CN106190887A - 一种枯草芽孢杆菌t400及其菌剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法，所述枯草芽孢杆菌T400保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015755，该枯草芽孢杆菌T400可以通过自生固氮补充作物生长过程中所需要的氮素，还能够分泌生长素促进植物生长。所述枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）培养基培养：利用发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）菌体回收；（5）菌剂制备。本发明的工艺简单成熟，可规模化生产，制得的枯草芽孢杆菌T400具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，应用范围广，经济效益高。

Description

一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法。

背景技术

随着世界人口的不断增长，全球农业对化学氮肥的需求也在逐年增加。化学氮肥使用极大提高了农业粮食的产量，但同时也带来了严重的环境污染和土壤肥力下降等负面影响。在自然界中，某些原核微生物在常温常压下通过固氮酶将大气中的分子氮（N₂）转化为氨（NH₃），这一过程称为生物固氮，这类微生物称为固氮微生物。据***粮农组织统计，地球上结合态氮总量有70%来源于生物固氮，每年全球微生物固定的氮素量可达2亿吨，约占全球作物需氮量的3/4，相当于工业生产氮肥的3倍多。通过生物固氮为农作物提供氮源、提高产量、降低化肥用量、减少生产成本，同时促进了农业的可持续发展，是最节能、环保、生态友好的氮素供应方式。因此，利用各种方式进行生物固氮是目前全球所关注的一个重要问题。

根据固氮微生物与宿主之间的结合关系，可以将固氮作用分为自生固氮和共生固氮，前者如棕色固氮菌、克氏肺炎杆菌、巨大芽孢杆菌等，后者如根瘤菌和放线菌。其中，根瘤菌研究已经超过100年的历史，是迄今研究的最为清楚的生物固氮体系，并且在美国、巴西、阿根廷、澳大利亚等应用广泛。但是，根瘤菌具有非常苛刻的专一侵染性，仅限于豆科作物生产使用，与禾本科等作物不能实现共生固氮。因此，通过定植于根际、根表，或者进入根的皮层组织的自生固氮微生物与水稻、玉米、甘蔗等禾本科作物联合固氮具有十分重要的应用前景。

自生固氮微生物是通常在自然环境或培养基中独立生活，而且可以将大气中的分子态氮固定为氨的一类微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物联合就能固氮，有条件宽、适应广的特点而且还能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生长发育，自生固氮菌能够改善植物根际的微生态群落，起到促进植物生长，提高植物抗逆性的作用。但是由于国内外特别是国内对自生固氮菌的研究起步较晚，大大限制了微生物菌剂在农业上的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌T400，该功能微生物菌种枯草芽孢杆菌T400可以通过自生固氮补充作物生长过程中所需要的氮素，还能够分泌生长素促进植物生长。

本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产，制得的枯草芽孢杆菌T400具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，应用范围广，经济效益高。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种枯草芽孢杆菌T400，所述枯草芽孢杆菌分类命名：枯草芽孢杆菌T400Bacillus subtilis T400，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCollection)，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期;2015年12月15日，保藏编号：CCTCCNO：M2015755。

所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为600.000-800.000 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸IAA，吲哚乙酸浓度为95-103 mg/L。优选地，该枯草芽孢杆菌T400为含有芽孢的革兰氏阳性菌。

具体地，该枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性测定方法如下：

试验方法：

采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5 mL半固体培养基的10 mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24 h后，注入1/10体积的10%乙炔气体，继续培养24 h，从试管中抽取0.5 mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小（北京农业大学微生物专业编，1986）：

C=(h _x×c×V)/(24.9×h _s×t) (2.1)

其中，h _x为样品峰面积值；h _s为标准C₂H₄峰面积值；c为标准C₂H₄浓度(nmol/mL)；

V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C₂H₄浓度[nmol/(mL·h)]。

试验结果：

结果分析，如图4所示，根据公式 (2.1) 计算可得固氮酶活性为600.000-800.000nmol/(mL·h)。由此可以说明，枯草芽孢杆菌T400在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。

