CN114517161B - 高产赤霉素ga3的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
本发明涉及一种高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。本发明通过增强表达藤仓赤霉菌中表达氮源调控因子AreA的基因和全局调控因子Lae1的基因，增强其对赤霉素合成代谢路径中相关基因的正向调控作用，提高了相关基因的转录水平，提高了赤霉素GA3的积累。本发明提供的高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌，经过改造后的重组藤仓赤霉菌相比于野生型增强了GA基因簇整体转录水平，提高了代谢过程的合成能力，削弱了GA3合成相关基因的转录抑制，能够更好的利用碳源物质、氮源物质进行赤霉素GA3的生产，经过改造后性能最优的菌株在发酵产赤霉素GA3的水平相比于出发菌株从2 g/L提高到3.25 g/L，显著提升赤霉素GA3生产能力，可应用于大规模赤霉素GA3生产中。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
赤霉素（Gibberellin Acid，GA3）是由植物、部分真菌合成的一种植物生长激素。因其特殊的刺激植物生长的能力被广泛应用于农业、园艺与酿酒生产。藤仓赤霉菌最早由日本的植物病理学家在研究水稻恶苗病发现，后续研究证实藤仓赤霉菌天然具有完整的GA3合成能力。GA3是一种四环二萜羧酸，分子式C19H22O6，分子量346.37，熔点233~235 ℃，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氢钠溶液以及pH为6.2的磷酸缓冲液，难溶于水和***。GA3作为一种次级代谢产物，一般通过液态发酵、固态发酵与植物提取的方式获得。目前GA3的生产主要依赖液体深层发酵或固态发酵。
藤仓赤霉菌中GA3的合成场所在细胞质，其生物合成由TCA循环合成的乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）出发，经甲羟戊酸途径合成异戊烯焦磷酸（IPP）及其异构体二甲烯丙基二磷酸（DMAPP），后续由合成酶催化经由基焦磷酸（GPP），法尼基焦磷酸（FPP）合成前体二基焦磷酸（GGPP）。在赤霉素合成基因簇的作用下，两分子GGPP环化合成焦磷酸古巴酯（CPP）后，产生了贝壳杉烯。在C-19上由P450单加氧酶逐步氧化产生贝壳杉烯酸，后续通过在C-7α与C-6β位置的氧化产生GA12-半醛，P450单加氧酶在C-3β 与 C-7的氧化产生GA14，GA14通过氧化转化为GA4，经去饱和作用生产GA7，经羟基化转化为GA3。
现有对藤仓赤霉菌合成GA3的技术方案，主要以不同方式的诱变为主，包括化学诱变，辐射诱变和ARTP诱变等。中国发明专利（公开号CN104892554A、CN201910304928.1与CN201910438160.7）分别描述了GA3的制备方法、诱变结果与ARTP的诱变技术，但通过传统诱变方案获得的菌株产量达到了2 g/L后再难得到提升。
发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，提供高产赤霉素GA3的基因工程菌、构建方法及应用。
本发明采用的技术方案是：
高产赤霉素GA3的基因工程菌，由如下方法构建获得：以藤仓赤霉为底盘菌，将其基因组中编码氮源调控因子AreA的基因和编码全局调控因子Lae1的基因增强表达，获得所述高产赤霉素GA3的基因工程菌。
优选的，所述底盘菌为藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）CCTCC NO: M 2019378（已在在先申请CN110527630A中公开）。
本发明通过增强表达藤仓赤霉菌中表达氮源调控因子AreA的基因和全局调控因子Lae1的基因，以增强其对赤霉素合成代谢路径中相关基因（cps/ks、p450-1、p450-2、des等）的正向调控作用，提高了相关基因的转录水平，实现了积累赤霉素GA3的目的。由通过以上改造策略的组合，本发明成功获得了高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌菌株。
本发明还涉及构建所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：分别构建AreA和Lae1基因的体外组装完整基因表达盒，将其导入引入底盘菌为藤仓赤霉中，得到所述基因工程菌。
优选的，所述AreA基因的完整基因表达盒，用来源于pAN7-1质粒的gpdA启动子和trpC终止子连接氮源调控因子的编码序列。
具体的，所述氮源调控因子的编码序列如SEQ ID No.1所示，所述gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述Lae1基因的完整基因表达盒，用来源于构巢曲霉的Ptef1启动子和Ttef1终止子连接全局调控因子的基因序列。
具体的，所述全局调控因子的基因序列如SEQ ID No.4所示，所述Ptef1启动子核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Ttef1终止子核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素GA3中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25~30 ℃、200~300 rpm条件下进行发酵培养150~200 h获得含赤霉素GA3的发酵液，将发酵液分离纯化获得所述赤霉素GA3。
优选的，所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉70~90 g/L，米粉70~90 g/L，大豆粉10~30 g/L，花生粉10~30 g/L，硫酸钾 0.5~1.5 g/L，磷酸二氢钾0.5~1.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30 min。
通常，所述基因工程菌株发酵前，先进行斜面活化，再接种至种子培养基，在25~30℃、200~300 rpm条件下培养。然后将种子液转接到发酵培养基中，在25~30 ℃、200~300rpm条件下培养。将培养液分离纯化，获得赤霉素GA3。
所述斜面活化方法为：将重组藤仓赤霉菌接种在种子培养基中，在25~30 ℃、200~300 rpm条件下培养2天，涂布在PDA斜面上，在28 ℃培养4天，获得种子斜面。
所述种子培养基终浓度组成如下：玉米淀粉10~30 g/L、蔗糖10 ~30 g/L、花生粉10 ~30 g/L、大豆粉10 ~30 g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5 g/L、硫酸镁0.5~1.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30 min。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的高产赤霉素GA3的重组藤仓赤霉菌，经过改造后的重组藤仓赤霉菌相比于野生型增强了GA基因簇整体转录水平，提高了代谢过程的合成能力，削弱了GA3合成相关基因的转录抑制，能够更好的利用淀粉米粉等碳源物质、花生粉玉米粉等氮源物质进行赤霉素GA3的生产；经过改造后性能最优的菌株在发酵产赤霉素GA3的水平相比于出发菌株从2 g/L提高到3.25 g/L，显著提升赤霉素GA3生产能力，可应用于大规模赤霉素GA3生产中。
