CN115867299A - 用于预防或治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分，以及用于使用该药物组合物预防或治疗癌症的方法。此外，本发明还涉及药物组合物和免疫检查点抑制剂用于治疗癌症的联合用途。

Description

用于预防或治疗癌症的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物以及使用该药物组合物预防或治疗癌症的方法。此外，本发明还涉及药物组合物和免疫检查点抑制剂在癌症联合治疗中的用途。

本申请要求于2020年5月20日提交的美国临时申请号63/027,574的优先权和利益，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

癌症通常被定义为细胞以过快的速率***并且其功能变得异常的疾病、恶性肿瘤和肿瘤。标准治疗包括外科手术、化疗和放疗，以去除受感染癌组织。某些癌症对此类化疗、放疗和其他治疗没有反应或变得具有抗性。虽然一些人类肿瘤对常规化疗/放疗敏感，但已知各种实体肿瘤(例如结直肠肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤和其他肿瘤)和血液肿瘤用常规治疗方案是难治的。最近，与传统的癌症治疗不同，利用免疫***治疗癌症的免疫疗法正在引起关注。

免疫化疗是这样一种方法，其与传统的抗癌剂不同，通过将人工免疫蛋白注射到体内以刺激免疫***来诱导免疫细胞选择性地仅攻击癌细胞，并且主要分为被动免疫疗法和主动免疫疗法。被动免疫疗法包括免疫检查点抑制剂、免疫细胞疗法和治疗性抗体。其中，免疫检查点抑制剂是阻断参与T细胞抑制的免疫检查点蛋白激活以激活T细胞并攻击癌细胞的药物，并且包括CTLA-4、PD-1和PD-L1抑制剂。2016年，FDA批准了一种PD-L1抗体药物(阿替利珠单抗，atezolizumab)用于抗癌治疗，但存在的局限性在于，它作为免疫检查点抑制剂的单一治疗显示出有限的治疗效果。此外，主动免疫疗法包括治疗性癌症疫苗和免疫调节剂，其中，治疗性癌症疫苗是由癌细胞或癌细胞衍生物质制备的，是注射到人体中以使身体的天然防御***可运行的药物。然而，存在的问题在于，治疗性癌症疫苗具有复杂的生产过程，难以应用于各种类型的癌症，并且由于它们是一种个性化疗法而给患者带来了经济负担。

因此，重要的是开发出一种更有效的方法，特别是联合方法，以改进癌症的预防和治疗。

结直肠癌是一种由结肠中的癌细胞组成的恶性肿瘤，并且具有排便习惯改变、腹泻、便秘、便血、腹痛、腹胀、疲劳、食欲不振和消化不良等症状。对于结直肠癌治疗，治疗方法根据癌细胞的组织渗透程度确定，在大多数原发性癌症的情况下，切除术与化疗或放疗相结合。然而，作为外科手术的副作用，可能会发生术后全身麻醉引起的肺部并发症、吻合口瘘、出血或肠梗阻。此外，化疗的副作用包括白细胞减少或血小板减少、脱发、反胃(恶心)、呕吐和疲劳，而放疗的副作用则包括盆腔疼痛、排便习惯改变、排尿困难、***疼痛、腹泻或脱发。

此外，结直肠癌即使在根治性切除术后也有大约20％至50％的复发率，并出现三种类型，例如局部复发、远处转移和局部复发伴远处转移。一般地，有广泛的复发，伴有局部复发和远处转移，并且当转移时，被归类为最晚期的4期结直肠癌已知具有较差的预后。因此，需要研究一种用于补偿具有许多副作用的当前治疗方法并有效治疗结直肠癌的新治疗方法。

同时，病毒是生物治疗剂之一，并具有利用其中的基因突变攻击肿瘤细胞的靶向治疗概念。抗癌病毒在癌细胞中选择性增殖，并诱导肿瘤坏死和死亡。

溶瘤病毒是用于癌症治疗的病毒，而使用这些病毒的抗癌疗法称为溶瘤病毒(OV)疗法。使用野生型溶瘤病毒进行癌症治疗的研究与基因疗法不同，该基因疗法主要是通过将现有的治疗基因***病毒中来观察治疗基因的表达所引起的溶瘤效应，这是从已知一些野生型病毒具有内在强大的溶瘤能力开始的。

长期以来，有报道称，由于各种类型的病毒的天然感染，癌症可以天然治愈，并且自从对野生型病毒的肿瘤特异性裂解机制的研究正式开始以来，使用野生型呼肠孤病毒的癌症治疗研究已达到3期临床试验。此外，腺病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒和水疱性口炎病毒已经开发出来，而提高病毒效力和稳定性的方法正在研究中。

发明内容

[技术问题]

发明人确认，不仅可以通过口服施用呼肠孤病毒治疗癌症，而且病毒与免疫检查点抑制剂的联合使用在癌症治疗中显示出显著的协同效果，从而改进了抗癌效果。因此，完成了本发明。

因此，本发明旨在提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

本发明还涉及提供一种用于预防或治疗复发性癌症的药物组合物，其包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员将从以下描述中完全理解本文未描述的其他问题。

[技术方案]

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗复发性癌症的药物组合物，其包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

此外，本发明提供了一种预防或治疗癌症或复发性癌症的方法，其包括向受试者施用包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分的组合物。

此外，本发明提供了一种组合物用于预防或治疗癌症或复发性癌症的用途，该组合物包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

此外，本发明提供了一种组合物用于制备用于预防或治疗癌症或复发性癌症的药物的用途，该组合物包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

在本发明的一个实施方案中，癌症可以是选自由以下项组成的群组中的一种或多种：***、肺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、脑癌、血癌，胃癌、肛周癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌、泌尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、CNS中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤，但本发明不限于此。

在本发明的另一个实施方案中，药物组合物可以进一步包括免疫检查点抑制剂，但本发明不限于此。

在本发明的另一个实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是选自由PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂组成的群组中的一种或多种，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品和免疫检查点抑制剂可以同时、单独或依次施用，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品可以口服施用，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，药物组合物可以增加CD8+T细胞对肿瘤的浸润，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，免疫检查点抑制剂可以肠胃外施用，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，药物组合物可以与免疫检查点抑制剂同时、单独或依次施用，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，可以通过将有效量的呼肠孤病毒施用到离体生物样品来制备生物样品以杀死癌细胞，但本发明不限于此。

在本发明的又一个实施方案中，生物样品可以是骨髓样品、脂肪来源的干细胞样品或血液样品，但本发明不限于此。

[有利效果]

本发明人不仅确认了呼肠孤病毒单独的癌症治疗效果，而且还确认了当呼肠孤病毒口服施用并与免疫检查点抑制剂联合使用时，特别是当PD-1抗体、CTLA-4抗体和呼肠孤病毒疫苗联合使用时时，癌症治疗效果的显著增加，例如肿瘤体积减少、肿瘤生长速率的抑制，以及结直肠癌、皮肤癌和肾癌的存活率的增加；本发明人确认了不仅癌症完全消退，而且能够抑制癌症复发。因此，预期本发明的呼肠孤病毒将有用地用作各种类型癌症的治疗剂和治疗佐剂。

附图说明

图1显示了制作偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结直肠癌动物模型的过程以及呼肠孤病毒(RC402)和抗PD-L1抗体的施用时间表。

图2显示了用于测量结直肠癌动物模型的结直肠癌相关疾病的严重性的疾病活动性指数(DAI)确定标准。

图3显示了正常对照、AOM/DSS诱导的结直肠组(载体)、呼肠孤病毒口服施用组(RC402)、免疫检查点抑制剂腹腔内施用组(αPD-L1)和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组(RC402+αPD-L1)的DAI测量结果。

图4显示了正常对照、AOM/DSS诱导的结直肠组(载体)、呼肠孤病毒口服施用组(RC402)、免疫检查点抑制剂腹腔内施用(αPD-L1)和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组(RC402+αPD-L1)的存活率测量结果。

