CN110484572A - 一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导***，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌。本发明使用酵母二次生长诱导***进行代谢改造，当GAL启动子驱动的表达盒大量整合在基因组上后，GAL启动子的转录活性大幅度下降，而本发明中过表达转录因子Hac1则可以提高GAL启动子的转录活性和菌株活力，进而促进二次生长诱导***中目标代谢产物的合成，橙花叔醇产量提高了48.4％，达到497mg/L。

Description

一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法。
(二)背景技术
酿酒酵母具有遗传操作简便、生物安全性高和发酵稳定等优点，是一种应用广泛的生物细胞工厂。萜类化合物的通用C5前体为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，它们在酵母中通过甲羟戊酸(MVA)途径合成。通过提高乙酰-COA和MVA水平，研究者已经成功地将酿酒酵母改造为异源生物合成萜类化合物的高产微生物。橙花叔醇是一种芳香的倍半萜精油成分，广泛应用于化妆品和洗涤。此外，橙花叔醇还具有抗病毒、抗肿瘤和抗疟疾的作用。本发明以酵母工程菌中橙花叔醇的合成为例，为提高酵母倍半萜的生产提供了一种新的方法。
在代谢工程中，加强代谢途径通量可能导致细胞产生代谢压力或对细胞有毒性的中间代谢物。为了解决这个问题，研究者设计了基于酵母GAL启动子的二次生长诱导***，在该***中，敲除GAL80基因的菌株，GAL启动子在培养基中糖耗尽后开始转录，无需半乳糖诱导。该***成功地将细胞生长和产物积累阶段分离，减轻了产物对菌体的毒性。
然而，酵母细胞工厂中重组蛋白或代谢酶的过表达，仍然会导致细胞蛋白负荷增大，使得菌体的比生长速率下降，发酵启动延迟，发酵产量降低，或生物量降低。酵母已经进化出一些细胞应激防御策略，以减轻蛋白质负荷压力。众所周知的调节策略之一涉及在未折叠蛋白反应中起重要作用的转录因子Hac1p。错误折叠的膜蛋白或分泌蛋白在内质网中的积累，会诱导Hac1p转录物的进一步剪接，后者调节未折叠蛋白反应靶基因的转录。未折叠蛋白反应靶基因编码参与蛋白质折叠的分子伴侣、蛋白质降解、糖基化和脂质代谢。Hac1在毕赤酵母中的过表达已经成为增强分泌异源蛋白表达的常用策略。
在目前所有文献的报道中，Hac1参与调控的未折叠蛋白反应，是由错误折叠的膜蛋白或分泌蛋白在内质网中的积累引发。而代谢工程中往往将代谢酶基因在细胞质中表达，似乎与Hac1的功能无关。然而，在本发明中，我们发现随着整合在基因组上的GAL启动子驱动的基因表达盒的数量不断提高，二次生长诱导***中目的产物代谢途径的酶基因的转录水平会大幅度下降。可以通过高表达Hac1，增强二次生长诱导***中，由Gal启动子驱动的代谢途径中酶基因的转录水平，从而进一步增强目的代谢产物的合成。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种提高酿酒酵母代谢工程菌的橙花叔醇产量的方法，使用现有的酵母二次生长诱导***进行代谢改造，当GAL启动子驱动的表达盒大量整合在基因组上后，GAL启动子的转录活性大幅度下降，而本发明中利用组成型启动子过表达转录因子hac1则可以提高GAL启动子的转录活性，进而促进二次生长诱导***中目标代谢产物的合成。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导***，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌。通过过表达转录因子hac1基因，进一步提高酿酒酵母工程菌橙花叔醇的产量。
所述酿酒酵母为酵母CEN.PK2-1D(EUROSCARF公司，德国)；所述Gal启动子包括Gal1、Gal10和Gal2；所述甲羟戊酸途径代谢酶包括乙酰辅酶A乙酰转移酶ERG10、法尼烯焦磷酸合成酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸激酶ERG12、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶MVD1、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶ERG13。上述Gal启动子和甲羟戊酸途径代谢酶基因之间可以随机组合；所述Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶的表达是将甲羟戊酸途径代谢酶基因中的一种或多种采用Gal启动子驱动导入酿酒酵母进行表达。
所述橙花叔醇合成酶为来源于猕猴桃(Actinidia chinensis)的橙花叔醇合成酶AcNES1，通过将编码基因AcNES1(SEQ ID NO.2所示)克隆至pYES2载体Gal1启动子之后，导入酿酒酵母进行表达。
所述转录因子hac1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述hac1基因的过表达按如下方法进行：将Hac1基因与TDH3启动子整合到基因组位点YPRCtau3，或者在pRS316质粒上组成型过表达Hac1，或者在pRS316质粒上过表达Gal1启动子驱动的Hac1。
本发明所述酿酒酵母工程菌培养方法为：将本发明构建的酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃、摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物接种至18mL蔗糖合成最小培养基，使得初始OD600达到0.2，再加入2mL十二烷，在30℃、摇瓶转速200rpm条件下培养96h，培养物离心，得到含有橙花叔醇的十二烷有机相；所述葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH5.0；其中微量营养素是指色氨酸、组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，它们在培养基中的终浓度均为20mg/L；根据筛选不同选择标记的需要，在培养基中添加不同微量营养素，例如筛选标记为ura3，则培养基中添加微量营养素为组氨酸；蔗糖合成最小培养基为上述葡萄糖合成最小培养基中2％蔗糖替换为2％葡萄糖；固体平板在上述组分基础上再加入2％琼脂。
本发明构建了二次生长诱导***驱动的可以合成橙花叔醇的酿酒酵母工程菌，当培养基中葡萄糖耗尽时，橙花叔醇开始合成，从而达到菌体生长和产物积累分离、减轻产物毒性的目的。所构建的一系列菌株中，橙花叔醇产量随着甲羟戊酸途径代谢酶基因在基因组拷贝数的增加而依次增强。再在二次生长诱导***驱动的酿酒酵母工程菌中过表达Hac1，进一步提高橙花叔醇产量。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明使用酵母二次生长诱导***进行代谢改造，当GAL启动子驱动的表达盒大量整合在基因组上后，GAL启动子的转录活性大幅度下降，而本发明中过表达转录因子Hac1则可以提高GAL启动子的转录活性和菌株活力，进而促进二次生长诱导***中目标代谢产物的合成，橙花叔醇摇瓶产量提高了48.4％，达到497mg/L。
(四)附图说明
图1为不同酵母菌株在蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养96h后的橙花叔醇产量。
图2为基因ACT1(a)、Hac1(b)、Gal1(c)和AcNES1(d)在蔗糖最小合成培养基中培养72h后不同酵母菌株的转录水平。内参为ACT1，YS004相对转录水平归一化为1。
图3为不同过表达方式的Hac1在蔗糖最小合成培养基中摇瓶培养96h后橙花叔醇产量的变化。
图4为在蔗糖最小合成培养基中摇瓶培养Hac1过表达菌株的生长曲线和橙花叔醇产物变化曲线。(a)橙花叔醇浓度；(b)细胞生长曲线。
图5为Hac1过表达对Gal1(a)、AcNES1(b)和Gal4(c)转录水平的影响。内参为ACT1。
图6为Hac1过表达对菌体活力的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1基于二次生长诱导***构建菌株及橙花叔醇产量测定
1、菌株构建
在酿酒酵母代谢工程中合成萜类化合物的例子很多，在这些报道的基础上，我们通过加强MVA通路代谢流，并加强乙醇向乙酰辅酶A的转化，同时减弱角鲨烯合成途径，参照文献(Coupling gene regulatory patterns to bioprocess conditions to optimizesynthetic metabolic modules for improved sesquiterpene production in yeast,Biotechnol.For.biofu,10(2017),43.Rewriting yeast central carbon metabolismfor industrial isoprenoid production,Nature.537(2016)694-697.Carotenoid-basedphenotypic screen of the yeast deletion collection reveals new genes withroles in isoprenoid production,Metab.Eng.15(2013)174-183.)构建了一系二次生长诱导***驱动的可以合成橙花叔醇的酿酒酵母工程菌的菌株(表1)，由杭州擎科新业生物技术有限公司进行引物合成和基因合成及克隆，如图1所示，具体构建方法如下：
(1)基因及来源
