CN108884495B

CN108884495B - 基因标记预测肝细胞癌对经导管动脉化疗栓塞(tace)的应答

Info

Publication number: CN108884495B
Application number: CN201780018693.9A
Authority: CN
Inventors: X·W·王; V·F·米勒
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: CN108884495A; US11306362B2; EP3414344A1; US20200032345A1; WO2017139276A1

Abstract

本公开提供了使用14或15个基因的基因标记预测肝细胞癌(HCC)将对经导管动脉化疗栓塞(TACE)应答的可能性的方法。还提供了检测该基因标记的核酸探针和试剂盒。

Description

基因标记预测肝细胞癌对经导管动脉化疗栓塞(TACE)的应答

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年2月8日提交的美国临时申请第62/292,789号的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用14或15个基因的基因标记预测肝细胞癌对经导管动脉化疗栓塞(TACE)的应答的方法，以及检测该基因标记的探针和试剂盒。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一，并且由于肿瘤异质性以及患有后期疾病的患者缺少有效的治疗选项，所以结果不佳。经导管动脉化疗栓塞(TACE)被认为是治疗患有中期至局部晚期肿瘤的患者的金标准。若干随机对照试验已经显示TACE后的存活益处，但只在采用严格的选择标准时才显示。在亚洲，TACE还通常用作手术切除后的辅助疗法，但是评价辅助TACE的益处的随机对照试验却显示矛盾的结果，这有可能是由于患者的选择与分层。

发明内容

本公开提供了选择最有可能对TACE应答的患者的方法。这些方法基于14-基因标记，其独立于其他临床变量预测对TACE的应答。无论患者是否接受辅助TACE或者肿瘤再发后接受TACE，该模块都预测应答。此外，提供了TACE Navigator基因标记测定，其包括对14个TACE标记基因和6个管家对照基因中的每一个有特异性的探针，其可与预后测定一起使用。

本文提供了一种检测表明HCC是否将对TACE应答的多个基因的表达的方法。在某些实施方案中，该方法包括检测或测量得自诊断有HCC的对象的HCC样本中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于对照的表达。例如，对这些基因中的每一个有特异性的核酸探针可与该样本一起孵育，并测量探针与基因之间的杂交，例如测量来自探针上荧光团的荧光。对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于对照(如ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA)的表达的调节(增加或降低)表明HCC将对TACE应答。在某些实施方案中，该方法还包括检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中GABARAPL3相对于对照的表达。对GABARAPL3相对于对照的表达的调节(增加或降低)表明HCC将对TACE应答。在某些实施方案中，该方法还包括例如如果测量到相对于对照的调节的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(在某些实例中还有GABARAPL3)表达，则对对象进行TACE。

还提供了一个探针组，其包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针。在某些实施方案中，该探针组还包括对GABARAPL3有特异性的核酸探针。在某些实施方案中，该探针组还包括对ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针。还提供了包含本文所公开的探针组的试剂盒。

还提供了一种检测表明HCC是否将对TACE应答的多个基因的表达的方法。在某些实施方案中，该方法包括用本文所公开的探针组检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于对照的表达。在某些实施方案中，该方法还包括用本文所公开的探针组检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中GABARAPL3相对于对照的表达。

通过参照附图进行的详细描述，本公开的前述及其他目的与特征将变得更加明显。

附图说明

图1A-1B为示出TACE患者队列(cohort)的层次聚类(hierarchical clustering)的图。图1A示出了通过1292个最可变基因的层次聚类将患者分配为聚类时TACE患者队列的差异总存活。图1B示出了通过层次聚类将接受其他辅助疗法的患者分配为聚类时总存活无差异(图1B)。通过log rank检验计算P值。

图2A为示出用于测定TACE Navigator基因标记所包括的基因的方法的示意图。图2B为显示分配为“应答者”聚类的45名TACE患者与分配为“非应答者”聚类的60名患者相比具有显著更佳的总存活和早期(<24个月)或晚期(>24个月)无疾病存活的一对图。通过logrank检验计算P值。

图3A为描述用于开发和验证TACE Navigator诊断装置的程序的示意图，并示出该装置如何在临床设置中应用。图3B为显示通过使用TACE Navigator预后装置的存活风险预测，分配为“低风险”的47名TACE患者比分配为“高风险”的46名TACE患者经历显著更佳的总存活以及更佳的早期(<24个月)或晚期(>24个月)无疾病存活的一对图。图3C显示当在香港验证队列中使用所述装置预测TACE患者应答者或非应答者时，被预测为“应答者”的28名患者比被预测为“非应答者”的21名患者经历显著更佳的总存活以及更佳的早期无复发存活的一对图。通过log rank检验计算P值。

图4A-4C示出了低氧应答可能与TACE治疗耐药性相关。当通过Ingenuity PathwayAnalysis和Gene Set Enrichment Analysis对TACE应答者与非应答者之间差异表达的基因进行分析时，预测主低氧调节基因HIF-1α直接位于7个TACE Navigator基因的上游，如图4A所示，并且已知对低氧应答而被上调的基因富集在差异表达的基因中，如图4B所示。当直接进行检查时，与应答者相比，HIF-1α和靶基因VEGF在TACE非应答者中被上调(图4C)。盒须图含有从第25百分位延伸至第75百分位的盒和Tukey须(1.5倍四分位数间距)，其中所述盒中部的线描述中位数，点表示Tukey变化外的样本。由Mann-Whitney U检验计算P值。

图5为示出比较TACE、其他疗法和无疗法患者组的总存活的Kaplan-Meier存活曲线的图。

图6为示出通过TACE Navigator基因标记层次聚类为两个聚类后每组的患者的危险比率(点)和95％置信区间(须)的Foreset图。

图7A-7B示出了通过AFFYMETRIX^TM芯片和NANOSTRING^TM测量的TACE Navigator标记基因(图7A)和伴随的管家基因(图7B)的基因表达(Log2)之间的相关性。通过PearsonCorrelation计算各图中显示的P和R值，P值小于0.05表明具有统计学显著性。

图8A为示出来自LCI队列的肿瘤(T)和非肿瘤(NT)样本中的6个不同管家基因的表达的图。图8B为示出来自TIGER队列的肿瘤(T)和非肿瘤(NT)样本中的6个不同管家基因的表达的图。

序列表

用核苷酸碱基的标准字母缩写表示在随附的序列表中列出的核酸序列，如37C.F.R.1.822中所定义。只显示每个核酸序列的一条链，但是应理解对显示的链的任何引用也包含了互补链。序列表以2017年1月30日创建的5.04KB的ASCII文本文件提交，其通过引用并入本文。在随附的序列表中：

SEQ ID NO:1-21为代码集的靶核酸序列。

发明详述

I.缩写

II.术语和方法

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学的常用术语的定义可在以下文献中找到：Benjamin Lewin，Genes VII，由Oxford University Press出版，2000(ISBN 019879276X)；Kendrew等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Publishers出版，1994(ISBN0632021829)；Robert A.Meyers(编)，MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由Wiley，John&Sons，Inc.出版，1995(ISBN 0471186341)；和George P.Rédei，Encyclopedic Dictionary ofGenetics，Genomics，and Proteomics，第2版，2003(ISBN:0-471-26821-6)。

除非上下文另有明确地说明，否则单数形式的“一个”、“一种”和“所述”是指一个或多于一个。例如，术语“包含探针”包括单数或复数个探针并且被认为等效于短语“包含至少一个探针”。除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是指陈述的可选元素中的单个元素，或两个或多个元素的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，在不排除额外元素的情况下，“包含A或B”意指“包括A、B、或A和B”。

尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下面仍对合适的方法和材料进行了说明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考皆通过引用被整体并入，登记号(对于2016年2月8日呈现的序列)也是如此。在发生冲突的情况下，将以包括术语解释的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在进行限定。

除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域已知并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2000)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,第4版,Wiley&Sons,1999；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990；和Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1999。

为便于查阅本公开的各个实施方案，以下提供了特定术语的解释：

辅助疗法：一种与主要治疗组合使用以提高主要治疗效果的治疗。例如，辅助疗法可包括手术切除癌组织后施用的化学疗法。在实例中，辅助疗法可包括TACE后的手术。

施用：通过任意有效途径向对象提供或给予药剂，如化疗药剂。示例性施用途径包括但不限于注射(如皮下注射、肌肉注射、真皮内注射、腹腔注射、瘤内注射、经动脉注射和静脉注射)、口服途径、舌下含服途径、直肠途径、经皮途径、鼻腔途径、***途径和吸入途径。

抗体：一种多肽，包括至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区，所述可变区特异性识别并结合抗原(如ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB、LDHA)表位或其片段。抗体由重链和轻链组成，每条重链和轻链具有可变区，称为重链可变(V_H)区和轻链可变(V_L)区。V_H区与V_L区一起负责结合由抗体识别的抗原。本公开的抗体包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB或LDHA有特异性的那些。

术语抗体包括完整的免疫球蛋白，以及其变体和部分，如Fab’片段、F(ab)’₂片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。该术语还包括遗传工程形式，如嵌合抗体(例如人源化小鼠抗体)和异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还包括单克隆抗体和多克隆抗体。

抗原Ki-67(MKI67)：例如，OMIM 176741。包括哺乳动物(如人)MKI67核酸分子(例如基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。MKI67是一种与细胞增殖有关的核蛋白。而且，它还与核糖体RNA转录有关。MKI67的失活导致抑制核糖体RNA合成。在具体的实例中，MKI67表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

MKI67序列是公开可得的。例如GenBank登记号NM_002417.4、NM_001271366.1和NM_001081117.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠MKI67编码序列。GenBank登记号P46013.2、P_001258295.1和AAH53453.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠MKI67蛋白序列。本领技术人员将认识到使用所公开的方法分析的MKI67核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为MKI67(例如，从天冬氨酸产生天冬酰胺的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

阵列：分子(例如生物大分子(如肽或核酸分子)或生物样本(如组织切片))在底物上或底物中的可寻址位置中的排列。“微阵列”是一种被小型化以便需要或通过显微镜检查来辅助来评价或分析的阵列。有时，阵列也称为DNA芯片或生物芯片。

分子的阵列(“特征”)有可能会一次性对样本进行非常大量的分析。在某些示例阵列中，一个或多个分子(如寡核苷酸探针或抗体)会多次(如两次)出现在阵列上，例如以提供内部对照。阵列上可寻址位置的数目可变化，例如从至少4个变到至少9个、至少10个、至少14个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少500个、至少550个、至少600个、至少800个、至少1000个、至少10,000个或更多。在具体的实例中，阵列包括5-100个可寻址位置，如5-50个可寻址位置。在具体的实例中，阵列基本上由对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB有特异性的探针或引物或抗体(如允许扩增或检测的那些)组成，并且在某些实例中，还有GABARAPL3和/或1至10个或者1至6个对照分子(如管家基因，如ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的1个、2个、3个、4个、5个或全部)。

在具体的实例中，阵列包括核酸分子，如长度为至少15个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸或者长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。

在阵列内，每个阵列化的样本都是可寻址的，即其位置可被可靠且一致地在阵列的至少两个维度内确定。阵列上的特征应用位置可以假定不同的形状。例如，阵列可以是规则的(如按均一的行和列排列)或不规则的。因此，在有序的阵列中，每个样本的位置在样本应用于阵列时被分配给该样本，并且可提供检索表(key)以将每个位置与适当的靶或特征位置相关联。通常，以对称网格模式排列有序的阵列，但是样本也可以其他模式(如径向分布的线、螺旋线或有序的聚类)排列。通常，可寻址阵列是计算机可读的，即计算机可进行编程以将阵列上的具体地址与关于该位置处的样本的信息(如杂交或结合数据，包括例如信号强度)相关联。在计算机可读形式的某些实例中，规则排列阵列中的单个特征，例如以Cartesian网格模式，其可通过计算机与地址信息相关联。

基于蛋白质的阵列包括是蛋白质的探针分子或包括蛋白质的探针分子，或者其中靶分子是蛋白质或靶分子包括蛋白质的探针分子，以及包括与蛋白质结合的核酸的阵列，反之亦然。在某些实例中，阵列含有14个不同TACE相关分子(ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB)或15个不同TACE相关分子(GABARAPL3、ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB)的抗体，并且在某些实例中，还含有1至10个管家基因的抗体(如对ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA有特异性的抗体)。在某些实例中，这些抗体与阵列共价连接。

天冬酰胺合成酶(ASNS)：例如，OMIM 108370。包括哺乳动物(如人)ASNS核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)与蛋白质。ASNA是一种酶(EC 6.3.5.4)，其从天冬氨酸生成天冬酰胺。在具体的实例中，ASNS表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

ASNS序列公开可得。例如，GenBank登记号M27396.1、M27838.1和U38940.1分别公开了示例性的人、仓鼠和小鼠ASNA编码序列。GenBank登记号NM_183356.2也公开了一种示例性的人ASNA编码序列。GenBank登记号AAA52756.1、AAA36977.1和AAH05552.1分别公开了示例性的人、仓鼠和小鼠ASNA蛋白序列。本领域的技术人员将认识到用所公开的方法分析的ASNS核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为ASNS(例如，从天冬氨酸生成天冬酰胺的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

β-肌动蛋白(ACTB)：例如，OMIM 102630。包括哺乳动物(如人)ACTB核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)与蛋白质。ACTB是参与细胞运动、结构和完整性的细胞骨架肌动蛋白的同种型。在具体的实例中，ACTB表达可用作所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似。

ACTB序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_001101.3、NM_031144.3和NM_007393.5分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠ACTB mRNA序列。GenBank登记号NP_001092.1、NP_112406.1和NP_031419.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠ACTB蛋白序列。本领域技术人员将认识到用所公开的方法分析的ACTB核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为ACTB(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)：例如，OMIM 61499。包括哺乳动物(如人)GUSB核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)与蛋白质。GUSB是一种溶酶体酶(EC 3.2.1.31)，其消化糖胺聚糖。在具体的实例中，GUSB表达可用作所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似。

GUSB序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_000181.3、NM_017015.2和NM_010368.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠GUSB mRNA序列。GenBank登记号NP_000172.2、NP_058711.2和NP_034498.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠GUSB蛋白序列。本领域技术人员将认识到用所公开的方法分析的GUSB核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为GUSB(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

β-2-微球蛋白(B2M)：例如，OMIM 109700。包括哺乳动物(如人)B2M核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)与蛋白质。B2M是一种血清蛋白，其被发现与几乎所有具核细胞表面上的主要组织相容性复合体(MHC)I类重链相关。在具体的实例中，B2M表达可作为所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

B2M序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_004048.2、NM_012512.2和NM_009735.3分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠B2M mRNA序列。GenBank登记号NP_004039.1、NP_036644.1和NP_033865.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠B2M蛋白序列。本领域技术人员将认识到用所公开的方法分析的B2M核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为B2M(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

结合或稳定结合：两种物质或分子之间的缔合，如一个核酸分子与另一核酸分子(或其自身)的杂交、抗体与肽的缔合、或者一种蛋白质与另一蛋白质或核酸分子的缔合。如果足够量的寡核苷酸分子形成了碱基对或与其靶核酸分子杂交，则寡核苷酸分子与靶核酸分子结合或稳定结合，以允许检测该结合。“优选结合”表明一种分子以高亲和力与另一分子结合，并且以低亲和力与异源分子结合。

可通过本领域技术人员已知的任意步骤检测结合，如通过靶:寡核苷酸复合体的物理或功能特性。例如，可通过测定结合对生物合成过程(如基因表达、DNA复制、转录、翻译等)是否有可观察的效果来功能性地检测结合。

检测核酸分子的互补链的结合的物理方法包括但不限于如方法DNase I或化学足迹、凝胶移位和亲和力裂解测定、RNA印记、斑点印记和光吸收检测步骤。例如，一种方法涉及当温度缓慢升高时观察含有寡核苷酸(或类似物)和靶核酸的溶液在220至330nm处的光吸收的变化。如果寡核苷酸或类似物已经与其靶结合，则随着寡核苷酸(或类似物)与靶彼此分离或融化，在特征温度的吸收快速增加。在另一实例中，所述方法涉及检测存在于一个或两个核酸分子(或适当的抗体或蛋白质)上的信号，如一个或多个可检测标记物。检测抗体与蛋白质结合的方法是常规的，如蛋白印记。

