本文中所定義的術語具有為本發明相關領域中之一般技術者所普遍瞭解的含意。術語諸如「一」、「一個」及「該」非旨在僅指單數，而是包括其中一特定實例可用於說明之一般類別。本文中的術語係用於描述本發明之特定實施例，但除非如於專利申請範圍中所列出，否則其使用並不限制本發明。例如，術語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。 如本文中所使用，術語「腫瘤」及「癌症」可互換使用且係指不具有生理功能且起因於不受控制之通常快速的細胞增殖產生之組織之惡性新生長。 如本文中所使用，「癌細胞」或「腫瘤細胞」係指在活體內、離體及在組織培養中具有不一定涉及吸收新遺傳物質之自發或誘導的表型變化之癌、癌前或轉化細胞。雖然轉化可起因於感染轉化病毒且併入新的基因組核酸、或吸收外源核酸發生，但其亦可自發地或在暴露於致癌物後，藉此使得內源基因突變而發生。轉化/癌症之實例係，例如，在適宜的動物宿主諸如裸小鼠中之形態變化、細胞永生化、異常生長之控制、病灶形成、增生、惡性病、腫瘤特異性標誌物水平、侵襲、腫瘤生長或抑制、及類似(活體外、活體內及離體)。 如本文中所使用，術語「醫藥上可接受之載劑」係指包括任何標準醫藥載劑，例如，磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水及乳液(諸如油/水或水/油乳液)、及各種類型的潤濕劑。該等組合物亦可包括穩定劑及防腐劑及任何上述載劑，但額外的限制條件為其等在活體內使用係可接受的。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin之REMINGTON'S PHARM.SCI.，第18版，Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1995)及「PHYSICIAN'S DESK REFERENCE」，第58版，Medical Economics, Montvale, N.J. (2004)。 如本文中所使用，術語「個體」在本文中定義為包括動物，諸如哺乳動物，包括(但不限於)靈長類動物(例如人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠及類似者。在特定實施例中，該個體為人類。術語「個體」及「患者」在本文中可互換用於指例如哺乳動物個體，諸如人類。 如本文中所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指根除或改善疾病或病症、或一或多種與該疾病或病症相關聯之症狀。在某些實施例中，該等術語係指藉由對罹患此種疾病或病症的個體投與一或多種預防性或治療性藥劑使得該疾病或病症之擴散或惡化最小化。在一些實施例中，該等術語係指在診斷出特定疾病或特定疾病之症狀發作後投與本文中所提供的化合物或抗體或劑型(含或不含一或多種額外活性劑)。 如本文中所使用，術語「抗體」意欲包括完整分子以及其包含抗原結合位點之片段二者。此等包括(但不限於)不含完整抗體的Fc片段之Fab及F(ab')
2
片段、及雙特異性抗體。 如本文中所使用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指防止疾病或病症或其一或多種症狀之發作、復發或擴散。在某些實施例中，該等術語係指在症狀發作前尤其對處在本文中所提供的疾病或病症風險中的患者用本文中所提供的化合物或抗體或劑型(含或不含一或多種其他額外活性劑)治療或投與其。該等術語包涵抑制或減輕該特定疾病之症狀。就此而言，術語「預防」可與術語「預防性治療」互換使用。 如本文中所使用，術語「復發」係指治療後癌症已有所緩解的個體再度具有癌細胞的情況。 如本文中所使用，術語「難治癒」或「抗性」係指個體甚至在強化治療後體內具有殘留癌細胞的情形。 如本文中所使用，術語「耐藥性」係指當疾病對一或多種藥物之治療無應答時的狀況。耐藥性可係內因性的，此意指疾病從未應答過該一或多種藥物，或其可係後天性的，此意指疾病停止對該疾病先前已有應答的該一或多種藥物的應答。 如本文中所使用，術語「抗癌藥物」或「癌症治療劑」意欲包括抗增生藥物及化療劑。 如本文中所使用，術語「共同投與」及「與···組合」包括除非另有指示，否則在未指定之時間限制內同時、合併、分開或連續地投與兩種或更多種治療劑。在一個實施例中，該等治療劑係在相同組合物或單位劑型中。在其他實施例中，該等治療劑係在分開組合物或單位劑型中。 如本文中所使用，術語「分開」治療使用係指在相同時間或在實質上相同時間藉由不同途徑投與至少兩種活性成分。 如本文中所使用，術語「連續」治療使用係指在不同時間投與至少兩種活性成分，投藥途徑係相同或不同的。更特定言之，連續使用係指在開始投與另一種或其他活性成分前完全地投與一種活性成分。因此，可在投與另一種或其他活性成分前歷時幾分鐘、幾小時或幾天投與一種活性成分。 如本文中所使用，術語「同時」治療使用係指依相同途徑且在相同時間或在實質上相同時間投與至少兩種活性成分。 