CN115873827A

CN115873827A - 一种高活性固定化脂肪酶及其在塑料降解中的应用

Info

Publication number: CN115873827A
Application number: CN202211682384.0A
Authority: CN
Inventors: 王宝娟; 侯焕焕; 汤慧良; 许心愿
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体提供一种高活性固定化脂肪酶及其在塑料降解中的应用，首先将半胱氨酸与脂肪酶溶液等体积混合，随后与3‑甲基‑1，2，4‑***、戊二醛、乙酸锌和氨水溶液依次混合，震匀后摇床中反应，最后将混合液离心得到固定化脂肪酶。该固定化酶的催化活性和稳定性都有明显提高，其催化活性是游离酶的166％；30℃同等条件处理，游离酶活性迅速下降，固定化酶孵育4天后到达半衰期；此外，固定化酶还获得重复使用性能，重复6次后仍保留初始活性的64％；在应用方面，所得固定化酶可应用于食品、医药、能源、农业等领域。本发明中，30℃下该固定化酶可在24h内降解71％的邻苯二甲酸二丁酯，为塑料降解提供了一种绿色、高效的处理技术。

Description

一种高活性固定化脂肪酶及其在塑料降解中的应用

技术领域

本发明属于脂肪酶的固定化制备技术领域，具体涉及一种高活性固定化脂肪酶及其在塑料降解中的应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)作为一种塑料改良剂，广泛应用于塑料、农药、涂料、化妆品等产品中，进入环境后，不易降解，可在环境中蓄积并通过生物链富集，低浓度时即具有生殖毒性。近年来随着工农业的快速发展，PAEs已经成为环境中的主要污染物之一。然而，传统的物理降解法和化学降解法成本高、操作复杂、可能造成二次污染。

目前一致认为，生物降解法是降解PAEs的最有效途径，其具有低能耗、低成本和可忽略的二次污染等优势。脂肪酶(Lipase)可以催化邻苯二甲酸酯进行水解反应，形成邻苯二甲单酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。作为一种具有多种催化功能的酶，脂肪酶被广泛应用在食品化工、医药制造、生物柴油、农药降解等重要的工业领域。然而，天然脂肪酶的稳定性差，易受pH、温度等多种因素影响，且使用后难以回收，这阻碍了脂肪酶在商业上的广泛使用。

一般来说，脂肪酶的固定化是解决成本高、恢复困难、稳定性低等问题的有效策略之一。酶的固定化是指将酶与不溶于水的载体通过物理或化学方法相结合，使酶局限在一定范围空间内，保留其催化活性，并可重复回收使用。目前，常用的固定化载体材料可以分为两大类：传统载体材料和新型载体材料，传统载体材料包括无机材料和有机高分子材料。然而，传统载体材料并不具有良好的可调性和结晶性，这可能会导致低蛋白装载效率、不稳定性以及酶浸出，进而影响固定化酶的活性。

金属有机框架(metal-organicframeworks，MOFs)是一种新型载体材料，具有晶体结构多样，孔径可调，孔隙率高和比表面积大的优点。蛋白质或酶的表面电荷和化学性质决定了其被封装到MOFs中的能力，因此，大多数固定化酶的酶活都不高。

通过诱导或掺杂氨基酸及其衍生物可以提高酶的催化活性。我们发现，与适当的氨基酸结合，可以增强酶的活性。将酶与合适的氨基酸固定在MOFs中，被捕获的氨基酸可以维持酶的活性构象，最终提高催化活性。此外，氨基酸的存在也可以保护高温条件下的活性位点，从而提高酶活。戊二醛是酶固定化中最常用的双功能交联剂，它可以通过共价键附着到氨基活化的载体上来固定蛋白质，也可以通过蛋白质聚集物的交联来固定蛋白质，从而提高固定化酶的稳定性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种固定化脂肪酶(Cys-CRL@GA@MAF-7)。本发明的固定化脂肪酶以褶皱念珠菌脂肪酶(CRL)为目的蛋白，以MAF-7为固定化载体，制备而得。

优选的，所述固定化脂肪酶的最适反应pH为8.5，最适反应温度为45℃。优选的，所述固定化脂肪酶提高了催化活性，酶活是游离酶的166％。

优选的，所述固定化脂肪酶增强了稳定性，30℃孵育4天后仍保留48％的初始活性。

优选的，所述固定化脂肪酶具有较好的重复使用性，重复使用6次后仍保留64％的初始活性。

本发明还提供了所述固定化脂肪酶的制备方法，其以褶皱念珠菌来源的脂肪酶为目的蛋白，以MAF-7为固定化载体，以半胱氨酸为辅助剂，以戊二醛为交联剂，以氨水为促进剂，制备得到固定化脂肪酶。