附图说明
图1为生产菌株中GA3的合成过程；
图2为重组表达质粒构建流程与转化流程图；
图3为工程菌株与出发菌株的发酵产物积累曲线；
图4为工程菌株经过多轮传代后的发酵结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。本发明所使用的术语“增强”指的是通过基因的过表达，增加由对应的多核苷酸编码的酶的活性。
实施例1：F. fujikuroi -OE: AreA的获得
通过PCR使用引物1和2，以pAN7-1质粒为模板扩增得到gpdA启动子片段，PCR反应条件如下：98℃ 5min；98℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环；72℃继续延续5min。按同样的方法使用引物3和4扩增得到trpC终止子片段，使用引物5和6扩增得到潮霉素hyg片段。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段（gpdA启动子片段、trpC终止子片段和潮霉素hyg1片段核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.7所示）。
通过PCR使用引物7和8，以藤仓赤霉菌（Fusarium fujikuroi）CCTCC NO:M2019378（CN110527630A）基因组为模板扩增得到areA基因片段，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃3min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）。
将回收的三个DNA片段（gpdA启动子，areA基因，trpC终止子）使用引物1和4进行融合PCR，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃5min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpress ⅡOne Step CloningKit（购自南京诺唯赞Vazyme）连接，构建pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC载体，连接产物转化至E. coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC载体。
藤仓赤霉菌原生质体制备，外源片段转化，复苏培养方案，验证方案如CN113832041A所述。转化后的单菌落以引物1和4进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE: AreA。质粒构建与转化过程如图2所示。
表1：引物序列
实施例2：F.fujikuroi -OE: Lae1的获得
通过PCR使用引物9和10，以构巢曲霉基因组为模板扩增得到tef1启动子片段，PCR反应条件如下：98℃5min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延续5min。按同样的方法使用引物11和12扩增得到tef1终止子片段，以pAN7-1质粒为模板使用引物13和14扩增得到潮霉素hyg2片段。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段（tef1启动子片段、tef1终止子片段和潮霉素hyg2片段核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示）。
通过PCR使用引物15和16，以藤仓赤霉菌（Fusarium fujikuroi）CCTCC NO:M2019378基因组为模板扩增得到lae1基因片段，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示）。
将回收的三个DNA片段（tef1启动子，lae1基因，tef2终止子）使用引物9和12进行融合PCR，PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃3min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpress ⅡOne Step CloningKit（购自南京诺唯赞Vazyme）连接，构建pUC19-Hyg2-Ptef1-Lae1-Ttef1载体，连接产物转化至E. coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg2-Ptef1-Lae1-Ttef1载体。
转化载体后的藤仓赤霉菌单菌落以引物9和12进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE: Lae1。
表2：引物序列
实施例3：F.fujikuroi -OE: AreA OE: Lae1的获得
通过PCR使用引物17和18，以实施例2中的pUC19-Hyg2-Ptef1-Lae1-Ttef1载体为模板，扩增Lae1完整表达盒。PCR反应条件如下：98℃8min；98℃30s，60℃30s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延续8min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
以pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC载体载体作为模板，通过一步克隆试剂盒ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（购自南京唯赞vazyme）连接，构建pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体，连接产物转化至E. coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落至含终浓度100 mg/L氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pUC19-Hyg1-PgpdA-AreA-TtrpC-Ptef1-Lae1-Ttef1载体。
转化载体后的藤仓赤霉菌单菌落以引物19和20进行PCR，用于确认外源片段整合到基因组上。如此构建的菌株命名为Fusarium fujikuroi-OE: AreA OE: Lae1。
表3：引物序列
实施例4：不同基因型产赤霉素GA3工程菌的摇瓶发酵验证
将实施例1，2和3中构建的改造菌株和出发菌株分别接种于25 mL种子培养基中，28 ℃、250 rpm培养用作预培养物。48 h后，接种2.8 mL预培养物到装有40 mL发酵培养基的500 mL摇瓶，然后在28 ℃、250 rpm培养7天。按照专利CN113832041A实施例7的HPLC检测方法检测GA3含量。发酵过程中，其发酵液中GA3含量变化如图3。