寡聚物与其靶核苷酸之间的结合经常以50％寡聚物从其靶熔化的温度(T_m)为特征。较高(T_m)意指相对于具有较低(T_m)的复合体的更强或更稳定的复合体。

慢性病毒感染：长持续时间的病毒感染或者长时间段复发。许多HCC病例是继发性慢性肝病毒感染，如慢性肝炎感染，如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HVC)感染。

肝硬化：一种肝慢性进行性疾病，其特征在于以瘢痕组织取代健康细胞。许多HCC病例是继发性肝硬化。肝硬化可由各种因素引起，如酒精中毒(长期饮酒)、暴露于(例如，摄取)黄曲霉毒素(如黄曲霉毒素B1)、或者遗传病症如遗传性血色素沉着病。在某些实例中，使用本文提供的方法分析肝硬化和HCC对象。

临床结果：是指在治疗疾病或病症后或没有治疗的患者的健康状况。临床结果包括但不限于直到死亡的时间长度的增加、直到死亡的时间长度的减少、存活机会的增加、死亡风险的增加、存活、无病存活、慢性病、转移、晚期或侵袭性疾病、疾病复发、死亡以及对疗法(如TACE)的有利或不良应答。

比较基因组杂交(CGH)：一种用于分析细胞如肿瘤细胞的DNA含量的拷贝数变化(增加/损失)的分子-细胞遗传学方法。该方法基于荧光标记的肿瘤DNA(如荧光素-FITC)和正常DNA(如罗丹明或德州红)与正常人中期制剂的杂交。肿瘤与对照DNA的荧光比率的区域差异可使用本领已知的方法如表面荧光显微镜术和定量图像分析检测，并用于鉴定肿瘤细胞基因组中的异常区域。CGH检测到不平衡的染色体变化。未检测到结构染色体畸变，如平衡的相互易位或倒位，因为他们不改变拷贝数。

在一个实例中，CGH包括以下步骤。用不同的可检测标记物如两种不同的荧光基团标记来自肿瘤组织和来自正常对照组织(参考)的DNA。在将肿瘤和参考DNA与未标记的人cot 1 DNA混合以抑制重复DNA序列之后，混合物与正常的中期染色体杂交，或者对于阵列-或基质-CGH，与含有成百或成千的定义的DNA探针的载玻片杂交。使用沿着染色体的(荧光)颜色比率来评价肿瘤样本中的DNA区域的增加或损失。

互补性与百分比互补性：当链通过形成Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogstee碱基对而彼此结合、(杂交)时，具有互补核酸的分子形成稳定的双链体或三链体。当寡核苷酸分子在要求的条件下仍可检测地与靶核酸序列结合时，发生稳定结合。

互补性是指一条核酸链中的碱基与第二条核酸链中的碱基碱基配对的程度。可通过百分比即在两条链之间或两条链的特定区域或结构域内形成碱基对的核苷酸的比例来方便地描述互补性。例如，如果15个核苷酸的寡核苷酸中的10个核苷酸与DNA分子的靶区域形成碱基对，那么寡核苷酸被称为与靶DNA区域有66.67％的互补性。

在本公开中，“充分互补性”意指在寡核苷酸分子与靶核酸序列之间存在足够数目的碱基对以实现可检测的结合。当以形成的碱基对的百分比表示或测量时，满足该目的的百分比互补性的范围为从低至大约50％的互补性到全(100％)互补性。一般地，充分互补性为至少大约50％，例如至少大约75％的互补性、至少大约90％的互补性、至少大约95％的互补性、至少大约98％的互补性，或甚至至少大约100％的互补性。

由Beltz等人(Methods Enzymol.100:266-285,1983)和Sambrook等人(编)(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版,vol.1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)提供了建立结合条件所涉及的定性和定量考虑因素的彻底处理，所述结合条件允许本领域技术人员在所需条件下设计合适的寡核苷酸以供使用。

基本上由……组成：根据本公开的上下文，“基本上由……组成”表明可评价额外的TACE相关基因但不超过10个额外TACE相关基因的表达。在某些实例中，“基本上由…组成”表明评价不超过5个的其他分子，如不超过4个、3个、2个或1个其他分子。在某些实例中，评价少于所引用的分子，但不少于5个、4个、3个、2个或1个更少的分子。在某些实例中，评价一个或多个对照的表达，如管家基因/蛋白质(如ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和/或LDHA)。在本上下文中，“由……组成”表明只评价所陈述的分子的表达；不评价额外分子的表达。

接触：直接物理缔合的放置，既包括固体形式又包括液体形式。使药剂与细胞接触可以通过将药剂添加到分离的细胞中而在体外发生或通过将药剂施用于对象而在体内发生。

对照：“对照”是指用于与实验样本(如得自有HCC的患者的肿瘤样本)进行比较的样本或标准。在某些实施方案中，对照为得自健康患者的样本或得自诊断有HCC的患者的非肿瘤组织样本(如正常的非肿瘤肝样本)。在某些实施方案中，对照为历史对照或标准参考值或值的范围(例如，先前检验的对照样本如一组对于TACE应答或无应答的HCC患者，或者代表基线或正常值的样本组如非肿瘤组织中TACE相关基因表达的水平)。

细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)：例如，OMIM 116940。也称为细胞***周期蛋白2同源物(CDC2)。包括哺乳动物(如人)CDK1核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。CDK1形成磷酸化各种靶底物的复合体，并且这些蛋白质的磷酸化导致细胞周期进程。在具体的实例中，CDK1表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

CDK1序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_001786.4、NM_019296.1和NM_007659.3分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠CDK1编码序列。GenBank登记号NP_001163877.1、NP_062169.1和NP_031685.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠CDK1蛋白序列。本领技术人员将认识到使用所公开的方法分析的CDK1核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为CDK1(例如，磷酸化靶底物的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

降低：减少某物的质量、数量或强度。在一个实例中，例如，与没有疗法的应答相比，疗法可减少肿瘤(如肿瘤的尺寸、肿瘤的体积、肿瘤的数目、肿瘤的转移或其组合)、或者与肿瘤相关的一个或多个症状。在具体的实例中，在疗法后，疗法减少肿瘤的尺寸、肿瘤的体积、肿瘤的数目、肿瘤的转移或其组合，如减少至少10％、至少20％、至少50％或甚至至少90％。这种降低可用本文所公开的方法测量。

脱氧核糖核酸酶I-样3(DNASE1L3)：例如，OMIM 602244。DNAse家族的成员。包括哺乳动物(如人)DNASE1L3核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。DNASE1L3水解DNA，并在细胞凋亡期间介导DNA的分解。在具体的实例中，DNASE1L3表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

DNASE1L3序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_004944.3、NM_053907.1和NM_007870.3分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠DNASE1L3 mRNA序列。GenBank登记号NM_001256560还公开了示例性人mRNA序列。GenBank登记号AH15831.1、EDL94170.1和EDL20577.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠DNASE1L蛋白序列。本领技术人员将认识到使用所公开的方法分析的DNASE1L3核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为DNASE1L3(例如，水解DNA的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

检测或测量表达：通过对核酸分子(例如，在基因组或mRNA水平)或蛋白质的检测以定性或定量的方式测定表达水平。示例性方法包括微阵列分析、PCR(如RT-PCR)，RNA印记、蛋白印记、ELISA和质谱分析。在一个实例中，使用方法。

诊断：通过其标志、症状和各种检验的结果鉴定疾病的过程。通过该过程达到的结论也称为“诊断”。通常所进行的测试的形式包括血液检验、医学成像和活检。

差异表达或改变的表达：一种在将基因(如TACE相关基因)中编码的信息转化为信使RNA、将mRNA转化为蛋白质或以上两者中的差异，如增加或降低。在某些实例中，该差异相对于对照或参考值(或值的范围)，例如一组对象如对TACE不应答的HCC的平均表达值。该差异可相对于来自相同对象或健康对象的非肿瘤组织。检测的差异表达可包括测量基因或蛋白表达的变化，如一个或多个TACE相关基因的表达的变化，如增加至少20％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％，或者降低至少20％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％。

下调或降低：当用于关于核酸分子的表达时，是指导致基因产物产生降低的任意过程。基因产物可以是RNA(如微小RNA、mRNA、rRNA、rRNA和结构RNA)或者蛋白质。因此，基因下调或失活包括降低基因转录或mRNA翻译的过程。

降低转录的过程的实例包括有利于降解转录起始复合体的那些过程，降低转录起始率的那些过程、降低转录延伸率的那些过程、降低转录持续合成能力的那些过程和增加转录抑制的那些过程。基因下调可包括将表达减少到现有水平之上。降低翻译的过程的实例包括降低翻译起始的那些过程、降低翻译延伸的那些过程和降低mRNA稳定性的那些过程。

基因下调包括基因产物产生中的任何可检测的降低。在某些实例中，与对照(如正常细胞中或与参考值相比的基因表达量)相比，基因产物的产生降低至少2倍，例如，至少3倍或至少4倍。

延伸因子1-α1(EEF1A1)：例如，OMIM 130590。包括哺乳动物(如人)EEF1A1核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。EEF1A1是延伸因子1复合体的α亚基的同种型，其负责将氨基酰基tRNA酶促递送至核糖体。在具体的实例中，EEF1A1表达可用作所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似。

EEF1A1序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_001402.5、NM_175838.1和NM_010106.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠EEF1A1mRNA序列。GenBank登记号NP_001393.1、NP_787032.1和NP_034236.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠EEF1A1蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的EEF1A1核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为EEF1A1(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤与非肿瘤组织中相似)。

表达：将基因的编码信息转化为细胞的可操作、不可操作或结构部分的过程，如蛋白质的合成。基因表达可受外部信号的影响。例如，细胞暴露于激素中可刺激激素诱导基因的表达。不同类型的基因可对相同信号做出不同的应答。也可在从DNA至RNA至蛋白质的途径中的任何位置调节基因的表达。调节可包括对中间分子如mRNA的转录、翻译、RNA运输和加工、降解的控制，或者在特定蛋白分子产生后对其通过活化、失活、区室作用或降解的控制。在一个实例中，可监控基因表达以诊断和/或预测有HCC的对象，如预测对象对TACE应答的能力。

相对于正常(野生型)的核酸分子，可改变核酸分子的表达。基因表达的改变如差异表达包括但不限于(1)过表达；(2)低表达(underexpression)；或(3)抑制表达。核酸分子表达的改变与相应蛋白质表达的变化有关，并且事实上引起相应蛋白质表达的变化。

还可以某些方式改变蛋白质表达以使其与正常(野生型)情形的蛋白质表达不同。这包括但非必要地限制于：(1)蛋白质突变，以使一个或多个氨基酸残基不同；(2)蛋白质的序列中短缺失或添加一个或少数(如不超过10-20个)氨基酸残基；(3)较长缺失或添加氨基酸残基(如至少20个残基)，使得去除或添加整个蛋白质结构域或亚结构域；(4)与对照或标准量相比，表达增加量的蛋白质；(5)与对照或标准量相比，表达降低量的蛋白质；(6)改变蛋白质的亚细胞定位和靶向；(7)改变蛋白质的时间调节表达(使得蛋白质在其非正常时被表达，或者在其正常时不被表达)；(8)通过增加蛋白质保持定位在细胞中的持续时间使蛋白质的稳定性改变；以及(9)各自与对照或标准相比，改变蛋白质的定位(如特定的器官或组织或亚细胞定位)表达(使得蛋白质在其正常表达处不被表达或者在其不正常表达处被表达)。对于差异表达的测定，用于与样本比较的对照或标准包括被认为是正常的样本(即它们不会改变所期望的特征，例如来自没有癌症如HCC的对象的样本)以及实验值(例如，值的范围)，尽管可能是任意设置的，但仍要记住在实验室与实验室之间这样的值可变化。

可基于已知的或已测定的群体值来设置实验室标准和值，并且可以允许对测量的实验上测定的值进行比较的图或表格的形式来提供。

F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)：例如，OMIM 605655。包括哺乳动物(如人)FBXL5核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。FBXL5为一种铁感应器，其促进铁应答性元件结合蛋白的泛素化和降解。在具体的实例中，FBXL5表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

FBXL5序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_012161.3、NM_001193534.1和NM_001159963.1分别公开了示例性的人同种型1、人同种型3、大鼠和小鼠FBXL5 mRNA序列。GenBank登记号NP_036293.1、NP_001180463.1、NP_001100692.1和AAH47214.1分别公开了示例性的人同种型1、人同种型3、大鼠和小鼠FBXL5蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的FBXL5核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为FBXL5(例如，作为铁感应器发挥功能的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

铁蛋白轻链(FTL)：例如，OMIM 134790。包括哺乳动物(如人)FTL核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。FTL为铁蛋白质的轻亚基。铁蛋白为主要的细胞内铁存储蛋白质。在具体的实例中，FTL表达可用作所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤组织和非肿瘤组织中相似。

FTL序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_000146.3、J02741.1和J04716.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠FTL mRNA序列。GenBank登记号NP_000137.2、AAA41155.1和AAA37614.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠FTL蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的FTL核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为FTL(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

GABA(A)受体相关蛋白样3，假基因(GABARAPL3)：例如，NCBI Gene ID 23766。包括哺乳动物(如人)GABARAPL3核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)。GABARAPL3是一种非编码RNA。在具体的实例中，GABARAPL3表达和其他14个表3中的基因与HCC对TACE的应答性相关。

GABARAPL3序列公开可得，例如，GenBank登记号NR_028287.1公开了示例性人GABARAPL3 RNA序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的GABARAPL3核酸分子可与公开可得的那些不同，但仍为GABARAPL3(例如，其表达和其他14个表3中的基因与HCC对TACE的应答性相关)。

基因表达谱(或指纹)：可通过基因表达(如cDNA或mRNA)的可检测量的变化或者通过由那些基因表达的蛋白质的可检测量的变化来检测差异性或改变的基因表达。一种不同的或可鉴定的基因表达模式，例如，一组定义的基因或基因指示性核酸如EST的高和/或低表达的模式；在某些实例中，是表3中的TACE谱(但在某些实例中不包括GABARAPL3)。基因表达谱(也称为指纹)可与组织或细胞类型(如HCC)联合以应答疗法(如TACE)，或应答任意其他不同或可鉴定的影响基因表达的情况。基因表达谱可包括特定基因的相对以及绝对表达水平，并且与基线或对照样本谱(如来自没有HCC对象的样本)相比，其可在测试样本的背景下进行观察。在一个实例中，在阵列(如核酸或蛋白质阵列)上读取对象中的基因表达谱。

肝细胞癌(HCC)：HCC是一种肝原发性恶性肿瘤，在某些情况下，其发生在具有因病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化(通常由酒精中毒引起)导致的炎症性肝的患者中。HCC的示例性疗法包括但不限于手术、经动脉化疗栓塞(TACE)、消融疗法(包括热消融和冷冻消融二者)、放射性栓塞和经皮醇注射中的一种或多种。

线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)：例如，OMIM 138150。包括哺乳动物(如人)GOT2核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。GOT2(EC 2.6.1.1)是一种参与苹果酸-天冬氨酸穿梭的吡哆醛磷酸盐依赖性酶，所述苹果酸-天冬氨酸穿梭是从细胞质基质到线粒体的路径。GOT2可对细胞增殖如肿瘤生长起作用。在具体的实例中，GOT2表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

GOT2序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_002080.3、NM_001286220.1、NM_174806.2和NM_010325.2公开了示例性的人同种型1、人同种型2、牛和小鼠GOT2 mRNA序列。GenBank登记号NP_002071.2、NP_001273149.1、NP_777231.1和NP_034455.1分别公开了示例性人同种型1、人同种型3、大鼠和小鼠GOT2蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的GOT2核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为GOT2(例如，参与苹果酸-天冬氨酸穿梭的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)：例如，OMIM 604296。包括哺乳动物(如人)GRHPR核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。GRHPR(EC 1.1.1.79)是一种具有羟基丙酮酸还原酶、乙醛酸还原酶和D-甘油酸脱氢酶酶促活性的酶。在具体的实例中，GRHPR表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