图5显示了使用CT26结直肠癌细胞植入的结直肠癌动物模型中呼肠孤病毒(RC402)和抗PD-L1抗体的施用时间表。

图6显示了根据图5的施用时间表的存活率测量结果。

图7显示了使用B16F10黑色素瘤细胞植入的皮肤癌动物模型中呼肠孤病毒(RC402)和抗PD-L1抗体的施用时间表。

图8显示了根据图7的施用时间表测量肿瘤体积的结果。

图9显示了根据图7的施用时间表的存活率测量结果。

图10显示了使用RENCA肾癌细胞植入的肾癌动物模型中的仅呼肠孤病毒的施用时间表。

图11显示了根据图10的施用时间表测量肿瘤体积和生长速率的结果。

图12显示了使用MC38结肠腺癌细胞植入的结直肠癌动物模型中仅呼肠孤病毒的施用时间表。

图13显示了根据图12的施用时间表测量肿瘤体积的结果和存活率测量结果。

图14显示了在MC38植入的结直肠癌动物模型中根据呼肠孤病毒(RC402)施用浸润入肿瘤的CD8+T细胞的比例。

图15显示了在免疫组织化学染色和DAPI染色后，通过荧光显微镜观察从植入MC38的结直肠癌动物模型获得的肿瘤和***中根据呼肠孤病毒(RC402)施用的CD8+T细胞浸润程度的结果。

图16显示了在免疫组织化学染色和DAPI染色后，通过荧光显微镜在从MC38植入的结直肠癌动物模型获得的肿瘤中根据呼肠孤病毒(RC402)施用获得CD8+T细胞进入肿瘤中的浸润的结果。

图17显示了使用CT26结直肠癌细胞植入的结直肠癌动物模型中呼肠孤病毒(RC402)和抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体的施用时间表。

图18显示了根据图17的施用时间表测量肿瘤体积的结果和存活率测量结果。

图19显示了通过免疫组织化学染色和流式细胞术，观察从植入CT26的结直肠癌动物模型获得的肿瘤中根据呼肠孤病毒(RC402)，以及抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体的施用的CD8+T细胞浸润程度的结果。

图20显示了在肿瘤完全消退后再次植入CT26以确认预防CT26结直肠癌复发效果的结果。

图21显示了流式细胞术结果，其显示了在完全消退后从CT26再植入小鼠中获得的脾脏中记忆T细胞(CD44+CD62+CD8+)的比例。

图22显示了流式细胞术结果，其显示了使用MC38特异性抗原肽负载的四聚合成MHC复合物表达T细胞受体的CD8+T细胞的比例。

图23显示了MC38结直肠癌模型中肠系膜***和血液中根据呼肠孤病毒(RC402)施用的CD8+细胞的PD-1表达。

具体实施方式

本发明提供了一种用于预防或治疗癌症或复发性癌症的药物组合物，其包括呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

下文，将详细描述本发明。

本文中使用的术语“呼肠孤病毒”是指具有分段RNA基因组的双链病毒，以及归类入呼肠孤病毒科的任何病毒。呼肠孤病毒的病毒粒子具有60nm至80nm的直径，并且具有两个同心的衣壳。该基因组由具有10至12个不连续片段的双链RNA组成，并且具有16至27kbp的基因组总大小，每个RNA片段具有不同的大小。

在本发明中，呼肠孤病毒不仅包括天然存在的呼肠孤病毒，而且包括修饰或重组呼肠孤病毒。当呼肠孤病毒可以从天然界中分离并且没有被人类人工修饰时，呼肠孤病毒是“天然存在的”。例如，呼肠孤病毒可以来源于“场源”，即被呼肠孤病毒感染的人类。

呼肠孤病毒可以被修饰，但可以溶解感染具有激活ras通路的哺乳动物细胞。此外，呼肠孤病毒可以在施用到增殖细胞中之前进行化学或生化预处理(例如，使用诸如糜蛋白酶或胰蛋白酶之类的蛋白酶处理)。通过使用蛋白酶预处理去除病毒的包膜或衣壳，可以提高病毒的传染性。呼肠孤病毒可以用脂质体或胶束包被，例如以产生新的感染性亚病毒颗粒，可以在形成胶束浓度的烷基硫酸盐洗涤剂存在下用糜蛋白酶处理病毒粒子。

在本发明中，呼肠孤病毒可以是野生型呼肠孤病毒或减毒呼肠孤病毒，但本发明不限于此。

减毒的呼肠孤病毒包括缺乏呼肠孤病毒σ-1(sigma-1)衣壳蛋白的一种传染性的可复制的呼肠孤病毒，其可以由缺乏野生型呼肠孤病毒S1基因的呼肠孤病毒基因组检测到。因此，减毒的呼肠孤病毒源于以下令人惊讶的观察：缺乏可检测的呼肠孤病毒σ-1衣壳蛋白的突变呼肠孤病毒理想地避免了对非恶性细胞的细胞病变效应，同时出乎意料地保持了有效感染靶肿瘤细胞的能力。如上所述，在本公开之前，应当理解σ-1-缺陷性呼肠孤病毒的颗粒是非传染性的。

在一具体的实施方案中，减毒的呼肠孤病毒可以包括突变的呼肠孤病毒的S4基因。呼肠孤病毒野生型S4基因编码在呼肠孤病毒转染宿主细胞期间参与病毒粒子处理的呼肠孤病毒衣壳σ-3多肽。

在一具体的实施方案中，与野生型S4基因的序列相比，减毒的呼肠孤病毒可以包括突变的呼肠孤病毒S4基因，该突变的呼呼肠孤病毒S4基因包括编码呼肠孤病毒σ-3多肽的基因组序列中的一个或多个突变。

减毒的呼肠孤病毒缺乏可检测的σ-1衣壳蛋白，但具有出乎意料的传染性。如上所述，表明σ-1与在病毒转染早期经由细胞表面唾液酸残基结合和附着到细胞的呼肠孤病毒有关。尽管缺乏可检测的σ-1，但本文公开的减毒呼肠孤病毒能够进入宿主细胞并复制溶细胞病毒。此外，与由天然存在的非减毒呼肠孤病毒引起的对非恶性细胞的细胞病变效应水平相比，减毒的呼肠孤病毒表现出诱导对非恶性肿瘤细胞的一种或多种细胞病变效应的水平下降的显著特征(即统计显著性降低)。

减毒呼肠孤病毒可衍生自任何呼肠孤病毒，意指呼肠孤病毒科的成员，并包括可从各种来源获得的具有各种亲和力的呼肠孤病毒。

在一具体的实施方案中,减毒的呼肠孤病毒可以是哺乳动物呼肠孤病毒，而在另一个实施方案中是人呼肠孤病毒。在另一个实施方案中(例如，用于与人类疾病相关的动物模型或用于兽医相关的应用)，减毒呼肠孤病毒可衍生自对不同哺乳动物物种的细胞具有亲和力的一种或多种呼肠孤病毒，包括非人灵长类动物(例如，黑猩猩、大猩猩、猕猴、猴子等)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、兔子、豚鼠等)、狗、猫、普通家畜(例如，牛、马、猪和山羊)，或替代地，可以使用具有不同亲和力的呼肠孤病毒(例如，禽呼肠孤病毒)。

减毒的呼肠孤病毒涉及通过分子生物学方法生成和鉴定σ-1-缺陷性和/或σ-1-缺失性突变体(在具体的实施方案中，附加地或替代地，包括生成和鉴定一种(或多种)σ-3缺陷性和/或者σ-3缺失性突变体)，此外可以根据其他方法衍生得到，所述方法包括通过分离一种(或多种)天然存在的σ-1-缺陷失和/或σ-1-缺失性突变体和/或σ-3突变体来人工诱导此类一种(或多种)σ-1(和/或σ-3)突变体，和/或化学、物理和/或遗传技术(例如，在生产性感染的宿主细胞中选择性重组呼肠孤病毒基因)。

