CN115710553A - 一株热带假丝酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株热带假丝酵母及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的热带假丝酵母(Candida tropicalis)为热带假丝酵母LABOFMIC‑308，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。实验表明，LABOFMIC‑308具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、提高皮肤抗菌能力、抗衰老的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株热带假丝酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一株热带假丝酵母及其应用。

背景技术

人体皮肤上栖息着各种细菌、真菌、病毒，还有螨虫等小型节肢动物，它们的集合形成皮肤微生物组或皮肤菌群。皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态***，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。

大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用。最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达，皮肤驻留细菌不仅仅是被动驻留菌；它们通过完整的皮肤屏障主动参与宿主免疫。皮肤固有免疫***联合皮肤微生物群是人体抵御致病微生物和机会致病菌的屏障。

皮肤微生物组在皮肤表面合成具有活性的代谢产物，如短链脂肪酸、B族维生素等，调节皮肤生理功能。越来越多的研究表明，皮肤微生态失衡(又称菌群失衡)会导致一系列皮肤疾病，如特应性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、银屑病、机会性感染等。当有益菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株热带假丝酵母及其应用。

本发明提供了热带假丝酵母(Candida tropicalis)，该菌株为热带假丝酵母LABOFMIC-308，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。

本发明的另一目的是提供了上述热带假丝酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

较佳地，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、提高皮肤抗菌能力、抗衰老中的至少一种。

一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞增殖和/或促进成纤维细胞增殖，所述促进皮肤角质细胞增殖的增值率为：10.19％～15.97％，所述促进成纤维细胞增殖的增值率为8.97％～14.81％。

一些实施方案中，所述修护皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达，所述屏障修护相关基因包括FLG和OVOL1。

一些实施方案中，所述保湿包括上调保湿相关基因的表达，所述保湿相关基因包括AQP3和/或GBA。

一些实施方案中，所述提高皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8和LCN-2中的至少一种。

一些实施方案中，所述抗衰老包括上调第一组相关基因的表达及下调第二组相关基因的表达，所述第一组相关基因包括细胞外基质相关基因、抑制细胞凋亡相关基因、细胞自噬相关基因、细胞抗氧化相关基因、免疫调节因子相关基因及细胞生长因子相关基因，所述第二组相关基因包括降解细胞外基质相关基因及细胞凋亡相关基因。

一些实施方案中，所述抗衰老还包括抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基和抗氧化中的至少一种。

一些实施方案中，所述产品为食品、药品或化妆品。

本发明公开的热带假丝酵母(Candida tropicalis)LABOFMIC-308，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。实验表明，热带假丝酵母LABOFMIC-308具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、提高皮肤抗菌能力、抗衰老的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

热带假丝酵母(Candida tropicalis)LABOFMIC-308，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。

具体实施方式

本发明提供了一株热带假丝酵母及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种热带假丝酵母LABOFMIC-308，来源于阳山水蜜桃表皮，经真菌ITS基因序列鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。该菌株在显微镜下呈单细胞，球形或卵球形；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面软而平滑或部分有皱纹、无光泽、中央扁平的白色圆形菌落，质地均匀，边缘不规则；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。

本发明中，所述促细胞增殖包括促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞的增殖。本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，对所述的热带假丝酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的热带假丝酵母可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为10.19～15.97％。本发明中，所述促细胞增殖包括促进皮肤成纤维细胞的增殖。本发明以HFF细胞为受试对象，对所述的热带假丝酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的热带假丝酵母可促进HFF细胞增殖，促进增殖率为8.97～14.81％。

本发明中，所述的修护皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG和OVOL1中的至少一种。进一步的，本发明以HaCaT细胞为受试对象，对所述的热带假丝酵母的SDS损伤修复能力进行了研究，结果表明，所述的热带假丝酵母可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。

