管组织))与区分至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述至少一种标志物包含DMR(例如，表5中提供的DMRNo.77、90和135)以及
2)分类为巴雷特食管或巴雷特食管发育异常(例如，具有大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性)。
在本技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：
1)使获自受试者的核酸(例如基因组DNA，例如分离自食管组织(例如通过全食管拭抹或刷擦获得的食管组织))与区分至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述至少一种标志物包含DMR(例如，表5中提供的DMRNo.77、90和135)以及
2)分类为巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常或食管腺癌(例如，具有大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性)。
优选地，灵敏度为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。优选地，特异性为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。
可以通过任何方式分离基因组DNA，包括使用市售的试剂盒。简言之，其中目标DNA被细胞膜包封，必须通过酶、化学或机械手段破坏和裂解生物样品。然后可以例如通过用蛋白酶K消化来从DNA溶液中清除蛋白质和其他污染物。然后从溶液中回收基因组DNA。这可以通过多种方法进行，包括盐析、有机萃取或将DNA与固相载体结合。方法的选择受到多个因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA数量。包含肿瘤物质或前肿瘤物质的所有临床样品类型均适用于本方法，例如细胞系、组织学切片、活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿液、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞及其组合。
在其中样品包含食管组织的一些实施方案中，通过内窥镜技术获得样品。
在其中样品包含食管组织的一些实施方案中，通过内窥镜刷擦或者使用系留装置(例如胶囊海绵、球囊或其他装置)的非内窥镜全食管刷擦或拭抹获得样品。
本技术不限于用于制备样品并提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获(例如美国专利申请序列No.61/485386中所述)或相关方法从粪便样品或从血液或从血浆样品中分离DNA。
然后用区分含有DMR(例如，DMR 1-229，例如由表1、2、3、5、6、7、8提供)的至少一种标志物中的甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂处理基因组DNA样品。
在一些实施方案中，试剂将在5'-位未甲基化的胞嘧啶碱转换为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不相似的另一碱基。然而，在一些实施方案中，试剂可以是甲基化敏感性限制酶。
在一些实施方案中，以这样的方式处理基因组DNA样品，使得在5'-位未甲基化的胞嘧啶碱转换为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不相似的另一碱基。在一些实施方案中，用硫酸氢盐(亚硫酸氢盐、二亚硫酸盐)进行这种处理，然后进行碱水解。
然后分析经处理的核酸以确定靶基因序列的甲基化状态(来自标志物的至少一个基因、基因组序列或核苷酸，所述标志物包含DMR，例如选自DMR 1-229的至少一种DMR，例如在表1、2、3、5、6、7、8中提供)。分析方法可以选自本领域已知的方法，包括本文所列的那些，例如本文所述的QuARTS和MSP。
本技术涉及与食管疾病(例如BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)相关的任何样品的分析。例如，在一些实施方案中，样品包含从患者获得的组织和/或生物流体。在一些实施方案中，样品包含食管组织。在一些实施方案中，样品包含通过全食管拭抹或刷擦获得的食管组织。在一些实施方案中，样品包含分泌物。在一些实施方案中，样品包含血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、胃肠活检样品、食管活检的显微切割细胞、脱落到肠胃腔中的食管细胞和/或从粪便中回收的食管细胞。在一些实施方案中，受试者是人。这些样品可以来自上胃肠道、下胃肠道，或者包含来自上胃肠道和下胃肠道两者的细胞、组织和/或分泌物。样品可以包含来自肝脏、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食管、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、***和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包含细胞液、腹水、尿液、粪便、胰液、内窥镜检查期间获得的液体、血液、粘液或唾液。在一些实施方案中，样品是粪便样品。
这样的样品可以通过本领域已知的任何数量的方法获得，例如对本领域技术人员来说是显而易见的那些。例如，尿液和粪便样品容易获得，而血液、腹水、血清或胰液样品可以例如通过使用针和注射器肠胃外获得。可以通过使样品经受本领域技术人员已知的各种技术(包括但不限于离心和过滤)来获得无细胞或基本上无细胞的样品。虽然通常优选不使用侵入性技术来获得样品，但是可能依然优选的是获得诸如组织匀浆、组织切片和活检标本的样品。在一些实施方案中，通过食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得样品。
在一些实施方案中，本技术涉及治疗患者(例如具有BE、BED、BE-LGD、BE-HGD和/或EAC的患者)的方法，所述方法包括确定本文所提供的一种或多种DMR的甲基化状态，以及基于确定甲基化状态的结果向患者施用治疗。治疗可以是施用药物化合物、疫苗、进行手术、对患者成像、进行另一测试。优选地，所述用途是临床筛选的方法、预后评估的方法、监测治疗结果的方法、鉴定最可能响应于特定治疗性治疗的患者的方法、对患者或受试者成像的方法，以及药物筛选和开发的方法。
在本技术的一些实施方案中，提供了用于诊断受试者中的食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的方法。本文所用的术语“进行诊断”和“诊断”是指本领域技术人员可以估计甚至确定受试者是否患有给定疾病或病症或可能在将来发展给定疾病或病症的方法。本领域技术人员通常基于一种或多种诊断指标进行诊断，例如生物标志物(例如，本文公开的DMR)，其甲基化状态指示病症的存在、严重性或不存在。
随着诊断，临床癌症预后(例如，对于BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)涉及确定癌症的侵袭性和肿瘤复发的可能性来规划最有效的治疗。如果可以进行更准确的预后，或者甚至可以评估发展癌症的潜在风险，则可以选择适当的治疗，并且在某些情况下可以选择对患者进行较不严厉的治疗。癌症生物标志物的评估(例如，确定甲基化状态)可用于分开具有良好预后和/或低发展癌症风险的将不需要治疗或需要有限的治疗的受试者，以及更可能发展为癌症或遭受癌症复发的将受益于更加强化的治疗的受试者。
因此，如本文所使用的“进行诊断”或“诊断”还包括确定发展癌症的风险或确定预后，其可以基于本文提供的诊断生物标志物(例如DMR)的测量，提供用于预测临床结果(具有或不具有临床治疗)，选择合适的治疗(或治疗是否有效)或监测当前治疗以及潜在地改变治疗。此外，在本公开的主题的一些实施方案中，可以进行生物标志物随时间的多次测定以有助于诊断和/或预后。生物标志物的时间变化可用于预测临床结果，监测食管疾病的进展和/或监测针对癌症的适当治疗的效力。在这样的实施方案中，例如，在有效治疗的过程中，预期可以看到生物样品中本文公开的一种或多种生物标志物(例如，DMR)(以及潜在的一种或多种另外的生物标志物，如果监测的话)的甲基化状态随时间的变化。
本公开的主题在一些实施方案中进一步提供了用于确定是否开始或继续预防或治疗受试者中的食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的方法。在一些实施方案中，方法包括随时间从受试者提供一系列生物样品；分析所述系列生物样品以确定每个生物样品中本文公开的至少一种生物标志物的甲基化状态；以及比较每个生物样品中一种或多种生物标志物的甲基化状态的任何可测量的变化。生物标志物在这段时间内的甲基化状态的任何变化都可用于预测发展食管疾病的风险，预测临床结果，确定是否开始或继续预防或治疗癌症，以及当前治疗是否有效地治疗食管疾病。例如，可以在开始治疗之前选择第一时间点，并且可以在开始治疗后的某个时间选择第二时间点。可以在从不同时间点取得的每个样品中测量甲基化状态，并记录定性和/或定量差异。来自不同样品的生物标志物水平的甲基化状态的变化可以与受试者的食管疾病风险、预后、确定治疗效力和/或食管疾病的进展相关。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于在早期阶段治疗或诊断疾病，例如在疾病的症状出现之前。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于在临床阶段治疗或诊断疾病。
如上所述，在一些实施方案中，可以进行一种或多种诊断或预后生物标志物的多重测定，并且可以使用标志物的时间变化来确定诊断或预后。例如，可以在初始时间确定诊断标志物，并且在第二时间再次确定诊断标志物。在这样的实施方案中，从初始时间到第二时间的标志物的增加可以诊断食管疾病的特定类型或严重程度，或给定的预后。同样，从初始时间到第二时间的标志物的减少可以指示食管疾病的特定类型或严重程度，或给定的预后。此外，一种或多种标志物的变化程度可以与食管疾病的严重程度和将来的不良事件有关。本领域技术人员将理解，尽管在某些实施方案中，可以在多个时间点对同一生物标志物进行比较测量，但也可以在一个时间点测量给定的生物标志物，并且在第二时间点测量第二生物标志物，并且这些标志物的比较可以提供诊断信息。
如本文所用，短语“确定预后”是指本领域技术人员可以预测受试者中病症的过程或结果的方法。术语“预后”不是指以100％准确度预测病症的过程或结果的能力，或者甚至基于生物标志物(例如，DMR)的甲基化状态可预测给定的过程或结果或多或少可能发生。相反，本领域技术人员将理解，术语“预后”是指发生某过程或结果的增加的可能性；也就是说，当与未表现出病症的个体相比时，在表现出给定病症的受试者中过程或结果更可能发生。例如，在未表现出病症(例如具有一种或多种DMR的正常甲基化状态)的个体中，给定结果(例如，患有食管疾病)的可能性可能非常低。
在一些实施方案中，统计分析将预后指标与不利结果的倾向相关联。例如，在一些实施方案中，与获自不具有食管疾病的患者的正常对照样品中的甲基化状态不同的甲基化状态可以表明，同具有与对照样品中的甲基化状态更类似的水平的受试者相比，受试者更可能患有食管疾病，如通过统计学显著性水平确定的。此外，甲基化状态从基线(例如“正常”)水平的变化可以反映受试者的预后，并且甲基化状态的变化程度可以与不良事件的严重程度相关。通常通过比较两个或多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计学显著性(参见例如Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983)。本发明主题的示例性置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，而示例性的p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
在另一些实施方案中，可以建立本文公开的预后或诊断性生物标志物(例如，DMR)的甲基化状态的阈值变化程度，并且将生物样品中生物标志物的甲基化状态的变化程度与甲基化状态的阈值变化程度简单比较。本文提供的生物标志物的甲基化状态的优选阈值变化为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％和约150％。在另一些实施方案中，可以建立“列线图(nomogram)”，通过“列线图”，预后或诊断指标(生物标志物或生物标志物的组合)的甲基化状态与给定结果的相关倾向直接相关。本领域技术人员熟悉使用这样的列线图来使两个数值相关联，并且认识到该测量的不确定性与标志物浓度的不确定性相同，因为引用了单个样品测量，而不是群体平均值。