将来源于猕猴桃(Actinidia chinensis)的橙花叔醇合成酶编码基因AcNES1(GenBank数据库登录号KX064240)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ IDNO.2所示)，通过限制性内切酶BamHI/EcoRI克隆至pYES2载体(Invitrogen，美国)。来源于玫瑰杆菌(Ruegeria pomeroyi)的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(RpHMGR；UniProtKB数据库登录号Q5LL64)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.3所示)，通过限制性内切酶SalI/XhoI克隆至pESC-His载体(Stratagene，美国)。来源于肠溶沙门氏菌(Salmonella enteric)的乙酰辅酶A合成酶(ACSL641P；UniProtKB数据库登录号A0A0F7JF17)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.4所示)，通过限制性内切酶SalI/XhoI克隆至pESC-His载体。来源于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶(ZmPDC；UniProtKB数据库登录号P06672)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.5所示)，限制性内切酶NotI/SacI克隆至pESC-His载体。来源于细菌性软腐病菌(Dickeya zeae)的乙醛脱氢酶(DzAda；UniProtKB数据库登录号A0A0A8FAE2)，按酿酒酵母密码子偏好性，合成核苷酸序列(SEQ ID NO.6所示)，通过限制性内切酶SalI/XhoI克隆至pESC-His载体。
(2)培养基组成
葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指组氨酸、，在培养基中的终浓度为20mg/L。蔗糖合成最小培养基为上述葡萄糖合成最小培养基中2％蔗糖替换为2％葡萄糖。固体平板在上述组分基础上再加入2％琼脂。
YPD培养基质量终浓度组成：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，溶剂为去离子水，pH值自然。
(3)引物、启动子
本实施例所用到的PCR引物序列和模板列于表2，所用到的内源性启动子片段、内源酶编码基因及其终止子片段和同源臂片段，均从酵母CEN.PK2-1D(EUROSCARF公司，德国)的基因组DNA中扩增，同时菌株构建过程中所有内源启动子和基因序列均可在酿酒酵母基因组数据库(www.yeastgenome.org)查询得到。其中所用到的Gal1/10启动子序列为Gal1/Gal10基因上游668bp，Gal2启动子为Gal2基因上游704bp，FBA1启动子为FBA1基因上游507bp，HXT1启动子为HXT1基因上游1123bp，HXT7启动子为HXT7基因上游640bp。
由于Gal80p抑制Gal启动子转录激活因子Gal4p的活性，因此敲除GAL80基因的菌株，Gal启动子在培养基中糖耗尽后开始转录，无需半乳糖诱导，该***称为酵母Gal启动子的二次生长诱导***，该***成功地将细胞生长和产物积累阶段分离，减轻了产物对菌体的毒性。
(4)菌株构建
菌株YS003的构建：将载体pUG6(new efficient gene disruption cassette forrepeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res(1996)24:2519-2524)的KanMX表达盒替换为来自载体YEplac181(Escherichia coli shuttle vectors constructed within vitro mutagenized yeast genes lacking restriction sites.Gene(1988)74:527–534)的ura3表达盒，得到载体pUU-1，该载体带有两侧为loxP位点的ura3基因表达盒(loxP-ura3-loxP基因核苷酸序列为SEQ ID NO.7)，用于5-氟乳清酸筛选和筛选标记的回收使用。以载体pUU-1为模板，使用表2中所列引物(gal80△-F和gal80△-R)，PCR扩增得到带有GAL80基因同源臂的LoxP-ura3-LoxP片段，将该片段通过乙酸锂化学转化法转入酵母CEN.PK2-1D，筛选阳性转化子。阳性转化子在YPD培养基中30℃培养1-2天，吸取100μL培养物离心后用无菌水清洗，涂布在含有1mg/mL的5-氟乳清酸的葡萄糖合成最小培养基平板上，生长出的菌落即为去除筛选标记ura3的菌株YS003。
菌株YS005的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点上游同源臂(SEQ ID NO.8，片段1)、法尼烯焦磷酸合成酶基因(ERG20)及其375bp终止子(片段2)、Gal1/10启动子(片段3)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因及其275bp终止子(片段4)、整合位点下游同源臂(SEQ ID NO.9，片段5)。按照文献(Modular pathway engineering ofditerpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradieneproduction,J.Am.Chem.Soc.(2012)134:3234-3241)的方法，使用重叠延伸PCR将这些DNA片段拼接为有重叠区的长片段。例如需要将上述5个片段整合到基因组上，可以使用重叠延伸PCR方法将片段1、片段2、片段3拼接成第一个大片段。将片段3、片段4、片段5拼接成第二个大片段。其中片段1和2为基因组同源臂，片段3为重叠区。按照文献(DNA assembler,anin vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways,Nucleic.Acid.s Res.(2009)37:16)中的DNA装配方法，将上述带有同源臂和重叠区的DNA长片段，通过乙酸锂化学转化法，整合至酵母基因组上。以YS003为宿主，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS005。
菌株YS010的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点rox1上游同源臂(SEQ ID NO.10，片段1)、磷酸甲羟酸激酶编码基因(ERG8)及其224bp终止子(片段2)、Gal1/10启动子(片段3)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶编码基因(MVD1)及其335bp终止子(片段4)、Gal2启动子(片段5)、异戊烯焦磷酸异构酶编码基因(IDI1)及其182bp终止子(片段6)、LoxP-ura3-LoxP片段(SEQ ID NO.7，片段7)、整合位点rox1下游同源臂(SEQ ID NO.11，片段8)。以YS005为宿主菌，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS010。
菌株YS014的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点ypl062w上游同源臂(SEQ ID NO.12，片段1)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶编码基因(ERG13)及其312bp终止子(片段2)、Gal1/10启动子-RpHMGR-终止子表达盒(SEQ ID NO.13)(片段3)、LoxP-ura3-LoxP片段(SEQ ID NO.7)(片段4)、Gal2启动子(片段5)、甲羟戊酸激酶编码基因(ERG12)及其136bp终止子(片段6)、整合位点的下游同源臂(SEQ ID NO.14，片段7)。以菌株YS010为宿主菌，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS014。
菌株YS017的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点上游同源臂(SEQ ID NO.15，片段1)、PGAL10-ERG13_PGAL1表达盒(片段2)、ERG12及其136bp终止子(片段3)、PGAL2-IDI1-Ura3表达盒(片段4)、HXT1启动子(片段5)、整合位点下游同源臂(SEQ IDNO.16，片段6)。以菌株YS014为宿主菌，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS017。
菌株YS030的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点bts1基因(编码香叶酰香叶酰二磷酸合酶)上游同源臂(SEQ ID NO.17，片段1)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因(ERG10)及其211bp终止子(片段2)、GAL1/10启动子-RpHMGR表达盒(片段3，SEQ ID NO.13)、loxP-ura3-loxP片段(片段4，SEQ ID NO.7)、GAL2启动子(片段5)、tHMGR及其275bp终止子(片段6)、整合位点bts1基因下游同源臂(SEQ ID NO.18，片段7)。以菌株YS017为宿主菌，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS030。
菌株YS036的构建：使用表2中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点ADH1(酵母乙醇脱氢酶1)上游同源臂(SEQ ID NO.19，片段1)、FBA1启动子(片段2)、ACSL641P及终止子(SEQ ID NO.20，片段3)、loxP-ura3-loxP片段(片段4，SEQ ID NO.7)、Gal10启动子-zmPDC(SEQ ID NO.21)表达盒(片段5)、Gal10/1启动子-DzAda(SEQ ID NO.22)表达盒(片段6)、HXT7启动子(片段7)、ADH2(酵母醇脱氢酶)基因及其441bp终止子(片段8)、下游同源臂(SEQID NO.23，片段9)。以菌株YS030为宿主菌，DNA拼接方法、转化方法和去除筛选标记ura3方法如前所述，得到菌株YS036。