本发明中，所述的保湿包括但不限于上调保湿相关基因的表达，所述的保湿相关基因包括但不限于AQP3和/或GBA。本发明以HaCaT细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母的对皮肤的保湿效果，结果显示，所述的热带假丝酵母可上调保湿相关基因AQP3和/或GBA的表达，促进皮肤细胞保湿。

本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、LCN-2的表达，提高皮肤抗菌能力。

本发明中，所述抗衰老包括如下所示的至少一种：上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、LN、COL13A1、SMAD3和COL3A1中的至少一种；下调降解细胞外基质相关基因的表达，所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族基因中的至少一种；上调细胞抗氧化相关基因NRF2、SIRT-1的表达；下调细胞凋亡相关基因的表达，所述细胞凋亡相关基因包括Caspase家族中的任意一个或多个；上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；上调细胞生长因子相关基因VEGF、FGF1、FGF2、FGF21、HGF的表达；抑制胶原蛋白酶活性；清除DPPH自由基；抗氧化能力。

为了探究所述的热带假丝酵母的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞凋亡、细胞自噬、细胞生长因子、抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基及抗氧化能力中的至少一个。

本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调细胞外基质合成相关基因TIMP1的表达，促进细胞外基质的合成。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调细胞外基质合成相关基因LN、COL13A1、SMAD3和COL3A1的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因MMP3、MMP8、MMP10的表达，抑制细胞外基质的降解。

本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HaCaT角质细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调抗氧化相关基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力。

本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HaCaT角质细胞细胞自噬的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调细胞自噬相关基因LC3B的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。

本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HaCaT角质细胞生长因子相关基因表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调血管内皮生长因子相关基因VEGF的表达，促进细胞生长。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF细胞凋亡的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可下调细胞凋亡相关基因Caspase3和Caspase9的表达，抑制细胞凋亡。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF抑制细胞凋亡的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达，抑制细胞凋亡。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF角质细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调抗氧化相关基因SIRT-1的表达，增强细胞的抗氧化能力。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF成纤维细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调免疫调节因子相关基因MOR的表达，增强细胞的免疫调节能力。

本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对HFF成纤维细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的热带假丝酵母可上调成纤维细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF的表达，促进细胞生长。

本发明以胶原蛋白酶为受试对象，研究所述的热带假丝酵母影响胶原蛋白酶活性的检测。结果表明，所述的热带假丝酵母可抑制胶原蛋白酶活性，减少胶原蛋白降解。

本发明以热带假丝酵母为受试对象，研究所述的热带假丝酵母对清除DPPH自由基和总抗氧化力的检测。结果表明，所述的热带假丝酵母可清除DPPH自由基且具抗氧化能力，减少细胞的氧化损伤。

本发明还提供了上述技术方案中所述的热带假丝酵母LABOFMIC-308在制备改善皮肤状况的产品中的应用，所述热带假丝酵母LABOFMIC-308在所述的应用或产品中，存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为菌体裂解物和/或提取物的形式，或为酵母产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液、菌体裂解物。

进一步的，所述产品包括含有所述热带假丝酵母的菌群；

进一步地，所述产品还包括含有所述热带假丝酵母及其裂解物、提取物、代谢产物制成的菌剂，或者含有所述的热带假丝酵母的菌群制成的菌剂，本发明对此不做限定。

进一步地，所述的产品还包括所述的热带假丝酵母或其裂解物、提取物、代谢产物，本发明对此不做限定。本发明对此不做限定。

所述产品的剂型包括但不限于膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种，本发明对此不做限定。

本发明还提供了一种改善肌肤状态的方法，包括使用上述技术方案中所述的产品进行涂抹、外敷、熏蒸或注射，本发明对此不做限定。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1LABOFMIC-308的分离

于阳山水蜜桃表皮上采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂平板，28℃恒温培养12-16h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-308。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-308在显微镜下呈单细胞，球形或卵球形；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面软而平滑或部分有皱纹、无光泽、中央扁平的白色圆形菌落，质地均匀，边缘不规则；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。