GRHPR序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_012203.1、NM_001113754.1和AY113690.1公开了示例性的人、大鼠和小鼠GRHPR mRNA序列。GenBank登记号No.NP_036335.1、AAI58681.1和NP_525028.1分别公开了示例性人、大鼠和小鼠GRHPR蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的GRHPR核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为GRHPR(例如，具有羟基丙酮酸还原酶、乙醛酸还原酶和D-甘油酸脱氢酶酶促活性，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

杂交：在DNA、RNA的两条链的互补区域之间或者DNA与RNA之间形成碱基对，从而形成双链体分子。导致特定的严格程度的杂交条件将根据杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲剂的离子强度(如Na+浓度)将确定杂交的严格性。Sambrook等人的(1989)Molecular Cloning，第二版,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY(第9和11章)中讨论了针对获得特定严格程度的杂交条件的计算。以下是一组示例性杂交条件但不是限制性的：

·非常高的严格性(检测具有至少90％相同性的序列)

杂交：5xSSC，65℃，16小时

洗涤两次：2x SSC，室温(RT)，每次15分钟

洗涤两次：0.5x SSC，65℃，每次20分钟

高严格性(检测具有至少80％相同性的序列)

杂交：5x-6x SSC，65℃-70℃，16-20小时

洗涤两次：2x SSC，室温，每次5-20分钟

洗涤两次：1x SSC，55℃-70℃下，每次30分钟

低严格性(检测具有至少60％相同性的序列)

杂交：6x SSC，室温至55℃，16-20小时

洗涤至少两次：2x-3x SSC，室温至55℃，每次20-30分钟

分离的：一种已基本上与有机体的细胞中的其他生物成分或有机体本身分开或纯化的分离的生物成分(如核酸分子、蛋白质或细胞，其中所述成分是天然存在的)，如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞。已被“分离的”核酸分子和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中的重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)：例如，OMIM 600709。包括哺乳动物(如人)IARS核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。IARS(EC6.1.1.5)是一种通过其同源氨基酸催化tRNA的氨酰化的酶。在具体的实例中，IARS表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

IARS序列公开可得。例如，GenBank登记号U04953.1、NM_001100572.1和NM_172015.3分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠IARS编码序列。GenBank登记号NM_002161.3还编码示例性人编码序列。GenBank登记号AAA80153.1、NP_001094042.1和NP_742012.2分别公开了示例性人、大鼠和小鼠IARS蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的IARS核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为IARS(例如，通过其同源氨基酸催化tRNA的氨酰化的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

标记物：一种能够检测的试剂，例如通过ELISA、分光光度法、流式细胞术或显微镜检查。例如，标记物可连接(如共价连接)至核酸分子(如核酸探针)或蛋白质，从而允许检测核酸分子或蛋白质。标记物的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。例如，在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中讨论了标记方法和用于各种目的的适当标记物的选择的指导。在具体的实例中，标记物与特异性结合一个或多个TACE相关分子的结合试剂缀合。

乳酸脱氢酶A(LDHA)：例如，OMIM 150000。包括哺乳动物(如人)LDHA核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。LDHA是一种酶(EC 1.1.1.27)，其催化丙酮酸与L-乳酸的相互转化并伴随NADH与NAD+的相互转化。在具体的实例中，LDHA表达可用作所公开方法的对照，例如作为具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似。

LDHA序列公开可得。例如，GenBank登记号AY581313.1、NM_001135239.1、NM_012595.2和M17516.1分别公开了示例性的人、人、大鼠和小鼠LDHA mRNA序列。GenBank登记号NM_001165414.1还公开了示例性人编码序列。GenBank登记号NP_001128711.1、AAH67223.1、AAI68737.1和NP_001129541.2分别公开了示例性人同种型2、人、大鼠和小鼠LDHA蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的LDHA核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为LDHA(例如，具有高表达的管家基因，所述高表达在HCC肿瘤和非肿瘤组织中相似)。

可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)：例如，OMIM 153619。也被称为半乳糖凝集素-3。包括哺乳动物(如人)LGALS3核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。LGALS3是一种与β-半乳糖苷结合的凝集素，其在细胞-细胞黏着、细胞-基质相互作用、巨噬细胞活化、血管生成、转移和凋亡中起作用。在具体的实例中，LGALS3表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

LGALS3序列公开可得。例如，GenBank登记号CR542097.1、NM_031832.1和NM_001145953.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠LGALS3编码序列。GenBank登记号No.NM_001177388.1还公开了示例性人编码序列。GenBank登记号CAG33178.1、NP_114020.1和NP_001139425.1分别公开了示例性人、大鼠和小鼠LGALS3蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的LGALS3核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为LGALS3(例如，与β-半乳糖苷结合的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

脂肪瘤HMGIG融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)：例如，OMIM 609718。包括哺乳动物(如人)LHFPL2核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。LHFPL2是四分子交联体(tetraspan)跨膜蛋白编码基因的超家族中的成员。在具体的实例中，LHFPL2表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE应答性相关。

LHFPL2序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_005779.2、NM_001106402.1和NM_172589.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠LHFPL2编码序列。GenBank登记号NP_005770.1、NP_001099872.1和NP_766177.1分别公开了示例性人、大鼠和小鼠LHFPL2蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的LHFPL2核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为LHFPL2(例如，作为跨膜蛋白发挥功能的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

恶性的：具有退行发育、侵入和转移特性的细胞。

哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物二者。哺乳动物的实例包括但不限于人、猪、牛、山羊、猫、狗、兔和小鼠。

乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)：例如，OMIM 602281。也称为乳黏着蛋白。包括哺乳动物(如人)MFGE8核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。MFGE8可作为细胞黏着蛋白发挥功能以将平滑肌连接至动脉中的弹性纤维。在具体的实例中，MFGE8表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

MFGE8序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_005928.3、NM_001114614.2、NM_001040186.2和NM_001045489.1分别公开了示例性的人转录物1、人转录物2、大鼠和小鼠MFGE8编码序列。GenBank登记号AAH03610.1,P70490.1和NP_001038954.1分别公开了示例性人、大鼠和小鼠MFGE8蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的MFGE8核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为MFGE8(例如，作为细胞黏着蛋白发挥功能的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

核酸阵列：核酸(如DNA或RNA)在基质上的分配位置中的排列，如在cDNA阵列、mRNA阵列或寡核苷酸阵列中发现的。在某些实例中，核酸分子共价连接至所述阵列。

寡核苷酸：由天然磷酸二酯键连接的多个连接的核苷酸，例如，长度为大约6个至大约300个核苷酸之间。寡核苷酸类似物是指与寡核苷酸功能相似但具有非天然存在的部分的部分，例如，寡核苷酸类似物可含有非天然存在的部分，如改变的糖部分或糖间连接物，如硫代磷酸寡脱氧核苷酸。

特定的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可包括长度至多大约200个核苷酸的线性序列，例如，一序列(如DNA或RNA)，其至少为6个核苷酸，例如至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少100个或者甚至至少200个核苷酸长，或者大约6个至大约50个核苷酸，例如大约10-25个核苷酸，如12个、15个或20个核苷酸。在一个实例中，寡核苷酸是所公开的TACE相关基因(如ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS,LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB)中的至少一个或图8A所示的管家基因之一的核苷酸短序列。

寡核苷酸探针：一条核苷酸序列，如长度为至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个或者至少55个核苷酸，用于通过分子杂交检测互补序列的存在。在具体的实例中，寡核苷酸探针包括一个或多个标记物，该标记物允许检测寡核苷酸探针：靶序列杂交复合体。在一个实例中，寡核苷酸探针用于检测所公开的TACE相关基因(如ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和/或UBB)以及图8A所示的管家基因的存在。

磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)：例如，OMIM 604591。包括哺乳动物(如人)PEBP1核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。PEBP1编码蛋白质的磷脂酰乙醇胺结合家族的成员并已显示出调节多个信号转导途径，包括MAP激酶(MAPK)、NF-κB和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)信号转导途径。在具体的实例中，PEBP1表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

PEBP1序列公开可得。例如，GenBank登记号NM_002567.3、NM_017236.1和NM_018858.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠PEBP1编码序列。GenBank登记号NP_002558.1、P31044.3和NP_061346.2分别公开了示例性人、大鼠和小鼠PEBP1蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的PEBP1核酸和蛋白质分子可与公开可得的那些不同，但仍为PEBP1(例如，调节MAPK、NF-κB和/或GSK-3信号传导途径的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

聚合酶链反应(PCR)：一种体外扩增技术，其增加核酸分子(例如，样本或标本中的核酸分子)的拷贝数。在一个实例中，收集自对象的生物样本在允许将引物与样本中的核酸模板杂交的条件下与一对寡核苷酸引物接触。引物在合适的条件下延伸，与模板分离，然后重退火、延伸和分离以扩增核酸的拷贝数。PCR产物可使用标准技术或本领域已知的其他标准技术通过电泳、限制性内切酶剪切模式、寡核苷酸杂交或连接和/或核酸测序来表征。

引物：短的核酸分子，例如，长度为10-100个核苷酸如长度为大约15个、20个、25个、30个或50个核苷酸的DNA寡核苷酸。引物可通过核酸杂交退火至互补靶DNA链以在引物与靶DNA链之间形成杂交物。引物对可用于扩增核酸序列，例如通过PCR或本领域已知的其他核酸扩增方法。

例如，在Sambrook等(In Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSHL,NewYork,1989)、Ausubel等(编辑)(In Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New York,1998)和Innis等(PCR Protocols,A Guide to Methods andApplications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1990)中描述了制备和使用核酸引物的方法。例如，通过使用意在该目的的计算机程序如Primer(版本0.5,1991,WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,MA)从已知的序列中衍生出PCR引物对。本领域普通技术人员将认识到特定引物的特异性随其长度增加。因此，为了获得更好的特异性，引物可选择包括至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个连续核苷酸的靶核酸序列(如TACE相关分子)。

预后：预测病程，如HCC。预测可包括确定对象发展成侵袭性、复发的疾病以存活特定时间量的可能性(例如，确定对象将存活1年、2年、3年或5年的可能性)，以应答特定的疗法(例如TACE)，或其组合。

纯化的：术语“纯化的”并不要求绝对的纯；相反，它意为相对的术语。因此，例如，纯化的蛋白制剂是其中所指的蛋白质比细胞内天然环境中的蛋白质更纯的蛋白质制剂。例如，纯化蛋白质制剂以使该蛋白质代表所述制剂的总蛋白质含量的至少50％。类似的，纯化的mRNA制剂为其中的mRNA比包含核酸分子的复合混合物的环境中的mRNA更纯的mRNA制剂。

样本(或生物样本)：一种得自对象的含有基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物标本。实例包括但不限于外周血、尿液、唾液、组织活检、细针抽吸物、穿孔活检手术标本和尸检材料。在一个实例中，样本包括HCC活检。

序列相同性/相似性：按照序列之间的相同性或相似性来表达两个或多个核酸序列或者两个或多个氨基酸序列之间的相同性/相似性。可按照百分比相同性测量序列相同性；百分比越高，序列越相同。可按照百分比相似性测量序列相似性(其考虑到保守氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。

用于比较的序列比对方法是本领域已知的。以下文献描述了各种程序和比对算法：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.In the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson等人,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994.Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-10,1990，给出了序列比对方法的详细考虑。

NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可从多个来源获得，包括National Center for Biological Information(NCBI,National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,MD 20894)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、

tblastn和tblastx联合。也可在NCBI网站找到额外的信息。

BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。如果两个比较的序列具有同源性，那么指定的输出文件将呈现那些同源性区域为比对的序列。如果两个比较的序列不具有同源性，那么指定的输出文件将不呈现比对的序列。

一旦比对，通过对两条序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目计数来确定匹配数。百分比序列相同性是通过以下确定的：将匹配数除以所鉴定序列中所示序列的长度或者除以分节的长度(如来自所鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后再将所得的值乘以100。例如，具有1166个匹配的核酸序列在与具有1554个核苷酸的测试序列比对时，其与该测试序列具有75.0％的相同性(1166÷1554*100＝75.0)。百分比序列相同性值四舍五入到最近的十分位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入到75.2。长度值将始终是整数。在另一实例中，与来自以下所鉴定序列的20个连续核苷酸比对的含有20-核苷酸区域的靶序列含有与所鉴定序列具有75％的序列相同性的区域(即，15÷20*100＝75)。

对于大于大约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，可以利用使用设置在默认参数(缺口存在代价11，每残基缺口代价1)的默认BLOSUM62矩阵的Blast 2序列功能。用blastn程序搜索的查询用DUST过滤(Hancock and Armstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其他程序可使用SEG。此外，可进行人工比对。具有甚至更大相似性的蛋白质在通过该方法进行评估时会显示出增加的百分比相同性。因此，在某些实例中，与天然ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB或LDHA蛋白序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性但仍保留蛋白生物功能的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB或LDHA蛋白的表达可使用所公开的方法检查。

两个核酸分子密切相关的一个指示是这两个分子在如上所述的严格条件下彼此杂交。然而，由于遗传密码的简并性，未显示高度相同性的核酸序列可编码相同或相似(保守)的氨基酸序列。使用该简并性使核酸序列变化以产生多个核酸分子，所有所述核酸分子基本上编码相同的蛋白质。两个核酸序列是基本上相同的另一(并且不必要累积)指示为第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽是免疫交叉反应的。因此，在某些实例中，与天然ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB或LDHA核酸(如mRNA、cDNA或基因)序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％序列相同性的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB或LDHA的表达可使用所公开的方法检查。本领域技术人员将认识到提供的特定序列相同性范围仅用于指导。

特异性结合剂：一种基本上或优选地仅与所定义的靶如蛋白质、酶、多糖、寡核苷酸、DNA、RNA、重组载体或小分子结合的试剂。在实例中，“特异性结合剂”能够与ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的至少一种结合。

因此，核酸-特异性结合剂基本上仅与所定义的核酸如mRNA或基因序列结合，或者与核酸内的特异性区域结合。蛋白-特异性结合剂基本上仅与所定义的蛋白质结合，或者与蛋白质内的特异性区域结合。例如，“特异性结合剂”包括抗体和基本上与特定的多肽结合的其他试剂。抗体包括对多肽有特异性的单克隆或多克隆抗体，及其免疫学上有效的部分(“片段”)。使用常规程序可容易地测定特定试剂基本上仅与特异性靶结合。示例性合适的体外测定法包括蛋白印记和核酸杂交程序。

对象：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的一类。在一个实例中，对象有HCC。

靶序列：一条位于人基因组中特定区域的核苷酸序列，其对应于所期望的序列，如TACE相关基因，例如ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10或UBB。靶序列可编码靶蛋白，或者可是非编码RNA。例如，靶可以是编码序列；它也可以是对应于编码序列的非编码链。靶序列的实例包括与HCC对TACE的应答性相关的那些。

治疗有效量：单独或与额外的治疗剂(例如，化疗剂)一起的组合物的量，其诱导所期望的应答(例如，***)。以治疗有效量施用本文所公开的制剂。在一个实例中，所期望的应答为减少施用疗法的对象的肿瘤的尺寸或体积或转移。为使所述组合物有效，肿瘤或其转移不需要完全被消除。例如，与没有疗法的肿瘤的尺寸或体积或转移相比，组合物可将肿瘤的尺寸或体积或者肿瘤的转移减少至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少100％(消除肿瘤)。

在具体的实例中，它是有效减少肿瘤细胞数目(例如有HCC患者中肿瘤细胞的数目)的治疗剂的量。为使组合物有效，肿瘤细胞不需要被完全消除。例如，与没有组合物的肿瘤细胞的数目相比，组合物可将肿瘤细胞的数目减少所期望的量，例如减少至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少100％(可检测的肿瘤消除)。

在疗程期间，可将治疗有效量的治疗剂以单剂量或以若干剂量施用，例如每天。然而，治疗有效量取决于正在被治疗的对象、正在被治疗的病症的严重性和类型、施用的方式与正在施用的治疗剂的类型。