在一些实施方案中，与生物样品同时分析对照样品，使得可以将从生物样品获得的结果与从对照样品获得的结果进行比较。此外，预期可以提供标准曲线，利用其可以比较生物样品的测定结果。如果使用荧光标记，则这样的标准曲线呈现作为测定单位(例如荧光信号强度)的函数的生物标志物的甲基化状态。使用从多个供体获取的样品，可以提供正常组织中一种或多种生物标志物的对照甲基化状态以及从具有化生的供体或从具有食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的供体取得组织中一种或多种生物标志物的“风险水平”的标准曲线。在该方法的某些实施方案中，在获自受试者的生物样品中鉴定出本文提供的一种或多种DMR的异常甲基化状态时，将受试者鉴定为具有食管疾病。在该方法的另一些实施方案中，在获自受试者的生物样品中检测到一种或多种这样的生物标志物的异常甲基化状态导致受试者被鉴定为具有食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)。
标志物的分析可以在一个测试样品内单独进行或与另外的标志物同时进行。例如，可以将多种标志物组合在一个测试中用于有效处理多个样品并且潜在地提供更好的诊断和/或预后准确性。此外，本领域技术人员将认识到测试来自相同受试者的多个样品(例如，在连续的时间点)的值。这样测试一系列样品可以允许鉴定标志物甲基化状态随时间的变化。甲基化状态的变化以及不存在甲基化状态的变化，可以提供关于疾病状态的有用信息，包括但不限于确定事件开始的大致时间，可救治组织的存在和量，药物疗法的适当性，各种疗法的有效性，鉴定受试者的结果，包括未来事件的风险。
生物标志物的分析可以以多种物理形式进行。例如，可以使用微量滴定板或自动化来促进大量测试样品的处理。或者，可以开发单一样品形式，以便于及时地进行即时治疗和诊断，例如在动态运输或急诊室环境中。
在一些实施方案中，如果与对照甲基化状态相比，样品中至少一种生物标志物的甲基化状态具有可测量变化，则将所述受试者诊断为具有食管疾病(例如BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)。相反，当在生物样品中没鉴定到甲基化状态的变化时，可以将受试者鉴定为不具有食管疾病，不具有食管疾病的风险，或具有低的食管疾病的风险。在这方面，可以将具有食管疾病或其风险的受试者与具有低至基本上没有食管疾病或其风险的受试者区分开来。可以将具有发展食管疾病的风险的受试者放置在更加强化和/或定期的筛选方案中，包括内窥镜监测。另一方面，具有低至基本上没有风险的受试者可以避免进行内窥镜检查或食管刷擦，直到未来筛选的时间，例如根据本技术进行的筛选表明这些受试者中已经出现了食管疾病的风险。
如上所述，根据本技术的方法的实施方案，检测一种或多种生物标志物的甲基化状态的变化可以是定性测定，也可以是定量测定。因此，将受试者诊断为患有食管疾病或具有发展为食管疾病的风险的步骤表明进行某些阈值测量，例如，生物样品中的一种或多种生物标志物的甲基化状态与预定对照甲基化状态的变化。在该方法的一些实施方案中，对照甲基化状态是生物标志物的任何可检测的甲基化状态。在与生物样品同时测试对照样品的方法的另一些实施方案中，预定甲基化状态是对照样品中的甲基化状态。在该方法的另一些实施方案中，预定甲基化状态基于标准曲线和/或通过标准曲线鉴定。在该方法的另一些实施方案中，预定甲基化状态是具体状态或状态范围。因此，预定甲基化状态可以在本领域技术人员显而易见的限度内选择，其部分基于所实施方法的实施方案和期望的特异性等。
此外，关于诊断方法，优选的受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血的；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选是人。如本文所用，术语“受试者”包括人和动物受试者。因此，本文提供了兽医治疗用途。因此，本技术提供了对哺乳动物的诊断，例如人，以及由于濒危而很重要的哺乳动物，例如西伯利亚虎；经济上重要的哺乳动物，例如养殖场养殖的供人消费的动物；和/或对人具有社会重要性的动物，例如作为宠物饲养的动物或动物园中的动物。这些动物的实例包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪科动物，包括猪(pig)、阉公猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物，如牛(cattle)、公牛(oxen)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、北美野牛和骆驼；和马。因此，还提供了对家畜，包括但不限于驯养的猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)等的诊断和治疗。本公开的主题还包括用于诊断受试者中的食管疾病(例如，BE、BED、BE-LGD、BE-HGD、EAC)的***。该***可以例如作为商业试剂盒提供，其可用于筛选已经收集生物样品的受试者中食管疾病的风险或诊断食管疾病。根据本技术提供的示例性***包括评估DMR的甲基化状态，如表1、2、3、5、6、7和/或8中提供的DMR。
具体实施方式
本发明还涉及以下实施方案：
1.一种在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及
b)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管，其中所述标志物包含选自BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH的差异甲基化区域(DMR)中的碱基。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
3.如实施方案1所述的方法，其中所述样品包含通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得的食管组织。
4.如实施方案1所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的升高的甲基化。
5.如实施方案1所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的不同的甲基化模式。
6.如实施方案1所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
7.如实施方案1所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性聚合酶链式反应。
8.如实施方案1所述的方法，其中所述测定利用核酸测序。
9.如实施方案1所述的方法，其中所述测定利用质谱法。
10.如实施方案1所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性核酸酶。
11.如实施方案1所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。
12.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有巴雷特食管或巴雷特食管发育异常的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
13.如实施方案12所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
14.如实施方案12所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
15.如实施方案12所述的方法，其中所述样品包含通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得的食管组织。
16.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括使包含DMR(例如BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)不具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)和b)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
18.如实施方案16所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
19.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的***，所述***包括：分析组件，其被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告巴雷特食管相关甲基化状态的使用者。
20.如实施方案19所述的***，其中所述样品包含含有选自BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH的DMR的核酸。
21.如实施方案19所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
22.如实施方案19所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
23.如实施方案19所述的***，其中所述样品包含食管组织。
24.如实施方案19所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
25.如实施方案19所述的***，其中所述数据库包含来自具有巴雷特食管的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者和来自不具有巴雷特食管发育异常的受试者的核酸序列。
26.一种用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含选自BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)不具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异
e)当i)和ii)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
27.如实施方案26所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
28.如实施方案27所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
29.如实施方案26所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
30.如实施方案26所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
31.如实施方案26所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
32.如实施方案26所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
33.如实施方案26所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
34.一种在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及
b)将所述受试者鉴定为
i)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管，其中所述标志物包含选自DMR 1-78、80、82-86、88、90-102、108、122、133-135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、176、179、181、185-229的差异甲基化区域(DMR)中的碱基；
ii)当所述标志物的甲基化状态不同于在具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管发育异常，其中所述标志物包含选自DMR 3、5、30、33、43、58、77、79-187的DMR中的碱基；
iii)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管高度发育异常的受试者以及具有食管腺癌的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管低度发育异常，其中所述标志物包含选自DMR 77、90和135的DMR中的碱基；
iv)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及具有食管腺癌的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管高度发育异常，其中所述标志物包含选自DMR 77、90和135的DMR中的碱基；以及
