CN115926014A - 贝母多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贝母多糖的提取方法，包括：步骤一、制备贝母粉体；步骤二、将贝母粉体与石油醚混合，微波加热后水浴中回流脱脂，得脱脂贝母粉体；步骤三、向脱脂贝母粉体中加入蒸馏水及纤维素酶溶液，在45～55℃条件下提取，得到贝母多糖粗提液；步骤四、将贝母多糖粗提液加热灭酶，并加入氯仿‑正丁醇溶液，充分振荡，离心，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水搅拌，再离心，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；步骤五、醇沉干燥得贝母粗多糖；步骤六、在贝母粗多糖中加入蒸馏水复溶，再加入经预处理过的大孔吸附树脂振荡进行纯化，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖。本发明方法对贝母多糖提取率高且纯化效果好。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取多糖的技术领域，具体涉及一种贝母多糖的提取方法。
背景技术
多糖作为近年来研究的热点之一，它参与了细胞的多种生命现象的调节，具有重要的保健功能，包括氧化还原平衡的维护、与重金属螯合、免疫调节***的调节、抑制基因毒性等，都依赖于多糖的结构特征，且多糖广泛分布于自然界中。大量研究表明植物多糖具有抗衰老等多种生物学功效，而且对机体几乎没有毒性，故对其生物学功效的研究愈来愈引起人们的重视，因此，从中草药中筛选具有抗氧化和清除自由基活性的多糖物质，对食品和医药工业均有重要意义。贝母属于百合科多年生草本植物，是一种药食同源的植物，其含有的贝母多糖不仅具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等生物活性，且其没有任何毒副作用，而且应用化学手段就可以很容易的控制其药物质量，基于此，贝母多糖已经为如今的新药研发、绿色食品添加剂、功能保健品等开辟了新的研究思路与方向，所以设计一种贝母多糖的提取方法意义重大。
发明内容
本发明提供一种贝母多糖的提取方法，其通过微波加热脱脂、纤维素酶提取、氯仿-正丁醇溶液及大孔吸附树脂除杂等工艺，可获得高提取率高纯度的贝母精多糖。
为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种贝母多糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取刚采集的贝母，清水洗净，冷冻干燥，超微粉碎，得贝母粉体；
步骤二、将贝母粉体与石油醚按质量体积比为1：(6～8)(即每6～8mL石油醚中含1g贝母粉体)混合并搅拌均匀，微波加热8～12min后放置于60～70℃水浴中回流脱脂30～40min，离心，收集残渣，重复脱脂三次，石油醚挥干后加入乙醇溶液，磁力搅拌，离心，收集残渣，挥干，得脱脂贝母粉体；
步骤三、向脱脂贝母粉体中加入其10～20倍重量的蒸馏水，搅拌均匀，再加入该溶液2～3倍体积的纤维素酶溶液，在45～55℃条件下提取35～45min，得到贝母多糖粗提液；
步骤四、将贝母多糖粗提液在90～100℃条件下加热10～15min灭酶，并加入其1/5倍体积的氯仿-正丁醇溶液，充分振荡至少30min后，离心15～20min，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水45～55℃条件下搅拌5～10min，再离心15～20min，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；
步骤五、向贝母多糖浓缩液中加入其3～5倍体积的乙醇溶液，边加边搅拌，在5～8℃下静置24～40h，后离心15～20min，收集沉淀，经真空干燥得贝母粗多糖；