组织：多个功能上相关的细胞。组织可以是悬浮液、半固体或固体。组织包括收集自对象如来自肝的细胞。

经动脉导管化疗栓塞(TACE)：用于***如HCC的方法，例如通过限制肿瘤的血液供给。在该治疗中，可将包覆有化疗剂的小栓塞颗粒选择性地注射至供给肿瘤的动脉(如肝动脉)中。在某些实例中，该方法要求施用较高化疗剂量。此类颗粒和可使用的化疗剂的实例包括但不限于聚乙烯醇微球(例如，装载有多柔比星(doxorubicin))、高吸水聚合物微球(例如，装载有多柔比星)和凝胶微球(例如，装载有顺铂)。可在Van Ha(Semin InterventRadiol.2009 Sep；26(3):270–275)中找到额外的信息。在某些实例中，TACE使用顺铂、阿霉素、丝裂霉素和多柔比星中的一种或多种。在一个实例中，TACE使用顺铂、阿霉素和丝裂霉素(CAM)。

TACE相关分子：如本文所使用，“TACE相关分子”是一种基因或蛋白质，其表达或活性在对TACE疗法应答的HCC肿瘤中相对于对照或参考标准(如对TACE疗法无应答的HCC肿瘤)改变。在本公开的上下文中，TACE相关分子包括以下且在某些实例中基本上由以下组成或由以下组成：ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB基因或者由这些基因编码的蛋白质。在某些实例中，TACE相关分子包括以下且在某些实例中基本上由以下组成或由以下组成：ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB基因或者由这些基因编码的蛋白质。因而，“TACE相关基因”是指ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)，且“TACE相关蛋白”是指由ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)编码的蛋白质。

治疗疾病：“治疗”是指一种治疗性干预，其改善疾病或病理病况的迹象或症状，如HCC的迹象或症状。治疗还可诱导病况如HCC的缓解或治愈。治疗疾病并不要求完全没有疾病。例如，肿瘤尺寸和/或体积的减小，和/或转移的数目、转移的尺寸和/或体积的减少，如减少至少20％、至少50％、至少75％或者至少90％可足够。在某些实例中，治疗疾病可提高HCC患者的预后，例如，通过增加HCC患者的预测的存活时间。

肿瘤：所有瘤细胞生长与增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有的癌前细胞和癌细胞与组织。在实例中，肿瘤是HCC肿瘤。

肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)：例如，OMIM 603598。也称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。包括哺乳动物(如人)TNFSF10核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。TNFSF10为诱导细胞凋亡的细胞因子。在具体的实例中，TNFSF10表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

TNFSF10序列公开可得。例如，GenBank登记号CR456895.1、NM_145681.2和NM_009425.2分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠TNFSF10编码序列。GenBank登记号NM_003810.2还公开了示例性人编码序列。GenBank登记号CAG33176.1、NP_663714.2和NP_033451.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠TNFSF10蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的TNFSF10核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为TNFSF10(例如，诱导细胞凋亡的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

泛素B(UBB)：例如，OMIM 191339。包括哺乳动物(如人)UBB核酸分子(例如，基因、cDNA和mRNA)和蛋白质。需要UBB用于具有快速转换(turnover)的异常蛋白质和正常蛋白质的ATP依赖性、非溶酶体细胞内蛋白质降解。在具体的实例中，UBB表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关。

UBB序列公开可得。例如，GenBank登记号BC038999.1、BC060312.1和BC100341.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠UBB0编码序列。GenBank登记号NM_018955.2还公开了示例性人编码序列。GenBank登记号AAH38999.1、AAH60312.1和AAI00342.1分别公开了示例性的人、大鼠和小鼠UBB蛋白序列。本领域技术人员将认识到使用所公开的方法分析的UBB核酸和蛋白分子可与公开可得的那些不同，但仍为UBB(例如，降解蛋白质的能力，并且其表达和其他14个表3中的基因(但在一些实例中不包括GABARAPL3)与HCC对TACE的应答性相关)。

在足以…的条件下：一个用于描述允许所期望活性的任何环境的短语。在一个实例中，包括向有HCC对象施用足以允许所期望活性的一种或多种化疗剂，如治疗HCC。

上调的、活化的或增加的：当用于引用核酸分子如基因的表达时，指使基因产物的产生增加的任意过程。基因产物可以是RNA(如mRNA、rRNA、tRNA和结构RNA)或蛋白质。因此，基因上调或活化包括增加基因的转录或者mRNA的翻译的过程。

增加转录的过程的实例包括有利于形成转录起始复合体的那些过程、增加转录起始率的那些过程、增加转录延伸率的那些过程和缓解转录抑制(例如，通过阻断转录阻遏物的结合)的那些过程。基因上调可包括抑制阻遏以及刺激表达至现有水平之上。增加翻译的过程的实例包括增加翻译起始的那些过程、增加翻译延伸的那些过程和增加mRNA稳定性的那些过程。

基因上调包括可检测地增加基因产物的产生。在某些实例中，与对照(如正常细胞中基因表达的量)相比，基因产物的产生增加至少2倍，例如至少3倍或至少4倍。在一个实例中，对照是生物样本中如得自未患HCC的对象的肝组织活检中基因表达的相对量。

III.概述

本公开提供了第一独特遗传标记模块，其预测患有肝细胞癌(HCC)的患者对经动脉导管化疗栓塞(TACE)治疗的应答。

本文公开了检测多个基因的表达的方法，例如，其表明肝细胞癌(HCC)是否将对经动脉化疗栓塞(TACE)应答。在某些实施方式中，该方法包括或由以下组成：检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)相对于对照的表达。在某些实例中，对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)相对于对照的表达的调节(增加或降低)表明HCC将对TACE应答。在具体的非限制性实例中，相对于对照，ASNS、CDKl、FBXL5、IARS、LGALS3、LHFPL2、MKI67和UBB的表达增加以及DNASE1L3、GOT2、GRHPR、MFGE8、PEBP1和TNFSF10(并且任选地GABARAPL3)的表达降低表明HCC将对TACE应答。

在某些实例中，提供了方法，所述方法包括：检测或测量样本中ASNS、CDKl、FBXL5、IARS、LGALS3、LHFPL2、MKI67和UBB相对于对照的增加的表达；检测或测量DNASE1L3、GOT2、GRHPR、MFGE8、PEBP1和TNFSF10(并且任选地GABARAPL3)相对于对照的降低的表达；以及将TACE治疗施用于获得样本的对象，并且在某些实例中还包括可手术去除对象中全部或部分HCC。

任意所公开的方法还可包括测量或测定试验对象的血液中的AFP浓度(例如，对象是否是AFP阳性或阴性)。

在所公开方法的某些实例中，相对于对照，表达的调节(增加或降低)为至少大约1.5倍、至少大约2倍、至少大约2.5倍、至少大约3倍、至少大约4倍或者至少大约5倍。

在某些实施方案中，该方法还包括检测至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个(如大约1至大约10个，或大约1至大约6个)管家基因或蛋白质的表达。在某些实例中，管家基因或蛋白质包括ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的1个、2个、3个、4个、5个或者6个。

在所述方法的某些实施方案中，对照为参考值或非肿瘤组织样本。在某些实例中，非肿瘤组织样本为来自有HCC对象的非肿瘤肝组织或来自健康对象的肝组织。

在某些实施方案中，诊断有HCC的对象有慢性病毒感染。在某些实施方案中，诊断有HCC的对象有肝硬化。

在所公开方法的某些实施方案中，检测基因表达包括使用显微镜装置检测ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB的mRNA水平。在某些实例中，检测基因表达还包括使用显微镜装置检测GABARAPL3的水平。

在某些实施方案中，该方法还包括将基因表达值转换为z分数。在某些实例中，该方法还包括应用预后指数方程以预测HCC是否对TACE应答(参见图3A与实施例1和2)。

本文还公开了探针组。在某些实施方案中，探针组包括至少一个对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针。在某些实例中，探针组还包括一个或多个对GABARAPL3有特异性的核酸探针。在某些实例中，探针组还包括对至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或者10个(如大约1至大约10个或大约1至大约6个)管家基因有特异性的核酸探针。在特定的非限制性实例中，管家基因包括ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的1个、2个、3个、4个、5个或6个。在一个特定的实例中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针。在另一特定的实例中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针。

在某些实施方案中，核酸探针包含捕获探针和报告探针，其中报告探针包含一个或多个可检测标记物。在某些实例中，捕获探针包括允许固定靶：探针复合体的分子。在某些实例中，核酸探针的长度为至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55或至少60个核苷酸。在特定的非限制性实例中，探针的长度为大约20个至大约60个、大约30个至大约55个或者大约40个至大约50个核苷酸。在具体的实例中，捕获探针和报告探针的长度各自为大约50个核苷酸。在特定的非限制性实例中，捕获探针和报告探针各自杂交至如本文SEQID NO:1-21中任意一个所示的靶序列的一部分。

本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所公开的探针组，如包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针的探针组；对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针的探针组；或者对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针的探针组。在某些实例中，试剂盒还包括缓冲剂，如杂交缓冲剂。在某些实例中，试剂盒还包括用于进行PCR的试剂，如聚合酶、dNTP和/或MgCl2。

本公开还提供了一种用于进行TACE Navigator基因标记测定的装置。在某些实施方案中，该装置包括本文公开的探针组，如包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针的探针组；对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针的探针组；或者对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针的探针组。

本文还提供了通过使用本文公开的探针组检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于对照的表达来检测表明HCC是否将对TACE应答的多个基因的表达的方法。在某些实施方案中，该方法还包括使用本文公开的探针组检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中GABARAPL3相对于对照的表达。

本文还提供了一种治疗对象中肝细胞癌(HCC)的方法。在某些实施方案中，该方法包括通过检测对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于对照的表达的调节(增加或降低)测定HCC将对经动脉栓赛化疗(TACE)应答；和将TACE施用于对象。在某些实例中，该方法还包括检测对GABARAPL3相对于对照的表达的调节(增加或降低)。在某些实例中，对象还接受一个或多个额外的疗法和/或手术。在某些实例中，通过对对象治疗的同一方进行TACE应答基因的表达的调节的测定。在其他实例中，通过第三方如临床实验室进行TACE应答基因的表达的调节的检测。

在本文所公开的方法的某些实施方案中，TACE包括顺铂、阿霉素、丝裂霉素和多比柔星中的一个或多个。

IV.TACE基因标记

本文公开了鉴定用于预测HCC对TACE应答性的基因标记。14-基因标记包括ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB。对TACE应答和不应答的对象中的基因表达的相关性分析导致鉴定14-基因标记。在某些实例中，基因标记为还包括GABARAPL3的15-基因标记。

因此，本文提供了一种方法，其可用于预测诊断有HCC的对象是否将对TACE应答；用于治疗诊断有HCC的对象(例如，用TACE、手术或二者)；或用于其组合。该方法包括检测TACE相关基因ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和/或UBB(并且任选地GABARAPL3)的表达，和将肿瘤样本中的TACE相关基因的表达与对照比较。在一个实例中，该方法包括检测得自对象的肿瘤样本中多个HCC相关基因的表达，其中所述多个TACE相关基因基本上由以下组成或由以下组成：ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB。在另一个实例中，所述多个TACE相关基因基本上由以下组成或由以下组成：ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB。在某些实例中，还检测管家基因表达，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或者10个管家基因(如ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的1个、2个、3个、4个、5个或6个)。

在该方法的某些实施方案中，对肿瘤样本中的14个TACE相关基因相对于对照的表达的调节表明肿瘤将有可能对TACE应答。在具体的非限制性实例中，ASNS、CDKl、FBXL5、IARS、LGALS3、LHFPL2、MKI67和UBB相对于对照的表达增加和DNASE1L3、GOT2、GRHPR、MFGE8、PEBP1和TNFSF10(并且任选地GABARAPL3)相对于对照的表达降低表明肿瘤将对TACE应答。因此，在某些实例中，例如，单独地用TACE治疗或者与手术结合治疗检测到此种表达的对象。

在某些实施方案中，该方法还包括将基因表达值转换至z分数。在某些实例中，该方法还包括应用预后指数方程来预测HCC是否将对TACE应答(参见图3A与实例1和2)。

可使用本领域已知的任意合适的手段检测TACE相关基因(和管家基因)的表达。例如，可使用RT-PCR、阵列或分析完成基因表达的检测。检测基因表达的额外的方法在本领域中是已知的，并且在下文对其进行了更详细的描述。

TACE相关基因的改变的表达可以是任意可测量地增加或降低表达，其与对TACE的可能的应答性有关。在某些实施方案中，表达增加或降低大约1.5倍、大约2倍、大约2.5倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约7倍或者大约10倍。TACE相关基因之间的表达水平的相对增加或降低可在肿瘤内变化并且也可在肿瘤样本之间变化。

在替代的实施方案中，通过检测HCC样本中所公开的14个TACE相关基因的DNA拷贝数测定或预测HCC对TACE的应答性。例如，基因组DNA例如可通过PCR来扩增以检测存在或不存在ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)中的一个或多个的基因缺失。HCC样本中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)相对于对照的拷贝数的变化(例如，增加或降低)表明HCC将有可能对TACE应答。

对照可以是与肿瘤样本中TACE相关基因的表达比较的任意合适的对照。在某些实施方案中，对照样本是非肿瘤组织。在某些实例中，非肿瘤组织得自相同的对象，如与HCC肿瘤相邻的非肿瘤肝组织。在其他的实例中，得自健康的对照对象(如过去没有且现在没有癌症的对象)的非肿瘤组织。在某些实施方案中，对照是参考值。例如，参考值可衍生自得自一组健康对照对象或得自一组HCC患者的非肿瘤组织的平均表达值。

本文所描述的方法可用于预测HCC患者对具有任意类型疾病病因学的TACE的应答性。在某些实施方案中，诊断有HCC的对象有慢性病毒感染。在一个实例中，慢性感染是HBV感染。在另一个实例中，慢性感染是HCV感染。在其他的实施方案中，诊断有HCC的对象有肝硬化。在一个实例中，肝硬化是由长期饮酒引起的。在另一个实例中，肝硬化是由遗传性血色素沉着病引起的。在另一个实例中，肝硬化是由暴露于黄曲霉素引起的，如通过摄取黄曲霉素污染的食物。

·A.检测TACE相关基因的表达

如下文所述，可采用多个方法中的任意种检测14个TACE相关基因(或者在某些情况下，15个TACE相关基因)的表达。本文考虑了mRNA或蛋白质的表达。

·1.检测mRNA的方法

通过检测编码感兴趣的基因的mRNA评价基因表达。因此，所公开的方法可包括评价编码ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)的mRNA，且在某些实例中还有编码ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA的mRNA。在某些实例中，定量mRNA。

使用本领域技术人员已知的方法包括可商购的试剂盒将RNA从来自对象的HCC肿瘤样本、来自对象的相邻非肿瘤组织样本、来自正常(健康)对象的无肿瘤组织样本或其组合中分离。用于mRNA提取的一般方法公开在分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等的Current Protocols of Molecular Biology,John Wiley and Sons(1997)。例如，在以下文献中公开了从石蜡包埋组织中提取RNA的方法：Rupp and Locker的Lab Invest.56:A67(1987)和De Andres等的BioTechniques 18:42044(1995)。在一个实例中，使用来自商业制造商如的纯化试剂盒、缓冲剂套装和蛋白酶根据制造商说明书进行RNA分离。例如，使用/>RNeasy微型柱从培养物细胞(如得自对象的那些)分离总RNA。其他可商购的RNA分离试剂盒包括/>Complete DNA and RNAPurification Kit(/>Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA IsolationKit(Ambion,Inc.)。可使用RNA Stat-60(Tel-检验)从组织样本中分离总RNA。例如，可通过氯化铯密度梯度分离从肿瘤或其他生物样本制备的RNA。