上述菌株YS003、YS005、YS010、YS014、YS017、YS030、YS036，分别转入带有橙花叔醇合成酶基因AcNES1(SEQ ID NO.2)的pYES2质粒，构建橙花叔醇合成菌株YS004、YS006、YS011、YS015、YS018、YS031、YS037。
2、菌株橙花叔醇产量测定
将步骤1构建的菌株(表1)分别接种在蔗糖合成最小培养基中，培养温度30℃，摇瓶转速200rpm，培养过夜，培养物接种至18mL蔗糖合成最小培养基，使初始OD600达到0.2。然后加入2mL十二烷，用于橙花叔醇的边合成边萃取。培养温度30℃，摇瓶转速200rpm，培养96h后(OD600达到9左右)，培养物离心，取上层十二烷待测。橙花叔醇气相色谱测定条件：使用安捷伦7890AGC***测定，进样口温度280℃，进样量1μl，分流比1:10，色谱柱：HP-5GC(30m×0.25μm×0.25μm)；色谱条件：氦气流量1mL/min，60℃，5min，10℃/min升温到280℃。
Gal80p抑制Gal启动子转录激活因子Gal4p的活性，因此在GAL80缺失菌株中糖耗尽后，人为构建的Gal启动子驱动的甲羟戊酸途径被激活。随着甲羟戊酸途径代谢酶的基因表达盒不断被整合到宿主基因组上，菌株的橙花叔醇产量逐步提高。菌株YS004产生14.8mg/L的橙花叔醇，YS006产生43.3mg/L橙花叔醇。菌株YS011橙花叔醇的产量增加到56.8mg/L。在菌株YS015中，橙花叔醇产量进一步增加至83.1mg/L。YS018中，橙花叔醇产量增加到187.2mg/L。菌株YS031中，橙花叔醇产量进一步增加了48.3％，达到259.6mg/L。当蔗糖作为碳源时，蔗糖及其水解产物(葡萄糖和果糖)转化为乙醇，然后该菌株在指数生长期后期再以乙醇作为碳源，进行二次生长。为了进一步提高橙花叔醇的产量，对菌株乙醇代谢途径进行了修饰，以提高乙酰辅酶A的供应。菌株YS037产生334.8mg/L的橙花叔醇(图1)。
表1实施例1中所涉及的菌株
表2.实施例1用到的引物
注：引物序列中的下划线序列为与相邻片段的重叠序列，以便进行重叠延伸PCR。引物名称带有“up”为整合位点上游同源臂，“down”为下游同源臂。
实施例2构建的菌株中Hac1转录水平的测定
按照TransZol Up试剂盒使用说明(全式金，中国)提取菌株YS004、YS006、YS011、YS015、YS018、YS031和YS037培养72h后的RNA，RNA通过NanoDrop 2000c(赛默飞，美国)定量，然后以500ng总RNA作为模板，使用qPCR RT试剂盒(东洋纺，日本)反转录合成cDNA。使用SYBR GreenReal time PCR Master Mix(东洋纺，日本)，用Lightcycler 480II Real-TimePCR***(罗氏，瑞士)进行定量PCR测定。基因特异性引物列于表3中。将PCR程序设定为95℃，30s，然后95℃，5s，57℃，5s和72℃，15s，共40个循环。使用2-ΔΔCT方法，计算Hac1，Gal1，Gal4和AcNES1 mRNA相对于内参ACT1的表达水平，结果见图2所示。
在未折叠蛋白反应中，剪接后的Hac1 mRNA编码活性形式的转录因子，该转录因子与未折叠蛋白反应中的靶基因启动子上的顺式元件结合。Hac1 mRNA的剪接是酵母未折叠蛋白反应激活过程中必不可少的步骤，因此，荧光定量PCR可以将剪接的Hac1 mRNA水平作为未折叠蛋白反应激活的指标。本实施例中设计的用于Hac1荧光定量PCR的反向引物(表3)，该引物跨越了Hac1 mRNA中5'和3'外显子内含子剪接位点。因此，只有被剪接的Hac1mRNA才能测定出来。
所有用于荧光定量PCR实验的cDNA均转录自500ng总RNA。我们发现在菌株YS004、YS006和YS011中剪接了的Hac1转录水平保持稳定(图2中a)。在菌株YS018、YS031和YS037基因组中整合更多Gal启动子驱动的基因表达盒后，Hac1转录水平逐渐升高。与YS004相比，YS018、YS031和YS037中Hac1转录本分别增加到2.9、4.6和6.3倍，说明未折叠蛋白反应被激活。未折叠蛋白反应激活可能是由于Gal80、rox1、ypl062w基因位点的缺失和ERG9启动子的替换引起。但考虑到上述菌株中Hac1转录水平是逐渐升高的，因此导致未折叠蛋白反应活化的最可能的原因与酵母基因组中基因表达盒的大量整合有关。
表3实施例2中所使用的荧光定量引物列表
我们还测定了表达橙花叔醇的工程菌株中Gal1和AcNES1的转录水平，分别反映了Gal1启动子在基因组和pYES2质粒中的转录活性(图2中b和图2中c)。我们发现Gal1和AcNES1的转录水平有相似的变化趋势，YS017、YS031和YS037的基因组整合了更多由Gal启动子驱动的基因表达片段。这三株菌株Gal1和AcNES1的转录水平均明显低于菌株YS004、YS006和YS011，说明菌株构建操作抑制了Gal1启动子的转录活性。其中一个原因是转录激活因子Gal4p在细胞内的数量不够。因此，有研究增加GAL4p的表达水平或活性可以成功地提高酵母二次生长诱导体系中所需的产物浓度。从另一个角度，我们假设未折叠蛋白反应的调控会在二次生长诱导***中以某种间接的方式影响Gal启动子的转录和所需的产物合成。接下来，我们观察了Hac1过表达对酵母橙花叔醇合成的影响。
实施例3过表达Hac1对橙花叔醇合成的影响
本实施例所用到的引物和模板在表4列出，所构建的菌株在表5列出。
菌株YS038的构建：我们构建了在pRS316质粒(A system of shuttle vectorsand yeast host strains designedfor efficient manipulation of DNA inSaccharomyces cerevisiae.Genetics(1989)122,19–27)上组成型过表达Hac1的橙花叔醇合成菌株YS038。使用表4中引物Hac1-F1/Hac1-R1和Hac1-F2/Hac1-R2从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组中克隆出Hac1的两个DNA片段，第一个片段(片段1)为SEQ ID NO.1的1～660个碱基，第二个片段(片段2)为SEQ ID NO.1的661～991个碱基(最后274bp为HAC1基因的终止子序列)。通过重叠延伸PCR融合上述Hac1的两个DNA片段，得到剪接后的HAC1片段，即序列SEQID NO.1；使用表4中所列引物和模板，PCR扩增得到pRS316载体骨架(片段3)、TDH3启动子(片段4)、筛选标记Leu2表达盒(片段5)。将上述PCR扩增得到各个DNA片段与带有橙花叔醇合成酶基因AcNES1(SEQ ID NO.2)的pYES2质粒同时转入YS036菌株中，得到菌株YS038。
菌株YS041的构建：首先将Hac1表达盒与TDH3启动子整合到基因组位点YPRCtau3，构建菌株YS040。使用表4中所列引物和模板，PCR扩增得到整合位点YPRCtau3上游同源臂(SEQ ID NO.24，片段1)、Hac1-Leu2片段(片段2)、YPRCtau3位点下游同源臂(SEQ IDNO.25，片段3)。DNA拼接方法和转化方法如实施例1所述，转入YS036菌株，得到菌株YS040。菌株YS040转入带有橙花叔醇合成酶基因AcNES1(SEQ ID NO.2)的pYES2质粒，构建橙花叔醇合成菌株YS041。
菌株YS042的构建：在pRS316质粒上过表达了Gal1启动子驱动的Hac1，构建了菌株YS042。使用表4中所列引物和模板，PCR扩增得到带有Hac1和Leu2的pRS316载体骨架和Gal1启动子。将带有Hac1和Leu2的pRS316载体骨架(片段1)、Gal1启动子片段(片段2)、带有橙花叔醇合成酶基因AcNES1(SEQ ID NO.2)的pYES2质粒，同时转入YS036菌株中，构建出菌株YS042。
采用实施例1中的菌株培养方法和橙花叔醇测定方法评估上述菌株的橙花叔醇合成能力。
如图3所示，与菌株YS037相比，pRS316质粒上组成型表达Hac1的菌株YS038的橙花叔醇产量提高了48.4％，达到497mg/L。然而，在菌株YS042中的Gal1启动子驱动的Hac1表达对产生橙花叔醇没有提高，带有TDH3启动子的Hac1整合表达使菌株YS041中的橙花叔醇提高22.5％，达到410.1mg/L。细胞中ARS1/CEN4质粒的拷贝数不止一个。因此，在基因组中过表达HAC1可以进一步提高橙花叔醇产量。
在蔗糖合成最小培养基中摇瓶培养菌株YS037和YS038，测定产物橙花叔醇的生成曲线(图4中a)。菌株培养和产物测定方法与实施例1中一致。发酵48小时后，YS038产生的橙花叔醇比YS037提高40.7％(340mg/L vs.241.7mg/L)。发酵96h时，YS038的橙花叔醇产量达到最高水平，为497mg/L，是YS037的1.5倍。同时还观察了YS037和YS038的生长曲线，YS038在24小时比YS037的比生长速率略大(比生长速率为0.064/h vs.0.048/h)。两种菌株在96小时发酵后达到相似的生物量。因为橙花叔醇合成与细胞生长不同步，因此我们成功构建了二次生长诱导***。综上所述，酵母Hac1的过表达增加了橙花叔醇的产量和比生长速率。
表4实施例3中所使用的引物列表
注：引物序列中的下划线序列为与相邻片段的重叠序列，以便进行重叠延伸PCR。引物名称带有“up”为整合位点上游同源臂，“down”为下游同源臂。
表5实施例3中所构建的菌株
实施例4Hac1过表达对AcNES、GAL1和Gal4转录水平的影响