种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20 g/L、蔗糖20 g/L、花生粉20 g/L、大豆粉20 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0g/L，pH自然，121℃灭菌30 min。
发酵培养基组成：玉米淀粉80g/L，米粉80 g/L，大豆粉20 g/L，花生粉20 g/L，硫酸钾 1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，溶剂为自来水，pH自然，121度灭菌30 min。
不同基因型的菌株发酵产量如表4所示。
表4
实施例5：高产赤霉素GA3工程菌的传代验证
按照专利CN113832041A的斜面培养基组成与培养条件，挑取实施例1，2和3中构建的改造菌株，经过连续5次传代，经过与实施例4相同的培养方法和HPLC分析，赤霉素GA3的产量稳定，较出发菌株提高了60%以上。传代验证结果如图4所示，说明本发明中构建的产赤霉素GA3工程菌具有传代稳定性。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产赤霉素GA<sub>3</sub>的基因工程菌、构建方法及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3102
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgaacccaa taataacaga gcacgacttt cgttttccaa gaaggccaag tgcatggcct 60
ggcgctgcta ttcacaacgc tcccactcag cgcagcggca actcgaaccg catcccaaac 120
tctcgtgacg cttcggccag cttcaaggag cacaagaccg atatggccac cacatattcc 180
cttgcccggc agggcctggg cggcagcgcc cttttccctt ttctccagaa tggcttggcc 240
gactccgatc gcagtatcga cagaatgcaa caggatgatc cgcttgcgac tcaggtctgg 300
aaattcttcg cgaggaccaa gcaccagctc cctagccagc accgcatgga gaatctgact 360
tggcgtatga tggctctcaa cattcgcagg cacaaggaag agcagcagca aaggcaagac 420
gaggcggatg ctcgaagaaa aaagaacatg gacgctggca gccggtatgt aaatcatatt 480
ttattcctac aacgccattt gtgcttcgaa tcgcgttctt acatttggac catgacgtgc 540
taaccagggc tttcaggctt ggacgcccaa tgatgcaaag ctctcccagt ggcattgccc 600
agctgagaaa gtcttctgaa aacaatctcg ctcaacctga tgccatgaat cttgacgact 660
tcattttttc tgacaattct ggctcgccta tcaactttgc ctctcctgaa ggcgataaaa 720
tggttgacga taggtctggc agttcaatgg cgtcggccat cccaatcaaa tcccgcaagg 780
aaccatctct ccagaatttt gtcccacagt cggtgcccgt ccagccagct caccaagcta 840
ctcagggtag cgaattcaac tatgtgaacc gacatcttcg aaaaacgagc atcgatgacc 900
gcagggtgag taactttcat tgcccctcct ctttgtgtga ccagctgcgc atattgccat 960
tcgtccgtcg caaacctcca agtttgtgtt actttttatt ttacatgtga taacacgcct 1020
atttcccgct cggttgctaa cctttacaaa cagactcgaa agcgccctgc taatttctcc 1080
ccccaagtcc cagctgttaa cagcactgcg gcgcagaatg acctcgatct tgattcagag 1140
ttgcacgact attccctaga ccagcccaac caggccggta tccctcagca gtctaatggc 1200
agcaatgttc ccttcaacat cgatactttt atggaaaatg actccatggt caacaatgga 1260
aatttccagc agaacttctc attttctcct tctacatcac ctatgatacc ccatggtccc 1320
ttttctggca tgtaccacaa ttcgtctgtc ccttcagcat cgatgagcaa caacaacaac 1380
aatagcgact tttattcgcc accagcgtct gcgtatccct caaatgtctc gacccctcat 1440
cctgtgcctg agcaggaagg gttctatttt ggatcccagg atgcgcgaac gcaacgtcca 1500
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gccgactccg atgatgagga taacaacgca tttgctgatc gcaatgtttc aatgcaaaag 1800
gacatgtctt catcacttga tgagtcggga gcgatgggct gggatgctag cctgccaggc 1860
cagttcagca cccaagcagc tcgtttccct ggcgggccaa ctcgcaagca ggtgatgatt 1920
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cgatcgcagt cgcagtcttt tagaggagga aacctaagaa ggcagcatcc taaattaccg 2040
cgaaatgcat ctacgccagt tcattttggc ggacagcaaa atggttttga gcagcttgca 2100
cagtcgatgc aaagctctcc tgctggtgat ggcaacggga ccatgtcagg attctcatct 2160
gtggccccaa gcagaccatc ttcgcctccc atgtcaaagc agggctcaac caccaacttg 2220
