CN116479026B - 一种真菌病毒诱导的基因沉默载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真菌病毒诱导的基因沉默载体及其构建方法和应用，属于基因工程领域。该真菌病毒诱导的基因沉默载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其构建方法包括(1)将真菌病毒FgGMTV1/HB58的3个单链环状DAN分子DNA‑A、DNA‑B和DNA‑C串联并导入同一载体，构建重组载体；(2)对所述重组载体中的DNA‑C分子的编码蛋白p26进行缺失突变，获取真菌病毒诱导的基因沉默载体。本发明构建通过缩短DNA‑A、DNA‑B和DNA‑C并串联后导入同一载体构建的基因沉默载体，经试验，结果显示该基因沉默载体可以有效控制小麦赤霉病，为小麦赤霉病的防控提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种真菌病毒诱导的基因沉默载体及其构建方法和应用。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)是利用RNA介导的植物抗病毒机制进行植物基因功能研究的一种技术。其原理是在病毒载体中***目的基因片段并侵染寄主植物，当植物自身免疫***在识别病毒和目的基因的同时，将内源目的基因mRNA降解，使植物出现目的基因功能丧失或表达水平下降的表型。VIGS启动时，目的基因片段先在RNA介导的RNA聚合酶作用下合成大量双链RNA(dsRNA)。在细胞中dsRNA被RNaseⅢ家族类的特异性核酸内切酶Dicer类似物切割成19-24nt的siRNA。siRNA以单链形式与特定蛋白结合形成RNA介导沉默复合物(RISC)，该复合体能特异地与细胞质中目的基因的mRNA结合，导致目的基因mRNA降解，使被侵染的植株表现出目的基因突变性状，从而直接推断目的基因的功能或提供间接生物学证据。随着VIGS技术发展的不断成熟和研究的不断深入，该技术已经广泛的应用在植物抗性、生长发育以及代谢调控等相关功能基因的研究鉴定，在植物性状改良和植物保护等方面具有良好的发展及应用前景。
禾谷镰孢菌单链DNA病毒Fusarium graminearum gemytripvirus 1(FgGMTV1)是多组分的单链环状DNA病毒，包含三个单链环状DNA片段：DNA-A、DNA-B和DNA-C，分子大小分别是1316nt，1320nt和1309nt，分别编码复制起始蛋白(Replication initiationprotein,Rep)、外壳蛋白(Coat protein,CP)和未知功能蛋白。本实验室已成功构建FgGMTV1侵染性克隆，明确了各个组分之间的关系：DNA-A和DNA-B是病毒复制和侵染所必须的，二者共同侵染可以显著抑制寄主真菌的生长、孢子产量和致病力，但是病毒不稳定，也不会通过分生孢子垂直传播；DNA-C的复制和增殖依赖于DNA-A和DNA-B，含有三组分的病毒稳定，可以通过分生孢子传播，但是不影响寄主真菌的表型和致病力。因此，以FgGMTV1侵染性克隆为基本元件，并通过人工的改造构建VIGS的载体也成为一种可能。
小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)主要由禾谷镰孢菌复合种(Fusariumgraminearum complex)等引起的世界性小麦病害。如何防治赤霉病及其导致的毒素污染显得尤为迫切和重要，其直接关系到食品安全、粮食安全和人民健康。化学防治仍是当前赤霉病防控的重要措施，但过分依赖化学防治导致病菌对杀菌剂产生了抗药性；此外，由于缺乏高抗赤霉病的小麦品种，当前乃至今后较长一段时间，小麦赤霉病仍将保持高位发生态势。新的小麦赤霉病防治方法的发掘与探索显得尤其重要。通过成功构建FgGMTV1的VIGS载体，沉默寄主致病性和产毒相关基因，获得的弱毒菌株可以作为生物防治因子，提供了一种新的防治小麦赤霉病的方法。另一方面，所获得的VIGS载体可以被广泛用于禾谷镰孢菌的基因功能研究，解决了用基因敲除方法无法研究致死基因的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种真菌病毒诱导的基因沉默载体及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过禾谷镰孢菌单链环状DNA病毒FgGMTV1诱导的基因沉默载体可以有效的降低被侵染的禾谷镰孢菌的毒素产量和致病力，为防控小麦赤霉病提供了新的方向。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种真菌病毒诱导的基因沉默载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供一种所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将真菌病毒FgGMTV1/HB58的3个单链环状DNA分子DNA-A、DNA-B和DNA-C串联并导入同一载体，构建重组载体；
(2)对所述重组载体中的DNA-C分子的编码蛋白p26进行缺失突变，获取真菌病毒诱导的基因沉默载体。