步骤六、在贝母粗多糖中加入其400～500倍重量的蒸馏水复溶，再加入经预处理过的大孔吸附树脂，室温下摇床振荡24～30h，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，步骤二中，所述贝母粉体脱脂后加入不小于其5倍体积的乙醇溶液。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，步骤三中，所述纤维素酶溶液的质量浓度为4～6％。即每100升溶液中含有4～6g纤维素酶。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，步骤四中，所述氯仿-正丁醇溶液为体积比为(4～6)：1的氯仿：正丁醇混合物。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，其特征在于，步骤二和步骤五中乙醇溶液均为体积分数为80～90％的乙醇溶液。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，大孔吸附树脂的预处理方法为：取大孔吸附树脂，用蒸馏水充分清洗去除表面杂质，再加无水乙醇浸泡20～30h，使树脂充分溶胀，之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，再加3～4％的弱酸溶液浸泡2～3h，蒸馏水洗涤至中性，再加4～5％的小苏打甘油水溶液浸泡2～3h，蒸馏水洗涤至中性，最后加入蒸馏水浸泡，4～5℃保存备用。3～4％的弱酸溶液为每100g水中含3～4g弱酸；4～5％的小苏打甘油水溶液为每100g甘油水溶液中含4～5g小苏打。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，所述弱酸为柠檬酸、醋酸、乳酸中的一种。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，所述甘油水溶液中甘油和水的体积比为1:(5～8)。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，步骤六中，每1g未经处理的大孔吸附树脂对应吸附处理3～4mL的复溶溶液。
优选的是，所述的贝母多糖的提取方法中，大孔吸收树脂为AB-8型大孔吸附树脂或D-101型大孔吸附树脂。
本发明至少包括以下有益效果：本发明方法中通过石油醚除脂过程中进行微波加热，促进植物细胞壁破裂使细胞内各种物质快速移动至石油醚中，提高了除脂率，并在除脂后通过乙醇溶液除去小分子醇容物，进一步提高了多糖提取纯度；多糖提取过程中加入了纤维素酶，加速了植物组织的分解及多糖的提取；通过氯仿-正丁醇对贝母多糖粗提液除去纤维素酶和大部分提取出的蛋白质类物质，减轻了后续纯化过程中大孔吸附树脂对蛋白质的吸附任务，而吸附更多的其他杂质，提高了纯化效果；用蒸馏水对纤维素酶沉淀进行再溶，提取沉淀中掺杂的贝母多糖，避免了被提取出的多糖的浪费；通过对大孔树脂预处理，不仅去除大孔树脂内的杂质，避免将杂质代入贝母多糖中，且甘油在小苏打的弱碱性溶液条件下对大孔吸附树脂发生作用，使大孔吸附树脂对多糖的吸附率降低，从而使更多的贝母多糖保留在最后的贝母精多糖，提高贝母精多糖的提取率；本发明方法对贝母多糖的提取率高且纯化效果好，所得的贝母精多糖纯度均在98％以上，适于各类贝母中贝母多糖的提取。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
步骤一、取刚采集的浙贝母，清水洗净，冷冻干燥，超微粉碎至粒径为30μm，得贝母粉体；
步骤二、将贝母粉体与石油醚按质量体积比为1：6混合并搅拌均匀，微波加热8min后放置于60℃水浴中回流脱脂30min，离心，收集残渣，重复脱脂三次，石油醚挥干后加入其5倍体积的80％的乙醇溶液，以1000r/min磁力搅拌30min，离心10min，收集残渣，挥干，得脱脂贝母粉体；
步骤三、向脱脂贝母粉体中加入其10倍重量的蒸馏水，搅拌均匀，再加入该溶液2倍体积的质量浓度为4％的纤维素酶溶液，在45℃条件下提取35min，提取过程中每隔5min缓慢搅拌10s，得到贝母多糖粗提液；
步骤四、将贝母多糖粗提液在90℃条件下加热10min灭酶，并加入其1/5倍体积的氯仿-正丁醇溶液，充分振荡30min后，离心15min，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水45℃条件下搅拌5min，再离心15min，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；
其中，氯仿-正丁醇溶液为体积比为4：1的氯仿：正丁醇混合物；
步骤五、向贝母多糖浓缩液中加入其3倍体积的80％的乙醇溶液，边加边搅拌，在5℃下静置24h，后离心15min，收集沉淀，经真空干燥得贝母粗多糖；
步骤六、在贝母粗多糖中加入其400倍重量的蒸馏水复溶，再加入经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂，室温下摇床振荡24h，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖；