按照实施例2中的方法，我们测定了Hac1过表达菌株YS038中的AcNES、GAL1和Gal4的转录水平，并与YS037做了对比(图5)。明显观察到，Hac1过表达增加了这三个基因的转录水平，其中AcNES转录水平增加了8.2倍，Gal1增加了11.6倍，Gal4增加了3.1倍。Gal1和AcNES1的转录水平反映了基因组和pYES2质粒中Gal1启动子的活性。Gal启动子起作用需要激活Gal4。因此，虽然Hac1过表达对二次生长诱导***的调控还不完全清楚，但是本实验表明Hac1过表达可以通过增加Gal4转录水平，从而提高Gal1启动子的转录活性。
实施例5过表达Hac1对工程酵母细胞活力的影响
在一些报道中，工程酵母的萜类化合物合成与细胞活力有关。HAC1在正常生长条件下不是必需的，但在触发未折叠蛋白反应的条件下是必需的。因此，我们观察了Hac1过表达是否可以增加细胞活力。按照实施例1中的方法培养菌株YS037和YS038。
向100mL的质量浓度0.01％氢氧化钠水溶液中加入30mL的95％乙醇和0.3g亚甲基蓝染料(索莱宝，中国)，得到亚甲基蓝染液。将收取的菌液稀释到OD600为1，使用无菌水洗涤后再次悬浮，吸取10μL滴在载玻片上，然后吸取10μL配置好的亚甲基蓝染液覆盖菌液，室温染色5min后光学显微镜观察。活的细胞可以将亚甲基蓝氧化为无色，死的或者活力较差的细胞会被染成蓝色或淡蓝色。细胞活力＝活细胞数/细胞总数。
在生长24小时之前，YS037和YS038的细胞活力没有显着差异。在生长48小时碳源耗尽后，与YS037(43.5％细胞活力)相比，YS038在培养基中显示出更高的细胞活力(63％)(图6)。在发酵72小时和96小时，YS038的细胞活力也高于YS037。类似地，自发酵48小时以后，YS038的橙花叔醇含量也高于YS037(图4中a)。因此，Hac1过表达增加了YS038的细胞活力。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 991
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggaaatga ctgattttga actaactagt aattcgcaat cgaacttggc tatccctacc 60
aacttcaagt cgactctgcc tccaaggaaa agagccaaga caaaagagga aaaggaacag 120
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tttttggctg caaggagcaa gactggctgg g 991
<210> 2
<211> 1722
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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<211> 1959
<212> DNA
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agtttggtaa tattcaattc gaagtgttca gtcttttact tctcttgttt tatagaagaa 300
aaaacatcaa gaaacatctt taacatacac aaacacatac tatcagaata caatgactaa 360
gctacacttt gacactgctg aaccagtcaa gatcacactt ccaaatggtt tgacatacga 420
gcaaccaacc ggtctattca ttaacaacaa gtttatgaaa gctcaagacg gtaagaccta 480
tcccgtcgaa gatccttcca ctgaaaacac cgtttgtgag gtctcttctg ccaccactga 540
agatgttgaa tatgctatcg aatgtgccga ccgtgctttc cacgacactg aatgggctac 600
ccaagaccca agagaaagag gccgtctact aagtaagttg gctgacga 648
<210> 15
<211> 618
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
gcaaaatagt aggtaggaac aagtcgactc taggcagata aggaagatgt ccggtaaatg 60
gagactagtg ctgaccggga taggcaatcc agagcctcag tacgctggta cccgtcacaa 120
tgtagggcta tatatgctgg agctgctacg aaagcggctt ggtctgcagg ggagaactta 180
ttcccctgtg cctaatacgg gcggcaaagt gcattatata gaagacgaac attgtacgat 240
actaagatcg gatggccagt acatgaatct aagtggagaa caggtgtgca aggtctgggc 300
ccggtacgcc aagtaccaag cccgacacgt agttattcat gacgagttaa gtgtggcgtg 360
tggaaaagtg cagctcagag cccccagcac cagtattaga ggtcataatg ggctgcgaag 420
cctgctaaaa tgcagtggag gccgtgtacc ctttgccaaa ttggctattg gaatcggcag 480
agaacctggg tcccgttcta gagaccctgc gagcgtgtcc cggtgggttc tgggagctct 540
aactccgcag gaactacaaa ccttgcttac acagagtgaa cctgctgcct ggcgtgctct 600
gactcagtac atttcata 618
<210> 16
<211> 803
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60
aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120
cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240
atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300
gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420
caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540
tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720
gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780
ctggggttgg actgtataaa cca 803
<210> 17
<211> 661
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
aggaaacctc catttagcca ccccagtcac agcggcactg cctaccacaa tgacatcatc 60
catgagatag cgaatttgca ttctattaac ctggtagatt tgattaattt ggaagtatat 120
aataacaatt gccatacaaa caacacagcg ttgcaaacta cggcgaattc gctgacactt 180
aatagcatta tcaaaaagct tgacaagcca atactgaaag aaagaaataa ttctctggta 240
tggccccata aaagcagatt taaagcaaaa aggaaccaac cttcgcctgg ccaatcttta 300
attaacaata cagatataac tctctacaac gatgtatagc cgccatctct actcactcca 360
taatattaca tatagatata ggacaagccc gcattttcat actgaaaggt aaacttctat 420
tattatagtg gtatccaacg ttcaccgctt ccagcatagc agaaattacg tgtttttgca 480
tatgttatgc tgatcattgt atgcttacta ccatttttct ttgcttcgcc ttgccttctt 540
tgacgttttt ttgaagcaaa aaaaaagtca agacagatgt gcttacaaaa ccatgtaagg 600
ctcattttca aagaagctac taatagaaag agaacaaagc gtttacgagt ctggaaaatc 660
a 661
<210> 18
<211> 647
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
tacctgattt ggcttcgcat tccgacaccg ccaccaattt acatgacgaa ttgttatata 60
taatagacca cttatccgaa ttgtgaaata aattgatcaa tcaaattagt ggaggaagat 120
agtcagaaat aaagccttct ctcctcctct ttcgcatcta tacatacgat ttcatatata 180
cgtttcattg catcatcttt tgatatatct caaaaagatc tcttagttcg caaatagtca 240
aatcttcaaa tttatagcct ttatattttt tccacgattt ctgaaactcc tttttatcag 300
caccgttaat gctagcggtt actgtcaaat cgccggtaaa ttcgcgattt ccgtgctcta 360