v)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有食管腺癌的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管高度发育异常的受试者以及具有巴雷特食管低度发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有食管腺癌，其中所述标志物包含选自DMR 77、90和135的DMR中的碱基。
35.如实施方案34所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
36.如实施方案34所述的方法，
其中所述标志物包含选自DMR 101、77、134、92、133、77、90、193和135的DMR中的碱基，
其中所述样品包含通过全食管拭抹或刷擦获得的食管组织，
当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
37.如实施方案34所述的方法，
其中所述标志物包含选自DMR 92、133、134和194的DMR中的碱基，
其中所述样品包含通过海绵胶囊获得的食管组织，
当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
38.实施方案34的方法，
其中所述标志物包含选自DMR 77、90和135的DMR中的碱基，
其中所述样品包含通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得的食管组织。
39.如实施方案34所述的方法，其包括测定2-194种标志物。
40.如实施方案34所述的方法，其中测定样品中所述标志物的甲基化状态包括确定一个或多个碱基的甲基化状态。
41.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的升高的甲基化。
42.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的不同的甲基化模式。
43.如实施方案34所述的方法，其包括测定正向链的甲基化状态或测定反向链的甲基化状态。
44.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物是100个或更少碱基的区域。
45.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物是500个或更少碱基的区域。
46.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物是1000个或更少碱基的区域。
47.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物是5000个或更少碱基的区域。
48.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物是一个碱基。
49.如实施方案34所述的方法，其中所述标志物在高CpG密度启动子中。
50.如实施方案34所述的方法，其中所述样品是粪便样品、组织样品、血液样品或尿液样品。
51.实施方案50的方法，其中所述样品包含食管组织。
52.如实施方案34所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
53.如实施方案34所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性聚合酶链式反应。
54.如实施方案34所述的方法，其中所述测定利用核酸测序。
55.如实施方案34所述的方法，其中所述测定利用质谱法。
56.如实施方案34所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性核酸酶。
57.如实施方案34所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。
58.一种寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1-50的序列。
59.一种寡核苷酸，其包含与在DMR中具有碱基的染色体区域互补的序列。
60.如实施方案34所述的方法，其中具有表1、2、3、5、6、7和/或8中提供的注释的染色体区域包含标志物。
61.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表1，并且选自DMRNo.1-78。
62.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表2，并且选自DMRNo.3、5、30、33、43、58、77和79-128。
63.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表3，并且选自DMRNo.77、27、193、90、92、101和129-134。
64.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表5，并且选自DMRNo.77、90和135。
65.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表6，并且选自DMRNo.136-187。
66.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表7，并且选自DMRNo.21和188-193。
67.如实施方案34所述的方法，其中所述DMR来自表8，并且选自DMRNo.2-4、6、7、14、30、77、80、82-86、88、90-102、108、122、135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、179、181、185、187、193-229。
68.如实施方案34所述的方法，其包括确定两种或更多种标志物的甲基化状态。
69.一种试剂盒，其包含：
1)亚硫酸氢盐试剂；和
2)对照核酸，所述对照核酸包含选自来自表1、2、3、5、6、7和8的DMR 1-229的DMR的序列，并且具有与不具有癌症的受试者相关的甲基化状态。
70.一种试剂盒，其包含亚硫酸氢盐试剂和包含选自SEQ ID NO:1–50的序列的一种或多种寡核苷酸。
71.一种试剂盒，其包含：
1)亚硫酸氢盐试剂；和
2)对照核酸，所述对照核酸包含选自DMR 1-194的DMR的序列，并且具有与具有巴雷特食管、巴雷特食管发育异常、巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的受试者相关的甲基化状态。
72.一种试剂盒，其包含：用于从受试者获得样品的样品收集器；用于从所述样品中分离核酸的试剂；亚硫酸氢盐试剂；以及包含选自SEQ ID NO:1–50的序列的一种或多种寡核苷酸。
73.一种组合物，其包含含有DMR的核酸和亚硫酸氢盐试剂。
74.一种组合物，其包含含有DMR的核酸和包含选自SEQ ID NO:1–50的序列的一种或多种寡核苷酸
75.一种组合物，其包含含有DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。
76.一种组合物，其包含含有DMR的核酸和聚合酶。
77.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自来自表1、7和8的1-78、80、82-86、88、90-102、108、122、133-135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、176、179、181、185-229的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有巴雷特食管或巴雷特食管发育异常的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
78.如实施方案77所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
79.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管发育异常的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自来自表2、3、5和6的DMR 3、5、30、33、43、58、77、82、83、27、193、90、92、101、129-187的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有巴雷特食管发育异常或巴雷特食管的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
80.如实施方案46所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
81.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管低度发育异常的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自来自表5的DMR77、90和135的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管高度发育异常的受试者以及具有食管腺癌的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
82.如实施方案81所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
83.如实施方案81所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
84.如实施方案81所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
85.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管高度发育异常的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自来自表5的DMR77、90和135的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及具有食管腺癌的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
86.如实施方案85所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
87.如实施方案85所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
88.如实施方案87所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
89.一种用于在获自受试者的样品中筛选食管腺癌的方法，所述方法包括：
a)确定所述样品中的标志物的甲基化状态，所述标志物包含选自来自表5的DMR77、90和135的DMR中的碱基；
b)将来自所述受试者样品的所述标志物的甲基化状态与来自不具有食管腺癌的受试者、不具有巴雷特食管发育异常的受试者、具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及具有巴雷特食管高度发育异常的受试者的正常对照样品的所述标志物的甲基化状态进行比较；
c)确定所述受试者样品和所述正常对照样品的甲基化状态的差异的置信区间和/或p值。
90.如实施方案89所述的方法，其中所述置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％，且所述p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
91.如实施方案89所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
92.如实施方案91所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
93.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括使包含DMR(例如DMRNo.1-78、80、82-86、88、90-102、108、122、133-135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、176、179、181、185-229)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)不具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)和b)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
