CN115927024A - 酿酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及酿酒酵母及其应用。本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20221398的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其应用。实验表明，本发明提供的酿酒酵母能够促进细胞增殖、修护皮肤屏障，在皮肤抗衰老、增强皮肤抗菌能力以及减少毛发脱落等方面具有优异的效果，适用于制备改善皮肤相关功能的食品、药品、化妆品等。

Description

酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及酿酒酵母及其应用。

背景技术

人体皮肤大约每平方厘米就有100万个微生物，它们与皮肤共同构成了一个微型的生态***。大多数皮肤上的微生物与人体互利共生、相互影响。一方面，我们的皮脂、死亡的角质细胞为微生物提供了充足的养分；另一方面，微生物群维持着皮肤的正常结构，抵御外来病原体的入侵，促进皮肤的免疫反应和伤口的再生修复。

这些微生物，主要存在于皮肤表面，以及皮肤附属器中，比如毛囊、汗腺及皮脂腺等，最有代表性的微生物包括丙酸杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和马拉色菌属。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖。常驻菌可以产生脂类、固醇类等物质，为肌体细胞提供营养，参与皮肤细胞代谢等，代谢的脂质可以在皮肤上形成一层乳化脂质膜，能防止水分过度蒸发，保持皮肤湿润。

皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用，大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。当皮肤因为外部原因的侵害，例如空气污染、化妆品过度使用或使用了含激素的化妆品后，就可能导致皮肤表面菌群失调，从而造成各种肌肤问题。

因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供酿酒酵母及其在促进细胞增殖、改善皮肤屏障、抗衰老、增强皮肤抗菌能力以及减少毛发脱落的产品中的应用。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20221398的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

所述酿酒酵母来源于贵州茅台镇酱香型酒曲，实验表明，所述的酿酒酵母能够促进细胞增殖、修护皮肤屏障，在皮肤抗衰老、增强皮肤抗菌能力以及减少毛发脱落等方面效果优异。

进一步的，本发明还提供了所述的酿酒酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

本发明提供了改善皮肤状况的产品，由包括所述的酿酒酵母的原料制成。

优选的，所述产品包括如下Ⅰ或Ⅱ所示的一种或两种：

Ⅰ、所述的酿酒酵母的灭活菌和/或灭活上清液；

Ⅱ、所述的酿酒酵母的培养物、外泌体、裂解物、提取物、发酵滤液和/或发酵溶胞物。

进一步的，本发明提供了所述的产品在以下ⅰ～ⅴ至少一项中的应用：

ⅰ、促进细胞增殖；

ⅱ、改善皮肤屏障；

ⅲ、抗衰老；

ⅳ、增强皮肤抗菌能力；

ⅴ、减少毛发脱落。

本发明中，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞增殖的作用。

在一些实施例中，发明以HaCaT角质细胞为受试对象，对所述的酿酒酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的酿酒酵母可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为9.33％～16.78％。

在一些实施例中，本发明以HFF细胞为受试对象，对所述的酿酒酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的酿酒酵母可促进HFF细胞增殖，促进增殖率为9.77％～12.65％。

本发明中，所述改善皮肤屏障包括恢复细胞活力和/或上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG的表达。

在一些实施例中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，对所述的酿酒酵母的SDS损伤修复能力进行了研究，结果表明，所述的酿酒酵母可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。

本发明中，所述抗衰老包括如下a)～i)所示的至少一种：

a)、上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL1A1和COL3A1中的至少一种；

b)、下调降解细胞外基质相关基因的表达，所述降解细胞外基质相关基因MMP家族基因中的至少一种；

c)、上调细胞抗氧化相关基因的表达，所述细胞抗氧化相关基因包括NRF2、PTEN、SIRT-1和SIRT-3中的至少一种；

d)、下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族中的任意一个或多个；

e)、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

f)、上调免疫调节因子相关基因MOR的表达；

g)、上调细胞生长因子相关基因FGF21的表达；

h)、上调抑制细胞调往相关基因BCL-2的表达；

i)、降低蛋白羰基含量。

为了探究所述的酿酒酵母的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞凋亡、免疫调节因子、细胞自噬、细胞生长因子及蛋白羰基含量中的至少一个。

在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调细胞外基质合成相关基因COL1A1和TIMP1的表达，促进细胞外基质的合成,下调降解细胞外基质相关基因MMP1的表达，抑制细胞外基质的降解。