其中，每1g未经处理的大孔吸附树脂对应吸附处理3mL的复溶溶液；
大孔吸附树脂的预处理方法为：取大孔吸附树脂，用蒸馏水充分清洗去除表面杂质，再加无水乙醇浸泡20h，使树脂充分溶胀，之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，再加3％的柠檬酸溶液浸泡2h，蒸馏水洗涤至中性，再加4％的小苏打甘油水溶液浸泡2h，蒸馏水洗涤至中性，最后加入蒸馏水浸泡，4℃保存备用；甘油水溶液中甘油和水的体积比为1:5。
本实施例中所有离心转速均为4000r/min。
实施例2
步骤一、取刚采集的川贝母，清水洗净，冷冻干燥，超微粉碎至粒径为60μm，得贝母粉体；
步骤二、将贝母粉体与石油醚按质量体积比为1：7混合并搅拌均匀，微波加热10min后放置于65℃水浴中回流脱脂35min，离心，收集残渣，重复脱脂三次，石油醚挥干后加入6倍体积的85％的乙醇溶液，以1000r/min磁力搅拌30min，离心10min，收集残渣，挥干，得脱脂贝母粉体；
步骤三、向脱脂贝母粉体中加入其15倍重量的蒸馏水，搅拌均匀，再加入该溶液2.5倍体积的质量浓度为5％的纤维素酶溶液，在50℃条件下提取40min，提取过程中每隔5min缓慢搅拌10s，得到贝母多糖粗提液；
步骤四、将贝母多糖粗提液在95℃条件下加热13min灭酶，并加入其1/5倍体积的氯仿-正丁醇溶液，充分振荡40min后，离心18min，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水50℃条件下搅拌8min，再离心18min，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；
其中，氯仿-正丁醇溶液为体积比为5：1的氯仿：正丁醇混合物；
步骤五、向贝母多糖浓缩液中加入其4倍体积的85％的乙醇溶液，边加边搅拌，在6℃下静置32h，后离心18min，收集沉淀，经真空干燥得贝母粗多糖；
步骤六、在贝母粗多糖中加入其450倍重量的蒸馏水复溶，再加入经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂，室温下摇床振荡27h，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖；
其中，每1g未经处理的大孔吸附树脂对应吸附处理4mL的复溶溶液；
大孔吸附树脂的预处理方法为：取大孔吸附树脂，用蒸馏水充分清洗去除表面杂质，再加无水乙醇浸泡25h，使树脂充分溶胀，之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，再加4％的醋酸溶液浸泡2.5h，蒸馏水洗涤至中性，再加4％的小苏打甘油水溶液浸泡2.5h，蒸馏水洗涤至中性，最后加入蒸馏水浸泡，4℃保存备用；甘油水溶液中甘油和水的体积比为1:7。
本实施例中所有离心转速均为4000r/min。
实施例3
步骤一、取刚采集的伊贝母，清水洗净，冷冻干燥，超微粉碎至粒径为100μm，得贝母粉体；
步骤二、将贝母粉体与石油醚按质量体积比为1：8混合并搅拌均匀，微波加热12min后放置于70℃水浴中回流脱脂40min，离心，收集残渣，重复脱脂三次，石油醚挥干后加入8倍体积的90％的乙醇溶液，以1000r/min磁力搅拌30min，离心10min，收集残渣，挥干，得脱脂贝母粉体；
步骤三、向脱脂贝母粉体中加入其20倍重量的蒸馏水，搅拌均匀，再加入该溶液3倍体积的质量浓度为6％的纤维素酶溶液，在55℃条件下提取45min，提取过程中每隔5min缓慢搅拌10s，得到贝母多糖粗提液；
步骤四、将贝母多糖粗提液在100℃条件下加热15min灭酶，并加入其1/5倍体积的氯仿-正丁醇溶液，充分振荡50min后，离心20min，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水55℃条件下搅拌10min，再离心20min，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；
其中，氯仿-正丁醇溶液为体积比为6：1的氯仿：正丁醇混合物；
步骤五、向贝母多糖浓缩液中加入其5倍体积的90％的乙醇溶液，边加边搅拌，在8℃下静置40h，后离心20min，收集沉淀，经真空干燥得贝母粗多糖；
步骤六、在贝母粗多糖中加入其500倍重量的蒸馏水复溶，再加入经预处理过的D-101型大孔吸附树脂，室温下摇床振荡30h，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖；