aagatgctga agatcgtgaa gatgatgaag ttgatcgtga gccatcccta gacatctctg 420
ttgtatctct attgctcaat tccatggata attgagacga acttcgtggt atgtttaagt 480
tgttgctact gtgaaggtta ttattgctag tattgttagg atgtggtgga gtatatgacc 540
taatttttcc gatgatattt tttaatgatg aatcaaaaac ggtcctgaag ccatcatacg 600
aattcgatct tgtaacatct ggcctttgga tagtaggagt cacgatg 647
<210> 19
<211> 671
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
tggcaaccaa acccatacat cgggattcct ataatacctt cgttggtctc cctaacatgt 60
aggtggcgga ggggagatat acaatagaac agataccaga caagacataa tgggctaaac 120
aagactacac caattacact gcctcattga tggtggtaca taacgaacta atactgtagc 180
cctagacttg atagccatca tcatatcgaa gtttcactac cctttttcca tttgccatct 240
attgaagtaa taataggcgc atgcaacttc ttttcttttt ttttcttttc tctctccccc 300
gttgttgtct caccatatcc gcaatgacaa aaaaatgatg gaagacacta aaggaaaaaa 360
ttaacgacaa agacagcacc aacagatgtc gttgttccag agctgatgag gggtatctcg 420
aagcacacga aactttttcc ttccttcatt cacgcacact actctctaat gagcaacggt 480
atacggcctt ccttccagtt acttgaattt gaaataaaaa aaagtttgct gtcttgctat 540
caagtataaa tagacctgca attattaatc ttttgtttcc tcgtcattgt tctcgttccc 600
tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata tttcaagcta taccaagcat acaatcaact 660
atctcatata c 671
<210> 20
<211> 1991
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
atgtctcaga cgcataaaca tgcaattcct gcaaacatcg ctgacaggtg ccttatcaac 60
cctgaacaat atgagaccaa gtacaaacaa tccataaatg atcctgatac gttttggggg 120
gagcaaggaa aaattctaga ttggataacc ccgtatcaaa aggtgaaaaa cacctcattt 180
gcccctggaa atgtgagcat aaagtggtac gaagacggca cgttgaatct ggctgccaat 240
tgtcttgaca ggcatttaca ggagaatggt gataggacgg ccattatttg ggaaggtgat 300
gacacatctc agtctaagca tataagttac agggagcttc atcgtgacgt atgccgtttc 360
gcgaacaccc ttcttgattt gggtataaag aaaggagatg ttgtcgcgat ctatatgcct 420
atggtcccgg aagccgctgt agccatgcta gcctgcgcca ggataggggc ggtccattct 480
gtgatttttg ggggctttag tcccgaggcg gttgcaggca ggatcataga ctcttcatcc 540
aggttagtca ttactgcaga cgagggcgtc cgtgcaggga gatcaatacc attgaagaaa 600
aatgttgacg acgcattaaa aaatccgaat gtgacgtctg tagagcacgt gattgtatta 660
aaaagaactg gaagcgacat agactggcaa gaagggagag acttgtggtg gcgtgacctg 720
attgagaagg catccccaga acatcaaccg gaggctatga acgctgaaga tcctcttttt 780
atcctatata ccagtgggag tacaggcaaa ccgaaaggag tgttgcacac caccgggggg 840
tatttagtct atgcagcaac caccttcaaa tatgtttttg attatcaccc cggtgacata 900
tattggtgca ctgcggacgt aggatgggta accggacata gctatctatt atacggacct 960
ctagcttgcg gagcgaccac tttgatgttc gagggagtgc ctaactggcc tacacctgcg 1020
aggatgtgtc aagtcgtgga caaacatcaa gtcaacatct tatatacagc tccaactgca 1080
ataagggccc tgatggctga gggggataaa gctattgagg gcacggatcg tagttctttg 1140
cgtatccttg gatctgttgg cgagcctatt aatccagaag cgtgggagtg gtattggaaa 1200
aaaatcggga aggaaaaatg tcctgtcgta gacacctggt ggcaaacgga gacaggcggc 1260
tttatgataa ctccactgcc gggcgcaatc gaactaaaag ccggcagtgc gacgcgtccg 1320
ttctttggtg tacagccggc tttggtcgat aatgaaggcc acccacagga aggggccacc 1380
gaggggaacc tagtaattac tgactcctgg ccggggcaag cgcgtacgct tttcggcgat 1440
cacgagagat ttgagcaaac ctatttctct acatttaaaa atatgtactt cagtggtgat 1500
ggcgcacgtc gtgatgaaga cgggtactat tggatcacag gtcgtgtgga cgacgtactt 1560
aatgtgagcg gacatcgtct agggaccgct gaaatcgagt ctgcgttagt ggcacacccg 1620
aaaatcgccg aggctgccgt ggtcgggata ccgcacgcga taaaaggcca ggcaatatat 1680
gcctacgtta cgcttaacca cggtgaagaa ccatccccgg agttatacgc agaagtccgt 1740
aattgggtta gaaaagagat tggaccattg gcgacaccgg atgttctaca ctggacggat 1800
agtctaccaa aaactaggag cgggaaaata atgagaagaa tattaagaaa gatcgccgct 1860
ggggacacta gcaatctagg cgacacgagt acgctagccg atccaggagt tgtagagaag 1920
cccttggaag agaagcaggc aattgcgatg ccgagttaat atataactgt ctagaaataa 1980
attttttcaa a 1991
<210> 21
<211> 2544
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 21
gagcgacctc atgctatacc tgagaaagca acctgaccta caggaaagag ttactcaaga 60
ataagaattt tcgttttaaa acctaagagt cactttaaaa tttgtataca cttatttttt 120
ttataactta tttaataata aaaatcataa atcataagaa attcgcttat ttagaagtgt 180
caacaacgta tctaccaacg atttgaccct tttccatctt ttcgtaaatt tctggcaagg 240
tagacaagcc gacaaccttg attggagact tgaccaaacc tctggcgaag aattgttaat 300
taagagctct tacagtaact tgtttaccgg cttacgacta tttgccgcgg ccactctctt 360
accccattta accaattcct cggtgcaatc ctccctccct ataaagcact cgataagcgt 420
aggaccatca gtgtttgcca acgccacttt tattgcttcc gccaattctc caccggtctt 480
agcttttagc cccttacctg cccctgaatc ataacctccg ttcccattaa atacttccat 540
aagcccggca tagtcccagt ttttaatatt gttgtacgga ccgtcatgaa tcattacctc 600