减毒的呼肠孤病毒包括感染性的可复制的呼肠孤病毒粒子，其缺乏野生型呼肠孤病毒S1基因，因此缺乏可检测的呼肠孤病毒σ-1衣壳蛋白(即，包括病毒基因组、核心蛋白和蛋白包膜的病毒颗粒)。

在一具体的实施方案中，减毒的呼肠孤病毒缺乏野生型呼肠孤病毒S4基因并表达突变的呼肠孤病毒σ-3衣壳蛋白。如相关领域中所知，传染性的可复制的呼肠孤病毒是能够结合宿主细胞并在适当条件下在其中内化足够长时间的一种病毒，此外，指示呼肠孤病毒基因组的复制和呼肠孤病毒的结构蛋白的生物合成，其方式是允许组装完整的子代呼肠孤病毒，当从宿主细胞释放出来时，该子代呼肠孤病毒能够有效地感染其他宿主细胞以延续病毒复制周期。

例如，在美国专利申请公开号US2009/0214479和US2009/0104162中公开了用于癌症治疗的减毒呼肠孤病毒，其中每一个均通过引用以其整体并入本文。

人呼肠孤病毒可以由以下三种血清型组成：1型(Lang菌株或T1L)、2型(Jones菌株，T2J)和3型(Dearing菌株，T3D；或Abney菌株，T3A)。基于中和反应和血凝素抑制试验可以容易地识别这三种血清型。

在本发明中，呼肠孤病毒可以使用幼仓鼠肾(BHK)细胞(例如BHK-21细胞)获得，但本发明不限于此。在本文使用的术语“BHK-21细胞”中，BHK是幼仓鼠肾的缩写，BHK细胞最初是通过仓鼠细胞的多瘤转化分离的，并且可以用作关于疫苗的底物以用于病毒繁殖和病毒介导的表达。此外，BHK细胞可用作稳定表达各种重组蛋白的宿主细胞系。BHK菌株21(HK-21)由IA Macpherson和MGP Stoker于1961年3月从5只去势的1日龄仓鼠的幼仓鼠肾脏中衍生得到。这些仓鼠被用来生产BHK-21细胞，通常被称为叙利亚金仓鼠(Mesocricetusauratus)。

本文中使用的术语“经呼肠孤病毒处理的生物样品”中的“生物样品”是从受试者、细胞系、组织培养物或其他细胞源获得的任何生物样品，并且是指例如成人干细胞(动物脂肪衍生性干细胞或骨髓干细胞)或脐血干细胞。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法在本领域是公知的。例如，动物脂肪衍生性干细胞可以在用溶瘤病毒预处理后被施用到癌症患者。

在本发明中，可以制备生物样品以通过相对于离体生物样品施用有效量的呼肠孤病毒来杀死多个癌细胞，但本发明不限于此。

在本发明中，生物样品可以是骨髓样品、动物脂肪衍生性干细胞样品或血液样品，但本发明不限于此。

本发明的药物组合物可以口服施用，但本发明不限于此。口服施用可将重复施用引起的副作用最小化。具体地，在连续2至3次连续静脉施用相同量的病毒的情况下，由于细胞因子风暴等副作用，这可能是致命的。相反，在重复口服施用相同量或更多的病毒的情况下，可能不会出现这种副作用。

此外，本发明的用于口服施用的药物组合物可以在没有肠溶包衣的情况下以裸型施用以用于肠内施用。

此外，本发明的用于口服施用的药物组合物由于优异的病毒进入癌症的递送效率而可使抗癌效果最大化。病毒进入癌症的递送效率被认为是决定抗癌效果的最重要因素。已经尝试通过静脉施用抗癌病毒进行癌症治疗，但据报道，这种施用方法通过血液中的抗病毒免疫***去除了大部分病毒，从而大大降低了进入癌症的递送效率。另一方面，在口服施用的情况下，由免疫***引起的抗病毒效果相对较低，因此预计病毒递送效率将良好。

在本发明中，用于口服施用的药物组合物可以与免疫检查点抑制剂联合施用。80至90％的转移性结直肠癌迫切需要联合治疗，这是一种对免疫检查点抑制剂没有反应的微卫星稳定型(MSS)，以使其反应性提高和最大化。由于呼肠孤病毒具有将这种癌症转化为反应性癌症的极好的启动作用，当本发明的药物组合物与免疫检查点抑制剂组合使用时，它可以是通过协同作用在癌症治疗中的突破，其通过口服施用使病毒递送效率最大化并显著增加了免疫检查点抑制剂的反应性。

本文中使用的术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分抑制、干扰或调节一种或多种免疫检查点蛋白(也称为癌症免疫疗法)的材料。免疫检查点蛋白调节T细胞的激活或功能。已知有许多免疫检查点蛋白，例如PD-1、PD-L1和CTLA-4(Nature Reviews Cancer12:252-264,2012)。这些蛋白质参与T细胞反应的共刺激或抑制相互作用。免疫检查点抑制剂可以包括抗体，并且可以衍生自抗体。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是特异性结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的药物，但本发明不限于此。在一个示例性实施方案中，与PD-1特异性结合的药物可以是抗PD-1抗体，其可以选自由纳武单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、司帕他利单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多塔利单抗、INCMGA00012、AMP-224和AMP-514组成的群组，但本发明不限于此。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是与程序性死亡配体1(PD-L1)特异性结合的药物，但本发明不限于此。在一个示例性实施方案中，与PD-L1特异性结合的药物可以是抗PD-L1抗体，其可以选自阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、恩弗利单抗、柯希利单抗(cosibelimab)、AUNP12、CA-170和BMS-986189，但本发明不限于此。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是与细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)特异性结合的药物，但本发明不限于此。在示例性实施方案中，与CTLA-4特异性结合的药物可以是抗CTLA-4抗体，其可以是伊匹单抗或替西木单抗，但本发明不限于此。

本文中使用的术语“抗体”是一种特异性结合免疫检查点蛋白(如PD-1、PD-L1或CTLA4)并表现出对免疫检查点的抑制活性的材料。抗体的范围包括完整形式的抗体以及抗体分子的抗原结合位点。此外，抗体包括单克隆抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体，但本发明不限于此。

本文中使用的术语“癌症”是指与细胞死亡调节相关并在正常细胞凋亡平衡被打破时由细胞过度增殖生成的疾病。在某些情况下，这种异常的过度增殖的细胞可能浸润到周围组织和器官，从而形成肿块，导致身体正常结构的破坏或变形，这种情况通常称为肿瘤。

通常，肿瘤可分为良性肿瘤和恶性肿瘤。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度非常快，并浸润到周围组织以诱导转移，从而威胁生命。这种恶性肿瘤通常被称为“癌症”。

在本发明中，癌症可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种：***、肺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤，子宫癌、卵巢癌、直肠癌、脑癌、血癌、胃癌、肛周癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌、尿路癌、肾细胞癌、肾盂癌、CNS中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤，但本发明不限于此。

本文中使用的术语“协同作用”意指，如文献(Chou和Talalay,Adv.Enzyme.Regul.,22:27-55,1984)中所示，当每种组分联合施用时产生的效果大于当本发明的药物组合物作为单一组分单独施用时所产生的效果之和。

本文中使用的术语“联合施用”是指将不同组分联合施用到受试者。不同组分的联合施用意指，为了获得期望的治疗效果，可以同时按任何顺序或在不同时间依次施用每个组分。

本发明中的药物组合物可以包括呼肠孤病毒和PD-L1抑制剂作为活性成分，但本发明不限于此。替代地，在本发明中，含呼肠孤病毒的药物组合物可以与PD-L1抑制剂组合施用，但本发明不限于此。