94.如实施方案93所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
95.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管发育异常的方法，所述方法包括使包含DMR(例如DMR No.3、5、30、33、43、58、77、79-187)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)和b)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管发育异常。
96.如实施方案95所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
97.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管低度发育异常的方法，所述方法包括使包含DMR(例如DMRNo.77、90和135)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
c)具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
d)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)、b)、c)和d)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管低度发育异常。
98.如实施方案97所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
99.如实施方案98所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
100.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管高度发育异常的方法，所述方法包括使包含DMR(例如DMRNo.77、90和135)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
c)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
d)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)、b)、c)和d)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管高度发育异常。
101.如实施方案100所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
102.如实施方案101所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
103.一种用于在获自受试者的样品中筛选食管腺癌的方法，所述方法包括使包含DMR(例如DMRNo.77、90和135)的核酸与亚硫酸氢盐试剂反应以产生经亚硫酸氢盐反应的核酸；对所述经亚硫酸氢盐反应的核酸测序以提供所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列；将所述经亚硫酸氢盐反应的核酸的核苷酸序列与来自以下受试者的含有所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较：
a)不具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
b)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
c)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
d)具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
当a)、b)、c)和d)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有食管腺癌。
104.如实施方案103所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
105.如实施方案104所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
106.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的***，所述***包括：分析组件，其被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告巴雷特食管相关甲基化状态的使用者。
107.如实施方案106所述的***，其中所述样品包含含有DMR的核酸。
108.如实施方案107所述的***，其中所述DMR选自DMR No.1-78、83、92、101、133、134、135、171、176、186和188-194。
109.如实施方案106所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
110.如实施方案106所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
111.如实施方案106所述的***，其中所述样品包含食管组织。
112.如实施方案106所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
113.如实施方案106所述的***，其中所述数据库包含来自具有巴雷特食管的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者和来自不具有巴雷特食管发育异常的受试者的核酸序列。
114.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管发育异常的***，所述***包括：分析组件，被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告巴雷特食管发育异常相关甲基化状态的使用者。
115.如实施方案114所述的***，其中所述样品包含含有DMR的核酸。
116.如实施方案115所述的***，其中所述DMR选自DMR No.3、5、30、33、43、58、77、79-187。
117.如实施方案114所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
118.如实施方案114所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
119.如实施方案114所述的***，其中所述样品包含食管组织。
120.如实施方案114所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
121.如实施方案114所述的***，其中所述数据库包含来自具有巴雷特食管发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者和来自不具有巴雷特食管发育异常的受试者的核酸序列。
122.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管低度发育异常的***，所述***包括：分析组件，被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告巴雷特食管低度发育异常相关甲基化状态的使用者。
123.如实施方案122所述的***，其中所述样品包含含有DMR的核酸。
124.如实施方案123所述的***，其中所述DMR选自DMR No.77、90和135。
125.如实施方案122所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
126.如实施方案122所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
127.如实施方案122所述的***，其中所述样品包含食管组织。
128.如实施方案127所述的***，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
129.如实施方案122所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
130.如实施方案122所述的***，其中所述数据库包含来自具有巴雷特食管低度发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者、来自不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及来自不具有食管腺癌的受试者的核酸序列。
131.一种用于在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管高度发育异常的***，所述***包括：分析组件，其被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及警报组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告巴雷特食管高度发育异常相关甲基化状态的使用者。
132.如实施方案131所述的***，其中所述样品包含含有DMR的核酸。
133.如实施方案132所述的***，其中所述DMR选自DMR No.77、90和135。
134.如实施方案131所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
135.如实施方案131所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
136.如实施方案131所述的***，其中所述样品包含食管组织。
137.如实施方案131所述的***，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
138.如实施方案131所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
139.如实施方案131所述的***，其中所述数据库包含来自具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者、来自不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及来自不具有食管腺癌的受试者的核酸序列。
140.一种用于在获自受试者的样品中筛选食管腺癌的***，所述***包括：分析组件，其被配置为确定样品的甲基化状态；软件组件，其被配置为将所述样品的甲基化状态与记录在数据库中的对照样品或参考样品甲基化状态进行比较；以及软件组件，其被配置为基于甲基化状态的组合来确定单个值并且警告食管腺癌相关甲基化状态的使用者。
141.如实施方案140所述的***，其中所述样品包含含有DMR的核酸。
142.如实施方案141所述的***，其中所述DMR选自DMR No.77、90和135。
143.如实施方案140所述的***，其还包括用于分离核酸的组件。
144.如实施方案140所述的***，其还包括用于收集样品的组件。
145.如实施方案140所述的***，其中所述样品包含食管组织。
146.如实施方案145所述的***，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
147.如实施方案140所述的***，其中所述数据库包含含有DMR的核酸序列。
148.如实施方案140所述的***，其中所述数据库包含来自具有食管腺癌的受试者、来自不具有巴雷特食管的受试者、来自不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者、来自不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者以及来自不具有食管腺癌的受试者的核酸序列。
149.一组分离的核酸，每个核酸具有包含DMR的序列。
150.如实施方案149所述的核酸的组，其中每个核酸具有来自不具有巴雷特食管、巴雷特食管发育异常、巴雷特食管低度发育异常、巴雷特食管高度发育异常和食管腺癌的受试者的序列。
151.一种***，其包含根据实施方案149或150的核酸的组，以及与所述核酸的组相关的核酸序列的数据库。
152.如实施方案151所述的***，其还包括亚硫酸氢盐试剂。
153.如实施方案151所述的***，其还包括核酸测序仪。
154.一种用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.1-78、80、82-86、88、90-102、108、122、133-135、136、141、142、144、146、148-149、152、154、156、164、166、171、173、175、178、176、179、181、185-229提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)不具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异