基因表达谱分析方法包括基于杂交分析多核苷酸的方法、基于测序多核苷酸的方法和基于蛋白质组的方法。在某些实例中，使用RNA印记或原位杂交(Parker&Barnes,Methods in Molecular Biology 106:247-283,1999)、RNAse保护测定(Hod,Biotechniques 13:852-4,1992)和基于PCR的方法如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Weis等,Trends in Genetics 8:263-4,1992)对样本中的mRNA表达定量。可选地，可采用能识别包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或者DNA-蛋白质双链体的特定双链体的抗体。用于基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达系列分析(SAGE)和通过大规模平行标记测序技术(MPSS)的基因表达分析。在一个实例中，RT-PCR可用于比较不同样本中、正常和肿瘤组织中、经或不经药物治疗的的mRNA水平以表征基因表达的模式、以在密切相关的mRNA之间区分、以及以分析RNA结构。

定量mRNA的方法在本领是已知的。在某些实例中，该方法利用了RT-PCR。通常，通过RT-PCR的基因表达谱分析的第一步为将RNA模板逆转录成cRNA，然后在PCR反应中将其指数式扩增。两个共同使用的逆转录酶为禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AWV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤通常使用特定引物、随机六聚体或寡核苷酸-dT引物来启动，这取决于环境和表达谱的目的。例如，可使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(PerkinElmer,Calif.,USA)按照制造商的说明书逆转录提取的RNA。然后衍生的cDNA可用作在后续PCR反应中的模板。

尽管PCR步骤可使用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，但是该步骤通常采用TaqDNA聚合酶。PCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5’-核酸酶活性来水解连接至其靶扩增子的杂交探针，但也可使用具有等价的5’核酸酶活性的任意酶。使用两个寡核苷酸引物产生PCR反应的典型扩增子。设计第三寡核苷酸或探针以检测位于所述两个PCR引物之间的核苷酸序列。探针通过Taq聚合酶的酶不可延伸，并且探针用报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当在探针上两种染料紧密地位于一起时，任何来自报告染料的由激光诱导的发射由淬灭染料淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶的酶以模板依赖性的方式裂解探针。得到的探针片段在溶液中解离，且来自释放的报告染料的信号没有第二荧光团的淬灭效应。每合成一个新的分子，就释放一分子报告染料，从而检测未淬灭的报告染料为定量解释数据提供了基础。

为了最小化样本-样本变化的误差和效果，可使用内部标准进行RT-PCR。以不同组织之间的恒定水平表示理想的内部标准，且该理想的内部标准不受实验治疗的影响。通常用于规范化基因表达的模式的RNA为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白和18S核糖体RNA的mRNA。

RT-PCR的变化是实时定量RT-PCR，其通过双标记的荧光探针(例如，探针)测量PCR产物累积。实时PCR与定量竞争PCR(其中每个靶序列的内部竞争者用于规范化)和定量比较PCR(使用包含在样品中的规范化基因或用于RT-PCR的管家基因)配合(参见Held等,Genome Research6:986 994,1996)。在U.S.Pat.No.5,538,848中也描述了定量PCR。在U.S.Pat.No.5,716,784和U.S.Pat.No.5,723,591中描述了相关探针和定量扩增步骤。用于在微量滴定板中进行定量PCR的仪器购自PE Applied Biosystems,850LincolnCentre Drive,Foster City,CA 94404，商标为ABI/>7700。

在各种出版物(参见Godfrey等,J.Mol.Diag.2:84 91,2000；Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29,2001)中给出了使用固定的石蜡包埋的组织作为RNA源进行定量基因表达的代表方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简而言之，代表性方法以切割大约10μm厚的石蜡包埋肿瘤组织样本或相邻的非癌组织的切片开始。然后，提取RNA，去除蛋白质和DNA。可选地，RNA直接从肿瘤样本或其他组织样本中定位。在分析RNA浓度后，如有必要，可包括RNA修复和/或扩增步骤，并且利用基因特异性启动子逆转录RNA，然后进行RT-PCR。选择用于扩增的引物以扩增感兴趣的基因的独特片段，如编码ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10或UBB的mRNA。在某些实施方案中，还检测其他基因的表达。可商购或者可设计并合成用于扩增ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10或UBB的引物。

在U.S.Pat.No.5,219,727中描述了另外的定量核酸扩增步骤。在该步骤中，通过同时扩增靶序列和内部标准核酸区段测定样本中靶序列的量。测定来自每个区段的扩增的DNA的量并与标准曲线比较以测定扩增前在样本中存在的靶核酸区段的量。

在本方法的某些实施方案中，还可评价“管家”基因或“内部对照”的表达。这些术语包括任意组成型或全局表达的基因，其存在能够评估HCC相关基因mRNA水平。这种评估包括测定基因转录的总组成型水平和控制RNA回收的变化。示例性管家基因包括ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA。

在某些实例中，使用微阵列技术鉴定或确认基因表达。因此，使用微阵列技术可在新鲜的或者石蜡包埋的肿瘤组织中测量表达谱。在本方法中，在微芯片底物上铺板或阵列化感兴趣的TACE相关基因核酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。然后，阵列化的序列与来自感兴趣的细胞或组织的特异性DNA探针杂交。就如在RT-PCR方法中，mRNA的来源通常为分离自人肿瘤且任选地分离自相应非癌组织和正常组织或细胞系的总RNA。

在微阵列技术的特定实施方案中，将cDNA克隆的PCR扩增***物以应用于密度阵列的底物中。将至少对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(且在某些实例中，还包括GABARAPL3和/或管家基因ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA)核酸序列有特异性的探针应用于底物中，并且阵列可基本上由或由这些序列组成。微阵列化的核酸适合于在严格条件下杂交。通过从感兴趣的组织提取的RNA的逆转录，经由掺入荧光核苷酸，可生成荧光标记的cDNA探针。应用到芯片上的标记的cDNA探针与阵列上每个DNA点特异性杂交。在严格清洗去除非特异性结合的探针之后，通过共聚焦激光显微镜或者通过另一检测方法扫描芯片。量化每个阵列化的元件的杂交允许对相应的mRNA丰度评估。用双色荧光，由两种RNA来源生成的分别标记的cDNA探针成对地杂交至阵列上。因此，同时测定来自两个来源与每个特定基因相对应的转录物的相对丰度。小型化规模的杂交提供了对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选的GABARAPL3)的表达模式的便利和快速评价。可根据制造商方案通过商购的设备进行微阵列分析。

基因表达系列分析(SAGE)允许同时并定量分析大量基因转录物，而不需要为每个转录物提供单个杂交探针。首先，生成含有足够的信息以独特地鉴定转录物的短序列标签(大约10-14个碱基对)，提供了得自每个转录物内的独特位置的标签。然后，将许多转录物连接在一起以形成可被测序的长系列分子，同时揭示了多个标签的相同性。可通过测定各个标签的丰度和鉴定对应于每个标签的基因来定量评价任何转录物群的表达模式(参见，例如，Velculescu等，Science 270:484-7，1995；和Velculescu等，Cell 88:243-51,1997，通过引用并入本文)。

原位杂交(ISH)是另一种检测和比较感兴趣的基因的表达的方法。ISH将核酸杂交技术应用于并推断于单个细胞水平，并且结合细胞化学、免疫细胞化学和免疫组织化学的领域，允许保留形态并鉴定待保留和鉴定的细胞标识物，并允许将序列定位于群体如组织和血液样本内的特定细胞中。ISH是一种杂交类型，其使用互补核酸将一个或多个特定核酸序列定位于组织的某部分或某段中(原位)，或者，如果组织足够小，则可定位于整个组织(整体ISH)中。RNA ISH可用于测定组织中的表达模式，如TACE相关基因的表达。

处理样本细胞或组织来增加其渗透性，以使探针如TACE-相关基因特异性探针进入细胞内。将探针加入到处理过的细胞中，允许在相关的温度杂交，清洗掉过量的探针。用放射性、荧光或抗原标签标记互补探针，以使用射线自显迹法、荧光显微镜或免疫测定确定组织中探针的位置和数量。样本可以是本文描述的任何样本，如非癌的或者HCC肿瘤样本。由于感兴趣的TACE相关基因的序列是已知的，由此，可设计探针使得探针特异性结合感兴趣的基因。

原位PCR是在ISH之前的基于PCR的靶核酸分子扩增。为了检测RNA，可在原位PCR之前引入细胞内逆转录步骤以从RNA模板产生互补DNA。这使得检测低拷贝RNA序列。

在原位PCR之前，固定且渗透细胞或组织样本以保存形态以及允许PCR试剂进入待扩增的细胞内序列。然后，在保持于悬浮液中或者直接在细胞离心制剂或载玻片上的组织切片中的完整细胞内对靶序列进行PCR扩增。在前一个方法中，使用常规的热循环仪对悬浮于PCR反应混合物中的固定细胞进行热循环。PCR后，通过ISH或免疫组织化学将细胞细胞离心至载玻片上，并可视化细胞内的PCR产物。在载玻片上的原位PCR通过在盖玻片下用PCR混合物覆盖样本来进行，其之后被密封以防止反应混合物蒸发。通过将载玻片直接置于常规的或专门设计的热循环仪的加热块的顶部或者通过使用热循环炉来实现热循环。

细胞内PCR产物的检测可通过ISH与PCR产物特异性探针来实现，或者通过直接检测标记的核苷酸(如异羟基洋地黄毒苷-11-dUTP、荧光素-dUTP、3H-CTP或生物素-16-dUTP，其已在热循环期间掺入PCR产物)的无ISH的直接原位PCR来实现。

还可使用由NanoString(Seattle,WA；参见，例如，U.S.Patent No.7,473,767；7,919,237；和9,371,563，其通过引用整体并入本文)研发的技术检测和定量基因表达。/>分析***利用基于基因表达的直接多重测量的数字彩色编码的条码技术。该技术使用分子“条码”与单分子成像以检测和计数单一反应中的数百个独特的转录物。每个彩色编码的条码连接至对应于感兴趣的基因(如TACE应答性基因)的单个靶特异性探针上。它们与对照一起混合形成多重代码集。

每个彩色编码的条码代表一个单一靶分子。条码直接与靶分子杂交并且可单个计数而不需要扩增。方法包括三个步骤：(1)杂交；(2)纯化和固定化；以及(3)计数。该技术每个mRNA采用两个大约50碱基的在溶液中杂交的探针。报告探针携带信号；捕获探针允许复合体被固定化以进行数据收集。杂交后，去除过量的探针，并且在盒中比对和固定探针/靶复合体。将样本盒置于数字分析仪内用于数据收集。对盒表面上的彩色代码计数并对每个靶分子制表。该方法描述在以下文献中，例如，U.S.Patent No.7,919,237；和U.S.Patent Application Publication No.20100015607；20100112710；20130017971，其通过引用整体并入本文。也可在公司的网站(nanostring.com)上找到关于该技术的信息。

·2.用于肿瘤相关基因表达谱的阵列

在本文提供的具体的实施方案中，提供可用于评价基因表达的阵列，例如，来确定有HCC的患者是否将对TACE应答。当描述基本上由对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB有特异性的探针或引物组成的阵列时，这种阵列包括对这14个TACE相关基因有特异性的探针或引物，还包括对照探针(例如，以确认培养条件是充分的)。在某些实例中，阵列还可包括对GABARAPL3有特异性的探针或引物。在某些实例中，阵列还可包含额外的如1个、2个、3个、4个或5个额外的肿瘤相关基因。在其他的实例中，阵列可包括更少的如1个、2个、3个、4个或5个更少的肿瘤相关基因。在某些实例中，阵列包括1-10个管家特异性探针或引物(如对ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA有特异性的那些)。在一个实例中，阵列是多孔板(例如，98或364孔板)。

在一个实例中，阵列包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：能识别ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且在某些实例中还有ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA)的探针或引物(如寡核苷酸或抗体)。在另一个实例中，阵列包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：能识别ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且在某些实例中，还有ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA)的探针或引物(如寡核苷酸或抗体)。寡核苷酸探针或引物还可包括一个或多个可检测标记物以允许在探针与靶序列(如本文公开的14或15个TACE相关基因)之间检测杂交信号。

·a.阵列底物

可由有机聚合物形成阵列的固体支持。用于固体支持的合适的材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚维酮、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯基醇(polyethylenevinyl alcohol)、聚甲基戊烯、聚氯三氟乙烯、聚砜类(polysulfornes)、羟基化双向拉伸聚丙烯、胺化双向拉伸聚丙烯、硫醇化双向拉伸聚丙烯、乙烯丙烯酸、thylene甲基丙烯酸及其共聚物的混合物(参见U.S.PatentNo.5,985,567)。

在一个实例中，固体支持表面为聚丙烯。在另一个实例中，表面活化的有机聚合物用作固体支持表面。表面活化的有机聚合物的一个实例为经射频等离子放电胺化的聚丙烯材料。这种材料易于用于连接核苷酸分子。活化的有机聚合物上的胺基与核苷酸分子有反应性以使核苷酸分子可结合至聚合物。也可使用其他反应性基团，如羧基基团、羟基基团、硫醇化基团或活化酯基团。

·b.阵列形式

根据本公开可采用各种各样的阵列形式。一个实例包括寡核苷酸带的线性阵列，在本领域中通常称为试纸条(dipstick)。另一个合适的形式包括分离细胞的二维模式(如64*64阵列中的4096方形)。如本领域技术人员所理解的，包括但不限于缝隙(矩形)和圆形阵列的其他阵列形式同样适用。在某些实例中，阵列为多孔板。在一个实例中，阵列形成在聚合物介质上，其为线、薄膜或膜。有机聚合物介质的实例为聚丙烯片，其具有大约1密尔(0.001英寸)至大约20密尔级的厚度，尽管膜的厚度并不是关键性的且会在相当宽的范围内变化。阵列可包括双向拉伸的聚丙烯(BOPP)膜，其除了其耐久性外还展现出低的背景荧光。

本公开的阵列形式可包括在多种不同类型的形式中。“形式”包括固体支持可以附着的任何形式，如微量滴定板(例如，多孔板)、试管、无机片材、试纸条等。例如，当固体支持为聚丙烯线时，一个或多个聚丙烯线附着于塑料试纸条型装置上；聚丙烯薄膜可附着于载玻片上。其具体形式或其中的具体形式不重要。

可通过多种方法制备本公开的阵列。在一个实例中，分别合成寡核苷酸或蛋白质序列，然后再附着于固体支持(参见U.S.Patent No.6,013,789)上。在另一个实例中，将序列直接合成至支持上以提供所期望的阵列(参见U.S.Patent No.5,554,501)。用于将寡核苷酸和蛋白质与固体支持共价偶联和用于将寡核苷酸或蛋白质直接合成至支持上的合适方法是已知的。对合适方法的综述可在Matson等，Anal.Biochem.217:306-10,1994中找到。在一个实例中，使用化学技术将寡核苷酸合成至支持上用于固体支持上制备寡核苷酸(参见PCT申请WO 85/01051和WO 89/10977,或U.S.Patent No.5,554,501)。

寡核苷酸可通过寡核苷酸的3’端或者通过寡核苷酸的5’端与聚丙烯支持结合。在一个实例中，寡核苷酸通过3’端与固体支持结合。然而，本领技术人员可确定寡核苷酸的3’端或5’端的使用是否适用于与固体支持结合。通常，在3’端和5’端区域中的寡核苷酸探针的内部互补性决定了与支持的结合。

在具体的实例中，阵列上的寡核苷酸探针包括一个或多个标记物，其允许检测寡核苷酸探针：靶序列杂交复合体。

·3.检测蛋白质的方法

在某些实例中，分析了ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质的表达。合适的生物样本包括含有得自对象的HCC的蛋白质、得自对象的非肿瘤组织和/或得自无癌症对象的一个或多个样本的蛋白质的样本。在来自对象的肿瘤中的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质相对于对照的量的变化(如表达的增加或降低)如上文所述表明HCC是否将对TACE应答。

通过本领域已知的多种免疫测定方法如Harlow and Lane(Antibodies,ALaboratory Manual,CSHL,New York,1988)中陈述的那些之一可将对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质有特异性的抗体用于检测和定量TACE相关蛋白质。构建此类抗体的方法在本领是已知的。