在本发明中，药物组合物可以包括呼肠孤病毒和PD-1抑制剂作为活性成分，但本发明不限于此。替代地，在本发明中，含呼肠孤病毒的药物组合物可以与PD-1抑制剂组合施用，但本发明不限于此。

在本发明中，药物组合物可以包括呼肠孤病毒、PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂作为活性成分，但本发明不限于此。替代地，在本发明中，含呼肠孤病毒的药物组合物可以与PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂组合施用，但本发明不限于此。

在本发明中，口服施用的药物组合物可以与免疫检查点抑制剂同时、单独或依次施用。

免疫检查点抑制剂可以经由各种途径施用到受试者。可以预期所有的施用方法，并且本发明的药物组合物可以通过例如口服施用、鼻内施用、肿瘤内施用，支气管施用、动脉注射、静脉注射、皮下注射、肌肉内注射或腹腔内注射来施用。每日剂量可以施用一次，或者分为每天几次。

在本发明中，呼肠孤病毒可以包括用于癌症治疗的异源基因，但本发明不限于此。术语“异源基因”用于意指接受病毒基因组中未发现的任何基因。异源基因可以是野生型基因或突变基因的等位基因变体。用于癌症治疗的异源基因可以***呼肠孤病毒基因中的必需区或非必需区以增加抗癌活性。

异源基因可以可操作地连接到控制序列，该控制序列允许上述异源基因在体内条件下在细胞中表达。因此，本发明的病毒可用于在体内条件下将一种/多种异源基因递送到细胞中，在该体内条件中一种(/多种)异源基因可被表达。该基因通常编码能够增强病毒溶瘤特性的蛋白质。该基因本身可以是一种细胞毒素，或者可以编码一种能够促进/改善抗肿瘤免疫反应的蛋白质。

异源基因可以包括通过***到可复制溶瘤病毒或现有的不可复制病毒载体中来治疗癌症的所有基因。

本文中使用的术语“治疗基因”意在描述其表达影响优选结果(例如抗癌效果)的所有大范围基因。本发明的呼肠孤病毒可以包括编码治疗基因的一个或多个靶序列。当适当地施用至患者，特别是患有疾病或紊乱病况的患者，或需要保护免受这种疾病或病况的患者时，治疗基因可以具有药理学或预防活性。

这种药理学或预防活性意指它预期与对疾病或病况的病程或症状的有益影响相关。靶序列可以与引入该序列的靶细胞同源或异源，并编码多肽的全部或部分，特别是具有治疗或预防性质的治疗或预防多肽。多肽被理解为多核苷酸的任何翻译产物，无论大小和糖基化如何，并包括肽和蛋白质。治疗性多肽包括能够补偿动物或人类有机体中删除或缺陷的蛋白质的多肽，或由于毒性效应而限制或去除体内有害细胞的多肽。它们也可以是作为内源性抗原的免疫赋予多肽，以诱导体液或细胞反应或两者，并包括例如药物致敏基因、促凋亡基因、细胞抑制基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制基因、抗原基因、抗血管生成基因和细胞因子基因，但本发明不限于此。

本发明的活性成分以药学有效量施用到受试者。

本文中使用的术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理益处或风险比治疗疾病的量，并且有效剂量可以由包括以下的参数来确定：患者疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和***率、治疗持续时间和同时使用的药物以及医学领域众所周知的其他参数。

有效量的病毒是指在足够的时间内缓解、改进、减轻、改善、稳定疾病、抑制疾病传播、延缓疾病进展或治愈疾病所需的剂量。例如，有效量可足以达到减少癌细胞数量、减少被病毒破坏或慢性感染的细胞数量或抑制细胞生长和/或增殖的效果。

有效量可以根据诸如病毒的药代动力学特性、施用方法、患者的年龄、健康状况和体重、疾病状态的特征和程度、治疗次数和最新的治疗类型之类的多种因素而变化，也可以根据例如病毒的毒力和滴度而变化。本领域技术人员可以基于上述因素调整适当的量。根据患者的临床反应，病毒最初可以根据需要以适当的剂量施用。病毒的有效量可由经验确定，并可由可安全施用的病毒的最大量和引起优选结果的病毒的最小量确定。

所施用的病毒的浓度可以根据待施用的呼肠孤病毒株的毒力和靶细胞的特性而变化。

在本发明中，可包括10²至10¹⁵PFU的呼肠孤病毒。此外，可包括10²至10¹⁵TCID₅₀、10³至10¹⁴TCID₅₀、10³至10¹³TCID₅₀、10³至10¹²TCID₅₀、10⁴至10¹²TCID₅₀、10⁵至10¹¹TCID₅₀、10⁵至10¹⁰TCID₅₀、10⁶至10¹⁰TCID₅₀、或10⁷至10¹⁰TCID₅₀的呼肠孤病毒。

根据初始治疗方案的效果，可以重复施用有效量的病毒。通常，可以在监测所有反应的同时定期施用病毒。本领域普通技术人员可以容易地理解，根据给药时间表和所选途径，可以施用比上述更高或更低剂量的病毒。

在本发明的一个实施方案中，确认当在结直肠癌动物模型中单独或与抗PD-L1抗体组合施用呼肠孤病毒时，结直肠癌相关疾病的严重性显著减轻(图2和3)。

在本发明的另一个实施方案中，确认当在结直肠癌动物模型中单独或与抗PD-L1抗体组合施用呼肠孤病毒时，结直肠癌动物模型的存活率显著增加(图4)。

在本发明的又一个实施方案中，确认当在结直肠癌动物模型中单独或与抗PD-L1抗体组合施用呼肠孤病毒时，结直肠癌动物模型的存活率显著增加(图6)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在皮肤癌动物模型中，根据呼肠孤病毒和抗PD-L1抗体的联合施用，减少皮肤癌体积的效果显著增加(图8)。

在本发明的又一个实施方案中，确认根据在皮肤癌动物模型中联合施用呼肠孤病毒和抗PD-L1抗体，皮肤癌动物模型的存活率显著增加(图9)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在肾癌动物模型中，根据呼肠孤病毒和抗PD-L1抗体的联合施用，减少肾癌体积的效果和减少肾癌生长速率的效果显著增加(图11)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在结直肠癌动物模型中，由于单独口服施用呼肠孤病毒，减少结直肠癌体积的效果和降低结直肠癌生长速率的效果显著增加(图13)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在结直肠癌动物模型中由于单独口服施用呼肠孤病毒，CD8+T细胞浸润入肿瘤的比例显著增加(图14至16)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在结直肠癌动物模型中由于呼肠孤病毒和抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体的联合施用，减少结直肠癌体积的效果和降低结直肠癌生长速率的效果显著增加(图18)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在结直肠癌动物模型中由于联合施用呼肠孤病毒和抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体，浸润入肿瘤中的CD8+T细胞的比例显著增加(图19)。

在本发明呼肠孤病毒的又一个实施方案中，确认在使用呼肠孤病毒、抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体使结直肠癌完全消退后，CT26结直肠癌不会因CT26再激发而复发(图20)。

在本发明呼肠孤病毒的又一个实施方案，确认了在使用呼肠孤病毒、抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体使结直肠癌完全消退后，脾脏中的记忆T细胞率(CD44+CD62+CD8+)和CD8+T细胞的比例因CT26再激发而显著增加(图21)。

在本发明的又一个实施方案中，确认在结直肠癌模型的肠系膜***中，通过呼肠孤病毒施用，CD8+细胞的PD-1表达增加(图23)。

根据上述结果，预期本发明的药物组合物可用于预防和治疗癌症或复发性癌症。

根据本发明的药物组合物可以用呼肠孤病毒制备；经呼肠孤病毒处理的生物样品和免疫检查点抑制剂呈单一组合物形式或单独组合物形式。优选地，根据本发明的药物组合物可以以单独组合物的形式制备。制备该组合物的方法可以使用本领域常用的技术。