在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合，其包含抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯之疫苗的組合。在一個實施例中，該組合包含約5至約50 mg/mL之抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑之與HPV抗原相關聯之疫苗。 在一些實施例中，組合中之該抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體的量為約5 mg至約45 mg、約5 mg至約40 mg、約5 mg至約35 mg、約5 mg至約30 mg、約10 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約10 mg至約35 mg、約10 mg至約30 mg、約15 mg至約45 mg、約15 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約15 mg至約30 mg、約20 mg至約45 mg、約20 mg至約40 mg、約20 mg至約35 mg或約20 mg至約30 mg。 在一些實施例中，組合中之該與HPV抗原相關聯之疫苗的量為約1 x 10
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至約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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CFU/劑或約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑。 在另一個態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防罹患與HPV相關聯之腫瘤的個體中腫瘤生長、侵襲及/或轉移之方法，其包括投與抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯之疫苗。在一個實施例中，該抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯之疫苗可同時、合併、分開或連續地投與。在一個實施例中，該等腫瘤係與HPV相關聯之腫瘤。 在另一個態樣中，本發明提供一種用於改良個體中之PD-1/PD-L1癌症免疫療法之方法，其包括投與抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯之疫苗的組合。在一個實施例中，該抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯之疫苗可同時、合併、分開或連續地投與。 在一個實施例中，該方法可改良癌症的預後。 在一些實施例中，該與HPV相關聯之腫瘤為肺腫瘤、子宮頸腫瘤、***腫瘤、外陰腫瘤、陰莖腫瘤、肛門腫瘤、直腸腫瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭部及頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)及口咽腫瘤。在一個實施例中，該與HPV相關聯之腫瘤為受HPV感染的肺或子宮頸腫瘤。在一個實施例中，該與HPV相關聯之腫瘤係PD-L1-陽性肺腫瘤。較佳地，該肺腫瘤為非小細胞肺腫瘤。 在一個實施例中，該抗-PD-L1抗體為阿特珠單抗或MEDI4736。在一個實施例中，該抗-PD-1抗體為納武單抗或帕姆單抗。 在一個實施例中，該與HPV相關聯之疫苗為治療性與HPV相關聯之疫苗。在一個實施例中，該與HPV相關聯之疫苗為攜帶Lm-LLO-E6融合蛋白質之載體。較佳地，該攜帶Lm-LLO-E6融合蛋白質之載體為攜帶表現Lm-LLO-E6融合蛋白質之質體的李斯特菌。較佳地，該李斯特菌物種為單核細胞增多性李斯特菌。 如下為Lm-LLO-E6融合蛋白質之核酸序列及胺基酸序列。 DNA (1803 bp) ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATAGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGAT
CTCGAG
CACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA (SEQ ID NO:1) 蛋白質(601 aa) MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD
LE
HQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL* (SEQ ID NO:2) 在一個實施例中，該個體為已復發性或難治愈個體。在一個實施例中，該個體為哺乳動物。較佳地，該個體為靈長類(例如人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠或小鼠。 在一個實施例中，該抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體的給藥量在約0.01 mg/kg至約20 mg/kg範圍內。較佳地，該抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體的含量為約0.01 mg/kg至約15 mg/kg、約0.01 mg/kg至約10 mg/kg、約0.01 mg/kg至約5 mg/kg、約0.01 mg/kg至約1 mg/kg、約0.05 mg/kg至約20 mg/kg、約0.05 mg/kg至約15 mg/kg、約0.05 mg/kg至約10 mg/kg、約0.05 mg/kg至約5 mg/kg、約0.1 mg/kg至約20 mg/kg、約0.1 mg/kg至約15 mg/kg、約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約20 mg/kg、約0.5 mg/kg至約15 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約15 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約15 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約5 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、或約10 mg/kg至約15 mg/kg。 在一個實施例中，該與HPV抗原相關聯之疫苗的給藥量在約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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至約1 x 10
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CFU/劑、約1 x 10
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CFU/劑或約1 x 10
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CFU/劑範圍內。 本發明之醫藥組合可進一步包含一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑及其他的經併入調配物中以提供改良之轉移、遞送、耐受及類似的藥劑(本文中統稱為「醫藥上可接受之載劑或稀釋劑」)。許多適宜的調配物可在為所有藥物化學家已知的處方集中發現：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa。該等調配物包括(例如)粉劑、膏劑、軟膏、膠凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)微脂粒、DNA共軛物、無水吸收膏、水包油型及油包水型乳液、乳液碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固態凝膠及半固態含碳蠟混合物。亦可參見Powell等人，「Compendium of excipients for parenteral formulations」 PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311。 因此，設計用於口服、舌、舌下、口頰及口腔外投藥的組合/組合物可在不需要過度實驗下由相關技術中熟知的方法，例如，用惰性稀釋劑或用可食載劑進行製造。該等組合物可密封於明膠膠囊中或壓縮成錠劑。為口服治療投藥的目的，本發明之醫藥組合物可併入賦形劑並呈錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑(wafer)、口嚼錠及類似形式使用。 錠劑、丸劑、膠囊、片劑及類似物亦可包含黏合劑、受體、崩解劑、潤滑劑、甜味劑及矯味劑。黏合劑的一些實例包括微晶纖維素、黃蓍膠或明膠。賦形劑的實例包括澱粉或乳糖。崩解劑的一些實例包括海藻酸、玉米澱粉及類似物。潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。滑動劑的一個實例為膠態二氧化矽。甜味劑的一些實例包括蔗糖、醣精及類似物。矯味劑的實例包括薄荷、水楊酸甲酯、柳橙香精及類似物。 較佳地，本發明之組合/組合物係以非經腸式，諸如(例如)藉由靜脈內、肌肉內、鞘內或皮下注射、經鼻內、經***、經直腸、經舌、經舌下、經頰、經頰內及經皮投與給患者。非經腸投藥可藉由將本發明組合物併入至溶液或懸浮液中來實現。此等溶液或懸浮液亦可包含無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。