具体地，该枯草芽孢杆菌T400的吲哚乙酸定性含量测定方法为：

生长素定性含量测定

（1）挑取菌株分别接种（OD ₆₀₀=1.0，0.5mL菌悬液）到盛有50mL King液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。

（2）接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。

（3）取上述在King液体培养基上生长3d后的菌悬液50µL置于透明离心管中，同时加50µL比色液。

（4）设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50µL浓度为10mg/L的植物生长激素（IAA），同时加50µL比色液。阴性对照中加50µLKing液体培养基，同时加50µL比色液。

（5）将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。培养基为King培养基(1L)；试剂配方为蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.725g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，丙三醇 15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。

生长素定量测定

参照 Riberio 等的方法略加改动。菌株T400接种到含有1 g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180 r/min，振荡培养 48 h。将培养液10000 r/min离心 5 min，取100 mL上清液加到 96孔板中，与 100mL Salkowski’s 试剂（1 mL 0.5 mol/L FeCl₃和 49 mL 35%高氯酸）混匀，室温静置 30 min，在波长 530 nm下用酶标仪测定吸光度。如图5所示，用不同浓度的IAA 标准品制作标准曲线，测定结果见表1。

表1 菌株T400 IAA测定结果

菌株	T400	T665	T808	T188
					IAA浓度（mg/L）	98.36	90.12	86.86	21.57

从图5和表1可以看出，枯草芽孢杆菌T400的生长素浓度为98.36 mg/L，因此，可以判断枯草芽孢杆菌T400在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。

所述枯草芽孢杆菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。

一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，包括以下步骤：

（1）分离、筛选

选取含有枯草芽孢杆菌T400的固氮菌菌落的土样，经分离、筛选，培养得到固氮菌菌落。

（2）纯化、保存

在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，保存该单菌落备用。图1为分离得到的枯草芽孢杆菌T400单菌落在显微镜下放大1000倍的菌落图。

（3）培养基培养：利用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌T400单菌落，得到微生物菌液；

培养条件为：影响微生物生长繁殖的环境因素有很多，对发酵影响较大的有装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH、和发酵时间。

（4）菌体回收

将发酵罐生产的微生物菌液接入无菌的碟式分离机，离心收集枯草芽孢杆菌T400菌体，快速脱去水分，制备干燥的纯菌粉，测定芽孢数为500-800亿/g。

（5）菌剂制备

将干燥纯菌粉与基质物料滑石粉和草炭完全混合，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-20亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/g以上，即得到枯草芽孢杆菌T400菌剂。

优选地，所述步骤（1）中，分离、筛选的具体方法为：在土样中加入无菌水，震荡，静置，取上清液离心处理，弃上清液，保留沉淀物，加入无菌水悬浮，离心，去沉淀，取上清液再离心，弃上清液，保留沉淀物，加入磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；将样品液加入磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释的菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取菌悬液涂布于无氮培养基，培养得到固氮菌菌落。

更具体地，分离、筛选的方法为：从广东省东莞市常平镇黄泥塘农场采取500 g 土样，加入3 L含0.01%吐温80的无菌水，震荡10min，静置半个小时，取上清液于20℃下8000rpm离心20min。弃上清液，保留沉淀物，加入30-50 mL含0.01%吐温80的无菌水悬浮，液体于20℃ 5000 rpm离心5秒钟，去沉淀，将上清液倒入一个干无菌离心管中于20℃下6000 rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用10 mL的pH7.0磷酸缓冲液悬浮，取1 mL上述样品液与9 mL磷酸缓冲液悬浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释的菌悬液置于75℃水浴加热15 min，自然冷却后吸取100µL涂布于无氮培养基，30℃培养36-48小时获得含枯草芽孢杆菌T400的固氮菌菌落。

优选地，所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于28-33℃恒温培养36-48小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于28-33℃恒温培养36-48小时后置于2-5℃冰箱中保存。

优选地，所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的70-75%；发酵罐装液量要根据发酵罐的实际大小来调控，装液太多会导致污染，装液量太少也会造成资源浪费的情况。