在一些实施例中，本发明以HFF细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL3A1的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因MMP3的表达，抑制细胞外基质的降解。

在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HaCaT角质细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调抗氧化相关基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF成纤维细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调抗氧化相关基因PTEN和SIRT-1、SIRT-3的表达，增强细胞的抗氧化能力。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF成纤维细胞凋亡的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可下调细胞凋亡相关基因BAX、Caspase3和Caspase9的表达，抑制细胞凋亡。

在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HaCaT角质细胞细胞自噬的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调细胞自噬相关基因LC3B的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF成纤维细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调免疫调节因子相关基因MOR的表达，增强细胞的免疫调节能力。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF成纤维细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调成纤维细胞生长因子相关基因FGF21的表达，促进细胞生长。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF抑制细胞凋亡的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达，抑制细胞凋亡。

在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HFF成纤维细胞蛋白羰基含量的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可降低蛋白羰基含量，减少蛋白糖化造成的衰老。

本发明中，所述提升抗菌力为上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8、DEFB4和LCN-2中的至少一种。

在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2的表达，增强皮肤抗菌能力。

本发明中，所述减少毛发脱落包括如下①～⑤所示的至少一种：

①、上调毛囊细胞生长因子相关基因FGF-2的表达；

②、上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4和/或HSPG2的表达；

③、上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27的表达；

④、上调毛囊细胞周期调控因子相关基因的表达，所述毛囊细胞周期调控因子相关基因包括c-Myc、Cyclin D1和PP2A中的至少一种；

⑤、下调毛囊休止期相关基因BMP4的表达。

在一些实施例中，本发明以HDPCS为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HDPCs细胞生长因子相关基因的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调毛囊细胞生长因子相关基因FGF-2的表达，促进HDPCs的细胞增殖、调控毛囊周期，诱导毛囊再生。

在一些实施例中，本发明以HDPCs为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HDPCs细胞外基质相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4和HSPG2的表达，促进HDPCs的细胞粘附及生长，促进毛发生长。

在一些实施例中，本发明以HDPCs为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HDPCs细胞凋亡的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27的表达，抑制HDPCs凋亡，预防毛发脱落。

在一些实施例中，本发明以HDPCs为受试对象，研究所述的酿酒酵母对HDPCs细胞毛囊细胞周期调控因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可上调毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A的表达，促进HDPCs细胞周期G1/S的转换，促进毛发生长。

在一些实施例中，本发明以HDPCS为受试对象，研究所述的酿酒酵母对毛囊休止期相关基因的影响。结果表明，所述的酿酒酵母可下调HDPCs毛囊休止期相关基因BMP4的表达，促进HDPCs由毛囊休止期进入毛囊生长期，促进毛发生长。

更进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种，本发明对此不做限定。

本发明还提供了改善皮肤状况的方法，包括：使用本发明所述的产品。所述的产品的使用方法包括内服或外用，所述外用包括涂抹、外敷、熏蒸或注射，本发明对此不做限定。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20221398的酿酒酵母。本发明提供的酿酒酵母能够促进细胞增殖、修护皮肤屏障，在皮肤抗衰老、增强皮肤抗菌能力以及减少毛发脱落等方面具有优异的效果，适用于制备改善皮肤相关功能的食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

酿酒酵母LABOFMIC-315(Saccharomyces cerevisiae LABOFMIC-315)，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M 20221398。

具体实施方式

本发明提供了酿酒酵母及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的酿酒酵母菌株LABOFMIC-315，来源于贵州茅台镇酱香型酒曲，经真菌ITS基因序列分析鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该菌株在显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面光滑、中央呈球形凸起的不透明、白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LABOFMIC-315，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221398。

进一步，本发明提供的酿酒酵母LABOFMIC-315在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为溶胞物和/或提取物的形式，或为酵母产物的形式或为发酵滤液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵滤液、发酵溶胞物。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：LABOFMIC-315的分离

于贵州茅台镇酱香型酒曲中采样，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂固体平板，28℃恒温培养12-16h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-315。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-315在显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形，出芽生殖；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面光滑、中央呈球形凸起的不透明、白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃，培养温度42℃仍可正常生长。

实施例2：LABOFMIC-315的核酸鉴定

1、真菌ITS基因序列分析：

挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物ITS1,ITS4，进行PCR扩增体系为15μL体系，95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延伸7min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-315菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