其中，每1g未经处理的大孔吸附树脂对应吸附处理4mL的复溶溶液；
大孔吸附树脂的预处理方法为：取大孔吸附树脂，用蒸馏水充分清洗去除表面杂质，再加无水乙醇浸泡30h，使树脂充分溶胀，之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，再加4％的乳酸溶液浸泡3h，蒸馏水洗涤至中性，再加5％的小苏打甘油水溶液浸泡3h，蒸馏水洗涤至中性，最后加入蒸馏水浸泡，5℃保存备用；甘油水溶液中甘油和水的体积比为1:8。
本实施例中所有离心转速均为4000r/min。
对比例1
同实施例2，不同之处为：步骤二中，未微波加热。
对比例2
同实施例2，不同之处为：步骤二中，脱脂后未用乙醇溶液处理。
对比例3
同实施例2，不同之处为：步骤三中，未加入纤维素酶溶液。
对比例4
同实施例2，不同之处为：步骤四中，将氯仿-正丁醇溶液换成蒸馏水。
对比例5
同实施例2，不同之处为：步骤四中，无加蒸馏水操作，即上清液A减压浓缩即得贝母多糖浓缩液。
对比例6
同实施例2，不同之处为：步骤六中，大孔吸附树脂未经预处理。
对比例7
同实施例2，不同之处为：大孔吸附树脂预处理方法中无甘油。
对比例8
同实施例2，不同之处为：大孔吸附树脂预处理方法中，单独用弱酸溶液、小苏打溶液、甘油水溶液浸泡处理。
对比例9
同实施例2，不同之处为：大孔吸附树脂预处理方法中，弱酸溶液中含有甘油、小苏打甘油水溶液为小苏打水溶液。
对比例10
用传统的水提醇沉方式提取贝母多糖：将采集的川贝母清洗干燥粉碎，然后加入其60～100倍体积蒸馏水，搅拌均匀，在45～55℃条件下提取24～30h，离心、取上清液、减压浓缩干燥即得贝母多糖。
根据公式：多糖提取率％＝贝母精多糖质量/贝母样品质量×100％测量并计算以上各实施例中多糖提取率，并记录至表1；将以上各实施例中的贝母精多糖加蒸馏水复溶，并利用硫酸-苯酚法对贝母多糖含量进行检测，测得结果即贝母精多糖纯度，并将结果记录至表1。
表1
| 多糖提取率％ | 多糖纯度％ | |
| 实施例1 | 12.61 | 98.6 |
| 实施例2 | 45.67 | 98.3 |
| 实施例3 | 20.25 | 98.1 |
| 对比例1 | 52.21 | 83.1 |
| 对比例2 | 47.37 | 95.3 |
| 对比例3 | 35.76 | 98.3 |
| 对比例4 | 57.61 | 73.6 |
| 对比例5 | 43.82 | 98.2 |
| 对比例6 | 56.23 | 74.9 |
| 对比例7 | 35.86 | 95.8 |
| 对比例8 | 35.83 | 95.7 |
| 对比例9 | 35.87 | 95.8 |
| 对比例10 | 10.76 | 65.3 |
通过表1的测试结果分析，通过本发明方法提取贝母中的多糖(实施例1、实施例2、实施例3)相较于传统的水提醇沉方法提取贝母多糖(对比例10)，不仅提取率有很大提高且纯度更高，均在98％以上；对比例1相较于实施例2中多糖提取率增加，而纯度降低，因为微波能促进细胞壁破碎，使细胞内多种物质转移至溶剂中，有助于石油醚脱脂除杂，对比例1中未进行微波加热，而降低了石油醚的脱脂率，使部分脂类杂质留在最后的贝母精多糖中；对比例2相较于实施例2中多糖提取率略增大，纯度略降低，因为实施例2步骤二中的乙醇用于除去小分子醇容物，以提高多糖纯度，而对比例2中无该操作，使部分小分子醇容物留在最后的贝母精多糖中；对比例3相较于实施例2中多糖提取率骤降，而纯度不变，因为纤维素酶可加速植物组织分解，促进贝母多糖快速释放提取，对比例3中未添加纤维素酶导致在相同时间内贝母多糖的提取量减少，导致提取率降低；对比例4相较于实施例2中多糖提取率增加，而纯度确明显降低，因为氯仿-正丁醇溶液的目的是用于除去纤维素酶和大部分提取出的蛋白质类物质，以减轻大孔吸附树脂对蛋白质的吸附任务而去吸附其他杂质，但对比例4中未加氯仿-正丁醇溶液，大孔吸附树脂不能将大量纤维素酶及蛋白质吸附除去，导致部分纤维素酶留在最后的贝母精多糖内，使其量增加，但纯度降低；对比例5相较于实施例2中多糖提取率略降低，纯度却不变，因为步骤四中上清液B中含有蒸馏水再溶的混杂在沉淀物中的多糖，对比例5未用蒸馏水对该部分多糖提取，而使该部分多糖混在沉淀物中被一同除去，所以使多糖提取率略低，但纯度基本不变；对比例6相较于对比例2中多糖提取率提高，而纯度却降低，因为未对大孔吸附树脂预处理除杂，使大孔吸附树脂中的部分杂质混入最后的贝母精多糖中；对比例7、对比例8、对比例9相较于对比例2中多糖提取率骤降，纯度略有下降但依然保持在较高位，因为大孔吸附树脂虽然对非多糖类杂质有吸附作用，但其对多糖也有吸附作用，且通过对比例7、对比例8、对比例9、实施例2的检测数据还可以发现，甘油只有在小苏打的弱碱性溶液条件下才会对大孔吸附树脂发生作用，使大孔吸附树脂对多糖的吸附率降低，从而使多糖保留在最后的贝母精多糖中。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (10)