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为5-10%；

接种量是指移种的种子液体积与发酵液体积之比。适当的接种量可调节培养液黏度和溶解氧含量，缩短生长达到高峰的时间、使产物提前合成。发酵时间与菌体生长繁殖的关系可以通过生长曲线得出，最适的发酵时间能够使得菌体的代谢量达到最大，而又不会出现菌体自溶的现象，确保发酵结果的准确性。

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为30-36℃；

微生物的生长和产物的合成均需要在其各自最合适的温度下进行。温度是保证酶活的重要条件，故在发酵过程中必须保证最适的温度环境。

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为150-300rpm；

发酵过程中的摇床转速使培养物混合均匀，确保每一个液体空间保持相同的生长时期，同时加大转速可以增加空气接触面积，提高培养基中溶解氧的浓度。

（3.5）通气量：在发酵工艺的研究方面，多以好氧发酵为主，氧主要是作为呼吸链的终端电子受体。好氧微生物通过有氧呼吸将有机物转化为CO₂、H₂O，并获取能量。枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在0.9-1.2vvm，优选地，通气量控制在1.04vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.15-1.6vvm，优选地，通气量控制在1.35vvm，接种后43-48小时，通气量控制在1.4-1.8vvm，优选地，设定通气量为1.63vvm。

（3.6）pH：pH是微生物生长和产物合成的非常重要的影响参数，是衡量代谢活动的综合指标。pH的变化会影响到各种酶活、菌对基质的利用速率和细胞的构造，从而影响菌的生长和产物的合成。在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.1-7.4。

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定42-48小时为发酵终点。

优选地，所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃1.0-1.4g，MgSO₄·7H₂O 0.6-1.2g，K₂HPO₄ 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.005g，NaMO4·2H₂O 0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.1-7.4。当然，按照上述质量的质量比也属于本发明的保护范围。

优选地，所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括有以下步骤：

（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；

（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。

革兰氏染色和芽孢染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可以缩小鉴定范围。未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察。革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属于革兰氏阳性（G⁺）或者革兰氏阴性菌（G^-），用以分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在安全隐患，在农业微生物应用过程中直接高温灭菌后舍弃结构特征，存在可能致病性的隐患。芽孢染色将菌体内的芽孢进行染色，可以直观观察芽孢的大小、位置、形状等特点，进一步缩小其鉴定范围。芽孢杆菌具有保质期长，易于存放的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。

通过图2的革兰氏染色结果图和图3的芽孢染色结果图可以看出，枯草芽孢杆菌T400为革兰氏阳性菌，且含有芽孢。

优选地，所述步骤（S1）革兰氏染色的具体方法为：

（S1.1） 涂片:在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质；在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀；将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞；

（S1.2）初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色；

（S1.3）媒染：先用新配的碘液（碘 1.0g、碘化钾 2.0g、蒸馏水 300.0mL）冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗；

（S1.4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗；

（S1.5）复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干；

（S1.6）镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。

优选地，所述步骤（S2）芽孢染色的具体方法为：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1-2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。用蒸馏水冲洗掉染液，风干后，将载玻片置于光学显微镜下观察。

本发明的有益效果：

（1）固氮：枯草芽孢杆菌属广泛存在于土壤、植物根际等环境中，具有菌种安全、功能多样、生产方便、保质期长等优点，是目前我国微生物肥料生产广泛应用的菌种之一，在微生物肥料应用领域具有十分可观的经济价值。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为600.000-800.000 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生的吲哚乙酸浓度为95-103 mg/L。

（2）减少氮素投入：玉米大田示范试验中，在施肥成本基本一致的基础上，试验组节氮率达17.2%，而增产率达29.24%，显著地提高了玉米的产量，说明施用T400菌剂在减少氮素投入的同时能够带来更大的经济效益。

（3）促进作物生长：玉米大田示范试验中，试验组的株高、茎粗、棒叶面积均高于对照组，相对穗位高和倒伏率均低于对照组，充分说明T400菌剂对玉米的生长具有显著的促进作用。