呼肠孤病毒的总有效量；并且经呼肠孤病毒处理的生物样品或免疫检查点抑制剂可以以单一剂量施用，或通过在长时间段内施用多次剂量的分级治疗方案施用。根据本发明的药物组合物可以根据疾病的严重程度和/或目的而含有不同量的组分(根据本发明的PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)，并且通常可以以0.01μg至10000mg(优选0.1μg至1000mg)的有效剂量用于单一施用，并且每天重复施用几次。然而，患者的有效剂量是在考虑诸如配方方法、施用途径、治疗次数以及患者的年龄、体重、健康状况和性别、疾病的严重程度、饮食和***率之类的各种参数的情况下确定的，因此考虑到这一点，本领域普通技术人员可以确定本发明组合物的合适有效剂量。根据本发明的药物组合物在其制剂、施用途径和施用方法方面没有特别限制，只要表现出本发明的效果即可。

根据本发明的药物组合物可以进一步包括常规用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。例如，赋形剂可以是选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、膜包衣材料和控释添加剂组成的群组中的一种或多种。

根据本发明的药物组合物可以根据常规方法以粉末、颗粒、缓释颗粒、肠溶颗粒、溶液和液体、眼用溶液、酏剂、乳液、悬浮液、醑剂、锭剂、芳香水、柠檬水、片剂、缓释片、肠溶片、舌下片、硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、肠溶胶囊、药丸、酊剂、软提取物、干提取物、流体提取物、注射剂、胶囊、囊剂、灌注液、膏药、洗剂、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴剂、无菌注射剂或外部制剂(如气雾剂)的形式配制，并且外部制剂可以配制成乳膏、凝胶、贴剂、喷雾、软膏、膏药、洗剂、搽剂、糊剂或泥罨剂。

可包括在根据本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的药物组合物可以用通常用于制备的稀释剂或赋形剂(如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂)配制。

作为片剂、粉末、颗粒剂、胶囊、丸剂和锭剂的添加剂，可以使用：赋形剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、二甘露醇、沉淀碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸一氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、纯化羊毛脂、微晶纤维素、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、高岭土、尿素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMC 1928、HPMC 2208、HPMC 2906、HPMC 2910、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙和Primojel；粘合剂，例如明胶、***胶、乙醇、琼脂粉末、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、葡萄糖、纯净水、酪蛋白酸钠、甘油、硬脂酸、羧甲纤维素钠、甲基纤维素钠、甲基纤维素、微晶纤维素、糊精、羟基纤维素、羟丙基淀粉、羟甲基纤维素、纯化虫胶、淀粉粉末、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如羟丙基甲基纤维素、玉米淀粉、琼脂粉末、甲基纤维素、膨润土、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钙、十二烷基硫酸钠、硅酸酐、1-羟丙基纤维素、葡聚糖、离子交换树脂、聚乙酸乙烯酯、甲醛处理的酪蛋白和明胶、海藻酸、直链淀粉、瓜尔胶、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、凝胶淀粉、***胶、支链淀粉、果胶、聚磷酸钠、乙基纤维素、蔗糖、硅酸镁铝、二山梨醇溶液和轻质无水硅酸；以及润滑剂，例如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、氢化植物油、滑石、石灰石高岭土、矿脂、硬脂酸钠、可可脂、水杨酸钠、水杨酸镁、聚乙二醇(PEG)4000、PEG6000、液体石蜡、氢化大豆油(Lubri蜡)、硬脂铝、硬脂锌、十二烷基硫酸钠、氧化镁、聚乙烯醇(Macrogol)、合成硅酸铝、硅酸酐、高级脂肪酸、高级醇、硅油、石蜡油、聚乙二醇脂肪酸醚、淀粉、氯化钠、乙酸钠、油酸钠、二亮氨酸和轻质无水硅酸。

根据本发明作为液体的添加剂，可以使用水、稀盐酸、稀硫酸、柠檬酸钠、蔗糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温酯)、聚氧亚单烷基醚、羊毛脂醚、羊绒脂酯、乙酸、盐酸、氨水、碳酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、醇溶谷蛋白(prolamine)、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素或羧甲基纤维素钠。

根据本发明作为糖浆，可以使用蔗糖溶液、其他糖或甜味剂，如果需要，可以使用香料、着色剂、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂或增稠剂。

根据本发明作为乳液，可以使用纯净水，如果需要，可以使用乳化剂、防腐剂、稳定剂或香料。

根据本发明作为悬浮剂，可以使用诸如相思树、黄芪、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维钠、微晶纤维素、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMC 1828、HPMC 2906或HPMC 2910之类的悬浮剂，并且如果需要，可以使用表面活性剂、防腐剂、稳定剂、着色剂或者香料。

根据本发明作为注射剂，可以使用：溶剂，例如可注射无菌水、0.9％注射用氯化钠、林格溶液、注射用葡萄糖、注射用葡聚糖+氯化钠、PEG、乳酸化的林格溶液、乙醇、丙二醇、非挥发性油-芝麻油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油、油酸乙酯、异丙基肉豆蔻酸或苯甲酸苯酯；增溶剂，例如苯甲酸钠、水杨酸钠、乙酸钠、尿素、尿烷、单乙基乙胺、丁唑啉、丙二醇、吐温、烟酰胺、六胺或二甲基乙酰胺；缓冲剂，例如弱酸及其盐(乙酸和乙酸钠)、弱碱及其盐(氨和乙酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨或树胶(gum)；等渗剂，例如氯化钠；稳定剂，例如亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、二氧化碳气体、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₃)，亚硫酸钠(Na₂SO₃)、氮气(N₂)或乙二胺四乙酸；抗氧化剂，例如0.1％亚硫酸氢钠、甲醛亚硫酸钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠或丙酮亚硫酸氢钠；止痛剂，例如苄醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖或葡萄糖酸钙；或者悬浮剂，例如CMC钠、海藻酸钠、吐温80或单硬脂酸铝。

根据本发明作为栓剂，可以使用碱，例如可可脂、羊毛脂、Witepsol、聚乙二醇、甘油明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸盐和油酸盐的混合物、Subanal、棉籽油、花生油、棕榈油、可可脂+胆固醇、卵磷脂、Lanette蜡、单硬脂酸甘油酯、吐温或Span、Imhausen、单烯(单硬脂酸丙二醇酯)、甘油、Adeps solidus、Buytyrum Tego-G、Cebes Pharma 16、六内酯碱95,Cotomar、Hydrokote SP、S-70-XXA、S-70-XX75(S-70-XX95)、Hydrokote 25、Hydrokote 711、Idropostal；Massa estrarium,A,AS,B,C,D,E,I,T)；Mass-MF、Masupol、Masupol-15、新栓剂-N(neosuppostal-N)、paramount-B、supposiro(OSI,OSIX,A,B,C,D,H,L)、IV型栓剂碱(AB,B,A,BC,BBG,E,BGF,C,D,299)、Suppostal(N,Es)、Wecoby(W,R,S,M,Fs)或Tegester甘油三酯碱(TG-95,MA,57)。

用于口服施用的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉末、颗粒或胶囊，并且这种固体制剂可以通过将至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)与活性成分混合来制备。此外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石。

作为口服施用的液体制剂，可以使用悬浮液、内用液体、乳剂或糖浆，并且可以包括通常使用的简单稀释剂，例如水或液体石蜡，以及各种类型的赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。用于肠胃外施用的制剂可以是灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干剂或栓剂。作为非水溶剂或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)或可注射酯(如油酸乙酯)。

在本发明中，除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括白蛋白和缓冲剂。

根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。本文所用的“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量可由包括以下的参数确定：患者疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和***率、治疗持续时间和同时使用的药物以及医学领域中众所周知的其他参数。