gatggtgtat ccataattgt tgatcaaaaa tataatcaca ggtagcttta gacgaaccat 660
ctgagctacc tcctgggcgg ttaactggaa tgacccgtca ccaaccatta gaatatttct 720
tctctcaggc gcaccgactg cataaccaaa tgctgcaggg acactccacc caatgtgtcc 780
ccattgcatt tcatactcga ccctcgcccc gttcggcaac ttcatccttt gtgcgttaaa 840
ccaagaatca cctgtttccg caatgaccgt cgtgttcgga gtaagcaaag cttcaacttg 900
acgtgctatc tcagcgttta ctaaaggtgc gctcgggtct gcgggtgcag ccttcttcaa 960
ttcacccgca tttaatgact tgaagaaatc cagcgcaccg gtcttctttg ataccttctg 1020
tgccagtctt gttaaatagt ctttaaggtg tacagatgga aaacgtatcc cgttaaccac 1080
tacagatctc ggctcagcca agaccagttt tttggggtcc ggtatgtctg tccatcctgt 1140
agtagagtaa tcattaaaaa caggagctag cgctataact gcgtcagcct ccttcatggt 1200
cttctctacg cccgggtagg agacctcccc ccagcttgtt cctatataat gcgggttctc 1260
ctccggaaaa aagctctttg cagcagccat ggttgctacg gccccgccta gcgcgtcggc 1320
aaatttgact gccgcctctt cggcgcccgc tgctctcaac tttgagccta ccaagacggc 1380
gaccttatct ctattcgcta tgaacttcaa tgtttcctct acggcagcat tcagggaagc 1440
ttcgtcgctt gcttcgtcat taaacaaggc actcgcaggc ccaggcgcag cgcaaggcat 1500
gctggctata ttacaggcga tttccaaata aactggcttc ttttcacgta gggccgtttt 1560
tatgacatga tctatcttag ccggagcctc ctcgggagta tagatcgcct ctgccgcagc 1620
agttatgttt ttagccattt ctagctggta atggtaatct gtcttgccaa gagcgtgatg 1680
cagaacatgg cccgctgcat gatcattatt gttcggtgca ccgctaatca agattacagg 1740
cagattctca gcataggccc ctcctatcgc atcaaatgcg gatagagccc ctactgagta 1800
tgtaactacg gccgcggcgg ctccctttgc cctcgcataa ccctctgcag aaaaaccaca 1860
gttcagttcg ttgcaacagt acacctgctc catgttctta tttagaagta gattatctag 1920
aagcactaag ttgtaatcgc cagcgaccgc gaagtgatgc ttaagaccga tttgcaccaa 1980
tctttcagct aaataagtac caacagtata tgacatgccc tttagtgagg gttgaattcg 2040
aattttcaaa aattcttact ttttttttgg atggacgcaa agaagtttaa taatcatatt 2100
acatggcatt accaccatat acatatccat atacatatcc atatctaatc ttacttatat 2160
gttgtggaaa tgtaaagagc cccattatct tagcctaaaa aaaccttctc tttggaactt 2220
tcagtaatac gcttaactgc tcattgctat attgaagtac ggattagaag ccgccgagcg 2280
ggtgacagcc ctccgaagga agactctcct ccgtgcgtcc tcgtcttcac cggtcgcgtt 2340
cctgaaacgc agatgtgcct cgcgccgcac tgctccgaac aataaagatt ctacaatact 2400
agcttttatg gttatgaaga ggaaaaattg gcagtaacct ggccccacaa accttcaaat 2460
gaacgaatca aattaacaac cataggatga taatgcgatt agttttttag ccttatttct 2520
ggggtaatta atcagcgaag cgat 2544
<210> 22
<211> 2484
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
gccctttagt gagggttgaa ttcgaatttt caaaaattct tacttttttt ttggatggac 60
gcaaagaagt ttaataatca tattacatgg cattaccacc atatacatat ccatatacat 120
atccatatct aatcttactt atatgttgtg gaaatgtaaa gagccccatt atcttagcct 180
aaaaaaacct tctctttgga actttcagta atacgcttaa ctgctcattg ctatattgaa 240
gtacggatta gaagccgccg agcgggtgac agccctccga aggaagactc tcctccgtgc 300
gtcctcgtct tcaccggtcg cgttcctgaa acgcagatgt gcctcgcgcc gcactgctcc 360
gaacaataaa gattctacaa tactagcttt tatggttatg aagaggaaaa attggcagta 420
acctggcccc acaaaccttc aaatgaacga atcaaattaa caaccatagg atgataatgc 480
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 540
attaacagat atataaatgc aaaaactgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 600
tcggtttgta ttacttctta ttcaaatgta ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 660
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa accccggatc cgtaatacga ctcactatag 720
ggcccgggcg tcgacatgga gcacagcgta atagaaccta cggtccccat gcctatgcct 780
gctatgtttg acgcacctag tggtatcttc gattccctgg atgacgcggt acaggccgca 840
gcatacgcgc aacagcaact taacagtctt gaattgagac aacaggtaat caaagcaatt 900
cgtgtagccg gggaaagata tgcacaagta ctggctgaga tggcggtcgc tgagaccggt 960
atgggtaggg ttgtagataa atatgtaaaa aatgtctccc aagcacgtca tacgccaggc 1020
attgaatgtt tgagcgctga agtacttact ggagacaacg gtctgacctt aatagaaaat 1080
gcgccgtggg gtgtcgtagc cagtgttacg ccttctacga acccagctgc gactgtcatc 1140
aacaacgcga tatccatgat cgcagcaggc aacagtgtag tattcgcacc ccatccgtca 1200
gcaaagaatg taagcttaag aaccattagc ctgttgaaca aggccattgt tgcaaccggt 1260
ggccctgaaa acctactagt atctgttagt gatcccaata ttgaaactgc acaaaggtta 1320
tttagatatc ccggcatagg cttgttggta gtcactggcg gcgaggctgt cgtggaagca 1380
gcgcgtaagc atacagataa gcgtttaata gcggcgggtg cagggaatcc acccgtggtg 1440
gtggatgaaa ccgcagatat cccgaaagca gccagggcga ttgtcaaagg cgcgtctttt 1500
gataacaaca taatatgtgc tgatgagaaa gtgcttattg tcgtagatag cgttgcggat 1560
gccctactag cggagatgca acgtaaccac gcggtcctac taacgccagc ccaaacggaa 1620
caactattac cagcactgct atccgacatt gatgagcagg ggaagggaag agtgaacaga 1680