附图说明

图1为分离得到的枯草芽孢杆菌T400单菌落在显微镜下放大1000倍的菌落图。

图2为枯草芽孢杆菌T400革兰氏染色结果图。

图3为枯草芽孢杆菌T400芽孢染色结果图。

图4为枯草芽孢杆菌T400固氮酶活性测定结果图。

图5为枯草芽孢杆菌T400 IAA比色效果图。

图6为枯草芽孢杆菌T400菌剂的玉米盆栽试验效果图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步描述，见图1-6所示。

实施例1

本实施例的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，包括以下步骤：

（1）分离、筛选

选取具有枯草芽孢杆菌T400固氮菌菌落的土样，经分离、筛选，培养得到固氮菌菌落；

（2）纯化、保存

在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，保存该单菌落备用；

（3）培养基培养：利用发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；

（4）菌体回收

将微生物菌液接入无菌的碟式分离机，离心收集枯草芽孢杆菌T400菌体，快速脱去水分，制备干燥的纯菌粉，测定芽孢数为500亿/g；

（5）菌剂制备

将干燥纯菌粉与基质物料混合，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是5亿/g，即得到枯草芽孢杆菌T400菌剂。

所述枯草芽孢杆菌T400，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015755。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为680.604 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸浓度为98.36mg/L。所述枯草芽孢杆菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。

所述步骤（1）中，分离、筛选的具体方法为：在土样中加入无菌水，震荡，静置，取上清液离心处理，弃上清液，保留沉淀物，加入无菌水悬浮，离心，去沉淀，取上清液再离心，弃上清液，保留沉淀物，加入磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；将样品液加入磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释的菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取菌悬液涂布于无氮培养基，培养得到固氮菌菌落。

所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于32℃恒温培养38小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于31℃恒温培养42小时后置于4℃冰箱中保存。

所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的75%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为5%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为32℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为200rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在1.04vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.35vvm，接种后43-48小时，设定通气量为1.63vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.2；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定46小时为发酵终点。

所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.0015g，NaMO4·2H₂O 0.05g，蔗糖5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.1。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于，所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括有以下步骤：

（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；

（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。

所述步骤（S1）革兰氏染色的具体方法为：

（S1.1） 涂片:在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质；在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀；将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞；

（S1.2）初染：滴加4滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色；

（S1.3）媒染：先用新配的碘液冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗；

（S1.4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约18秒后，立即用流水冲洗；

（S1.5）复染：滴加1滴番红染色液，染4min，水洗后用吸水纸吸干；

（S1.6）镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。

所述步骤（S2）芽孢染色的具体方法为：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。

本实施例的其余内容与实施例1相同，这里不再赘述。

实施例3

本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的制备方法中，步骤（4）菌体回收，测定芽孢数为600亿/g；步骤（5）菌剂制备，检测结果显示该活菌数范围是8亿/g。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为692 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸浓度为98.2mg/L。

所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于28℃恒温培养48小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于28℃恒温培养48小时后置于2℃冰箱中保存。

所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的71%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为6%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为31℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为180rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在0.9vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.15，接种后43-48小时，通气量控制在1.4vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.2；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定48小时为发酵终点。

所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃ 1.2g，MgSO₄·7H₂O 0.8g，K₂HPO₄ 1.3g，NaCl 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，NaMO4·2H₂O 0.06g，蔗糖6g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.2。

本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。

实施例4

本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的制备方法中，步骤（4）菌体回收，测定芽孢数为700亿/g；步骤（5）菌剂制备，检测结果显示该活菌数范围是10亿/g。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为700 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸浓度为101.45 mg/L。

所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于30℃恒温培养36小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于30℃恒温培养36小时后置于3℃冰箱中保存。

所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的73%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为8%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为34℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为250rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在1.0vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.21vvm，接种后43-48小时，通气量控制在1.6vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.3；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定42小时为发酵终点。

所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃ 1.3g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，K₂HPO₄ 1.6g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.003g，NaMO4·2H₂O 0.08g，蔗糖8g，琼脂19g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.3。

本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。

实施例5

本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的制备方法中，步骤（4）菌体回收，测定芽孢数为750亿/g；步骤（5）菌剂制备，检测结果显示该活菌数范围是15亿/g。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为750.346 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸浓度为95.9 mg/L。