优选的是，将1.3个拷贝的DNA-A、1.3个拷贝的DNA-B和1.5个拷贝的DNA-C串联后，连接到pBluescriptⅡSK(+)，构建所述重组载体。
优选的是，所述DNA-A的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述DNA-B的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述DNA-C的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
优选的是，所述缺失突变为缺失所述DNA-C的编码蛋白p26的第454-603nt的序列。
本发明还提供一种重组菌，包含所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体。
优选的是，所述真菌病毒诱导的基因沉默载体携带外源基因，所述外源基因包括Tri101基因和FgPP1基因。
本发明还提供一种所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体，或所述的重组菌在防控小麦赤霉病中的应用。
本发明还提供一种所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体，或所述的重组菌在制备防控小麦赤霉病的制剂中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明在前期的研究基础上，缩短DNA-A、DNA-B和DNA-C组分的重复序列，并串联三个组分至同一载体，然后再通过对DNA-C组分编码蛋白p26进行系列缺失突变，筛选出适合作为VIGS载体的候选突变体p26-D4。通过实验验证，所构建的VIGS沉默载体p26-D4载体可容纳75-150bp长度的外源基因，并在野生型禾谷镰孢菌菌株PH-1中有效沉默靶标基因如GPF、Tri101和FgPP1，进一步验证该沉默载体p26-D4携带外源基因侵染禾谷镰孢菌菌株，可以有效防控小麦赤霉病。因此，本发明提供的沉默载体p26-D4为小麦赤霉病的防控提供了新的方向。
附图说明
图1为侵染性克隆pSK-ABC的结构示意图；
图2为FgGMTV1三组分串联的侵染性克隆pSK-ABC的侵染活性分析；其中，A：pSK-ABC转染子Southern blot检测；B：pSK-ABC转染子、菌株PH-1和菌株A+B+C菌落形态比较；C：pSK-ABC转染子、菌株PH-1和菌株A+B+C在PDA培养基上的生长直径比较；D：pSK-ABC转染子、菌株PH-1和菌株A+B+C接种小麦后的致病性比较，左侧为麦穗发病情况，右侧为每麦穗发病小穗数统计；
图3为基于DNA-C的缺失突变体的侵染活性分析；其中，A：缺失突变体p26-D1——p26-D5、菌株pSK-ABC、菌株PH-1(VF)菌落形态比较；B：缺失突变体p26-D1——p26-D5、菌株pSK-ABC、菌株PH-1(VF)的Southern blot检测；C：缺失突变体p26-D1——p26-D5、菌株pSK-ABC、菌株PH-1(VF)在PDA培养基上的生长直径比较；
图4为VIGS载体p26-D4的结构示意图；
图5为VIGS载体p26-D4对GFP基因的沉默效率分析；其中，A：菌株PH-1/WT(VF)、菌株PH-1/GFP(VF)、p26-D4、p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株的菌落形态比较、荧光观察与强度分析；B：菌株PH-1/GFP(VF)、p26-D4、p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F、p26-D4-GFP150R、p26-D4-GFP300F、p26-D4-GFP300R、p26-D4-GFP450F和p26-D4-GFP450R侵染的菌株的Southern blot检测；C：菌株PH-1/WT(VF)、菌株PH-1/GFP(VF)、p26-D4、p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株中GFP基因表达量的比较；
图6为禾谷镰孢菌内源基因Tri101和FgPP1沉默效率分析；其中，A：菌株PH-1/WT(VF)、p26-D4、p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株的Southern blot检测；B：在p26-D4、p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株中，Tri101和FgPP1基因的相对表达量比较；C：在p26-D4、p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株中，TBI诱导产毒液体培养基诱导DON产量比较；D：菌株PH-1/WT(VF)、p26-D4、p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株菌落形态比较；E：p26-D4、p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株接种小麦后的致病性比较，左侧为麦穗发病情况，右侧为每麦穗发病小穗数统计；