e)当i)和ii)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管。
155.如实施方案154所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
156.如实施方案155所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
157.如实施方案154所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
158.如实施方案154所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
159.如实施方案154所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
160.如实施方案154所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
161.一种用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管发育异常的方法，所述方法包括：
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMR No.3、5、30、33、43、58、77、79-187提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)具有巴雷特食管的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
e)当i)和ii)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管发育异常。
162.如实施方案161所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
163.如实施方案162所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
164.如实施方案161所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
165.如实施方案161所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
166.如实施方案161所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
167.如实施方案161所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
168.一种用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管低度发育异常的方法，所述方法包括：
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)不具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
iii)具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
iv)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
e)当i)、ii)、iii和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管低度发育异常。
169.如实施方案168所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
170.如实施方案169所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
171.如实施方案168所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
172.如实施方案168所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
173.如实施方案168所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
174.如实施方案168所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
175.如实施方案174所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
176.一种用于在获自受试者的样品中检测巴雷特食管高度发育异常的方法，所述方法包括
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)不具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
iii)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
iv)具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
e)当i)、ii)、iii和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管高度发育异常。
177.如实施方案176所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
178.如实施方案177所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
179.如实施方案176所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
180.如实施方案176所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
181.如实施方案176所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
182.如实施方案176所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
183.如实施方案182所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
184.一种用于在获自受试者的样品中检测食管腺癌的方法，所述方法包括
a)从受试者获得包含DNA的样品；
b)用试剂处理所获得的DNA，所述试剂选择性修饰所获得的DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生经修饰的残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；
c)确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平，其中一种或多种DNA甲基化标志物包含由DMRNo.77、90和135提供的差异甲基化区域(DMR)中的碱基，
d)将所述一种或多种DNA甲基化标志物的确定的甲基化水平与以下受试者的所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平参考进行比较：
i)不具有食管腺癌的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
ii)不具有巴雷特食管发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，
iii)具有巴雷特食管低度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异，和
iv具有巴雷特食管高度发育异常的受试者，以鉴定两个序列中的差异；以及
e)当i)、ii)、iii和iv)中的差异存在时，将所述受试者鉴定为具有食管腺癌。
185.如实施方案184所述的方法，其中一种或多种DNA甲基化标志物中升高的甲基化的确定包括选自CpG岛和CpG岛滨的区域中改变的甲基化的确定。
186.如实施方案185所述的方法，其中所述CpG岛或CpG岛滨中升高的甲基化的确定包括所述DNA甲基化标志物的编码区或调节区中的升高的甲基化。
187.如实施方案184所述的方法，其中所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平包括确定所述一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化评分和/或甲基化频率。
188.如实施方案184所述的方法，其中通过所获得的DNA的亚硫酸氢盐修饰来完成步骤b)的处理。
189.如实施方案184所述的方法，其中通过选自以下的技术实现所述确定已经经过步骤b)处理的DNA中的一种或多种DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序和亚硫酸氢盐基因组测序PCR。
190.如实施方案184所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
191.如实施方案190所述的方法，其中所述食管组织通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得。
实施例
实施例I.
分子标志物可有助于通过内窥镜或非内窥镜方法检测巴雷特食管(BE)和监测BE相关发育异常(BED)。进行实验以(1)鉴定和验证BE发育异常的新的甲基化DNA标志物，(2)测试候选标志物从全食管刷擦中检测BE发育不良的可行性。
使用来自没有发育异常、具有低度发育异常(BE-LGD)、具有高度发育异常(BE-HGD)或腺癌(EAC)的BE组织的DNA的全甲基化组(methylome)亚硫酸氢盐测序(每组18个样品)，鉴定候选标记物以分开BE和正常组织，以及分开BED和不具有发育异常的BE。
表1和表7提供了鉴定来分开BE和正常组织的这样的标志物的DMR信息，包括染色体号、基因注释和DMR起始/终止位置(参见用于产生表1和7的材料/方法的实施例II)。
表2和表6提供了鉴定来分开BED和不具有发育异常的BE的这样的标志物的DMR信息，包括染色体号、基因注释和DMR起始/终止位置(参见用于产生表2和6的材料/方法的实施例III)。在包括不具有发育异常的BE、BE-LGD和BE-HGD的独立组织(每组30-60个样品)中通过甲基化特异性PCR测定验证了最好的候选标志物。
使用高容量细胞刷(Hobbs Medical,Stafford Springs,CT)对计划进行内窥镜BE监测或BE相关癌症内窥镜评估的知情同意的BE患者进行全食管刷擦，通过全食管长度(BE+鳞状粘膜)从贲门圆周取样，以模拟吞咽的细绳上海绵装置。在DNA提取和亚硫酸氢盐处理后，通过甲基化特异性PCR或定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增检测靶基因的甲基化。标志物水平归一化至β-肌动蛋白(总人DNA的标志物)。鉴定出12种异常甲基化的基因，其最佳地区分了BED和不具有发育异常的BE(例如，ROC曲线下面积0.86-0.97)(参见表3)。这12种标志物是DIO3、MAX20.218、CD1D、T-SPYL5、ZNF568、ST8SIA1、ELMO1、ELOVL2、BMP3、NDRG4、HUNK和CDKN2A。表3DMR提供了鉴定来在通过全食管刷擦获得的食管样品中分开BED和不具有发育异常的BE的这样的标志物的信息，包括染色体号、基因注释和DMR起始/终止位置。表4提供了表3中提供的DMR的正向引物和反向引物信息。研究了39名受试者，其中值年龄为69岁(28-94岁)，74％为男性，中值BE长度为4(1-14)cm；18个不具有发育异常，21个具有发育异常(9个LGD、7个HGD及5个EAC(4个无症状早期阶段)。3个标志物的组(DIO3、MAX20.218、NDRG4)(参见表5)在95％特异性下检出了78％的LGD、71％的HGD、100％的EAC和81％的全部发育异常(参见图1)。表5提供了鉴定来区分LGD、HGD和EAC的这样的标志物的DMR信息，包括染色体号、基因注释和DMR起始/终止位置。
表1.区分BE和正常组织的DMR的信息
表2.区分BE和BED的DMR的信息
表3-区分BE和BED的DMR的信息
表4.表3中提供的DMR的引物。
表5-区分LGD、HGD和EAC以及区分BE和BED的DMR的信息
表6-区分BE和BED的DMR的信息
表7-区分BE和正常组织的DMR的信息
实施例II.