1.贝母多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取刚采集的贝母，清水洗净，冷冻干燥，超微粉碎，得贝母粉体；
步骤二、将贝母粉体与石油醚按质量体积比为1：(6～8)混合并搅拌均匀，微波加热8～12min后放置于60～70℃水浴中回流脱脂30～40min，离心，收集残渣，重复脱脂三次，石油醚挥干后加入乙醇溶液，磁力搅拌，离心，收集残渣，挥干，得脱脂贝母粉体；
步骤三、向脱脂贝母粉体中加入其10～20倍重量的蒸馏水，搅拌均匀，再加入该溶液2～3倍体积的纤维素酶溶液，在45～55℃条件下提取35～45min，得到贝母多糖粗提液；
步骤四、将贝母多糖粗提液在90～100℃条件下加热10～15min灭酶，并加入其1/5倍体积的氯仿-正丁醇溶液，充分振荡至少30min后，离心15～20min，取上清液A，收集沉淀并加入蒸馏水45～55℃条件下搅拌5～10min，再离心15～20min，取上清液B并与上清液A合并，减压浓缩，得贝母多糖浓缩液；
步骤五、向贝母多糖浓缩液中加入其3～5倍体积的乙醇溶液，边加边搅拌，在5～8℃下静置24～40h，后离心15～20min，收集沉淀，经真空干燥得贝母粗多糖；
步骤六、在贝母粗多糖中加入其400～500倍重量的蒸馏水复溶，再加入经预处理过的大孔吸附树脂，室温下摇床振荡24～30h，抽取被吸附后的溶液浓缩干燥即得贝母精多糖。
2.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述贝母粉体脱脂后加入不小于其5倍体积的乙醇溶液。
3.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，步骤三中，所述纤维素酶溶液的质量浓度为4～6％。
4.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，步骤四中，所述氯仿-正丁醇溶液为体积比为(4～6)：1的氯仿：正丁醇混合物。
5.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，步骤二和步骤五中乙醇溶液均为体积分数为80～90％的乙醇溶液。
6.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，大孔吸附树脂的预处理方法为：取大孔吸附树脂，用蒸馏水充分清洗去除表面杂质，再加无水乙醇浸泡20～30h，使树脂充分溶胀，之后弃去乙醇，用蒸馏水洗涤至无味，再加3～4％的弱酸溶液浸泡2～3h，蒸馏水洗涤至中性，再加4～5％的小苏打甘油水溶液浸泡2～3h，蒸馏水洗涤至中性，最后加入蒸馏水浸泡，4～5℃保存备用。
7.如权利要求6所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，所述弱酸为柠檬酸、醋酸、乳酸中的一种。
8.如权利要求6所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，所述甘油水溶液中甘油和水的体积比为1:(5～8)。
9.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，步骤六中，每1g未经处理的大孔吸附树脂对应吸附处理3～4mL的复溶溶液。
10.如权利要求1所述的贝母多糖的提取方法，其特征在于，大孔吸收树脂为AB-8型大孔吸附树脂或D-101型大孔吸附树脂。
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| CN108530551A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-09-14 | 河北化工医药职业技术学院 | 贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用 |
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