所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于32℃恒温培养40小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于32℃恒温培养40小时后置于3℃冰箱中保存。

所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的74%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为9%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为34℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为285rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在1.1vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.45vvm，接种后43-48小时，通气量控制在1.72vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.4；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定48小时为发酵终点。

所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃ 1.3g，MgSO₄·7H₂O 1.1g，K₂HPO₄ 1.8g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.004g，NaMO4·2H₂O 0.09g，蔗糖9g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.4。

本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。

实施例6

本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的制备方法中，步骤（4）菌体回收，测定芽孢数为800亿/g；步骤（5）菌剂制备，检测结果显示该活菌数范围是20亿/g。所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为786.375 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸浓度为99.2mg/L。

所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于33℃恒温培养36小时分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，于33℃恒温培养36小时后置于5℃冰箱中保存。

所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的75%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为10%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为36℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为300rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在1.2vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.6vvm，接种后43-48小时，通气量控制在1.8vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.4；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定42小时为发酵终点。

所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃1.4g，MgSO₄·7H₂O 1.2g，K₂HPO₄ 2.0g，NaCl0.4g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，NaMO4·2H₂O 0.1g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.4。

本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。

本发明的枯草芽孢杆菌T400的16S rDNA基因序列菌种鉴定

细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期以来，国际上通用的“正式的”或“官方的”细菌分类方法是以《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难以明确对该菌株进行鉴定。目前，细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结论。其中DNA序列分析的16S rRNA基因进化发育***已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段(Kim et al，2004；Prap et al，1997)。

核糖体16S rDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用保守区域设计的通用引物，可以扩增出所有细菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技术的基本原理是从微生物样本中提取16S rDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rDNA的序列信息，再与16S rDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16S rDNA片段保守区域设计的通用引物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此通过对某菌株16S rDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可的。

、鉴定方法

（1）PCR反应体系(25 μL) ：

10×PCR Buffer 2.5μL

dNTP(2.5mM) m 2.0μL

引物 27F（10μM） 0.5μL

引物 1492R（10μM） 0.5μL

DNA模板 100ng

Taq 酶(5U/μL) 0.5μL

ddH₂O 19μL

（2）PCR 反应条件 ：95℃预变性 5 min，95℃ 变性 30 s，58℃ 退火 30 s，72℃延伸80 s，35 个循环，72℃延伸 10 min。使用ABI 3730 xl DNA分析仪(应用生物***公司) 进行DNA测序。

、测序结果

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg

atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata

gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgaca

3、同源性分析

鉴定本细菌为Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。

应用例：将本发明的枯草芽孢杆菌T400菌剂进行玉米和水稻盆栽试验

1、育苗

将玉米和水稻种子温水中浸泡过夜，播种于装有土壤的塑料杯，自然条件育苗12-14天，植株大约10cm时，选择长势均匀的玉米和水稻移栽到花盆中。

2、土壤预处理

土壤风干后，过1 mm筛。每个处理设置3个重复。每个花盆分别装有土壤4.0 kg，尿素407 mg、过磷酸钙162 mg和硫酸钾418 mg。。

3、试验设置

选用具有自生固氮及促进作物生长功能的枯草芽孢杆菌T400菌剂进行盆栽效果对比试验，每盆添加菌剂1g。设置膨润土添加为对照实验，每盆添加膨润土1g。每天浇水适量，每盆的水量相同、播洒均匀，不要使水流出盆底以免肥料损失而产生误差。

4、试验结果

移苗45天后，测定水稻分蘖数、株高和叶绿素含量。数据采用SPSS 17.0进行统计分析。第64天后，测定玉米株高、叶片数及其单株鲜重。可以得出接种T400枯草芽孢杆菌菌剂可以明显促进玉米和水稻生长，见表2，表3和图6。