图7为VIGS诱导的弱毒菌株防治小麦赤霉病效果分析；其中，A：由左至右依次为共侵染法(Test 1)测定p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株控制小麦赤霉病的发病情况、每麦穗发病小穗数统计及DON积累量；B：由左至右依次为预喷施法(Test 2)测定p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株控制小麦赤霉病的发病情况、每麦穗发病小穗数统计及DON积累量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
本发明实施例中所用禾谷镰孢菌单链DNA病毒FgGMTV1由本实验室分离鉴定，具体参见LI P.(2020).A tripartite ssDNA mycovirus from a plant pathogenic fungusis infectious as cloned DNAand purified virions.Science Advances 6,eaay9634。所使用的野生型禾谷镰孢菌菌株PH-1及具有绿色荧光标签标记的禾谷镰孢菌菌株PH-1/GFP均由本实验室保藏。
实施例1禾谷镰孢菌DNA病毒FgGMTV1三个组分串联的侵染性克隆pSK-ABC构建及侵染活性验证
1、DNA病毒FgGMTV1三个组分串联的侵染性克隆pSK-ABC构建
专利CN109810997 A“一种禾谷镰孢菌单链环状DNA病毒FgGMTV1/HB58侵染性克隆的构建方法”，该发明公开了一种禾谷镰孢菌单链DNA病毒FgGMTV1/HB58侵染性克隆的构建方法，所述构建方法包括DNA-A侵染性克隆构建、DNA-B侵染性克隆构建及DNA-C侵染性克隆构建。将2个单位DNA-A和DNA-B分子序列，以及1.6个单位DNA-C分子序列分别连接到克隆载体pBluescript II SK(+)(pSK)，构建该病毒三个组分的侵染性克隆pSK-2A、pSK-2B和pSK-1.6C。因为3个侵染性克隆质粒同时转染，步骤繁琐，我们将DNA-A和DNA-B分子缩减到1.3个单位，DNA-C分子缩减到1.5个单位，只分别包含三个组分的编码区和2个重复的非编码区序列，串联在一起，连接到载体pBluescriptⅡSK(+)上。同时，在DNA-A、DNA-B和DNA-C序列的两端都加入了合适的酶切位点，以方便进一步的突变体构建(见图1)。在两端分别设计HindⅢ、SacⅠ、SphⅠ、MluⅠ、NcoⅠ、MfeⅠ、SacⅠ、PstⅠ和NotⅠ酶切位点，HindⅢ和NotⅠ双酶切组合用于将该克隆连接至pBluescript SK+克隆载体。在DNA-A和DNA-B之间设计SphⅠ和NheⅠ两个酶切位点，在DNA-B和DNA-C之间设计了NheⅠ、MluⅠ、NcoⅠ和MfeⅠ四个酶切位点，通过对各种酶切位点组合合理使用，以实现对DNA-A、DNA-B和DNA-C三个组分中任意组分的突变。该侵染性克隆序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成并连接至pBluescript SK+克隆载体，获得侵染性克隆pSK-ABC。如下SEQ ID NO：1所示序列为侵染性克隆pSK-ABC的全序列(不含载体)，标阴影底色为酶切位点，虚线为组分A的序列，直线下划线为组分B的序列，波浪线为组分C的序列。HindⅢ和NotⅠ双酶切用于将该序列连接至pBluescript SK+克隆载体。SEQ IDNO：1为：
2、禾谷镰孢菌原生质体制备
接种PDA平板上的赤霉菌到装有100mL CMC液体培养基的250mL三角瓶中，25℃，180rpm培养3-5天(优选4天)；用灭菌的三层擦镜纸过滤培养基，在室温下4000rpm离心5min，弃上清液；加入灭菌水，重悬分生孢子沉淀并稀释到107个孢子/mL的浓度；将3×107个孢子转移到含有100mL YEPD液体培养基的250mL三角瓶中，25℃，180rpm摇12–14小时；用三层灭菌擦镜纸过滤培养过夜的培养基，用无菌水冲洗3次，然后用1M蔗糖冲洗2次，用灭菌滤纸沥干，收集菌丝体；用灭菌镊子将菌丝转移至20mL原生质体酶解液中，90rpm，28℃，轻摇2–3h，每隔0.5h镜检原生质体质粒和数量。用二层灭菌擦镜纸过滤酶解混合物到无菌50mL离心管中，并用1M蔗糖溶液冲洗2次，将尽可能多的原生质体冲洗下来；将原生质体2600rpm，4℃离心1min，弃上清，用冰上预冷的STC缓冲液重悬，并按上述离心条件洗涤原生质体3次；最后用STC缓冲液重悬原生质体，并将其终浓度调至2×107个/mL；分装200μL/管，加终浓度为7％的二甲基亚砜(DMSO)，混匀，-80℃保存；
3、PEG介导的pSK-ABC的转染