非經腸調配物亦可包含抗細菌劑(諸如(例如)苄醇或對羥基苯甲酸甲酯)、抗氧化劑(諸如(例如)抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)及螯合劑(諸如EDTA)。亦可添加緩衝劑(諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)及用於調整滲透性之試劑(諸如氯化鈉或葡萄糖)。可將非經腸製劑密封於由玻璃或塑料製成的安瓿、丟棄式針筒或多劑量小瓶中。 直腸投藥包括投與醫藥組合/組合物至直腸或大腸中。此可使用栓劑或灌腸劑來實現。可由相關技術中已知的方法輕易地製得栓劑調配物。例如，可藉由加熱甘油至約120℃，將果膠組合物溶解於該甘油中，混合該經加熱的甘油，此後，可添加純水，然後將該熱混合物倒入至栓劑模具中來製備栓劑調配物。 經皮投藥包括穿過皮膚經皮吸收組合物。經皮調配物包括貼劑、軟膏、霜劑、凝膠、藥膏及類似物。 本發明之一個實施例顯示包含抗-PD-L1抗體或抗-PD-1抗體及與HPV抗原相關聯的疫苗之組合可係一用於抑制由受HPV感染的肺及子宮頸癌細胞誘導的腫瘤生長及轉移之有效治療。
實例 材料及方法
用於以下實例中之Lm-LLO、LLO-E6及Lm-LLO-E7係指Peng X、Hussain SF、Paterson Y。兩種靶向人類乳頭瘤病毒-16 E7之單核細胞增多性李斯特菌疫苗誘導抗腫瘤反應之能力與骨髓樹突細胞功能相關。Journal of immunology 2004；172:6030-8；及Gunn GR、Zubair A、Peters C、Pan ZK、Wu TC、Paterson Y。兩種表現人類乳頭瘤病毒-16(HPV-16) E7之不同分子形式的單核細胞增多性李斯特菌疫苗載體定性誘導不同T細胞免疫性，其與其誘導由HPV-16永生化之已確立腫瘤消退的能力相關。Journal of immunology 2001; 167:6471-9。用於以下實例中之抗-PD-L1抗體為BioLegend目錄號329716, RRID:AB_11149168中的抗體。
研究個體
從1998年與2004年期間在臺中榮民總醫院(Taichung Veterans General Hospital)胸外科(臺灣台中市)做過原發性NSCLC手術切除的122位患者收集肺腫瘤樣本。要求該等患者提交書面知情同意書；該研究已獲機構審查委員會(Institutional Review Board)(TMUH第201301051號)批准。依世界衛生組織(World Health Organization)分類系統在組織學上判定所收集的每個樣本之腫瘤類型及階段。藉由病歷閱讀得到癌症復發資料並由胸外科醫生證實。藉由病歷閱讀及中華民國行政院衛生部台灣癌症登記中心收集臨床參數及OS及RFS資料。
細胞系
TL-1及TL-4細胞由Y.-W. Cheng博士(臺灣台北市臺北醫學大學癌症生物學及藥物發現研究所)友好提供(10)。SiHa及C33A細胞係從食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(台灣新竹市)獲得。將TL-1、TL-4及C33A癌細胞系維持在RPMI-1640培養基(HyClone, Logan, UT)中。將SiHa癌細胞系維持在DMEM培養基(HyClone, Logan, UT)中。培養基包含補充青黴素(100 U/mL)及鏈黴素(100 mg/mL)之10%胎牛血清(FBS)。依供應商說明書培養該等細胞。一旦復甦，立刻藉由細胞形態監視、生長曲線分析、經同工酶學(isoenzymology)及染色體核型分析(karyotyping)驗證物種、經短串聯重複序列特性分析驗證同一性、及污染檢查來例行鑑認(每6個月一次；在2012年12月最後一次測試該等細胞)該等細胞系。
免疫組織化學分析
進行免疫組織化學分析以評估PD-L1蛋白質表現。將經福爾馬林固定且經石蠟包埋之樣本切成3 μm的切片，安置於玻璃上，並在37℃下乾燥過夜。接著在二甲苯中使所有切片脫蠟，經過醇再水化，並在磷酸鹽緩衝鹽水中洗滌。後續所有洗滌均使用該緩衝液。在微波烘箱中於檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中加熱該等切片兩次5 min且接著在室溫下依習知的鏈黴抗生物素過氧化物酶法(LSAB Kit K675, DAKO, Carpinteria, CA)培養60分鐘。用3,3'-二胺基聯苯胺使信號顯影5分鐘並用蘇木精(hematoxylin)將該等切片對比染色。省去一級抗體得到陰性對照。分別由三位觀測者評估信號的強度。
質體之建構、轉染、及穩定純系選擇
先前描述過HPV 16 E6 cDNA質體及HPV 16 E6小髮夾(sh)RNA。PD-L1 cDNA質體係購自Addgene (Addgene Company, Cambridge, MA)。PD-L1 shRNA係自中央研究院國家RNAi核心設施(National RNAi Core Facility, Academia Sinica)(台灣台北市)獲得。補充表2中呈現shRNA之靶序列。具有擾視序列及空載體表現之非特異性shRNA分別在敲低及異位表現實驗中用作對照。先前已描述轉染及穩定純系選擇程序。