表2 菌剂T400水稻盆栽试验结果

注：同列肩注不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

表3 菌剂T400玉米盆栽试验结果

菌株	株高(cm)	叶片数(片)	单株鲜重(g)
				T400	106.0	10.5	42.2
CK	77.6	8.8	29.2

从表2，表3和图6可以看出，利用本发明的枯草芽孢杆菌T400菌剂进行水稻和玉米盆栽试验，菌剂T400显著地提高了水稻的分蘖数、株高和叶绿素含量，分蘖数的增加率达70.67%，株高的增加率为19.34%，叶绿素含量的增加率为49.34%。玉米植株的株高为对照处理的植株株高的1.36倍，叶片数为对照处理的叶片数的1.19倍，单株植株鲜重是对照处理的1.44倍。

本发明由广东省引进创新创业团队项目资助研发，制得的枯草芽孢杆菌T400及其菌剂具有广阔的市场前景，经济效益高。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>东莞市保得生物工程有限公司

<120>一种枯草芽孢杆菌T400及其菌剂制备方法

<130>0

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>959

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T400的16s rDNA基因序列

<400>1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420

gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgaca 959

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015755。

2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400的固氮酶活性为600.000-800.000nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生的吲哚乙酸浓度为95-103mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌T400，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。

4.权利要求1-3任意一项所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

分离、筛选

选取含有枯草芽孢杆菌T400的固氮菌菌落的土样，经分离、筛选，培养得到固氮菌菌落；

纯化、保存

在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，保存该单菌落备用；

（3）培养基培养：利用培养基发酵培养枯草芽孢杆菌T400单菌落，得到微生物菌液；

菌体回收

将微生物菌液离心收集枯草芽孢杆菌T400菌体，快速脱去水分，制备干燥的纯菌粉，测定芽孢数为500-800亿/g；

（5）菌剂制备

将干燥纯菌粉与基质物料混合，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-20亿/g，即得到枯草芽孢杆菌T400菌剂。

5.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，分离、筛选的具体方法为：在土样中加入无菌水，震荡，静置，取上清液离心处理，弃上清液，保留沉淀物，加入无菌水悬浮，离心，去沉淀，取上清液再离心，弃上清液，保留沉淀物，加入磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；将样品液加入磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释的菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取菌悬液涂布于无氮培养基，培养得到固氮菌菌落。

6.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中纯化、保存的具体方法为：将步骤（1）培养得到固氮菌菌落于28-33℃恒温培养36-48小时，分离得到枯草芽孢杆菌T400单菌落，将单菌落保存在试管中，于28-33℃恒温培养36-48小时后置于2-5℃冰箱中保存。

7.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）的培养基培养对发酵罐装液量、接种量、培养温度、转速、通气量、pH和发酵时间作进一步限定，具体为：

（3.1）装液量：发酵罐装液量为罐体体积的70-75%；

（3.2）接种量：枯草芽孢杆菌T400的接种量为5-10%；

（3.3）培养温度：枯草芽孢杆菌T400的摇瓶培养温度为30-36℃；

（3.4）转速：发酵过程中枯草芽孢杆菌T400的摇床转速为150-300rpm；

（3.5）通气量：枯草芽孢杆菌T400的通气量按照不同培养时间进行设定，接种后0-12小时，通气量控制在0.9-1.2vvm，接种后13-42小时，通气量控制在1.15-1.6vvm，接种后43-48小时，通气量控制在1.4-1.8vvm；

（3.6）pH：在枯草芽孢杆菌T400发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH保持为7.1-7.4；

（3.7）发酵时间：根据枯草芽孢杆菌T400在摇瓶中的生长情况，设定其发酵时间为42-48小时。

8.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）培养基培养中，所述培养基由以下质量的原料组成：CaCO₃ 1.0-1.4g，MgSO₄·7H₂O0.6-1.2g，K₂HPO₄ 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO₄·7H₂O 0.001-0.005g，NaMO₄·2H₂O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000mL，所述培养基的pH为7.1-7.4。

9.根据权利要求4所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括以下步骤：

（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；

（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。

10.根据权利要求9所述的一种枯草芽孢杆菌T400的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（S1）革兰氏染色的具体方法为：

（S1.1） 涂片:在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除载玻片上的杂质；在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个枯草芽孢杆菌T400单菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀；将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞；

（S1.2）初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色；

（S1.3）媒染：先用新配的碘液冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min后水洗；

（S1.4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗；

（S1.5）复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干；

（S1.6）镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。