将原生质体从-80℃取出，冰上融化；2mL离心管中加入200μL PH-1原生质体和30μg的质粒，轻轻混匀后，冰上放置20min；1.25mL PTC滴加到2mL离心管中，用枪头吸打混匀后室温静置20min；将2mL离心管中的原生质体转入15mL离心管中，用5mL TB3(含50μg/mL氨苄青霉素)反复冲洗2mL离心管，然后加入到以上15mL离心管中，25℃，90rpm,轻摇过夜(16h)；将原生质体再生物4000rpm离心5min，弃上清，加600μL STC重悬沉淀，依次各取200μL放于9cm培养皿的中央，加20mL含50ug/mL氨苄青霉素的TB3固体培养基(酵母膏(YeastExtract)3g、酸水解酪素(Casamino Acids)3g、蔗糖(Sucrose)200g，加入蒸馏水定容至1L)；将平板面朝上放置，25℃，黑暗培养过夜。第二天倾斜平板去除浮于表面的STC。继续培养5d；观察菌丝形态，从边缘不同位置切取小块菌丝转移到PDA平板上，继续培养，分子鉴定后进行进一步实验观察。
4、菌株的菌落形态及生长速度测定
用5mm打孔器打取转染子菌株的菌饼置于PDA培养基平板的中央，活化菌株；用5mm打孔器打取活化菌株的菌落边缘菌饼，将菌饼转移到PDA培养基平板的中央，分别五个重复；25℃黑暗培养4d后观察菌落形态和测量菌落直径并统计分析。
5、菌株的致病力测定
种植小麦品种扬麦158，待小麦生长至扬花盛期时用于小麦穗接种。按上述方法制备各转染子菌株的分生孢子，并用血球计数板计量孢子浓度后将孢子浓度调节为3×105个/mL；选取长势基本一致的小麦穗，自下而上查到第五个小穗时，用手指将小穗的内颖和外颖分开。吸取10μL制备好的孢子液注入内颖和外颖之间的根部，轻轻闭合保持其自然状态。记号笔标记接种小穗并在小麦杆上挂上标签，记录接种菌株、接种方法、接种日期、接种人等信息。每个菌株至少接种15个小麦穗；用保鲜袋保湿培养48h；取下保鲜袋并继续培养14d后，观察小麦穗发病情况，剪下小麦穗拍照并统计每穗发病小穗数。
6、结果
结果显示，经过原生质体的制备、转染和再生，得到pSK-ABC转染子菌株，经过South ern blot分析(见图2)，证实侵染性克隆pSK-ABC转染子菌株有病毒存在，而且pSK-ABC转染子菌株和三个组分侵染性克隆共同转染所得菌株A+B+C相比，在菌落形态、菌落生长速度和致病性方面无明显差异(见图2)。证实DNA病毒FgGMTV1三个组分串联的侵染性克隆pSK-ABC构建成功。
实施例2基于病毒FgGMTV1的基因沉默载体p26-D4的构建
1、基于FgGMTV1的基因沉默载体的设计与构建
基于侵染性克隆pSK-ABC，在DNA-C组分p26编码框依次以150nt长度进行缺失，共获得5个缺失突变体，命名为p26-D1、p26-D2、p26-D3和p26-D4，p26-D5缺失81nt。构建这些突变体的方法是通过日本东洋纺生物公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit(code NO.SM K-101)试剂盒来完成的。该试剂盒的实验原理是通过反向PCR法(Inverse PCR)以pSK-AB C为模板，以反方向设计的两条引物，同时引入酶切位点NsiⅠ和AgeⅠ，利用高保真的K OD–Plus-酶对质粒进行完整的PCR，最后筛选得到目的突变体。
通过设计特异引物来构建基于DNA-C的缺失突变体，引物如表1，其中标下划线的序列为引入的酶切位点NsiⅠ和AgeⅠ。
表1DNA-C突变体引物
禾谷镰孢菌原生质体制备、PEG介导的病毒缺失突变体的转染和菌株的菌落形态观察，方法均同实施例1。
结果显示，基于侵染性克隆pSK-ABC构建的5个缺失突变体p26-D1——p26-D5，经Southern blot证实突变体p26-D1、p26-D2、p26-D3和p26-D4三个组分均可以有效复制，但只有p26-D4和野生型病毒的表型一致，即突变体病毒的侵染不会引起寄主的异常表型(图3)。p26-D4可以作为候选的基因沉默载体，命名为p26-D4，即缺失DNA-C组分上284-434nt的序列，并引入酶切位点NsiⅠ和AgeⅠ，其结构见图4。
上述VIGS载体p26-D4的全序列(不含载体)如SEQ ID NO：2所示，标阴影底色为酶切位点，虚线为组分A的序列，横线为组分B的序列，波浪线为组分C的序列。HindⅢ和NotⅠ双酶切用于将该序列连接至pBluescript SK+克隆载体。NsiⅠ和AgeⅠ用于***外源基因片段。SEQ ID NO：2为：
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实施例3p26-D4的沉默效果
本实施例以禾谷镰孢菌转基因表达的GFP基因作为靶标基因，说明p26-D4的沉默效果。
1、基于p26-D4的基因沉默载体的构建
基于p26-D4载体，针对靶标基因GFP构建含不同片段的GFP基因的VIGS载体来验证沉默效果以及外源片段***的大小范围。共构建8个载体：p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F、p26-D4-GFP150R、p26-D4-GFP300F、p26-D4-GFP300R、p26-D4-GFP450F和p26-D4-GFP450R。具体构建方法是通过RCR法扩增不同长度和方向的GFP基因片段，使用T4DNA连接酶连接的方法将扩增片段连接至p26-D4载体，最后筛选得到目的沉默载体。
通过特异引物来扩增不同长度和方向的GFP基因片段，具体引物见表2。