任何标准的免疫测定形式(如ELISA,蛋白印记或RIA测定)都可用于测量蛋白质水平。因此，可使用这些方法容易地评价HCC样本中的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)多肽水平。还可利用免疫组织化学技术用于肿瘤相关基因的测定和定量。可在以下文献中找到关于这些技术的一般指导：Bancrof and Stevens(Theory and Practice ofHistological Techniques,Churchill Livingstone,1982)和Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)。

为了定量肿瘤相关蛋白的目的，可使用包括细胞蛋白的对象的生物样本。可通过本领域已知的免疫测定方法实现对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质的定量。可评估在肿瘤中并且任选地在相邻非肿瘤组织或者在来自无癌症对象肝组织中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质的量。可将肿瘤中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)蛋白质的量与来自无癌症对象的细胞中发现的蛋白质水平或其他对照(如标准值或参考值)比较。使用本文公开的和/或本领域已知的统计学方法评价量的显著增加或降低。

定量光谱法如SELDI可用于分析样本(如非癌组织、肿瘤组织和来自无癌症对象的组织)中的ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)表达。在一个实例中，表面增强激光解吸-电离飞行时间(SELDI-TOF)质谱用于测定蛋白质表达，例如，通过使用ProteinChip^TM(Ciphergen Biosystems,Palo Alto,CA)。这些方法在本领域是已知的(例如，参见U.S.Pat.No.5,719,060；U.S.Pat.No.6,897,072；和U.S.Pat.No.6,881,586)。SELDI是一种用于解吸的固相法，其中，分析物被呈递给表面上的能量流以增强分析物捕获或解吸。

表面化学使结合的分析物被保留，使未结合材料被清洗掉。接着，可通过若干手段中的任意一种如使用质谱法解吸和分析与表面结合的分析物。当分析物在解吸的过程中如在激光解吸/电离质谱中被电离时，检测器可以是离子检测器。质谱仪通常包括用于确定解吸离子的飞行时间的装置。该信息可转化为质量。然而，不需要确定解吸离子的质量以对其分辨和检测：离子化的分析物在不同的时间撞击检测器的事实提供了对其检测和分辨。可选地，分析物可被可检测地标记(例如，用荧光团或放射性同位素)。在这些情况下，检测器可以是荧光或放射性检测器。可串联实现多个检测装置以充分询问分析物组分和与阵列中各个位置处的保留分子相关的功能。

因此，在具体的实例中，色谱表面包括特异性结合ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)的抗体。在其他的实例中，色谱表面基本上由以下组成或由以下组成：特异性结合ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB(并且任选地GABARAPL3)的抗体。在某些实例中，色谱表面包括结合其他分子如管家蛋白质(例如，ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA)的抗体。

在另一个实例中，使用细菌Fc结合支持将抗体固定至表面上。色谱表面与样本如HCC肿瘤样本一起孵育。样本中存在的抗原可识别色谱表面上的抗体。清洗掉未结合的蛋白质和质谱干扰化合物，并且通过SELDI-TOF来分析和检测保留在色谱表面的蛋白质。然后，使用差异蛋白表达图谱比较来自样本的MS谱，从而通过多种统计技术和生物信息学软件***来比较特定分子量的蛋白质的相对表达水平。

·4.检测基因缺失的方法

检测存在或不存在基因缺失的方法在本领域是已知的。例如，可从对象如从肿瘤样本或相邻的非肿瘤样本分离基因组DNA，并使用对感兴趣的基因组序列有特异性的引物进行PCR扩增。在具体的实例中，设计PCR引物以扩增对应于一个或多个TACE相关基因如ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和/或UBB的基因组区域。可选地，可使用基于基因组阵列的方法评估DNA拷贝数。

·B.肿瘤与非肿瘤组织样本

本文提供的方法包括检测HCC和非肿瘤组织样本中15个TACE相关基因的表达。在某些实施方案中，组织样本得自诊断有HCC的对象，并且在某些情况下，得自健康对象或尸体捐赠者。“样本”是指组织的一部分，其可以是整个组织，或组织的病变或健康部分。如本文所述，肿瘤组织样本与对照比较。在某些实施方案中，对照是得自同一对象的非肿瘤组织样本，如肿瘤周围的非癌肝组织。在其他的实施方案中，对照是基于平均历史值的标准或参考值。在某些实例中，参考值是得自一组对或不对TACE应答的HCC患者的HCC中的平均表达值。

组织样本可使用本领域已知的方法得自对象。例如，组织样本可以得自已接受了肿瘤切除作为治疗形式的HCC患者。肿瘤组织及周围的非癌结肠组织都可得自这些患者。在某些实施方案中，用作对照的非肿瘤组织样本得自尸体。在其他的实施方案中，非癌组织样本得自健康的肝捐赠者(参见Kim等,Hepatology 39(2):518-527,2004)。

在某些实施方案中，通过活检获得组织样本。活检样本可以是新鲜的、冷冻的或固定的，如***固定和石蜡包埋。可通过提取(例如，通过皮下注射针或其他类型的针)、通过显微解剖、通过激光捕获或者通过任何其他本领域已知的手段从患者中手术去除样本。

·C.治疗

鉴定为有可能对TACE应答的那些HCC可接受TACE治疗。因此，所公开的方法可包括施用TACE治疗。HCC的治疗可包括减少与这样的肿瘤的存在相关的病征或症状(例如通过减小肿瘤的尺寸或体积，或减少其转移)。在某些实例中，这种减少的生长降低或减慢肿瘤的转移，或者减小肿瘤的尺寸或体积至少10％、至少20％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％。在某些实例中，该方法包括测量肿瘤的尺寸和/或体积(如在TACE之前和之后)。在某些实例中，对象接受额外的疗法，如肿瘤的手术切除。

已经描述了TACE步骤(参见，例如，Van Ha,Semin Intervent Radiol26(3):270-275,2009)。TACE是一种经皮技术，其通常通过股总动脉途径，利用透视和同轴导管***将局部和浓缩剂量的化疗剂直接递送至肿瘤的动脉供血血管中，联合或之后再使用永久或暂时性颗粒材料栓塞。尽管这些技术可变化，但是TACE的原理是一致的：将可能比全身疗法更高的药物浓度递送至肿瘤中以及通过减少冲洗延长肿瘤内的药物驻留时间。大多数药物都会保留在肿瘤内，因此TACE的另一个益处在于减少全身药物毒性。TACE利用HCC的主要肝动脉供给，根据肿瘤部位如肋间、腰部、膈下或内乳动脉，偶尔从其他动脉区域进行寄生虹吸。正常的肝实质大部分由门静脉供给，由肝动脉供给的比例少得多。

通常，在TACE步骤时，进行常规腹部主动脉造影。这描绘了内脏解剖学并且可鉴定来自肋间、横膈膜或腰部动脉的肿瘤寄生物感染。然后，用导管选择肠系膜上动脉(SMA)，并且用大对比体积进行动脉造影以评估变体解剖、肿瘤的非常规供血动脉，并且在静脉期，评估门静脉未闭和流动。接下来，选择腹腔动脉并进行选择性动脉造影以查看对肿瘤的动脉供给，还可鉴定不应被栓塞的血管，如胆囊、胃和肠的血管。如果胃或肠的血管处于回流的风险，那么它们在化疗栓塞前不应被化学栓塞并且可能不太需要线圈栓塞。一旦鉴定出肿瘤的动脉供血血管，则它们就被超选择用于化疗栓塞。通常，由于肿瘤血管小的尺寸，以同轴的方式使用微导管。如果超选择有可能，那么血管被化疗栓塞至瘀滞。可通过用混合有化疗剂的乙碘油进行化疗栓塞，然后用(Pfizer Pharmaceuticals,New York,NY)或聚乙烯醇(PVA)颗粒(Boston Scientific,Natick,MA)进行栓塞。可选地，可使用药物洗脱珠进行TACE。如果有一个以上的供血血管，那么在动脉造影期间，使用每个血管供给的肿瘤体积的主观近似法将剂量分给分支血管。当有多个病灶时，情况相同。除非肿瘤负荷大，否则通常有足够的化学试剂来实现接近瘀滞或降低的流动。用/>或颗粒实现瘀滞。当使用药物洗脱珠时，较大的肿瘤负荷一般会要求两小瓶的珠，而不是通常的一小瓶。

在某些情况下，可使用使用了除药物洗脱珠以外的三种化疗剂的经修饰的常规TACE方案。在其他实例中，使用仅含有多比柔性的药物洗脱珠进行TACE。下文列出了示例性制剂。

1.常规TACE(三联剂或顺铂、阿霉素和丝裂霉素[CAM]方案)

·50至100mg多比柔星(Pharmacia&Upjohn,Kalamazoo,MI)

·50mg顺铂粉末(Bristol Myers Squibb,Princeton,NJ)

·10mg丝裂霉素(Bedford Laboratories,Bedford,OH)

用共 10mL的水溶性对比材料(Omnipaque 300；Winthrop Pharmaceuticals,NewYork,NY)重构这三种药物。在动脉内施用之前，在10cc的碘化油(Ethiodol；SavageLaboratories,Melville,NY)中乳化，总体积共20cc。在最后使用额外的颗粒或明胶海绵栓塞以实现肿瘤血管中的瘀滞。

2.药物洗脱珠

可商购两种类型的药物洗脱珠。它们可联合多比柔星使用。对于载多比柔星珠，选择肿瘤血管且施用载药珠。较大的肿瘤可能需要更多的栓塞(多于一小瓶)。在使用载药珠也未能实现瘀滞的情况下，可使用PVA颗粒实现瘀滞。除了载多比柔星珠以外，使用三联CAM方案制备含顺铂和丝裂霉素的另一注射器并在动脉内施用之前用碘化油乳化。通常，首先使用碘化油制剂，直到看得见油的吸收和分支血管内的流动减慢。然后，输注载多比柔星珠直到出现瘀滞。如果所有的载多比柔星珠使用后仍没有瘀滞出现，那么使用PVA颗粒实现瘀滞。

3.微球(100至150微米；Biosphere Medical,Rockland,MA)

·单一试剂：在1至2小瓶LC珠或中，多比柔星50至100mg。与10cc的生理盐水混合，静置至少1小时。当准备进行动脉内施用时，轻轻倒出并丢弃上清液。在等量的等渗非离子对比中与珠溶液混合。

·三联剂(CAM)：

o任选的：在5mL乙碘油中，顺铂50 mg，丝裂霉素10 mg

o注射器1：用10cc生理盐水重构50mg多比柔星。充分混合，得到澄清溶液。将重构的多比柔星加入至1-2小瓶的中。静置至少1小时。抽取内容物并放入10cc注射器中。在进行动脉内施用前，轻轻倒出并丢弃上清液(～5-6cc)，将剩余的溶液与5mLVisipaque^TM(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,UK)混合。

o注射器2：制备顺铂和丝裂霉素。将5cc生理盐水加入到10mg小瓶的丝裂霉素中。搅拌以混合溶液。抽取全部的内容物并加入到50mg小瓶的顺铂粉末中。搅拌以混合溶液。将5cc溶液置于10cc注射器中。在内动脉施用之前，与5cc乙碘油混合。

4.LC珠(300至500微米；Angiodynamics,Queensbury,NY)

允许小瓶的珠静置，珠将沉降至底部。吸取尽可能多的盐水并丢弃。用2cc无菌水构一小瓶50mg的多比柔星粉末并加入到LC珠中。珠会从蓝色变成红色。使珠吸附多比柔星至少30分钟。在使用之前，去除尽可能多的上清液，并加入与剩余的珠溶液相同体积的等渗非离子对比。对于三联剂的使用，用如上所述的顺铂和丝裂霉素制备另一注射器。

·V.探针与试剂盒

本文提供了TACE Navigator基因标记测定，其包括探针组，所述探针组包括对14个TACE标记基因(并且在某些实例中，15个TACE标记基因)和6个管家对照基因中的每一个有特异性的探针。在某些实施方案中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针。在其他的实施方案中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针。在某些实例中，探针组还包括对至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个(如大约1至大约10个或大约1个至大约6个)管家基因有特异性的核酸探针。在特定的非限制性实例中，管家基因包括ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的1个、2个、3个、4个、5个或6个。在一个特定的实例中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针。在另一个特定的实例中，探针组包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针。

在某些实例中，探针是可以与来自NanoString Technologies(Seattle,WA)的分析***使用的探针。例如，探针可包括捕获探针和报告探针，其中，报告探针包含一个或多个可检测标记物。在某些实例中，捕获探针包括允许对靶：探针复合体固定化的分子。在某些实例中，核酸探针的长度为至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或至少60个核苷酸。在特定的非限制性实例中，探针的长度为大约20至大约60个、大约30个至大约55个或大约40个至大约50个核苷酸。在具体的实例中，捕获探针和报告探针的长度各自为大约50个核苷酸。在特定的非限制性实例中，捕获探针和报告探针各自杂交至本文SEQ ID NO:1-21中的任意一者所示的靶序列的一部分上。

本文还还提供了试剂盒，其包括本文公开的探针组，如包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、ARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针；对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针；或对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI6、PEBP、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针的探针组。在某些实例中，试剂盒还包括缓冲剂，如杂交缓冲剂。

本公开还提供了一种用于进行TACE Navigator基因标记测定的装置。在某些实施方案中，所述装置包括本文公开的探针组，如包括对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针；对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB中的每一个有特异性的核酸探针；或对ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10、UBB、ACTB、B2M、EEF1A1、FTL、GUSB和LDHA中的每一个有特异性的核酸探针的探针组。

提供了以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被视将本公开限制于所描述的具体特征或实施方案。

实施例

·实施例1：材料与方法

本实施例描述了用于实施例2中的研究的材料和实验方法。

·临床标本

回顾性地分析了前文所述的队列(cohort)LCI队列，其中基因表达已由AFFYMETRIX^TM平台(NCBI GEO登记号GSE14520)测量。该队列由未接受过治疗的速冻的肿瘤组织组成，所述肿瘤组织来自在复旦大学肝癌研究所接受了根治切除的247名患者(Roessler等,Cancer Res 70:10202-10212,2010)。在这247名患者之中，有105名患者接受了TACE作为他们疗法的一部分，作为辅助疗法或者复发后疗法；有52名患者接受了其他形式的辅助疗法，但不包括TACE；有90名患者未接受额外的治疗。包括类型比较和存活风险预测算法的生物信息学分析用于鉴定接受了TACE的105名患者的组而不是接受其他辅助疗法(n＝52)或无辅助疗法(n＝90)的其他患者中的基因，所述基因可独立于其他临床变量预测总存活。

开发了由15-基因TACE标记和6个对照基因组成的定制的nCounter基因表达代码集，其在来自LCI队列的93名患者中使用NANOSTRING^TM平台进行了重新评价。然后，基于每个称为TACE Navigator基因标记的标记基因的表达开发了预后指数方程预测模块。验证队列香港队列由***固定的石蜡包埋的得自49名有HCC的患者的肿瘤样本组成，这些患者在香港的香港大学医学中心接受了根治切除，然后又接受了辅助TACE作为其治疗的一部分。在进行NANOSTRING^TM之前，对所有患者进行编码，通过NANOSTRING^TM测量每个TACENavigator标记基因的表达。完成数据收集，随后对患者进行解码，获得每个患者的临床数据。对预后指数方程将患者分配为具有不同总存活的组的能力进行评价。

·生物信息学分析

之前描述了先前使用AFFYMETRIX^TM人类基因组U133 2.0微阵列平台进行了谱分析(profiled)的速冻肿瘤组织的基因表达的微阵列谱(Roessler等,Cancer Res 70:10202-10212,2010)。BRB-ArrayTools软件4.5.0用于所有生物信息学分析。当检查最可变基因时，使用最可变基因过滤器以排除具有以下的基因：低于20％的表达数据值，该值从基因的中位数值的任一方向具有至少2倍变化；对数强度变化，P值>0.01；并且缺失数据百分比超过50％。在总共13,101个基因中，有1,292个基因通过了最可变过滤器。使用中心化相关(centered correlation)和平均连锁(average linkage)进行分层聚类。将基因中心化进行分析。对于主成分(principal component)分析，通过R版本3.2.3的统计包中的prcomp()函数从肿瘤样本的全基因表达计算三个主成分。由Plotly R API(PlotlyTechnologies Inc.,Montréal,QC)生成3D PCA散点图。使用多变量排列检验进行全局类型比较，排列1000次，并且90％置信水平的伪发现的最大比例为0.1。使用预后指数百分位为50％的2-风险组进行存活风险预测。使用10倍交叉验证法进行交叉验证，并进行基于对数秩统计的1000次排列。使用2个主成分确定基因列表。