实施例3：LABOFMIC-315促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液和发酵溶胞物制备：

发酵滤液的制备：

挑取酿酒酵母LABOFMIC-315单菌落于麦芽汁液体培养基，42℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵滤液。其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃，30min高压灭活，即得发酵溶胞物。

2、促进HaCaT细胞修复实验

接种HaCaT细胞(5×10⁴cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加5％发酵滤液，10％发酵溶胞物(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

LABOFMIC-315促进HaCaT细胞增殖的细胞增殖率计算公式及结果如下表所示：

上表结果可知，LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物均可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为9.33％～16.78％。

实施例4：LABOFMIC-315促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液和发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入发酵滤液5％(V/V)，发酵溶胞物10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

发酵滤液上调屏障修护基因FLG。结果见下表：

发酵溶胞物上调屏障修护基因FLG。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315发酵滤液和发酵溶胞物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG表达的作用，基因表达量上调1.36～1.77倍。表明LABOFMIC-315具有改善皮肤屏障的作用。

实施例5：LABOFMIC-315调节光老化HaCaT细胞外基质/抗氧化/细胞自噬相关基因表达实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-315添加

将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/细胞自噬相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1和TIMP1，抗氧化相关基因NRF2，细胞自噬相关基因LC3B的表达，以及降解细胞外基质相关基因MMP1。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵滤液上调细胞外基质相关基因COL1A1和细胞自噬相关基因LC3B以及降解细胞外基质相关基因MMP1，结果见下表：

发酵溶胞物上调细胞外基质基因COL1A1和TIMP1，抗氧化相关基因NRF2，结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原α1链基因COL1A1和组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1，抗氧化相关核因子E2相关因子2基因NRF2和细胞自噬相关微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B基因表达的作用，基因相对表达倍数1.21～2.00；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1，基因相对表达倍数0.55～0.70。

实施例6：LABOFMIC-315促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、LABOFMIC-315发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及LABOFMIC-315添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×10⁴细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H₂O₂，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，各孔添加发酵溶胞物10％(V/V)，对照组以等体积PBS替代发酵溶胞物。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

LABOFMIC-315促进HFF细胞增殖计算公式及结果，如下表所示：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率9.77％～12.65％。

实施例7：LABOFMIC-315调节氧化损伤HFF细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/细胞生长因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、LABOFMIC-315添加

将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/细胞生长因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX和COL3A1，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，抗氧化相关基因PTEN、SIRT-1和SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，细胞生长因子相关基因FGF21的表达；以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵滤液上调细胞外基质相关基因LN，抑制细胞凋亡基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF-21；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族，结果见下表：

发酵溶胞物上调抑制细胞外基质相关基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX和COL3A1，抗氧化相关基因PTEN、SIRT-1和SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF-21；下调细胞凋亡相关基因BAX。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315具有上调HFF细胞外基质相关的丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，层粘连蛋白LN、莫霍克蛋白基因MKX、信号转导蛋白SMAD3基因SMAD3和III型胶原α1链基因COL3A1，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，抗氧化相关的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因PTEN、Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1、SIRT-3，抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2以及细胞生长因子相关成纤维细胞生长因子基因FGF21表达的作用，基因相对表达倍数1.21～4.20倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的BCL2-AssociatedX蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.30～0.86。

实施例8:LABOFMIC-315降低HFF中蛋白羰基含量实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及紫外线损伤

将HFF细胞消化后以2ml/孔(内含8×10⁵细胞)接种至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-315添加

将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

4、降低HFF中蛋白羰基含量实验

弃去HFF细胞培养基，用PBS清洗后加入RIPA，充***解后，12000转离心5min取发酵滤液。按照南京建成蛋白定量(TP)测定试剂盒说明书，对样品发酵滤液进行检测，计算蛋白质浓度。按照南京建成蛋白质羰基含量测试盒说明书进行检测，计算蛋白羰基含量。

LABOFMIC-315降低HFF细胞蛋白羰基含量，结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物具有降低蛋白羰基含量的作用,下降率7.65％～29.36％。

实施例9：LABOFMIC-315上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、LABOFMIC-315添加及LPS刺激

将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞物10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞物)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵滤液上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、LCN-2，LABOFMIC-315发酵滤液上调抗菌肽相关基因的表达，结果见下表：