本实施例描述了用于产生1和表7的材料和方法。
从Mayo Clinic Rochester的制度癌症机构(institutional cancerregistries)选择18个巴雷特食管(BE)和18个正常食管组织样品，并且由专家病理学审核以确认正确分类。正常白细胞对照由Mayo Biospecimens Linking Investigators和GIHCell Signaling Research Clinical Core的临床医师提供。
文库制备：用10单位的MspI(识别含CpG的基序的甲基化特异性限制酶)消化使基因组DNA(300ng)片段化，以富集样品CpG含量并消除基因组的冗余区域。将消化的片段进行末端修复，并用5单位的Klenow片段(3'-5'外切)进行A尾处理(A-tailed)，并与含有条形码序列的甲基化TruSeq衔接子(Illumina,San Diego CA)连接过夜(将每个片段连接到其样品ID)。使用AgencourtAMPure XP SPRI珠/缓冲液(Beckman Coulter,Brea CA)进行160-340bp片段(40-220bp***片段)的大小选择。缓冲液截留值为珠/缓冲液的0.7X-1.1X样品体积。最终洗脱体积为22uL(EB缓冲液-Qiagen,Germantown MD)；qPCR用于在小样品等分试样上测量连接效率和片段质量。随后使用改良的EpiTect方案(Qiagen)对样品进行亚硫酸氢盐转化(两次)。对转化的样品等分试样进行的qPCR和常规PCR(PfuTurbo Cx hotstart–Agilent,Santa Clara CA)和接着的Bioanalyzer 2100(Agilent)评估确定了最终文库扩增前的最佳PCR循环数。以下条件用于最终PCR：1.)每50uL反应含有5uL 10X缓冲液，1.25uL10mM的每种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，5uL引物混合物(～5uM)，15uL模板(样品)，1uLPfuTurbo Cx hotstart和22.75水；温度和时间为95C-5分钟；98C-30秒；分别为98C-10秒，65C-30秒，72C-30秒，72C-5分钟和保持4C的16个循环。基于随机化方案将样品组合(等摩尔)到4-plex文库中，并进行以下测试：使用生物分析仪进行最终大小验证，使用phiX标准品和衔接子特异性引物进行qPCR。
测序和生物信息：根据随机泳道分配将样品加载到流动池上，另外还有保留用于内部测定对照的泳道。在Illumina HiSeq 2000上的Mayo Clinic Medical GenomeFacility通过Next Generation Sequencing Core进行测序。101次循环的读取是单向的。每个流动池泳道产生1亿-1.2亿读取，足够比对序列的30-50倍测序深度(每个CpG的读取次数)的中值覆盖度。Standard Illumina pipeline软件以fastq格式访问碱基和测序读数产生。如前所述，(28)SAAP-RRBS(约化表示亚硫酸氢盐测序的流水分析和注释管线)用于序列比对和甲基化提取。
MSP引物设计：设计并排序(IDT，Coralville IA)了来自测序结果的6种最好标志物的引物，以靶向特异性亚硫酸氢盐修饰的甲基化序列(表7)。这些设计通过Methprimer软件(University ofCalifornia,San Francisco CA)或MSPPrimer(Johns HopkinsUniversity,Baltimore,MD)完成。在普遍甲基化和非甲基化基因组DNA对照的稀释物上，利用SYBR Green通过qPCR进行测定的测试和优化。
甲基化特异性PCR：对独立组织提取的DNA进行定量MSP反应：108个BE样品-36个具有高度发育不良，36个具有低度发育不良，36个不具有发育不良，18个正常食管样品和36个正常白细胞样品。
统计分析：通过先验读取深度(priori read-depth)和方差标准，病例和对照之间差异％甲基化百分比的显著性，以及基于受试者操作特征曲线下面积(AUC)和靶与背景的比例，过滤候选CpG。
对于RRBS发现阶段，目标主要比较是每个映射的CpG的巴雷特病例、食管对照和白细胞对照之间的甲基化差异。通过观察到的预期CpG比值>0.6来生物化学地定义CpG岛。(30)然而，对于该模型，基于每个染色体的CpG位点位置之间的距离产生了CpG分析“差异甲基化区域(DMR)”的平铺单元。排除具有仅单个CpG的岛。仅当每个疾病组的总覆盖深度≥200读取(平均10读取/受试者)和％甲基化的方差>0(排除非信息性CpG)时，考虑单个CpG位点用于差异分析。读取深度标准基于期望的统计学功率，以检测任何两组之间的％甲基化的10％差异，其中每组的样本量为18个个体。基于读取计数，通过每个DMR的甲基化百分比的逻辑回归来确定统计学显著性。为了解释个体受试者的读取深度变化，使用过度离散逻辑回归模型，其中使用拟合模型的残差的Pearson卡方统计估计离散参数。如果良性食管和白细胞对照中的％甲基化，并且巴雷特病例中为≤1％但≥10％，则进一步考虑通过其显著性水平排序的DMR。这得到了78种标志物(表1)。全都具有大于0.90的AUC，和大于25的倍数变化。
对于6种标志物的qMSP验证研究(表7)，主要结果是每种标志物的受试者操作特征曲线下面积(AUC)，如由与正常食管和正常白细胞相比具有BE的每个样品的％甲基化拷贝数的逻辑回归模型计算的。对于每种标志物，AUC再次>0.90，并且病例和对照之间每个样品的候选基因组拷贝数的平均值的定量差异为至少50倍。
实施例III.