优选的，所述的制备方法包括以下步骤：(1)将氨基酸溶液与脂肪酶溶液等体积混合；(2)将步骤(1)得到的溶液与3-甲基-1，2，4-***、戊二醛、乙酸锌和氨水溶液依次混合，此混合溶液中的氨基酸为半胱氨酸，氨基酸的终浓度为5-70mM，3-甲基-1，2，4-***的终浓度为25-200mM，乙酸锌的终浓度是5-35mM，脂肪酶终浓度为50-400mg/L，戊二醛的终浓度是0.5％-5％，氨水的终浓度是0.3％(体积分数)；充分混匀后在20-40℃摇床中反应10-60min；(3)将步骤(2)得到的反应混合物离心得到淡黄色沉淀，将沉淀洗涤三次，得到固定化脂肪酶。

最优选所述制备方法为包括如下步骤：

(1)分别制备浓度为30mM的半胱氨酸溶液，浓度为1mg/mL的褶皱念珠菌脂肪酶溶液，浓度为1M的3-甲基-1，2，4-***溶液(乙醇做溶剂)和乙酸锌溶液及体积浓度为30％的氨水溶液；

(2)将上述制得的半胱氨酸2.5mL和脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，随后依次加入1mL3-甲基-1，2，4-***、0.4mL50％的戊二醛、0.25mL乙酸锌和0.1mL氨水溶液，每次添加后均震荡30s，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床中反应30min；

(3)反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到淡黄色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶。

本发明还提供了所述固定化脂肪酶在塑料降解领域的应用。

优选的，邻苯二甲酸二丁酯均匀分散在优选所述的固定化脂肪酶溶液中，将反应混合物振荡孵育，反应结束后分离获得未被降解的邻苯二甲酸二丁酯。

优选的，所述反应温度为25-37℃，振荡速度为150-200rpm，反应时间为0-24h。

本发明的有益之处在于：

1、金属有机框架由金属离子和有机配体通过强配位键组成。本发明采用的MAF-7载体是一种性能优异的MOFs材料，具有较大的比表面积、优良的化学和热稳定性、无毒性、合成过程简单。

2、本发明采用半胱氨酸做辅助剂，戊二醛做交联剂，氨水做促进剂，在常温常压条件下通过生物矿化法成功制备了固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶与游离酶相比，进一步提高了催化活性和稳定性，表现出良好的重复使用性，在塑料降解提供了一种绿色、高效的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为酶固定化过程中3-甲基-1，2，4-***摩尔浓度的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图2为酶固定化过程中乙酸锌摩尔浓度的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图3为酶固定化过程中酶蛋白质量浓度的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图4为酶固定化过程中氨基酸种类的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图5为酶固定化过程中半胱氨酸浓度的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图6为酶固定化过程中戊二醛浓度的确定(■,Relativeactivity；●,Immobilizationefficiency)。

图7为反应pH对CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7酶活的影响图。

图8为反应温度对CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7酶活的影响图。

图9为30℃缓冲液中CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7稳定性的影响图。

图10为45℃缓冲液中CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7稳定性的影响图。

图11为Cys-CRL@GA@MAF-7的重复使用次数示意。

图12为Cys-CRL@GA@MAF-7降解邻苯二甲酸二丁酯的时间梯度图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：固定化脂肪酶制备

将30mM半胱氨酸溶液2.5mL和1mg/mL脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，随后与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、50％的戊二醛0.4mL、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到淡黄色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶Cys-CRL@GA@MAF-7。

实施例2：催化活性的测定

以对硝基苯酚法检测游离酶或固定化脂肪酶的催化活性，一个酶活单位(U)定义为在最适pH(游离酶为8.0，固定化酶为8.5)和25℃条件下，单位时间内每产生1μmoL对硝基苯酚所需要的酶量。标准反应体系为1mL，包括10μL浓度为0.5mg/mL的CRL或同等酶量的固定化酶，10μL50mM对硝基苯酚丁酸酯和980μL50mMTris-HClBuffer(游离酶为pH8.0，固定化酶为pH8.5)，混合均匀，25℃水浴锅中孵育5min，游离酶立即测定OD410nm，固定化酶则12,000rpm离心30s，取上清液立即测定OD410nm，以不加酶的混合液为对照。所有实验均独立重复三次，测量值为三个独立实验平均值。

实施例3：固定化脂肪酶3-甲基-1，2，4-***摩尔浓度优化

将0.5mg/mL脂肪酶溶液5mL与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，其中3-甲基-1，2，4-***的终浓度为25，50，75，100，125，150，175，200mM，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到白色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶CRL@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中3-甲基-1，2，4-***摩尔浓度的确定结果如图1所示，当3-甲基-1，2，4-***的摩尔终浓度为100mM时，固定化脂肪酶的相对活性和蛋白固定化效率最高，固定化效果最好。