根据本发明的药物组合物可以单独或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用，或者以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述参数，重要的是在没有副作用的情况下以最小剂量实现最大效果，并且这种剂量可以由本领域普通技术人员容易地确定。

本发明的药物组合物可以经由各种途径施用到受试者。可以预期所有的施用方法，并且本发明的药物组合物可以通过例如口服施用、皮下注射、腹膜内施用、静脉注射、肌肉内注射、椎管旁间隙(鞘内)注射、舌下施用、颊粘膜施用、直肠***、******、眼施用、耳施用、鼻施用、吸入、经口或鼻喷雾、皮肤施用或经皮施用。

本发明的药物组合物由作为活性成分的药物的类型以及诸如待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度之类的若干相关参数确定。

本文所用的“受试者”是指需要治疗疾病的受试者，更具体地是指诸如人类或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛之类的哺乳动物，但本发明不限于此。

本文所用的“施用”是指通过任何合适的方法向受试者提供本发明的组合物。

本文所用的“预防”是指抑制或延缓所需疾病发生的所有作用，本文所用“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物来减轻或有益地改变目标疾病和代谢异常的症状所涉及的所有作用，并且“改进”是指通过施用根据本发明的组合物来降低与目标疾病相关的参数(例如症状的严重程度)的所有作用。

如本文所述，本说明书中提及的所有文件通过引用并入本文。当介绍本发明或其优选实施方案的元素时，术语“一种”、“一个”、“该”和“所述”意指一个或多个元素。术语“包含”、“包括”和“具有”意在是包含在内的，并意指除了所列要素之外还有其他要素。尽管已经参考特定方面或实施方案描述了本发明，但不应将其解释为限制各方面的细节。

下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。

实施例

实施例1.偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结直肠癌动物模型的制备

实验中使用的动物是购自Nara Biotech(韩国首尔)的7至8周龄的雌性BALB/C小鼠。将小鼠在ViroCure公司的动物实验室中驯化7天，然后进行实验，在驯化期间，水和饲料不受限制。为实验动物提供标准环境，以12小时间隔保持昼夜，将室内温度保持在适当水平(23±2℃)。如图1中所示，通过以下诱发结肠炎相关的结直肠癌：将致癌物AOM(Merk,目录号25843-45-2)以12mg/kg的浓度腹膜内注射到小鼠中一次，一周后，提供2.5％(W/V)DSS(代替普通饮用水)持续1周，并在两周休止期后，重复4组的1周DSS治疗(不包括AOM治疗)，以及2周休止期。

实施例2.口服施用含呼肠孤病毒的组合物和全身施用免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)

将实验中使用的小鼠分为正常对照、AOM/DSS诱导的结直肠癌组、呼肠孤病毒口服施用组、免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)腹腔内施用组和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组，并进行实验。作为用于将呼肠孤病毒施用到结直肠癌动物模型中的方法，使用口服施用，并且使用直接腹腔内注射进行抗体施用。

如图1中所示，在1x10⁸TCID₅₀/100μL PBS(在1xPBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))的条件下，连续口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)持续5天，并每隔一天以5mg/kg腹腔内施用抗PD-L1抗体(BioXcell,目录号BE0101)3次。如图1中所示，此施用总共重复4次。

实施例3.使用AOM/DSS诱导的结直肠癌动物模型分析用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物的治疗效果

从第一AOM治疗后第39天开始，进行实验，同时通过体重测量、大便和***状况、存活率以及癌症的形成和生长来观察结直肠癌的存在或不存在以及症状的严重程度。

使用GraphPad Prism 6进行统计分析。在单向ANOVA测试中，使用Dunnett多重比较测试来比较正常对照、AOM/DSS诱导的结直肠癌组、呼肠孤病毒口服施用组、免疫检查点抑制剂腹膜内施用组和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组之间的差异。P值小于0.05的差异被认为是统计学显著的。数据表示为平均值±SEM。

3-1.通过疾病活动性指数(DAI)测量进行目视评估

为了测量口服施用实施例2的含呼肠孤病毒的组合物并用抗PD-L1抗体腹膜内处理的结直肠癌动物模型小鼠的结直肠癌相关疾病的严重程度，根据基于图2所示的疾病活动性指数(DAI)的等级，通过检查体重变化、大便硬度和目视观察粪便或***中有无血便来测量疾病活动性。

如图3中所示，从施用后第4天起，在AOM/DSS施用的小鼠中开始出现软便和肉眼血便，并且在第7天，在所有小鼠中观察到腹泻和血便。同时，在口服施用呼肠孤病毒和腹腔内施用抗PD-L1抗体的联合施用组中，确认腹泻和血便的程度显著改进。

该结果表明，含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)的联合施用对结直肠癌表现出优异的抗癌效果。

3-2.通过测量存活率进行评估

结直肠癌动物模型通过结肠中的持续炎症和随后的癌症形成导致死亡。

如图4中所示，根据结直肠癌动物模型中疾病的进展，在AOM/DSS诱导的结直肠癌组和单一施用组(病毒或抗体施用组)中有死亡，而在联合施用组中没有发生死亡。

这些结果表明，含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)的联合施用可以大大改进结直肠癌的存活率。

3-3.通过测量癌症形成和生长进行评估

根据结直肠癌动物模型中疾病的进展，在单一施用组(病毒或抗体施用组)中，预期会部分抑制癌症形成或有不显著的效果。另一方面，在联合施用组中，预期由炎症引起的癌症形成将受极大抑制。

因此，预期含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)的联合施用极大抑制结直肠癌中的癌症形成和生长。

实施例4.通过将结直肠癌细胞系(CT26)外科手术植入结肠壁来制备结直肠癌动物模型

实验中使用的动物是购自Nara Biotech(韩国首尔)的7至8周龄的雌性BALB/C小鼠。将小鼠在ViroCure公司的动物实验室中驯化7天，然后进行实验，在驯化期间，水和饲料不受限制。为实验动物提供标准环境，以12小时间隔保持昼夜，并将室内温度保持在适当水平(23±2℃)。将结直肠癌细胞系(CT26细胞，1x10⁶细胞/10μL PBS)注射到结肠壁并植入小鼠内。通过确认植入后2周形成癌症，建立结直肠癌动物模型。

实施例5.口服施用含呼肠孤病毒的组合物和全身施用免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)

将实验中使用的动物分为正常对照、CT26细胞植入结直肠癌组、呼肠孤病毒口服施用组和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组，并进行实验。将呼肠孤病毒施用到结直肠癌动物模型中的方法是口服施用，并且抗体施用方法是直接腹膜内注射。

CT26细胞植入后4天，用1x10⁹/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))连续口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)持续3周，并以2.5mg/kg每3天腹腔内施用抗PD-L1抗体(BioXcell,Cat#BE0101)3次(图5)。

在结直肠癌动物模型中，如图6中所示，根据疾病的进展，与CT26细胞植入结直肠癌组相比，观察到治疗组(单独施用病毒或联合施用抗PD-L1抗体)的存活率得以改进。

该结果表明，单独施用含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)或联合施用免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)可极大改进结直肠癌的存活率。

实施例6.通过植入黑色素瘤细胞系(B16F10)制备皮肤癌动物模型

实验中使用的动物是购自Nara Biotech(韩国首尔)的5至8周龄雌性BALB/C小鼠。将小鼠在ViroCure公司的动物实验室中驯化7天，然后进行实验，在驯化期间，水和饲料不受限制。为实验动物提供标准环境，以12小时间隔保持昼夜，并将室内温度保持在适当水平(23±2℃)。将黑色素瘤细胞系(B16F10细胞，1x10⁵细胞/50μL PBS)皮下注射到小鼠的胁腹。

实施例7.口服施用含呼肠孤病毒的组合物和全身施用免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)