表2基于p26-D4的GFP基因沉默载体的构建引物
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禾谷镰孢菌原生质体制备、PEG介导的基于p26-D4的基因沉默载体的转染和菌株的菌落形态观察，方法均同实施例1。
2、荧光观察
准备带玻璃纸的PDA平板，并铺放无菌盖玻片，将3mm的新鲜菌块放置于距离盖玻片2cm的位置，黑暗培养2天，待菌丝长至盖玻片三分之一位置时观察荧光。荧光强度使用ImageJ软件分析。
3、结果
结果显示，基于p26-D4构建的GFP沉默载体p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F、p26-D4-GFP150R、p26-D4-GFP300F、p26-D4-GFP300R、p26-D4-GFP450F和p26-D4-GFP450R，经PEG介导的原生质体转染和再培养，获得转染子。经Southern blot和测序分析证实，在被p26-D4-GFP300F、p26-D4-GFP300R、p26-D4-GFP450F和p26-D4-GFP450R侵染的菌株中，***的300bp和450bp的GFP片段已在DNA-C组分中丢失，而在p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株中，***的75bp和150bp的GFP片段可稳定保留在病毒DNA-C组分中。p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株在生长表型上表现为正常表型(见图5)。通过荧光显微镜对荧光强度进行观察时发现，在p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株中GFP荧光强度明显弱于PH-1/GFP菌株和p26-D4侵染的PH-1/GFP菌株(见图5)。qPCR进一步证明，相比较无毒PH-1/GFP菌株和p26-D4侵染的PH-1/GFP菌株，在p26-D4-GFP75F、p26-D4-GFP75R、p26-D4-GFP150F和p26-D4-GFP150R侵染的菌株中GFP的mRNA表达水平降低了55％-75％(见图5)。因此，本发明证实基于p26-D4的VIGS沉默载体可有效对GFP进行基因沉默，且***片段约为75bp–150bp。
实施例4p26-D4的沉默效果
本实施例以禾谷镰孢菌内源基因Tri101和FgPP1作为靶标基因，说明p26-D4的沉默效果
1、构建沉默载体p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1
基于p26-D4载体，针对靶标基因Tri101和FgPP1构建VIGS载体p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1。具体构建方法是通过RCR法扩增150bp的Tri101和FgPP1基因片段，使用同源重组的方法将扩增片段连接至p26-D4载体，最后筛选得到目的沉默载体。
通过特异引物来扩增150bp的Tri101和FgPP1基因片段，具体引物见表3。
表3沉默载体p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1构建引物
禾谷镰孢菌原生质体制备、PEG介导的基于p26-D4的基因沉默载体的转染和菌株的菌落形态观察，方法均同实施例1。
上述靶标基因Tri101，序列如SEQ ID NO：3所示：
GATTTGTACTCTGTTCCCAAGCGTCATCTTTCTCAGCGCAGCACTTCTATAATTTAGC GGCCTCACCTTCTGTAACACCAACACCAAGTGATTTACAAACACCACCAAAATGGCTTT CAAGATACAGCTCGACACCCTCGGCCAGCTACC。
靶标基因FgPP1，序列如SEQ ID NO：4所示：
ACCATCTGCTTGCTCCTCGCCTACAAGATCAAGTACCCCGAAAACTTCTTCATCCTT CGAGGTAACCACGAGTGTGCCTCCATCAACCGTATTTATGGATTCTACGACGAGTGCAA GCGTCGCTATAACATCAAGTTGTGGAAGACTTTC。
2、结果
结果显示，基于p26-D4构建的沉默载体p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1，经PEG介导的原生质体转染和再培养，获得转染子。经Southern blot分析证实，在p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株中，病毒组分可有效复制(见图6)。与p26-D4侵染的菌株相比，在p26-D4-Tri101侵染的菌株中Tri101的RNA表达量降低80％，在p26-D4-FgPP1侵染的菌株中FgPP1的RNA表达量降低63％(见图6)。p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株的表型无明显异常，与无毒菌株PH-1和p26-D4侵染的菌株表型一致。另外，毒素产量检测和致病力测试实验证明，与p26-D4侵染的菌株相比，p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的菌株的产毒量和对小麦得致病力均大幅降低(见图6)。表明本发明构建的p26-D4可有效对禾谷镰孢菌的内源基因进行沉默，同时表明，该VIGS载体可成功将病原真菌菌株转换为低致病力的菌株。