实施例4：固定化脂肪酶乙酸锌摩尔浓度优化

将0.5mg/mL脂肪酶溶液5mL与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、1M乙酸锌和30％氨水溶液0.1mL依次混合，其中乙酸锌的终浓度为5，7.5，10，15，20，25，30，35mM，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到白色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶CRL@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中乙酸锌摩尔浓度的确定结果如图2所示，当乙酸锌摩尔终浓度为25mM时，固定化脂肪酶的相对活性和蛋白固定化效率最高，固定化效果最好。

实施例5：固定化脂肪酶CRL浓度优化

将0.5mg/mL脂肪酶溶液与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，其中CRL的终浓度为0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4mg/mL，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到白色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶CRL@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中酶蛋白质量浓度的确定结果如图3所示，当褶皱念珠菌脂肪酶的质量终浓度为0.25mg/mL时，固定化脂肪酶的相对活性和蛋白固定化效率最高，固定化效果最好。

实施例6：固定化脂肪酶氨基酸种类优化

将30mM氨基酸溶液2.5mL和1mg/mL脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，其中氨基酸为谷氨酸，组氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，脯氨酸，甘氨酸，酪氨酸，随后与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到白色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶Aa-CRL@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中氨基酸种类的确定结果如图4所示，当氨基酸种类为半胱氨酸时，固定化脂肪酶的相对活性和蛋白固定化效率最高，固定化效果最好。

实施例7：固定化脂肪酶半胱氨酸浓度优化

将半胱氨酸溶液2.5mL和1mg/mL脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，其中半胱氨酸溶液的浓度为5，10，20，30，40，50，60，70mM，随后与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到白色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶Cys-CRL@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中半胱氨酸浓度的确定结果如图5所示，当半胱氨酸浓度为30mM时，固定化脂肪酶的相对活性和蛋白固定化效率最高，固定化效果最好。

实施例8：固定化脂肪酶戊二醛浓度优化

将30mM半胱氨酸溶液2.5mL和1mg/mL脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，随后与1M3-甲基-1，2，4-***(溶于乙醇)1mL、50％的戊二醛、1M乙酸锌0.25mL和30％氨水溶液0.1mL依次混合，其中戊二醛的终浓度为0％，0.5％，1％，1.5％，2％，3％，4％，5％，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后在37℃摇床反应30min；反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到淡黄色沉淀，超纯水洗涤三次，得到固定化脂肪酶Cys-CRL@GA@MAF-7。

本实施例制备的固定化脂肪酶在合成过程中戊二醛浓度的确定结果如图6所示，戊二醛终浓度为0％时，固定化脂肪酶的相对活性最高，但此时Cys-CRL@GA@MAF-7不能重复使用，当戊二醛终浓度为2％时，固定化脂肪酶的相对活性第二高，蛋白固定化效率较高，且获得重复使用性能，故固定化效果最好。

实施例9：反应pH对实施例1的CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7酶活的影响

在不同的pH条件下测定了CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7的活性，缓冲液配方如下：50mMSodiumcitrateBuffer(pH5.5-7.0)；50mMTris-HCl Buffer(pH7.0-9.0)；50mMNa₂HPO₄-NaOHBuffer(pH9.0-10.5)。以所测得的最适pH条件下的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图7所示，CRL的最适pH为8.0(Tris-HClBuffer)，Cys-CRL@GA@MAF-7的最适pH为8.5(Tris-HClBuffer)；

实施例10：反应温度对实施例1的CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7酶活的影响

分别在pH8.0和pH8.5条件下，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例1相同)测定CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7在25-65℃温度范围内的活性，以测定的最适温度下的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图8所示，与CRL相比，Cys-CRL@GA@MAF-7的最适反应温度仍为25℃。

实施例11：30℃缓冲液中实施例1的CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7稳定性的影响

分别用pH8.0和pH8.5的缓冲液将CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7制备成溶液，将此溶液置于30℃水浴锅中，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例1相同)测定CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7的活性，以未作热处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图9所示，CRL30℃处理6h后达到半衰期，Cys-CRL@GA@MAF-730℃处理4天后达到半衰期。

实施例12：45℃缓冲液中实施例1的CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7稳定性的影响

分别用pH8.0和pH8.5的缓冲液将CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7制备成溶液，将此溶液置于45℃水浴锅中，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例1相同)测定CRL及Cys-CRL@GA@MAF-7的活性，以未作热处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图10所示，CRL45℃处理1h后达到半衰期，Cys-CRL@GA@MAF-745℃处理8h后达到半衰期。