本实施例描述了用于产生2和表6的材料和方法。
从Mayo Clinic Rochester的制度癌症机构选择36个具有高度和低度发育不良的巴雷特食管(BED)和18个不具有发育不良的巴雷特食管(BE)组织样品，并且由专家病理学审核以确认正确分类。18个正常白细胞对照由Mayo Biospecimens LinkingInvestigators和GIH Cell Signaling Research Clinical Core的临床医师提供。
文库制备：用10单位的MspI(识别含CpG的基序的甲基化特异性限制酶)消化使基因组DNA(300ng)片段化，以富集样品CpG含量并消除基因组的冗余区域。将消化的片段进行末端修复，并用5单位的Klenow片段(3'-5'外切)进行A尾处理(A-tailed)，并与含有条形码序列的甲基化TruSeq衔接子(Illumina,San Diego CA)连接过夜(将每个片段连接到其样品ID)。使用AgencourtAMPure XP SPRI珠/缓冲液(Beckman Coulter,Brea CA)进行160-340bp片段(40-220bp***片段)的大小选择。缓冲液截留值为珠/缓冲液的0.7X-1.1X样品体积。最终洗脱体积为22uL(EB缓冲液-Qiagen,Germantown MD)；qPCR用于在小样品等分试样上测量连接效率和片段质量。随后使用改良的EpiTect方案(Qiagen)对样品进行亚硫酸氢盐转化(两次)。对转化的样品等分试样进行的qPCR和常规PCR(PfuTurbo Cx hotstart–Agilent,Santa Clara CA)和接着的Bioanalyzer 2100(Agilent)评估确定了最终文库扩增前的最佳PCR循环数。以下条件用于最终PCR：1.)每50uL反应含有5uL 10X缓冲液，1.25uL10mM的每种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，5uL引物混合物(～5uM)，15uL模板(样品)，1uLPfuTurbo Cx hotstart和22.75水；温度和时间为95C-5分钟；98C-30秒；分别为98C-10秒，65C-30秒，72C-30秒，72C-5分钟和保持4C的16个循环。基于随机化方案将样品组合(等摩尔)到4-plex文库中，并进行以下测试：使用生物分析仪进行最终大小验证，使用phiX标准品和衔接子特异性引物进行qPCR。
测序和生物信息：根据随机泳道分配将样品加载到流动池上，另外还有保留用于内部测定对照的泳道。在Illumina HiSeq 2000上的Mayo Clinic Medical GenomeFacility通过Next Generation Sequencing Core进行测序。101次循环的读取是单向的。每个流动池泳道产生1亿-1.2亿读取，足够比对序列的30-50倍测序深度(每个CpG的读取次数)的中值覆盖度。Standard Illumina pipeline软件以fastq格式访问碱基和测序读数产生。如前所述，(28)SAAP-RRBS(约化表示亚硫酸氢盐测序的流水分析和注释管线)用于序列比对和甲基化提取。
MSP引物设计：设计并排序(IDT，Coralville IA)了来自测序结果的66种最好标志物的引物，以靶向特异性亚硫酸氢盐修饰的甲基化序列(表7)。这些设计通过Methprimer软件(University of California,San Francisco CA)或MSPPrimer(Johns HopkinsUniversity,Baltimore,MD)完成。在普遍甲基化和非甲基化基因组DNA对照的稀释物上，利用SYBR Green通过qPCR进行测定的测试和优化。
甲基化特异性PCR：对独立组织提取的DNA进行定量MSP反应：108个BE样品-36个具有高度发育不良，36个具有低度发育不良，36个不具有发育不良，18个正常食管样品和36个正常白细胞样品。
统计分析：通过先验读取深度和方差标准，病例和对照之间差异％甲基化百分比的显著性，以及基于受试者操作特征曲线下面积(AUC)和靶与背景的比例，过滤候选CpG。
对于RRBS发现阶段，目标主要比较是每个映射的CpG的具有高和低度发育不良的巴雷特病例、不具有发育不良的巴雷特对照和白细胞对照之间的甲基化差异。通过观察到的预期CpG比值>0.6来生物化学地定义CpG岛。(30)然而，对于该模型，基于每个染色体的CpG位点位置之间的距离产生了CpG分析“差异甲基化区域(DMR)”的平铺单元。排除具有仅单个CpG的岛。仅当每个疾病组的总覆盖深度≥200读取(平均10读取/受试者)和％甲基化的方差>0(排除非信息性CpG)时，考虑单个CpG位点用于差异分析。读取深度标准基于期望的统计学功率，以检测任何两组之间的％甲基化的10％差异，其中每组的样本量为18个个体。基于读取计数，通过每个DMR的甲基化百分比的逻辑回归来确定统计学显著性。为了解释个体受试者的读取深度变化，使用过度离散逻辑回归模型，其中使用拟合模型的残差的Pearson卡方统计估计离散参数。如果良性食管和白细胞对照中的％甲基化，并且巴雷特病例中为≤1％但≥10％，则进一步考虑通过其显著性水平排序的DMR。这得到了57种标志物(表2)。全都具有0.60至0.87的AUC，和2至10的倍数变化。进行数据的第二次分选，放松岛限制性计量，及聚焦于高度区分性单CpG的分组。还移除了对白细胞对照的批次间效应，其增加了总体覆盖率。这得到了52种额外的标志物，其具有增加的倍数变化(7-52)和类似的AUC(表6)。
对于66种DMRqMSP验证研究，主要结果是每种标志物的受试者操作特征曲线下面积(AUC)，如由与BE和正常白细胞相比具有BED的每个样品的％甲基化拷贝数的逻辑回归模型计算的。12种标志物表现出优异的性能(表3)。AUC为0.86-0.97，倍数变化为2-24。12种标志物中的10种与BMP3和NDRG4一起进行食管刷擦可行性研究。
实施例IV.
本实施例描述了在产生3、4和5中使用的材料和方法。
使用高容量细胞刷(Hobbs Medical,Stafford Springs,CT)对计划进行内窥镜BE监测或BE相关癌症内窥镜评估的知情同意的BE患者进行全食管刷擦，通过全食管长度(BE+鳞状粘膜)从贲门圆周取样。从手柄中取下细胞刷，并放入稳定/细胞裂解液的小瓶中，冷冻直到处理。使用Gentra Puregene Buccal程序(Qiagen,Valencia,CA)提取DNA。使用亚硫酸氢钠处理来自每个患者样品的2ug DNA，并使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)进行纯化。在来自BED vs BE研究(表3)的12个验证的DMR中的10个上，使用20ng转化的DNA进行MSP。在表4中突出了引物序列。此外，进行BMP3和NDRG4 Cologuard QuARTs测定。使用DeLong、DeLong和Clarke-Pearson的方法比较AUC并测量差异的显著性。Bonferroni校正用于避免多重比较的偏差。显示出对BED和BE的最高辨别度的(组合的)3种标志物列于表5中。
实施例V.