gattatgtcg ggagggacgc aaccaagcta gccgaagcta tcggtttgga agtcaacgag 1740
tataccaggc ttttattagc agaaacggat gcgagtcatc ccttcgcggt tacagagctt 1800
atgatgccgg ttctaccggt cgtgcgtgta aaaaacgtcg atgatgccat cgccctagct 1860
ttgaagcttg aaaacgggtg taggcatact gcggccatgc actcaactaa cataaggaat 1920
cttaatagga tggctaacgc aataaacact tctatattcg taaagaacgg accctgtata 1980
gcgggtctgg gccttggcgg agagggctgg acgtccatga ctataagtac tcctactggg 2040
gagggcgtga cttctgcacg tacgtttgta cgtttacgtc gttgtgtact tgtggatatg 2100
tttcgtatcg cctaactcga gtaagcttgg taccgcggct agctaagatc cgctctaacc 2160
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 2220
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 2280
tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaagatc 2340
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2400
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2460
gctcactcaa aggcggtaat acgg 2484
<210> 23
<211> 572
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 23
cgttggtaga tacgttgttg acacttctaa ataagcgaat ttcttatgat ttatgatttt 60
tattattaaa taagttataa aaaaaataag tgtatacaaa ttttaaagtg actcttaggt 120
tttaaaacga aaattcttat tcttgagtaa ctctttcctg taggtcaggt tgctttctca 180
ggtatagcat gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgccga gcaaatgcct 240
gcaaatcgct ccccatttca cccaattgta gatatgctaa ctccagcaat gagttgatga 300
atctcggtgt gtattttatg tcctcagagg acaacacctg ttgtaatcgt tcttccacac 360
ggatccacag cctagccttc agttgggctc tatcttcatc gtcattcatt gcatctacta 420
gccccttacc tgagcttcaa gacgttatat cgcttttatg tatcatgatc ttatcttgag 480
atatgaatac ataaatatat ttactcaagt gtatacgtgc atgctttttt tacggcagca 540
tttttttttc aactctgatc gcccctttac tg 572
<210> 24
<211> 592
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 24
cgataagtgc taaaggaggt gcacgcatta tggagaccac tacgatacga tagctgcgtt 60
gttgttgaag gggtttctta aggttgtttt cgttgaaggt aaatattggt cgtttttgtg 120
cagcatattg tcctctagat gcaaactctg caggtccatt tgcagtaaag tgagttgcct 180
ctcgaagaat cattaatttc gtataaccgt cactattaaa gtcagaaaat aaattctgtc 240
gtagacaatg ttaccataat gttcttgtcc attttgcata cactttaaat attcatttga 300
tttctcaggg ttcatgatca taataaattg cgcattcgca aggcggtagt attataatgg 360
ggtccatcat tctgtagcaa gaagttacag tacgctgttc aagcgttaaa caagataagt 420
aatctcgaat gaaacattca tatttcgcat gagccaacat acagttgctg agtaatcttc 480
attgcgctta tttatcggca ttgagattgt aaaggaagta aaacgcattt ttgcagatct 540
gttctcttat gtatttttaa tcgtccttgt atggaagtat caaaggggac gt 592
<210> 25
<211> 736
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 25
tatgccgagt cttgggttgc caaactaaga ggccatggaa tatatttgaa tgtttgtgat 60
ttggcttcat tgtaacatgt aagtgaacat caaaagagta ggcattaaaa gatgggacgt 120
cagcactgta cttgtttttg cgactagatt gtaaatcatt ctttatttaa tctctttctt 180
taactactgc ttaaagtata atttggtccg tagtttaata actatactaa gcgtaacaat 240
gcatactgac attataagcc tgaacattac gagtttaagt tgtatgtagg cgttctgtaa 300
gaggttactg cgtaaattat caacgaatgc attggtgtat ttgcgaaagc tacttctttt 360
aacaagtatt tacataagaa taatggtgat ctgctcaact gatttggtga taactctaac 420
ttttttagca acaatttaaa agataattcg aacatatata acagtaggaa gaatttgtgt 480
acgtcaaatt aagataattt agcattacca aagttattaa cctaaacata aaatatatat 540
gagacacatg tggaaatcgt atgaaacaac tgttatgaaa ctgacaagaa tgaatatata 600
gagtaagctc cgcttgtaaa gaggaatcac ttaagtgtat aaatgtctcg acgattactt 660
tagatccaag attgatgatt gatattactc tgtaatactt aagctctttt aatagctcac 720
tgttgtatta cgggct 736

Claims (10)

1.一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法，其特征在于所述方法为：在敲除Gal80基因的酿酒酵母中，使用Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶和橙花叔醇合成酶的表达形成二次生长诱导***，同时过表达转录因子hac1基因，构建得到合成橙花叔醇的酵母工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母为酵母CEN.PK2-1D。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述Gal启动子包括Gal1、Gal10和Gal2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述甲羟戊酸途径代谢酶包括乙酰辅酶A乙酰转移酶ERG10、法尼烯焦磷酸合成酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸激酶ERG12、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶MVD1、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶ERG13。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述Gal启动子驱动甲羟戊酸途径代谢酶的表达是将甲羟戊酸途径代谢酶基因中的一种或多种采用Gal启动子驱动导入酿酒酵母进行表达。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述橙花叔醇合成酶为来源于猕猴桃(Actinidia chinensis)的橙花叔醇合成酶AcNES1，通过将SEQ ID NO.2所示编码基因AcNES1克隆至pYES2载体GAL1启动子后，导入酿酒酵母进行表达。