对载体、1x PBS中的0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS)施用对照、呼肠孤病毒口服施用组、免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)腹腔内施用组和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组进行抗癌效果试验。将呼肠孤病毒施用到结直肠癌动物模型中的方法是口服施用，并且抗体施用方法是直接腹膜内注射。

如图7中所示，在B16F10细胞植入后一周，在第1、2、3、6、7和8天，用1x10⁹TCID₅₀/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)达6次，并每隔一天以5mg/kg腹腔内施用抗PD-L1抗体(Bioxcell,目录号BE0101)3次。

实施例8.对皮肤癌动物模型中用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物的治疗效果的分析

8-1.通过测量癌症生长进行评估

如图8中所示，在皮肤癌动物模型中，可以确认未经处理的对照在小鼠中生成肿瘤后继续生长。随着疾病的进展，在单一施用组(病毒或抗体施用组)中，与对照相比，观察到癌症生长延迟效果。另一方面，在联合施用组中，癌症生长受极大抑制。

因此，预期含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)的联合施用有效地用于预防或治疗皮肤癌。

8-2.通过测量存活率进行评估

如图9中所示，随着皮肤癌动物模型中疾病的进展，与对照和单一施用组(病毒或抗体施用组)相比，在联合施用组中，存活率得到极大改进。

因此，预期含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体)的联合施用极大改进皮肤癌的存活率。

实施例9.肾癌小鼠模型中单一施用的抗癌效果

实验中使用的动物是购自Nara Biotech(韩国首尔)的5至8周龄雌性BALB/C小鼠。将肾癌细胞系(RENCA细胞，2x10⁵细胞/50μL PBS)皮下注射到小鼠胁腹。

在RENCA细胞植入后一周，在1x10⁹TCID₅₀/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))的条件下每天口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)一次并持续10天(图10)。

如图11中所示，可以确认，肾癌动物模型中未经处理的对照在小鼠中生成肿瘤后继续生长。此外，随着疾病的进展，与对照组相比，在呼肠孤病毒口服施用组中观察到癌症生长延迟效果。

实施例10.在结直肠癌细胞植入的结直肠癌动物模型中通过呼肠孤病毒口服施用诱导免疫细胞向肿瘤中的浸润增加

该实施例是为了在体内确认口服施用呼肠孤病毒是否诱导了抗癌免疫细胞(CD8+T细胞)向肿瘤中浸润的增加。

10-1.肿瘤小鼠模型的构建

将源自C57BL6结肠腺癌细胞的MC38细胞系以1.0x10⁵细胞的浓度再悬浮在50μL的PBS中，并皮下注射到6周龄雄性C57BL 6小鼠的胁腹。在MC38细胞植入后一周，在1x10⁹TCID₅₀/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))的条件下每天口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)一次并持续10天(图12)。

如图13中所示，在结直肠癌动物模型中，可以确认未经处理的对照在小鼠中生成肿瘤后继续生长。此外，随着疾病的进展，与对照相比，在呼肠孤病毒口服施用组中观察到癌症生长延迟效果。

10-2.免疫细胞浸润入肿瘤的评估

施用三天和十天后，从小鼠中取出肿瘤，用PBS洗涤，切成2至4mm的大小，然后用1ml的含0.1到0.5％ I型胶原酶的PBS(Gibco，目录号P2031)在37℃下处理30分钟至1小时。在此，加入10ml的FACS缓冲液(PBS中的0.1％ BSA+0.01％叠氮化钠)，混合并以300到400g离心5分钟。丢弃上清液，然后用7ml的FACS缓冲液回收团粒，接着通过70-μm细胞滤器过滤。将过滤的单细胞混合在10ml的FACS缓冲液中，以300到400g离心5分钟以回收沉淀物。丢弃上清液后，加入1至2mL的ACK裂解缓冲液(Lonza目录号10-548E)，在室温下放置1分钟，在10ml的FACS缓冲液中混合，并以300到400g离心5分钟。在用适量的FACS缓冲液再悬浮后，用CD8单克隆抗体(BD Biosciences，目录号563234)对细胞进行染色，以确认CD8+T细胞水平的增加，其通过流式细胞术使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)进行分析。

如图14中所示，在施用10天后，确认在呼肠孤病毒口服施用组中浸润入肿瘤的CD8+T细胞的量增加了5倍或更多。

也就是说，通过浸润入肿瘤的CD8+T细胞的增加(其作为癌症免疫疗法的肿瘤抑制作用的代表性生物标志物)，预期用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物将通过抗癌免疫激活在癌症治疗中起作用。

10-3.免疫细胞浸润入肿瘤和***的评估

施用三天和十天后，从小鼠中收集肿瘤和***，用丙酮固定，放入OCT溶液(Sakura Finetek，目录号4583)中，并储存在-80℃的低温冷冻箱中，以制备冷冻组织块。用低温恒温器(Leica Biosystems,CM3050S)将冷冻的组织块切成5至10μm的厚度，以制造载玻片。组织切片载玻片使用科普林缸(Coplin Jar)用PBS洗涤，用200μL Superblock(ThermoFisher Scientific,目录号37515)覆盖，并在室温下处理10分钟。然后，在PBS中稀释的荧光标记的CD8单克隆抗体(Biolegend，目录号100723)或CD31单克隆抗体，目录号102416)在室温下染色1到2小时，同时遮光，用PBS洗涤三次，用ProLong Diamond AntifadeMountant(Thermofisher Scientific,目录号P36965)涂覆，接着用盖玻片覆盖。随后，通过荧光显微镜观察染色程度。用DAPI溶液(BD Biosciences，目录号564907)进行核染色1分钟。

如图15中所示，确认：施用后，在呼肠孤病毒口服施用组中，浸润入肠系膜***的CD8+T细胞的量显示出增加的趋势，特别是，第10天的增加程度显著高。

此外，如图16中所示，在施用的第10天，确认：呼肠孤病毒口服施用组中浸润入肿瘤的CD8+T细胞的量显著增加，这与流式细胞术分析结果相同。

由于浸润入肿瘤的CD8+T细胞的增加是癌症免疫疗法的肿瘤抑制效果的代表性生物标志物，因此预期用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物将通过抗癌免疫激活作用于癌症治疗。

实施例11.结直肠癌动物模型中的治疗效果

实验中使用的动物是购自Nara Biotech(韩国首尔)的5至8周龄雄性BALB/C小鼠。将小鼠在ViroCure公司的动物实验室中驯化7天，然后进行实验，在驯化期间，水和饲料不受限制。为实验动物提供标准环境，以12小时间隔保持昼夜，并将室内温度保持在适当水平(23±2℃)。将结直肠癌细胞系(CT26细胞，2x10⁵细胞/50μL PBS)皮下注射到小鼠胁腹。

11-1.对结直肠癌动物模型中用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物的治疗效果 的分析

对载体、1x PBS中的0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS)施用对照、呼肠孤病毒口服施用组、免疫检查点抑制剂(抗PD-L1抗体)腹腔内施用组和呼肠孤病毒/免疫检查点抑制剂联合施用组进行抗癌效果试验。将呼肠孤病毒施用到结直肠癌动物模型中的方法是口服施用，并且抗体施用方法是直接腹膜内注射。

CT26细胞植入后一周，在1x10⁹TCID₅₀/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))的条件下，每天口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)一次并持续12天。以8mg/kg腹膜内施用抗PD-1抗体(Bioxcell,目录号BE0033-2)，以4mg/kg每三天施用抗CTLA4抗体(Bioxcell,目录号BE0164)四次(图17)。

11-2.通过测量癌症生长进行评估

如图18中所示，可以确认，结直肠癌动物模型中未经处理的对照在小鼠中生成肿瘤后继续增加肿瘤体积。然而，随着疾病的进展，在单一施用组(病毒或抗体施用组)中，与对照相比，观察到了癌症生长延迟效果。