实施例13：实施例1的Cys-CRL@GA@MAF-7的重复使用次数

在25℃，pH8.5条件下，在标准反应体系(标准反应体系与实施例1相同)中检测

Cys-CRL@GA@MAF-7的水解活性，反应完成后以12,000rpm的速度离心5min，从反应液中将固定化酶分离出来，使用超纯水清洗一次后再次重复上述反应过程，以此类推，记录每次反应后上清液OD410的值，以第一次反应的酶活力为100％，计算之后反应过程的相对酶活，以此来测定Cys-CRL@GA@MAF-7的重复利用率。结果如图11所示，Cys-CRL@GA@MAF-7在连续使用6次后仍保留了约64％的残余酶活。该结果表明CRL经固定化后具有良好的重复使用性。

实施例14：实施例1的Cys-CRL@GA@MAF-7降解邻苯二甲酸二丁酯的时间梯度

采用高效液相色谱法探究Cys-CRL@GA@MAF-7对邻苯二甲酸二丁酯的降解能力。首先配制100mM邻苯二甲酸二丁酯溶液(甲醇做溶剂)、2mg/mL的Cys-CRL@GA@MAF-7溶液(50mMpH8.5Tris-HClBuffer作溶剂)，4℃冰箱保存备用。取15支2mL离心管，按以下方式配制反应体系(每个时间梯度设置3个重复)：包含10μL上述制备的邻苯二甲酸二丁酯溶液，490μL上述制备的固定化酶溶液。反应在30℃条件下进行，以不含酶的混合液为对照组在同等条件下孵育。反应总时长为24h，从0h开始，每隔6h取出一个样品加入50μL1MHCl终止反应，随后加入0.3gNaCl固体颗粒使其饱和，然后再加入等体积正己烷振荡15min，10,000rpm离心5min，此时Ep管内液体明显分层，上层为有机相，下层为水相，回收上层有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，去除杂质后使用高效液相色谱进行测定。结果如图12所示，Cys-CRL@GA@MAF-7在24h内可以降解71％的邻苯二甲酸二丁酯。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims

1.一种固定化脂肪酶，其特征在于其以褶皱念珠菌脂肪酶为目的蛋白，以金属有机框架材料MAF-7为固定化载体。

2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶，其特征在于所述固定化脂肪酶具有高催化活性，是游离酶的166％。

3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶，其特征在于所述固定化脂肪酶具有较强的稳定性，30℃孵育4天后仍保留初始活性的48％。

4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶，其特征在于所述固定化脂肪酶具有较好的重复使用性，重复6次后仍保留初始活性的64％。

5.根据权利要求1-4任意所述的固定化脂肪酶制备方法，其特征在于其以褶皱念珠菌来源的脂肪酶为目的蛋白，以MAF-7为固定化载体，以半胱氨酸为辅助剂，以戊二醛为交联剂，以氨水为促进剂，制备得到固定化脂肪酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：(1)将氨基酸与脂肪酶溶液等体积混合；(2)将步骤(1)溶液与3-甲基-1，2，4-***、戊二醛、乙酸锌和氨水溶液依次混合，此混合溶液中的氨基酸为半胱氨酸，氨基酸的终浓度为5-70mM，3-甲基-1，2，4-***的终浓度为25-200mM，乙酸锌的终浓度是5-35mM，脂肪酶终浓度为50-400mg/L，戊二醛的终浓度是0.5％-5％，氨水的终浓度是0.3％(体积分数)；充分混匀后在20-40℃摇床中反应10-60min；(3)将步骤(2)反应混合物离心得到淡黄色沉淀，即为固定化脂肪酶。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：

S1、分别制备浓度为30mM的半胱氨酸溶液，浓度为1mg/mL的褶皱念珠菌脂肪酶溶液，浓度为1M的3-甲基-1，2，4-***溶液(乙醇作溶剂)和乙酸锌溶液，以及体积浓度为30％的氨水溶液；

S2、将上述制得的半胱氨酸溶液2.5mL和脂肪酶溶液2.5mL等体积混合，随后与1mL3-甲基-1，2，4-***、0.4mL50％戊二醛、0.25mL乙酸锌和0.1mL氨水溶液依次混合，最后用去离子水补足体系至10mL，混合均匀后37℃摇床中反应30min；

S3、反应液由澄清变浑浊，10,000rpm离心5min得到淡黄色沉淀，超纯水洗涤三次得到固定化脂肪酶。

8.根据权利要求1-7任意之一所述固定化脂肪酶在塑料降解领域的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将邻苯二甲酸二丁酯均匀分散在固定化脂肪酶溶液中，将反应混合物振荡孵育，反应结束后分离获得未被降解的邻苯二甲酸二丁酯。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述反应温度为25-37℃，

振荡转速为150-200rpm，反应时间为0-24h。