实施例2LABOFMIC-308的核酸鉴定

1、真菌ITS基因序列分析

挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物ITS1,ITS4，进行PCR扩增体系为15μL体系，95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延伸7min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-308菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。

实施例3LABOFMIC-308促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验

1、LABOFMIC-308第一上清液制备

挑取热带假丝酵母LABOFMIC-308单菌落于麦芽汁液体培养基，40℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出后以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为第一上清液，所述第一上清液为灭活上清液。

2、促进HaCaT细胞修复实验

接种HaCaT细胞(5×10⁴cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔添加5％第一上清液(对照组以等体积PBS替代第一上清液)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

细胞增殖率计算公式及结果如下表：

上表结果可知，LABOFMIC-308第一上清液可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，即促进细胞增殖率，其增殖率为10.19％～15.97％。

实施例4LABOFMIC-308促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、LABOFMIC-308第一上清液和菌体裂解液的制备

第一上清液的制备方法参照实施例3；

菌体裂解液的制备方法如下：

将实施例3中的离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃，30min高压灭活，即得菌体裂解液。

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入第一上清液5％(V/V)，菌体裂解液10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代第一上清液/菌体裂解液)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG和OVOL1基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308第一上清液和菌体裂解液均具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG和OVO样转录因子1基因OVOL1表达的作用，基因表达量上调1.14～1.48倍。表明LABOFMIC-308具有促进皮肤屏障修护的作用。

实施例5LABOFMIC-308上调HaCaT保湿相关基因表达实验

1、LABOFMIC-308第一上清液和菌体裂解液的制备

制备方法参照实施例3及实施例4。

2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入第一上清液5％(V/V)，加入灭活菌体10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代第一上清液/菌体裂解液)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值，结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308第一上清液和菌体裂解液均具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3和葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.02～1.78倍。表明LABOFMIC-308具有促进皮肤保湿的作用。

实施例6LABOFMIC-308调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/抗氧化/生长因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-308菌体裂解液的制备

制备方法参照实施例4。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-308添加

将菌体裂解液10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组以等体积PBS替代菌体裂解液)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化/生长因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因TIMP1，细胞自噬相关基因LC3B，抗氧化相关基因NRF2以及细胞生长因子VEGF的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

菌体裂解液上调细胞外基质基因TIMP1，细胞自噬相关基因LC3B，抗氧化相关基因NRF2和细胞生长因子VEGF。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有上调HaCaT细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1，细胞自噬相关微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B，抗氧化相关核因子E2相关因子2基因NRF2以及生长因子相关的血管内皮生长因子基因VEGF表达的作用，基因相对表达倍数1.16～1.98。

实施例7LABOFMIC-308促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、LABOFMIC-308菌体裂解液的制备

制备方法参照实施例4。

2、HFF细胞制备及LABOFMIC-308添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×10⁴细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H₂O₂，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别添加菌体裂解液10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代菌体裂解液)。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A，其计算公式及结果如下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率8.97％～14.81％。

实施例8LABOFMIC-308调节氧化损伤HFF细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-308第一上清液及菌体裂解液的制备

制备方法参照实施例3及实施例4。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、LABOFMIC-308添加

将第一上清液5％(V/V)、菌体裂解液10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代第一上清液/菌体裂解液)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、COL13A1、SMAD3和COL3A1，免疫调节因子相关基因MOR，抗氧化相关基因SIRT-1，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

第一上清液上调细胞外基质相关基因LN、SMAD3、COL13A1，免疫调节因子相关基因MOR，抗氧化相关基因SIRT-1，抑制细胞凋亡基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族，结果见下表：

菌体裂解液上调细胞外基质相关基因COL3A1，免疫调节因子相关基因MOR，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF；下调降解细胞凋亡相关基因Caspase家族。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN，XIII型胶原α1链基因COL13A1，信号转导蛋白SMAD3基因SMAD3和III型胶原α1链基因COL3A1，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1，抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2以及细胞生长因子相关成纤维细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF21、肝细胞生长因子基因HGF表达的作用，基因相对表达倍数1.20～2.46倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.09～0.77。