为了分析基因网络，使用上文描述的全局类型比较确定TACE应答者与非应答者之间差异表达的基因。所有差异表达的基因都输入Gene Set Enrichment Analysis(BroadInstitute,Cambridge,MA)中。使用Hallmark基因组计算重叠。所有差异表达的基因和倍数变化可都上传至Ingenuity Pathway Analysis(Qiagen)，并进行核心分析。检查UpstreamAnalysis的结果。

·香港队列RNA分离

***固定或石蜡包埋患者样本。通过H&E染色验证肿瘤vs非肿瘤组织的存在，并且通过对每个患者刮下5份5μm肿瘤切片来收集肿瘤组织。根据制造商的说明书使用HighPure FFPET RNAIsolation Kit(Roche,Indianapolis,IN)分离总RNA。使用NANODROP^TM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)测量RNA浓度，并根据制造商的说明书使用2100Bioanalyzer和RNA 6000 Nano Kit(Agilent,Santa Clara,CA)来评价RNA质量。

·NANOSTRING^TM分析

通过NanoString Technologies(Seattle,WA)制造的定制的nCounter基因表达代码集，其含有15个选择的标记基因和6个额外的管家基因。通过NANOSTRING^TM设计针对每个基因的探针。从来自NANOSTRING^TM的54个建议的管家基因加上来自具有中位数Log2强度大于12的LCI患者队列的49个基因的列表中选择管家基因。使用来自LCI队列的488个肿瘤和非肿瘤样本评价基因，并使用以下准则缩减：管家基因在肿瘤与非肿瘤组织之间的表达必须变化不大(0.85≤倍数变化≤1.15)；中位数Log2强度大于8；Turkey变化(上下四分位数的1.5个四分位范围内)外的样本小于7.5％。总共5个基因符合该准则，且选择作为管家基因(FTL、EEF1A1、GUSB、B2M、LDHA)。此外，添加“经典的”管家基因ACTB，其满足所有准则，除了肿瘤与非肿瘤之间的倍数变化(倍数变化＝1.28)。在HCC患者的独立队列中验证所有管家基因，共有121个肿瘤和非肿瘤样本。在独立队列中，所有管家基因都满足所有的准则。

用nCounter代码集制备样本的方案根据NANOSTRING^TM提供的说明书。每个最终杂交反应在5μL水、10μL报告代码集、10μL杂交缓冲剂和5μL捕获探针集的总共30μL的体积中含有来自每个患者样本的100ng RNA。杂交反应于65℃孵育至少12小时(但不超过30小时)。在65℃保持反应，直到开始分析。然后，进行NANOSTRING^TM数字基因表达分析。总的来讲，在来自LCI队列的93个TACE患者中测量基因表达以确保由AFFYMETRIX^TM芯片或NANOSTRING^TM测量的基因表达被关联。然后，在来自香港队列的49个患者中通过NANOSTRING^TM测量基因表达用于验证。

使用由NANOSTRING^TM提供的nSolver分析软件2.5分析基因表达。通过减去包括在代码集中的8个阴性对照探针的最大计数值进行背景校正。然后，使用包括在代码集中的6个阳性对照探针的几何平均值标准化数据以计算标准化因子。如果标准化因子位于在0.3-3范围之外，则标记样本。也使用6个管家基因的几何平均值标准化数据以计算标准化因子。如果标准化因子位于在0.1-10范围之外，则标记样本。由nSolver软件提供的所有默认质量控制(QC)措施用于每个样本。包括在后续分析中的所有样本通过了所有的QC措施。在背景减去与标准化后，对测量的计数值进行log2转换，然后输出数据。

·预后指数方程

在LCI队列患者中评价由AFFYMETRIX^TM芯片和NANOSTRING^TM测量的所有标记基因的Log2表达，并检查相关性。在除了一个基因GABARAPL3以外的所有基因中，通过任一方法测量的所有基因的表达是统计显著相关的。由于缺少相关，随后从用于进一步分析的基因标记中去除该基因。然后，在每个队列内对Log2表达分数进行Z-分数校正，在各个队列之间比较每个基因的校正表达。在任意基因的Z-分数-校正表达中未见统计显著差异。

将LCI队列的Z-分数校正的数据输入BRB-ArrayTools。为创建预后指数方程，使用预后指数百分位为50％的2-风险组在患者的LCI队列中进行存活风险预测。使用10倍交叉验证法进行交叉验证，并进行基于对数秩统计的1000次排列。将Cox模型的显著性阈值设置为0.999以确保所有标记基因都包括在模型中。分析得到的基因权重和简单的公式以使用基因权重和基因表达计算预后指数，由BRB-ArrayTools输出。也通过分析确定用于确定新样本是否被预测为处于高风险(较差的总存活)或低风险(较好的总存活)的预后指数阈值。然后，该方程用于预测香港队列中的患者基于基因表达是否可能具有的较好或较差的总存活。

·统计分析

在所有用于该研究的统计分析中，P<0.05被认为具有统计学显著性。使用chi方检验、Fisher’s exact检验、普通one-way ANOVA或者2-tailed Student’s t-检验来评价临床数据。使用具有对数秩检验的Kaplan-Meier存活分析评价患者存活。利用Pearson相关法评价比较AFFYMETRIX^TM基因表达与NANOSTRING^TM基因表达的相关性，并使用非参数Mann-Whitney检验在LCI与香港队列之间比较每个标记基因的Z-分数校正的基因表达。使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad,San Diego,CA)计算所有统计数据。

用使用STATA14.0(College Station,TX)的Cox比例风险回归分析进行单变量和多变量分析。每个临床变量与存活的关联性先用单变量分析再通过多变量分析来评价，所述多变量分析包括与单变量分析中的存活显著相关的临床变量。未发现协变量的多重共线性，并且比例风险假定在最终模型中满足。

·实施例2：对预测HCC患者对TACE应答的基因标记的鉴定

本实施例描述了对基因标记(TACE Navigator基因标记)的鉴定，该基因标记独立于其他临床变量通过总存活的测量预测了对TACE的应答和非应答。

·患者的临床特征

对于本实施例中所述的研究，基于在手术切除后每个患者在他们的治疗过程期间接受的治疗，将来自先前描述的LCI队列的247名患者分配至以下三组之一：接受TACE作为其治疗的一部分的患者(TACE，n＝105)；接受除了TACE之外的其他辅助疗法形式的患者(其他疗法，n＝52)；以及接受无额外疗法的患者(无疗法，n＝90)。每个疗法组具有相似的临床特征，除了总存活，其中，其他疗法组与TACE和无疗法组相比具有显著更好的总存活(图1和表1)。获得由来自香港的接受了手术切除及手术时进行的辅助TACE的49名患者组成的验证队列，以用于该研究。接受了TACE的LCI检验队列和香港验证队列患者具有相似的临床特征，除了香港队列有更多的患者存在微血管侵入和更高的肿瘤结节转移(TNM)分期，表明更多的患者有晚期疾病。然而，这两个队列之间的总存活无统计学差异(表2)。·表1 LCI队列治疗组的临床特征

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指定为“TACE”的患者在其手术切除后的治疗期间的任何时间接受了TACE。在其治疗期间，“TACE”患者还可接受额外辅助疗法。

指定为“其他疗法”的患者在其治疗期间不接受TACE。手术切除后，“其他疗法”的患者接受了化疗、干扰素α疗法、射频消融、经皮乙醇注射、或传统中医、或其组合。

#指定为“无疗法”的患者在手术切除后没有接受额外疗法。

*P值小于0.05被认为表明统计显著。P值使用chi方检验计算，除了年龄和存活率，年龄用普通one-way ANOVA计算，存活用对数秩检验计算。·表2 LCI队列TACE患者与香港队列TACE患者的临床特征

/>

*P值小于0.05被认为表明统计显著。P值使用Fisher’s exact检验计算，除了年龄和存活，年龄用2-tailed Student’s t-检验计算，存活用对数秩检验计算。

·TACE患者中基因表达与临床结果的关联性

首先，从LCI队列中检查肿瘤基因表达数据，其中，先前通过AFFYMETRIX^TM平台已测量了13,101个基因的表达。通过使用1,292个“最可变基因”的分层聚类对TACE组和其他疗法组的患者进行细分组。与分配至TACE聚类2的66名患者相比，分配至TACE聚类1的39名患者具有显著更长的总存活，但聚类2中的患者与未接受疗法的90名患者之间的总存活无统计学显著差异(图1A)。然而，当通过相同最可变基因的分层聚类对其他疗法组中的患者进行细分组时，分配至其他疗法聚类1的28名患者与分配至其他疗法聚类2中的23名患者的总存活无统计学显著差异(图1B)。这些结果表明肿瘤基因表达的差异可与对TACE的应答vs非应答有关联，并且在预测哪些患者最有可能对TACE治疗应答方面具有实用性。一致地，基于所有13,101个基因的全局表达模式的主成分分析揭示了作为两个截然不同的分子组的TACE聚类1和TACE聚类2中的患者。

·TACE治疗后预测总存活的基因标记的开发

为了开发可预测TACE应答的基因标记，使用***的方法(图2A)。首先，进行与TACE聚类1和TACE聚类2之间的全局基因表达类型比较以在两组之间找到差异表达基因。在13,101个全局基因之中，找到2,471个基因在TACE聚类1与TACE聚类2之间有差异表达。然后，对TACE、其他疗法和无疗法队列中的2,471个差异表达基因进行存活风险预测以确定在每个队列中哪些基因与存活统计学相关。最后，为了选择最有可能与TACE治疗相关的基因，选择与具有显著性p<0.001的TACE队列的存活相关但不与其他疗法和无疗法队列的存活统计学相关(p>0.05)的所有基因(图2A)。该方法产生了形成基因标记基础的15个基因(表3)。

表3 15个TACE Navigator基因

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为了检查15-基因标记通过治疗后的结果分开患者的能力，如通过总存活所测量的，在TACE、其他疗法和无疗法队列中进行使用这15个基因的分层聚类。在TACE队列中，聚类揭示了指定为TACE应答者的45名患者的子集和指定为TACE非应答者的60名患者的子集，总存活有高显著性差异(图2B)。此外，TACE应答者与非应答者在早期无病存活(≤24个月)中显示出高度显著性差异，以及显示出晚期无病存活(≥24个月)显著不同。此外，当TACE患者队列又被细分为接受辅助TACE的患者(n＝75,p＝0.0015)或者接受TACE复发后的患者(n＝30,p＝0.0042)时，这15-基因标记预测存活。然而，如所期望，这15个基因不能在其他疗法(p＝0.67)或无疗法(p＝0.94)队列中将患者分为具有不同总存活的聚类(图5)。

为了确保这15-基因标记能够不依赖其他临床变量在TACE后预测结果，进行有Cox比例-风险回归的单变量分析以确定与TACE患者队列的存活显著相关的临床变量。除了分配的临床组，肝硬化状态、肿瘤尺寸、微血管侵入的存在和TNM阶段都各自与预后显著相关。最终的多变量模型示出了只有如通过TACE基因标记分配的临床组独立地与存活相关(表4)。因此，用称为TACE Navigator的这15-基因标记进行进一步分析。

表4根据单变量与多变量分析在LCI队列内通过TACE Navigator基因标记被指定为TACE应答者或非应答者的患者的死亡风险比率

变量	风险比(95％CI)	P值
			单变量分析
TACE标记(应答者vs.非应答者)	10.11(3.95-25.86)	<0.001
			年龄(≤50岁vs.>50岁)	0.93(0.50-1.71)	0.813
性别(男性vs.女性)	1.27(0.40-4.14)	0.680
			HBV(慢性携带者vs.活性病毒)	1.54(0.80-2.94)	0.196
肝硬化(否vs.是)	7.81(1.07-56.82)	0.042
			丙氨酸转氨酶(≤50 U/L vs>50 U/L)	0.87(0.48-1.59)	0.649
甲胎蛋白(≤20 ng/mL vs.>20 ng/mL)	0.98(0.50-1.89)	0.931
			TNM阶段(I vs.II+III)	2.98(1.44-5.76)	0.003
额外疗法(否vs.是)	1.02(0.56-1.86)	0.948
			多变量分析
TACE临床组	10.02(3.80-26.39)	<0.001
			肝硬化	6.69(0.89-50.25)	0.065
TNM阶段	1.42(0.69-2.91)	0.344

·TACE Navigator基因标记的验证

为了开发TACE Navigator基因标记作为诊断装置，创建了检验和验证该发现的流程(pipeline)(图3A)。由于验证样本来自FFPE肿瘤组织，已知这些验证样本具有显著的RNA降解，所以使用NANOSTRING^TM平台验证基因标记，该平台被优化以与重度降解的样本一起使用。委托创建定制的NANOSTRING^TM nCounter代码集，其含有针对标记的15个基因中的每一个的探针。首先，获得针对所有可得的LCI TACE患者(n＝93)的存档RNA，并且使用所述代码集测量基因表达以确保通过AFFYMETRIX^TM测量的基因表达与通过NANOSTRING^TM测量的基因表达相关。事实上，表达与所有基因都高度相关，除了GABARAPL3，该基因随后会从标记中去除。然后，通过Z分数标准化基因表达以校正在来自冷冻组织或FFPE组织的RNA中测量的基因表达的差异性。

使用LCI TACE患者作为检验队列，使用14个标记基因进行存活风险预测以将患者分配为低/高风险组，表明当通过NANOSTRING^TM测量基因表达时，TACE Navigator装置能够预测总存活和无病存活(图3B)。此外，存活风险预测用于创建预后指数方程和预后阈值(图3A)，然后可再将它们应用于测量的新样本中。将RNA从所编码的FFPE组织(来自验证队列)分离、使用代码集测量基因表达以及将基因表达数据转换为z分数后，将基因表达数据输入预后指数方程，基于先前步骤测定的阈值将患者分配为经预测的应答者或经预测的非应答者。然后，解码这些样本并进行存活分析。与分配为经预测的非应答者组的21名患者相比，分配为经预测的应答者组的28名患者具有显著更好的总存活和早期无病存活(图3B)。单变量与多变量分析表明TACE Navigator基因标记能够独立于其他临床变量预测香港队列的总存活(表5)。

表5根据单可变与多可变分析在香港队列内通过TACE Navigator基因标记被指定为TACE应答者或非应答者的患者的死亡风险比率

变量	风险比(95％CI)	P值
			单变量分析
TACE标记(应答者vs.非应答者)	3.16(1.32-7.56)	0.010
			年龄(≤50岁vs.>50岁)	2.25(0.86-5.91)	0.100
性别(男性vs.女性)	0.94(0.28-3.20)	0.922
			HBV(慢性携带者vs.活性病毒)	0.84(0.31-2.32)	0.743
肝硬化(否vs.是)	0.59(0.26-1.36)	0.215

变量	风险比(95％CI)	P值
			甲胎蛋白(≤20 ng/mL vs.>20 ng/mL)	1.25(0.48-3.22)	0.646
TNM阶段(I vs.II+III)	2.60(1.39-8.62)	0.128
			多变量分析
TACE临床组	3.21(1.31-7.83)	0.011
			肝硬化	0.52(0.23-1.23)	0.138
TNM阶段	2.33(0.67-8.05)	0.181

·与TACE应答相关的分子信号转导

为了检查非应答者患者中的TACE抗性的潜在机制，检查在LCI队列中的TACE应答者与非应答者之间差异表达的基因，将这1,726个差异表达基因输入至Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)和Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)中。IPA分析揭示了HIF-α被列为TACE应答者与非应答者之间差异表达的基因的顶级“上游调节因子”之一(表6)，并且15个TACE Navigator标记基因中的7个位于HIF-α信号转导的下游(图4A)，这表明低氧信号转导与TACE应答之间存在潜在联系。一致地，该基因集合富含有已知对低氧应答而被上调的基因，如GSEA所示(图4B)。事实上，当分别检查HIF-α和低氧靶基因VEGF时，与非应答者相比，二者在TACE应答者中显著下调，表明非应答者中的肿瘤微环境在TACE治疗前已处于低氧状态，或者在TACE步骤期间可导致对低氧的应答增强。