实施例5VIGS诱导的弱毒菌株的生物控制效果分析
基于实施例4的结果，进一步测试p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株的生物控制效果。本实施例选择共侵染法和预喷施法验证VIGS诱导的弱毒菌株的生物控制效果。
共侵染法(Test 1)：将p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株的菌块切成大小一致的小菌块，与10μL的PH-1分生孢子悬液共同接种至同一小穗。12天后，观察小麦赤霉病的发病情况，统计发病的小穗数量并测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)含量。
预喷施法(Test 2)：将p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株在PDB液体培养基中培养3天，收集菌丝，打碎成小的菌丝段，并调节OD600≈2.0。先喷施菌丝段悬浮液于小麦穗，24h后接种10μL的PH-1分生孢子悬液，12天后，观察小麦赤霉病的发病情况，统计发病的小穗数量并测定DON含量。
结果显示，在共侵染法(Test 1)测定实验中，与无菌水处理的对照组相比，p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株处理的小麦穗，小麦赤霉病病斑延伸明显迟滞，保护效率分别达到74％和76％，DON含量分别降低21％和29％(见图7)。在预喷施法(Test2)测定实验中，与无菌水处理的对照组相比，p26-D4-Tri101和p26-D4-FgPP1侵染的弱毒菌株处理的小麦穗，小麦赤霉病病斑延伸同样明显迟滞，保护效率分别达到72％和74％，DON含量分别降低25％和40％(图7)。该结果证明VIGS载体p26-D4诱导的低毒力菌株可在实验条件下有效的控制小麦赤霉病。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种真菌病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种如权利要求1所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将真菌病毒FgGMTV1/HB58的3个单链环状DNA分子DNA-A、DNA-B和DNA-C串联并导入同一载体，构建重组载体；
(2)对所述重组载体中的DNA-C分子的编码蛋白p26进行缺失突变，获取真菌病毒诱导的基因沉默载体。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将1.3个拷贝的DNA-A、1.3个拷贝的DNA-B和1.5个拷贝的DNA-C串联后，连接到pBluescriptⅡSK(+)，构建所述重组载体。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述DNA-A的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述DNA-B的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述DNA-C的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述缺失突变为缺失所述DNA-C的编码蛋白p26的第454-603nt的序列。
6.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述真菌病毒诱导的基因沉默载体携带外源基因，所述外源基因包括Tri101基因和FgPP1基因。
8.一种权利要求1所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体，或权利要求6-7任一项所述的重组菌在防控小麦赤霉病中的应用。
9.一种如权利要求1所述的真菌病毒诱导的基因沉默载体，或权利要求6-7任一项所述的重组菌在制备防控小麦赤霉病的制剂中的应用。
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| A tripartite ssDNA mycovirus from a plant pathogenic fungus in infectious as cloned DNA and purified virions.;Pengfei Li et al.;《Sci Adv》;第1-9页 * |
| 真菌病毒FpgMBV1中P3基因的原核表达及多克隆抗体的制备;李轲等;《植物病理学报》;第567-573页 * |
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