实施例9LABOFMIC-308上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、LABOFMIC-308第一上清液及菌体裂解液的制备

制备方法参照实施例3及实施例4。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、LABOFMIC-308添加及LPS刺激

将第一上清液5％(V/V)、菌体裂解液10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代第一上清液/菌体裂解液)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、LCN-2基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

第一上清液上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8，结果见下表：

菌体裂解液上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、LCN-2。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有促进抗菌肽相关基因银屑病素S100A7、钙粒蛋白A S100A8、脂质运载蛋白-2LCN-2表达的作用，基因相对表达倍数1.09～1.67。表明LABOFMIC-308具有提高皮肤能力的作用。

实施例10LABOFMIC-308抑制胶原蛋白酶活性实验

1、LABOFMIC-308第一上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、胶原蛋白酶活性抑制率检测

将50μL 0.2％的明胶(胶原蛋白)溶液和50μL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCL(含50mmol/L CaCl2)溶液混合，加入第一上清液25μL(对照组以等体积麦芽汁液体培养基替代第一上清液)，加入胶原蛋白酶液25μL在37℃反应0.5h。终止反应后以茚三酮显色在593nm下测定各组胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。

胶原蛋白酶活性抑制率计算公式及结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有抑制胶原蛋白酶活性的作用，抑制率10.63％～11.77％。

实施例11LABOFMIC-308清除自由基的作用

1、LABOFMIC-308第二上清液制备

挑取热带假丝酵母LABOFMIC-308单菌落于麦芽汁液体培养基，置于摇床28℃、160r/min培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出后以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为第二上清液，所述第二上清液为灭活上清液。

2、LABOFMIC-308第二上清液DPPH自由基清楚能力检测

试剂配制和检测方法按照索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸亮度，求平均值并计算各样品清除率。

计算公式及结果如下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有清除DPPH自由基的作用，自由基清除率91.56％～92.15％。

实施例12LABOFMIC-308总抗氧化能力测定实验

1、LABOFMIC-308第二上清液制备

制备方法参照实施例11。

2、总抗氧化能力测定

试剂配制和检测方法按照索莱宝总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒说明书进行，其中反应总体积为0.204ml，反应中样本体积0.006ml。测定各样品593nm吸亮度A，根据公式

A测-A空白＝6.1464X-0.0009计算得到X值，进而计算得到总抗氧化能力。

总抗氧化能力计算公式及结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的热带假丝酵母LABOFMIC-308具有抗氧化的作用，总抗氧化能力3.638～3.808μmol/mL。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株热带假丝酵母(Candida tropicalis)，该菌株为热带假丝酵母LABOFMIC-308，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221391。

2.保藏编号为CCTCC NO:M 20221391的热带假丝酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、提高皮肤抗菌能力、抗衰老中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞增殖和/或促进成纤维细胞增殖，所述促进皮肤角质细胞增殖的增值率为：10.19％～15.97％，所述促进成纤维细胞增殖的增值率为8.97％～14.81％。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修护皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达，所述屏障修护相关基因包括FLG和OVOL1。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿包括上调保湿相关基因的表达，所述保湿相关基因包括AQP3和/或GBA。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8和LCN-2中的至少一种。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括上调第一组相关基因的表达及下调第二组相关基因的表达，所述第一组相关基因包括细胞外基质相关基因、抑制细胞凋亡相关基因、细胞自噬相关基因、细胞抗氧化相关基因、免疫调节因子相关基因及细胞生长因子相关基因，所述第二组相关基因包括降解细胞外基质相关基因及细胞凋亡相关基因。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老还包括抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基和抗氧化中的至少一种。

10.根据权利要求2～9任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品。