另一方面，在联合施用组中，特别是联合施用两种免疫检查点抑制剂(RC402+aPD-1+aCTLA-4)的治疗组中，癌症生长被抑制了84.6％，并且产生了实现完全消退(CR)的受试者。

11-3.免疫细胞浸润入肿瘤的评估

施用13天后，从小鼠中取出肿瘤，并使用流式细胞术或免疫组织化学比较分析CD8+T细胞的浸润程度。

如图19中所示，确认：与经对照或仅抗体处理的组相比，仅病毒组或联合施用组中CD8+T细胞的肿瘤浸润程度与癌症生长抑制程度相关地增加，特别是确认了：在同时联合施用两种免疫检查点抑制剂的治疗组中，CD8+T细胞的肿瘤浸润程度显著增加。

实施例12.诱导长期抗癌免疫以预防治疗后癌症复发

12-1.通过测量癌症生长进行评估

通过联合施用含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(抗PD-1抗体)将CT26重新植入肿瘤完全消退的小鼠中。作为对照，使用新的BALB/C小鼠。

如图20中所示，确认了：在对照组中，CT26结直肠癌细胞系正常生长，但当CT26结肠癌细胞在完全消退后重新植入时，肿瘤没有生长。这意味着抗癌免疫效果持续。

因此，预期含呼肠孤病毒的组合物(口服施用)和免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体)的联合施用在临床上激活长期抗癌免疫。

12-2.脾脏中免疫细胞的分析

将从已发生完全消退的小鼠中取出10ml的脾脏打碎，然后通过70-μm细胞滤器过滤。通过以300至400g离心5分钟回收所得滤液。丢弃上清液后，加入1至2mL的ACK裂解缓冲液(Lonza目录号10-548E)，在室温下放置1分钟，在10mL的FACS缓冲液中混合，并以300至400g离心5分钟。在用适量的FACS缓冲液再悬浮后，用CD8单克隆抗体(BD Biosciences，目录号563234)、CD44抗体(Biosciences，目录号560569)、CD62抗体(BD Biosciences，目录号553150)对细胞进行染色，以确认CD8+T细胞水平的增加，其通过流式细胞术使用FACSDiVa软件(BD Bioscience)进行分析。

如图21中所示，确认了：在植入CT26结直肠癌细胞系的小鼠脾脏中，记忆T细胞(CD44+Cd62+CD8+)的比例增加。因此，确定记忆T细胞参与长期抗癌免疫。

也就是说，通过CD8+T细胞的增加，预期癌症免疫疗法的肿瘤抑制效果可以激活预防复发等长期抗癌免疫。

实施例13.通过呼肠孤病毒口服施用的免疫反应

以1.0x10⁵细胞将MC38细胞系再悬浮在50μL PBS中，并皮下注射到6周龄雄性C57BL6小鼠的胁腹。植入MC38细胞系一周后，在1x10⁹TCID₅₀/100μL PBS(1x PBS中的呼肠孤病毒/0.1％(w/v)人血清白蛋白(HAS))的条件下，每天口服施用呼肠孤病毒(3型，Dearing)一次并持续10天。

13-1.肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的增加

施用10天后，从小鼠中取出肠系膜***，并使用以MC38特异性抗原肽KSPWFTTL负载四聚体形式合成的MHC复合物(MBL，目录号TS-M507)，通过流式细胞术分析表达与其特异性结合的T细胞受体(TCR)的CD8+T细胞的变化。

用PBS清洗从小鼠中取出的肠系膜***，轻轻打碎，然后通过70-μm细胞滤器过滤。将过滤的单细胞在10ml的FACS缓冲液中混合，并通过以300至400g离心5分钟回收。将细胞以2x10⁷细胞/ml的浓度用适量的FACS缓冲液再悬浮。其中，将50μL的细胞悬浮液转移到含10μL的Clear Back溶液的试管中，并在室温下放置5分钟。在此，加入10μL的T-SelectMHC四聚体，然后轻轻搅拌所得产物，接着冷冻30至60分钟或在遮光条件下反应30分钟。加入抗CD8的单克隆抗体(BD Biosciences，目录号563234)，并在遮光条件下再次反应30分钟。通过以400g离心5分钟除去上清液，将沉淀物再悬浮在含0.5％多聚甲醛或***的磷酸盐缓冲溶液中。在遮光冷藏条件下放置1至24小时后，通过流式细胞术使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)分析所得产物。将MHC四聚体和CD8+T细胞的频率表示为总CD8+T细胞的百分比。

如图22中所示，确认了：在用于口服施用的含呼肠孤病毒的组合物的施用组中，具有肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞(KSP-四聚体+CD8+)显著增加。

13-2.增加***中CD8+T细胞中PD-1的表达

取出肠系膜***，用PBS洗涤，轻轻打碎，然后通过70μm细胞滤器过滤。将过滤的单细胞混合在10mL的FACS缓冲液中，然后通过以300至400g离心5分钟回收。

将血液加入EDTA(或肝素)涂层管中，并与PBS以1:1混合，将所得混合物转移到含Ficoll-Paque PLUS的15mL管中，离心以回收小鼠外周血单核细胞(PBMC)。以400g离心PBMC以除去上清液，加入1至2mL的ACK裂解缓冲液(Lonza目录号10-548E)并在室温下放置1分钟。之后，加入10mL的FACS缓冲液并混合，并通过以300至400g离心5分钟回收。通过从***或血液中分离而收集的免疫细胞用适量的FACS缓冲液再悬浮，并用CD8单克隆抗体(BDBiosciences，目录号563234)和抗PD-1的单克隆抗体(Biosciencies，目录号25-9985-80)进行染色，以使用流式细胞术确认表达PD-1的CD8+T细胞的增加。

如图23中所示，可以确认，在从血液中分离的PBMC中未观察到表达PD-1的CD8+T细胞的变化，但肠系膜***中的变化是明显的，导致CD8+T细胞增加2.5倍或更多。

本领域普通技术人员应当理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，本文公开的示例性实施方案可以容易地修改为其他特定形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的，而非在任何方面是限制性的。

工业适用性

本发明人不仅确认了呼肠孤病毒单独的癌症治疗效果，而且还确认了当呼肠孤病毒口服施用并与免疫检查点抑制剂联合使用时，特别是当PD-1抗体、CTLA-4抗体和呼肠孤病毒疫苗联合使用时，癌症治疗效果的显著增加，例如肿瘤体积减少、肿瘤生长速率的抑制，以及结直肠癌、皮肤癌和肾癌的存活率的增加，本发明人确认了不仅癌症完全消退，而且癌症的复发也可受抑制。因此，本发明的呼肠孤病毒将有效地用作各种类型癌症的治疗剂和治疗佐剂，因此其具有工业适用性。

Claims (13)

1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌症是选自由以下项组成的群组中的一种或多种：***、肺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、脑癌、血癌，胃癌、肛周癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、膀胱癌、肾癌、泌尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、CNS中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤。

3.根据权利要求1所述的组合物，其还包含免疫检查点抑制剂。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂组成的群组的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述呼肠孤病毒或所述经呼孤病毒处理的生物样品；以及所述免疫检查点抑制剂同时、单独或依次施用。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述呼肠孤病毒或所述经呼肠孤病毒处理的生物样品是口服施用的。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物增加CD8+T细胞进入肿瘤的浸润。

8.一种用于预防或治疗复发性癌症的药物组合物，其包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分。

9.根据权利要求8所述的组合物，其还包含免疫检查点抑制剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂组成的群组中的一种或多种。

11.一种预防或治疗癌症或复发性癌症的方法，所述方法包含：

将包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分的组合物施用到受试者。

12.包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分的组合物用于预防或治疗癌症或复发性癌症的用途。

13.包含呼肠孤病毒或经呼肠孤病毒处理的生物样品作为活性成分的组合物用于制备用于预防或治疗癌症或复发性癌症的药物的用途。

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