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转录因子hac1基因核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述hac1基因的过表达按如下方法进行：将Hac1基因与TDH3启动子整合到基因组位点YPRCtau3，或者在pRS316质粒上组成型过表达Hac1，或者在pRS316质粒上过表达Gal1启动子驱动的Hac1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酿酒酵母工程菌培养方法为：将酿酒酵母工程菌接种至葡萄糖合成最小培养基，在30℃、摇瓶转速200rpm下培养过夜，取培养物接种至18mL蔗糖合成最小培养基，使得初始OD600达到0.2，再加入2mL十二烷，在30℃、摇瓶转速200rpm条件下培养96h，培养物离心，得到含有橙花叔醇的十二烷有机相；所述葡萄糖合成最小培养基质量终浓度组成：2％蔗糖，0.17％酵母氮源，0.5％硫酸铵和微量营养素，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；其中微量营养素是指色氨酸、组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，它们在培养基中的终浓度均为20mg/L。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于微量营养素为组氨酸。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608936A (zh) * 2020-11-24 2021-04-06 宜昌东阳光生化制药有限公司 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
CN112877228A (zh) * 2021-01-22 2021-06-01 浙江工业大学 一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用
CN114657078A (zh) * 2022-01-27 2022-06-24 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种高产***二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用
CN115305254A (zh) * 2021-05-08 2022-11-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN115806889A (zh) * 2022-09-28 2023-03-17 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
CN115927134A (zh) * 2022-07-25 2023-04-07 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种可合成倍半萜的工程藻株及其制备方法
WO2023208037A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 武汉合生科技有限公司 一种橙花叔醇合成酶及应用
CN115806889B (zh) * 2022-09-28 2024-06-11 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101605887A (zh) * 2006-05-16 2009-12-16 协和发酵麒麟株式会社 蛋白的高分泌生产方法
CN104039973A (zh) * 2012-01-06 2014-09-10 弗门尼舍有限公司 基因工程酵母细胞
CN105255951A (zh) * 2015-10-28 2016-01-20 江南大学 一种通过过量表达hac1基因提高酒精生产效率的方法
CN108949602A (zh) * 2018-08-21 2018-12-07 吉林农业大学 一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用
CN109810999A (zh) * 2019-03-11 2019-05-28 湖北工业大学 一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101605887A (zh) * 2006-05-16 2009-12-16 协和发酵麒麟株式会社 蛋白的高分泌生产方法
CN104039973A (zh) * 2012-01-06 2014-09-10 弗门尼舍有限公司 基因工程酵母细胞
CN105255951A (zh) * 2015-10-28 2016-01-20 江南大学 一种通过过量表达hac1基因提高酒精生产效率的方法
CN108949602A (zh) * 2018-08-21 2018-12-07 吉林农业大学 一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用
CN109810999A (zh) * 2019-03-11 2019-05-28 湖北工业大学 一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN YAN等: "Primary and Secondary Metabolic Effects of a Key Gene Deletion (△YPL062W) in Metabolically Engineered Terpenoid-Producing Saccharomyces cerevisiae", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
JONIKAS MARTIN C.等: "Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum", 《SCIENCE》 *
PENG BINGYIN等: "Coupling gene regulatory patterns to bioprocess conditions to optimize synthetic metabolic modules for improved sesquiterpene production in yeast", 《BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS》 *
VALKONEN M等: "Effects of Inactivation and Constitutive Expression of the Unfolded-Protein Response Pathway on Protein Production in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
张艳等: "酿酒酵母细胞表达异源萜类化合物的研究进展", 《化工进展》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608936A (zh) * 2020-11-24 2021-04-06 宜昌东阳光生化制药有限公司 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
CN112608936B (zh) * 2020-11-24 2023-06-09 宜昌东阳光生化制药有限公司 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
CN112877228A (zh) * 2021-01-22 2021-06-01 浙江工业大学 一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用
CN112877228B (zh) * 2021-01-22 2022-06-21 浙江工业大学 一种高产红没药烯的酿酒酵母工程菌及应用
CN115305254A (zh) * 2021-05-08 2022-11-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN115305254B (zh) * 2021-05-08 2024-03-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
CN114657078A (zh) * 2022-01-27 2022-06-24 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种高产***二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用
CN114657078B (zh) * 2022-01-27 2024-04-02 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种高产***二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用
WO2023208037A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 武汉合生科技有限公司 一种橙花叔醇合成酶及应用
CN115927134A (zh) * 2022-07-25 2023-04-07 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种可合成倍半萜的工程藻株及其制备方法
CN115806889A (zh) * 2022-09-28 2023-03-17 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
CN115806889B (zh) * 2022-09-28 2024-06-11 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

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