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ggtcttttcc tgaagttgca cggcgtggtg agaccgttga gtttgaagac ggacgtgatt 2400
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aagaagacgg cgagtaccct gaactctcgc aaaaactcga ccttgtcgat gtccactgcg 2520
acggcaaata gcaccaaacc aaacagcagc aaccccacgc ccagagttac gacaccacct 2580
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ggtgccaaca ccgctggaag cactccaaac agccattttg gtggtccagg accctcttct 2700
ggcgctgtgg gtggtaaagg ggttgtaccc atcgcggctg cgcccccaaa gactagccct 2760
ggacctggtg cctcatcaat gtcaatgcag cgtcccgcca cagcttcgtc aaaacgacaa 2820
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<400> 2
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cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc tctgcactcg acctgctgag 1980
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tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat tttcctgctc tccccaccag 2100
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acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata ctccatcctt cccatccctt 2220
attcctttga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc gcagcttgac taacagctac 2280
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ttcatttgtc caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag 180
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gtccgagggc aaaggaatag ggtacctcta gaaagctt 1058
Claims (4)
1.高产赤霉素GA3的基因工程菌，由如下方法构建获得：以藤仓赤霉为底盘菌，将其基因组中编码氮源调控因子AreA的基因和编码全局调控因子Lae1的基因增强表达，获得所述高产赤霉素GA3的基因工程菌，所述底盘菌为藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）CCTCC NO: M2019378；
所述方法包括：分别构建AreA和Lae1基因的体外组装完整基因表达盒，将其导入引入底盘菌为藤仓赤霉中，得到所述基因工程菌；
所述AreA基因的完整基因表达盒，用来源于pAN7-1质粒的gpdA启动子和trpC终止子连接氮源调控因子的编码序列，所述氮源调控因子的编码序列如SEQ ID No.1所示，所述gpdA启动子核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述trpC终止子核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述Lae1基因的完整基因表达盒，用来源于构巢曲霉的Ptef1启动子和Ttef1终止子连接全局调控因子的基因序列，所述全局调控因子的基因序列如SEQ ID No.4所示，所述Ptef1启动子核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Ttef1终止子核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备赤霉素GA3中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25~30 ℃、200~300 rpm条件下进行发酵培养150~200 h获得含赤霉素GA3的发酵液，将发酵液分离纯化获得所述赤霉素GA3。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：玉米淀粉70~90 g/L，米粉70~90 g/L，大豆粉10~30 g/L，花生粉10~30 g/L，硫酸钾 0.5~1.5 g/L，磷酸二氢钾0.5~1.5 g/L，溶剂为水，pH自然，121度灭菌30 min。
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Citations (4)
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| CN110042061A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-23 | 浙江工业大学 | 高产赤霉素ga3的藤仓赤霉菌突变株及其应用 |
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| Mihlan et al..AREA directly mediates nitrogen regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi, but its activity is not affected by NMR.《Molecular Microbiology》.2003,第47卷(第4期),摘要部分. * |
| Niehaus et al..Analysis of the global regulator Lae1 uncovers a connection between Lae1 and the histone acetyltransferase HAT1 in Fusarium fujikuroi.《Appl Microbiol Biotechnol》.2017,摘要部分、第4页左栏第4段及第6页右栏倒数第2段. * |
| 李超 ; 杨佳羽 ; 刘佳 ; 朱廷恒 ; .藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)分子生物学及发酵工程研究进展.工业微生物.2016,(02),第47-55页. * |
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