本实施例证明了用于检测巴雷特食管的甲基化DNA标志物的发现、验证和可行性测试。
阶段1方法与结果：
由Mayo Clinic Tissue Registry提供病理学家验证的FFPE组织。临床组由具有以下的患者组成：巴雷特HGD(N＝34)、巴雷特LGD(N＝34)、不具有发育不良的巴雷特(N＝34)、食管腺癌(N＝12)、食管鳞状细胞癌(N＝12)、正常贲门(N＝13)、正常食管(N＝25)。使用Qiagen Mini试剂盒纯化DNA，并通过吸光度和picogreen分析进行定量。使用Zymo方法进行亚硫酸氢盐转化。甲基化标志物由来自3类RRBS子集的最好候选物组成：1)45种BEDvs.BE DMR(差异甲基化区域)，2)5种BE vs.正常食管DMR，以及3)33种之前验证的食管癌标志物。(注意：所有这些DMR之前针对正常白细胞进行过滤，用于<1％的背景甲基化)。为这些基因组区域中的每个设计甲基化特异性PCR(MSP)引物，并在3组甲基化对照上进行性能测试。表8提供了鉴定来分开BE和正常组织的这样的标志物的DMR信息，包括染色体号、基因注释和DMR起始/终止位置。使用Roche 480LightCyclers进行QMSP(SYBR Green)。将系列稀释的通用甲基化DNA用作标准品。此外，在标志物BMP3、NDRG4、SFMBT2和VAV3上进行QuARTs测定。后面这4种包括在其三重测定形式的两个参考基因β-肌动蛋白和ZDHHC1。
将结果相对于β-肌动蛋白和ZDHHC1归一化，并在JMP中进行逻辑分析。计算ROC曲线下面积(AUC)以及倍数变化和p值。阶段2的性能截止值为AUC≥0.95，倍数变化≥25，p值≤0.1。13种标志物通过了这些标准：CDKN2A、SFMBT2、VAV3、DIO3、ELMO1、FEM1B、HUNK、ADCY1、CD1D、ST3GAL6、LRRC4、NDRG4和BMP3(表9提供了包括OPLAH在内的这些测定的同一性和引物序列)。
表8.区分BE和正常组织的DMR的信息
表9.实施例V中描述的提供的特定DMR的引物。
阶段2方法和结果
内窥镜检查前招募了具有BE的49个病例和不具有BE的36个对照。中值年龄为69岁(范围63-73岁)和59岁(45-67岁)，男性分别占92％和42％。BE病例具有＞1cm(中值数＝2cm；IQR 4-8)的具有确认的肠上皮化生的圆周柱状粘膜；对照不具有内窥镜检查的BE。使用高容量内窥镜细胞刷(Hobbs Medical,Stafford Springs CT)获得样本；刷擦贲门、BE(病例)和全食管长度以模拟吞咽的海绵取样装置。将刷放置在含有裂解缓冲液的2ml小瓶中，并在-80C下迅速冷冻。将样品解冻并以盲性方式作为批处理。在将小瓶的剧烈涡旋以从刷上除去所有细胞材料后，使用Gentra Puregene试剂盒(Qiagen)纯化DNA。该方法允许同时收获游离DNA和细胞DNA。然后用亚硫酸氢钠处理样品，并使用EZ DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch)回收。
如前在Roche 480 LightCyclers上通过QMSP和QuARTs测定13种靶基因的甲基化。还定量了β-肌动蛋白和ZDHHC1作为总人DNA的标志物。多种标志物(例如BMP3、CDKN2A、CD1D、HUNK、ELMO1、DIO3)对于BE显示出异常辨别，AUC为0.91-0.97；来自BE病例和对照的甲基化水平分布显著不同(图2)。甲基化水平与BE长度和发育不良的存在相关，p<0.05。图3显示了来自第2阶段突出互补性(内窥镜刷研究)的最好的甲基化DNA标志物的命中矩阵。
选择10种巴雷特特异性标志物用于阶段3测试：BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH。OPLAH不包括在早期阶段，但由于其在区分食管癌和正常组织方面具有出色的表现，因此在这里添加了。
阶段3方法与结果：
在具有BE的10个病例和不具有明显BE的12个对照中，吞咽并且取出胶囊海绵装置(EsophaCap,Capnostics)，然后在24小时内内窥镜检查。在10个病例和12个对照中，中值年龄分别为65岁(59-69岁)和40岁(34-61岁)，男性分别占70％和45％。中值BE长度为4.5cm(IQR 2-9)。然后将装置放置在含有20mL细胞保存缓冲液(PreservCyt)的小瓶中。将样品涡旋并转移到50mL离心管中。用另外的PreservCyt的等分试样重复该步骤，总共40ml。将细胞沉淀并在1mL缓冲液(Puregene Buccal Cell Kit)中裂解，并按照制造商的指示提取。还测试了第二种提取方法(Maxwell-Promega)。在亚硫酸氢盐转化(Zymo Research)之后，如前通过QPCR测定样品。来自海绵的最好的标志物的分布高度辨别BE。在100％的特异性下，一组标志物检测到满足入选标准(100％灵敏度)的所有9个BE病例(1个不满足入选标准)。
图4显示来自阶段3(胶囊海绵研究)的BE病例和正常(N1)对照中甲基化的DNA标志物水平(PCR拷贝/30ng DNA)。
上述说明书中提及的所有出版物和专利的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。本技术的所描述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见的，而不脱离所描述的技术的范围和精神。虽然已经结合具体示例性实施方案描述了本技术，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方案。事实上，对药理学、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种在获自受试者的样品中筛选巴雷特食管的方法，所述方法包括：
a)测定获自受试者的样品中的标志物的甲基化状态；以及
b)当所述标志物的甲基化状态不同于在不具有巴雷特食管的受试者或不具有巴雷特食管发育异常的受试者中测定的所述标志物的甲基化状态时，将所述受试者鉴定为具有巴雷特食管，其中所述标志物包含选自BMP3、NDRG4、VAV3、SFMBT2、DIO3、HUNK、ELMO1、CD1D、CDKN2A和OPLAH的差异甲基化区域(DMR)中的碱基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含食管组织。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含通过全食管拭抹或刷擦或使用海绵胶囊装置获得的食管组织。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的升高的甲基化。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述标志物的甲基化状态包括相对于所述标志物的正常甲基化状态，所述标志物的不同的甲基化模式。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述测定包括使用甲基化特异性寡核苷酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性聚合酶链式反应。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述测定利用核酸测序。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述测定利用质谱法。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述测定利用甲基化特异性核酸酶。
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