表6通过Ingenuity Pathway Analysis的TACE应答者与非应答者之间的差异表达基因的上游分析结果

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^a根据IPA，由HIF-α直接调节的基因粗体显示

^bTACE应答者与非应答者之间基因的倍数变化，其出现在两组间差异表达基因的列表中

^c只检查被预测在TACE应答者中受到抑制的基因

^d由IPA计算活化z分数，其推断出预测的转录调节因子的状况。

^e如通过IPA、由Fisher’s Exact检验计算的重叠的P值，表明差异表达基因与由候选转录调节因子调节的基因之间的统计学显著重叠。只考虑p<0.0001的基因。

为进一步检查对TACE抗性的低氧应答的可能联系，使用形成低氧的核心应答的一列155个经验证和预测的HIF-α靶进行存活风险预测，如Benita等人(Nucleic Acids Res37:4587-4602,2009)所确定。发现这155个基因用于将患者分配为高风险和低风险组，只在接受了TACE的患者中观察到存活差异，但在接受了其他疗法或无疗法的患者中观察不到。事实上，当使用类型预测算法将TACE患者分配为应答者或非应答者组时，所有分类方法具有小于0.001的p值。Baysian混合协变量预测器具有最佳的分类表现，91％的患者被正确分类。这些结果表明两组间的HIF-α信号转导的活化存在可能的差异性。

·临床应用

HCC是一种高度异质性疾病，在血管生成、免疫与癌症干细胞种群、以及个体肿瘤的肿瘤微环境和细胞外周围环境有明显差异(Jeng等,Crit Rev Oncol Hematol 94(3):337-347,2015)。HCC的发展是由多种不同的病因引起的，所述病因包括酒精使用和肝硬化、慢性HBV或HCV感染、或非酒精脂肪肝疾病与非酒精脂肪性肝炎(Sanyal等,Oncologist 15(Suppl 4):14-22,2010)，并且这些不同的病因有助于在HCC中观察到的高肿瘤异质性。

目前关于HCC治疗的建议是由临床实践指南推动的，这些指南在全球各地各有不同。北美和欧洲最常用的是Barcelona-Clinic Liver Cancer(BCLC)分期指南(J Hepatol56:908-943,2012)，而在亚洲用的是几个其他的指南***，包括Chinese UniversityPrognostic Index(CUPI分数)(Leung等,Cancer 94:1760-1769,2002)和JapanIntegrated Staging(JIS)(Kudo等,J Gastroenterol 38:207-215,2003)。尽管在这些不同的评分和指南***之间存在差异，但是所有推动治疗的决定是主要基于肿瘤分期和肝功能，少有关注分子肿瘤生物学或者个性化的肿瘤特征。JIS是例外，其在最近更新为在其分类***中包括三个肿瘤生物标记物(Kitai等,Oncology 75(Suppl 1):83-90,2008)。

同位肝移植、局部消融或手术切除被认为是潜在有疗效的HCC治疗，其导致70％-75％的符合条件患者有5年的存活率(Raza和Sood,World J Gastroenterol 20:4115-4127,2014)。然而，大多数HCC患者由于晚期肿瘤阶段和肝功能损伤被认为不符合条件进行有疗效的治疗，相反地，依赖于姑息性治疗，如TACE(Villanueva等，Nat RevGastroenterol Hepatol 10:34-42,2013)，而由于肿瘤复发，这些治疗通常失败(Lin等，Liver Cancer 1:144-158,2012)。对于有晚期HCC的患者，多重激酶抑制剂索拉非尼是唯一批准的***性疗法，然而，只有不到三个月的适度存活效益已得到证实(Llovet等,N EnglJ Med 359:378-390,2008)。在基于分子肿瘤特征的预测和预后生物标志物指导治疗形式的个性化医疗时代，HCC治疗的进展已经落后于其他癌症类型。因此，很需要确定HCC患者的最佳治疗的新方法。

迄今为止，目前还没有用于预测HCC患者对TACE应答的基因标记或生物标记物。为此，本文公开的研究目标为基于基因表达创建临床相关的预后装置，该装置能将HCC患者分类为两组：被预测为对TACE有更多或更少应答的那些。本文公开的研究导致发现并验证了14-基因标记TACE Navigator，其独立地预测了来自亚洲的HCC患者的两个队列中的总存活和早期无病。手术切除后，基因标记不预测未接受辅助疗法或接受了其他形式的辅助疗法的患者的总存活，表明基因标记对TACE治疗应答有特异性，而在肿瘤生物学上无总差异。

在治疗前检查TACE应答者与非应答者之间的基因表达的差异，揭示了由于TACE应答者与非应答者之间的HIF-1α信号转导活化的差异，低氧应答可是潜在的抗性机制。TACE已知诱导低氧主调节因子HIF-1和靶基因VEGF的变化，这是由执行所述步骤期间肝动脉闭塞引起的(Jia等,Chin Med Sci J 26:158-162,2011；Liu等,J Clin Med Res 8:297-302,2016)。若干基因标记成员也可经下游途径直接与HIF-1α关联，以提供进一步证明在TACE步骤期间的低氧应答可在TACE治疗抗性中发挥作用。

·实施例3：TACE Navigator基因标记测定

可工程化所定制和独特的装置，其包括允许检测15个标记基因(表3)和6个管家基因(选择基于高基因表达，在肿瘤和非肿瘤组织中表达相似，并且在LCI队列的肿瘤与非肿瘤组织之间的变化的量低)的表达的试剂。在独立的亚洲队列TIGER-LC队列中也验证这些管家基因，所述TIGER-LC队列由来自泰国的患者组成(图8A和图8B)。

在一个实施例中，针对14或15个标记基因和6个管家基因的探针来自NanoStringTechnologies(例如，NanoStringAnalysis System)。因此，这些探针可用于本文提供的方法。

·表7代码集设计/>

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表8代码集同种型覆盖/>

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鉴于本公开的原理可应用其中的许多可能的实施方案，应认识到所示的实施方案仅仅是本发明的实施例，不应认为是限制本发明的范围。相反地，由以下权利要求限定本发明的范围。因此，我们要求落入这些权利要求的范围和精神内的所有内容都是我方的发明。

序列表

<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）

<120> 基因标记预测肝细胞癌对经导管动脉化疗栓塞(TACE)的应答

<130> 4239-96438-02

<150> US 62/292,789

<151> 2016-02-08

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tgcagaagga gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc 60

ctgagcgcaa gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggttacata tattttcaca aggctccttc tcctgaaaaa gccgaggagg agagtgagag 60

gcttctgagg gaactctatt tgtttgatgt tctccgcgca 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

cgggcattcc tgaagctgac agcattcggg ccgagatgtc tcgctccgtg gccttagctg 60

tgctcgcgct actctctctt tctggcctgg aggctatcca 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ggtacctatg gagttgtgta taagggtaga cacaaaacta caggtcaagt ggtagccatg 60

aaaaaaatca gactagaaag tgaagaggaa ggggttccta 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ccagagacat ccgttaagga gatcgatgag ttggttgagg tctacacgga cgtgaaacac 60

cgctggaagg cggagaattt cattttcatg ggtgacttca 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

acaagccctt gcgcctgcct ctccaggatg tctacaaaat tggtggtatt ggtactgttc 60

ctgttggccg agtggagact ggtgttctca aacccggtat 100

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gctttgtcct aacctggagc atctggatct tacccagact gacatttcag attctgcatt 60

tgacagttgg tcttggcttg gttgctgcca gagtcttcgg 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

cgccctccga tttcctctcc gcttgcaacc tccgggacca tcttctcggc catctcctgc 60

ttctgggacc tgccagcacc gtttttgtgg ttagctcctt 100

<210> 9

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

tgccctcccg cacacttgga ccagtgctgt tgacccggaa gcggacattt ctgcagctat 60

tctaagcaca cgtcggcgga gggagcggga cgtggccagc 100

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ggagagtagg aaactgtact ttatctcggc atcctcttga atgatagtgc aagtttctcc 60

agttgggatg ttgtctctgc ccggttggac ctcctccctt 100

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

acagatacca ccgccgaact cgcagtctcc ctgctactta ccacctgccg ccggttgccg 60

gaggccatcg aggaagtgaa gaatggtggc tggacctcgt 100

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

cggtcgtgat gtggtctgtg gccaacgagc ctgcgtccca cctagaatct gctggctact 60

acttgaagat ggtgatcgct cacaccaaat ccttggaccc 100

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

atgttgttcg gtcagccctt ccctaattac acctatcccc tacacataca tgcacataga 60

cacacacatg aacacactga agatatttcc ttcaggtgtg 100

<210> 14

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

aacttcctgg ctccttcact gaacatgcct agtccaacat tttttcccag tgagtcacat 60

cctgggatcc agtgtataaa tccaatatca tgtcttgtgc 100

<210> 15

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

cacggtgaag cccaatgcaa acagaattgc tttagatttc caaagaggga atgatgttgc 60

cttccacttt aacccacgct tcaatgagaa caacaggaga 100

<210> 16

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

tgattaactc cgtggactcc tgactctttc ttcgcccgga acatcaatat gtgtcatgtc 60

attgtcacct gtcgctcgat gctctggacc ttgctgagta 100

<210> 17

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gccactgggc ctggagaatg ggaacattgc caactcacag atcgccgcct cgtctgtgcg 60

tgtgaccttc ttgggtttgc agcattgggt cccggagctg 100

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

agcagatgta gagggagaac tcttagcgtg caggaatcta atgccatcag caggcaaagc 60

catgcacacg cctaaaccat cagtaggtga agagaaagac 100

<210> 19

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

cagcgctcgc tgacagcttg ggaggaaacc tgagatctgt gttttttaaa ttgatcgttc 60

ttcatggggg taagaaaagc tggtctggag ttgctgaatg 100

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg atcttcacag tgctcctgca 60

gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 100

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

cacctggtcc tgcgcctgag gggtggctgt taattcttca gtcatggcat tcgcagtgcc 60

cagtgatggc attactctgc actatagcca tttgccccaa 100

Claims

1.特异性结合多个基因的结合剂在制备用于一种检测表明肝细胞癌(HCC)是否将对经动脉化疗栓塞(TACE)应答的多个基因的表达的方法的试剂盒中的用途，所述方法包含：

检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中的天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)和泛素B(UBB)相对于对照的表达；并且

所述多个基因由ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB组成。

2.权利要求1的用途，其中ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBB相对于所述对照的表达的调节表明所述HCC是否将对TACE应答。

3.权利要求1或权利要求2的用途，所述方法还包含检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中的GABA(A)受体相关蛋白样3,假基因(GABARAPL3)相对于对照的表达。

4.权利要求3的用途，其中GABARAPL3相对于所述对照的表达的调节表明所述HCC是否将对TACE应答。

5.权利要求2的用途，其中ASNS、CDKl、FBXL5、IARS、LGALS3、LHFPL2、MKI67和UBB相对于所述对照的表达增加以及DNASE1L3、GOT2、GRHPR、MFGE8、PEBP1和TNFSF10相对于所述对照的表达降低表明所述HCC将对TACE应答。

6.权利要求5的用途，其中ASNS、CDKl、FBXL5、IARS、LGALS3、LHFPL2、MKI67和UBB相对于所述对照的表达增加以及DNASE1L3、GABARAPL3、GOT2、GRHPR、MFGE8、PEBP1和TNFSF10相对于所述对照的表达降低表明所述HCC将对TACE应答。

7.权利要求1的用途，所述方法还包含检测1至10个或1至6个管家基因或蛋白质的表达。

8.权利要求7的用途，其中所述管家基因或蛋白质包含β-肌动蛋白(ACTB)、β-2-微球蛋白(B2M)、延伸因子1-α1(EEF1A1)、铁蛋白轻链(FTL)、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)和乳酸脱氢酶A(LDHA)中的1个、2个、3个、4个、5个或6个。

9.权利要求1的用途，其中所述对照为参考值或非肿瘤组织样本，其中所述参考值衍生自得自一组健康对照对象或得自一组HCC患者的非肿瘤组织的平均表达值。

10.权利要求9的用途，其中所述非肿瘤组织样本为来自有HCC的对象的非肿瘤肝组织或来自健康对象的肝组织。

11.权利要求1的用途，其中所述诊断有HCC的对象有慢性病毒感染。

12.权利要求1的用途，其中所述诊断有HCC的对象有肝硬化。

13.权利要求1的用途，其中检测基因表达包含用显微镜装置检测ASNS、CDKl、DNASE1L3、FBXL5、GOT2、GRHPR、IARS、LGALS3、LHFPL2、MFGE8、MKI67、PEBP1、TNFSF10和UBBmRNA的水平。

14.权利要求13的用途，其中检测基因表达还包含用显微镜装置检测GABARAPL3 mRNA的水平。

15.权利要求1的用途，所述方法还包含将基因表达值转换为z分数。

16.权利要求15的用途，所述方法还包含应用预后指数方程来预测所述HCC是否将对TACE应答。

17.探针组在制备用于一种检测表明肝细胞癌(HCC)是否将对经动脉化疗栓塞(TACE)应答的多个基因的表达的方法的试剂盒中的用途，所述方法包含：

检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)和泛素B(UBB)相对于对照的表达，

其中所述探针组由如下组成：

(a)对天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)和泛素B(UBB)中的每一个有特异性的核酸探针，其中所述核酸探针包含捕获探针和报告探针，其中所述报告探针含有一个或多个可检测标记物；

(b)对天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)、泛素B(UBB)和GABA(A)受体相关蛋白样3,假基因(GABARAPL3)中的每一个有特异性的核酸探针，其中所述核酸探针包含捕获探针和报告探针，其中所述报告探针含有一个或多个可检测标记物；

(c)对天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)、泛素B(UBB)、β-肌动蛋白(ACTB)、β-2-微球蛋白(B2M)、延伸因子1-α1(EEF1A1)、铁蛋白轻链(FTL)、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)和乳酸脱氢酶A(LDHA)中的每一个有特异性的核酸探针，其中所述核酸探针包含捕获探针和报告探针，其中所述报告探针含有一个或多个可检测标记物；或

(d)对天冬酰胺合成酶(ASNS)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ-样3(DNASE1L3)、F-box与富含亮氨酸重复蛋白5(FBXL5)、线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、乙醛酸-还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)、异亮氨酰-tRNA合成酶(IARS)、可溶性半乳糖苷结合凝集素3(LGALS3)、脂肪瘤HMGIC融合伴侣样2蛋白(LHFPL2)、乳脂肪球-EGF因子8蛋白(MFGE8)、抗原Ki-67(MKI67)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、肿瘤坏死因子超家族成员10(TNFSF10)、泛素B(UBB)、GABA(A)受体相关蛋白样3,假基因(GABARAPL3)、β-肌动蛋白(ACTB)、β-2-微球蛋白(B2M)、延伸因子1-α1(EEF1A1)、铁蛋白轻链(FTL)、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)和乳酸脱氢酶A(LDHA)中的每一个有特异性的核酸探针，其中所述核酸探针包含捕获探针和报告探针，其中所述报告探针含有一个或多个可检测标记物。

18.权利要求17的用途，所述方法还包含用权利要求14-17任意一项的探针组检测得自诊断有HCC的对象的HCC样本中GABA(A)受体相关蛋白样3,假基因(GABARAPL3)相对于对照的表达。

19.权利要求1和权利要求17-18任意一项的用途，其中所述TACE包含顺铂、阿霉素、丝裂霉素和多比柔星中的一种或多种。

20.权利要求1和17-18任意一项的用途，所述方法还包含测量来自所述对象的血液样本中的甲胎蛋白(AFP)。

21.权利要求17的用途，其中所述核酸探针的长度为至少30个核苷酸。

22.权利要求17的用途，其中所述捕获探针和所述报告探针各自的长度为大约50个核苷酸。