发酵溶胞物上调抗菌肽相关基因S100A8、DEFB4，LABOFMIC-315发酵溶胞物上调抗菌肽相关基因的表达，结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315发酵滤液及发酵溶胞物具有上调抗菌肽相关银屑病素基因S100A7、钙粒蛋白基因S100A8、β防御素4基因DEFB4、脂质运载蛋白-2基因LCN-2表达的作用。基因相对表达倍数1.25～6.06。

实施例10：LABOFMIC-315调节氧化损伤HDPCs人毛囊***细胞生长因子/毛囊细胞外基质/抑制毛囊细胞凋亡/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因表达实验

1、LABOFMIC-315发酵溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HDPCs人毛囊***细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将成纤维细胞培养基培养的HDPCs消化后以2mL/孔(内含3×10⁵细胞)接种至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h后，PBS清洗两次并更换细胞培养基。

3、LABOFMIC-315添加

将发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HDPCs(对照组以等体积PBS替代发酵溶胞物)，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

4、qPCR法检测毛囊生长期/毛囊细胞生长因子/毛囊细胞外基质/抑制毛囊细胞凋亡/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测毛囊细胞生长因子相关基因FGF-2，毛囊细胞外基质相关基因CSPG4和HSPG2，抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27，毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、CyclinD1、PP2A；以及毛囊休止期相关基因BMP4的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵溶胞物上调毛囊细胞生长因子相关基因FGF-2，毛囊细胞外基质相关基因CSPG4和HSPG2，抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27，毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A的表达；下调毛囊休止期相关基因BMP4的表达，结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的酿酒酵母LABOFMIC-315发酵溶胞物具有上调HDPCs毛囊细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子2基因FGF-2，毛囊细胞外基质相关的粘附分子硫酸软骨素蛋白聚糖基因CSPG4和硫酸肝素蛋白聚糖基因HSPG2，抑制毛囊细胞凋亡相关的热休克蛋白27基因HSP27，毛囊细胞周期调控因子相关的Myc家族蛋白基因c-Myc、细胞周期蛋白D1基因Cyclin D1和蛋白磷酸酶2A基因PP2A的表达，基因相对表达倍数1.12～1.92；下调毛囊发育休止期相关骨形态发生蛋白4基因BMP4的表达，基因相对表达倍数为0.63～0.75。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.保藏编号为CCTCC NO:M 20221398的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

2.权利要求1所述的酿酒酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1所述的酿酒酵母的原料制成。

4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括如下Ⅰ或Ⅱ所示的一种或两种：

Ⅰ、权利要求1所述的酿酒酵母的灭活菌和/或灭活上清液；

Ⅱ、权利要求1所述的酿酒酵母的培养物、外泌体、裂解物、提取物、发酵滤液和/或发酵溶胞物。

5.权利要求3或4所述的产品在以下ⅰ～ⅴ至少一项中的应用：

ⅰ、促进细胞增殖；

ⅱ、改善皮肤屏障；

ⅲ、抗衰老；

ⅳ、增强皮肤抗菌能力；

ⅴ、减少毛发脱落。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞增殖的作用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤屏障包括恢复细胞活力和/或上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG的表达。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括如下a)～i)所示的至少一种：

a)、上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL1A1和COL3A1中的至少一种；

b)、下调降解细胞外基质相关基因的表达，所述降解细胞外基质相关基因MMP家族基因中的至少一种；

c)、上调细胞抗氧化相关基因的表达，所述细胞抗氧化相关基因包括NRF2、PTEN、SIRT-1和SIRT-3中的至少一种；

d)、下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族中的任意一个或多个；

e)、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

f)、上调免疫调节因子相关基因MOR的表达；

g)、上调细胞生长因子相关基因FGF21的表达；

h)、上调抑制细胞调往相关基因BCL-2的表达；

i)、降低蛋白羰基含量。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提升抗菌力为上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8、DEFB4和LCN-2中的至少一种。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述减少毛发脱落包括如下①～⑤所示的至少一种：

①、上调毛囊细胞生长因子相关基因FGF-2的表达；

②、上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4和/或HSPG2的表达；

③、上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27的表达；

④、上调毛囊细胞周期调控因子相关基因的表达，所述毛囊细胞周期调控因子相关基因包括c-Myc、Cyclin D1和PP2A中的至少一种；

⑤、下调毛囊休止期相关基因BMP4的表达。