非固著依賴性軟瓊脂群落形成
檢定非固著依賴性生長作為細胞在軟瓊脂板上形成群落之能力。底瓊脂係由6孔板中的含10%胎牛血清及0.5%瓊脂糖之生長培養基組成。將總共300個細胞再懸浮於含10%胎牛血清及0.4%瓊脂糖之生長培養基中並置於底瓊脂的頂部。在37℃下於5% CO
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的潮濕培養箱中使該等細胞生長。觀察群落並在培養14天後用顯微鏡定量，且計數直徑大於100 μm的群落。
皮下動物模型
六至八週齡雌性BALB/c裸小鼠及C57Bl/6小鼠係購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台灣台北)。依已獲NLAC動物照護及使用委員會核准的方案照護該等小鼠。以5 × 10
6
CFU/小鼠的劑量經腹膜內注射Lm-LLO-E6(E6)疫苗及Lm-LLO-E7(E7)疫苗。以25 μg/小鼠的劑量經靜脈內注射從BioLegend(San Diego, CA)獲得的抗-PD-L1 mAb。該實驗的目標係測定相比對照組由不同治療誘導的腫瘤生長之變化。簡言之，在第0天以500,000個TL-1細胞/小鼠皮下植入小鼠的右脇中。第7天(腫瘤尺寸~3至4 mm直徑)，該等小鼠係經腹膜內注射Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7及/或經靜脈內注射抗-PD-L1 mAb。在植入腫瘤後的第14天、第21天及第28天另用抗-PD-L1 mAb處理該等小鼠三次。對照組小鼠係僅注射TL-1或SiHa細胞。每3至4天使用數位游標卡尺測量腫瘤，並運用公式V = (W
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× L) /2，其中V為體積，L為長(長徑)，及W為寬(短徑)，計算得腫瘤體積。補充圖1中呈現流程圖。
尾靜脈轉移性肺腫瘤動物模型
以5 × 10
6
CFU/小鼠的劑量經腹膜內注射Lm-LLO-E6(E6)及Lm-LLO-E7(E7)疫苗。以25 μg/小鼠的劑量經靜脈內注射抗-PD-L1 mAb。本實驗的目標係測定不同治療誘導的腫瘤體積及存活期之變化。簡言之，在第0天藉由尾靜脈注射以100,000個TL-1或SiHa細胞/小鼠注射該等小鼠。第14天，該等小鼠經腹膜內注射Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7疫苗及/或經靜脈內注射抗-PD-L1 mAb。在注射腫瘤細胞後的第21天、第28天、第35天用抗-PD-L1 mAb再處理該等小鼠三次。該等小鼠繼續正常飲食直到死亡。
統計分析
使用如先前所描述的SPSS統計軟體程式(第17.0版；SPSS, Inc., Chicago, IL)進行所有統計分析(18，19)。進行統計測試的雙側方差分析，及P值＜0.050在統計學上視為顯著。
實例 1 抗 -PD-L1 抗體及 / 或與 Lm-LLO-E6 疫苗的組合物於腫瘤中之治療實驗
1. Lm-LLO-E6疫苗之發展。 用於E6腫瘤Ag研究中的李斯特菌菌株為Lm-LLO-E6(游離基因表現系統中之hly-E6融合基因)、Lm-E6(被整合至李斯特菌基因組中之單複本E6基因盒)、Lm-LLO-NP(游離基因表現系統中之hly-NP融合基因)及Lm-Gag(被整合至染色體中之單複本HIV-1 Gag基因盒)。先前已描述Lm-LLO-NP(亦稱為DP-L2028)(Chen CJ、Hsu LS、Lin LS、Lin SH、Chen MK、Wang HK、Hsu JD、Lee H、Yeh KT (2012) Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer. Human Pathology, 43, 1119-1125)及Lm-Gag(亦稱為ZY-18)(Wang YC、Sung WW、Wu TC、Wang L、Chien WP、Cheng YW、Chen CY、Shieh SH及Lee H* (2012). Interleukin-10 haplotype may predict survival and relapse in resected non-small cell lung cancer. PLOS ONE, 7, 7, e39525)。藉由PCR，使用引物5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID NO:6)(XhoI位點加下劃線)及5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID NO:7)(SpeI位點加下劃線)，擴增E6，並接合至pCR2.1(Invitrogen, San Diego, CA)中。藉由以XhoI及SpeI雙重消解自pCR2.1切下E6並接合至pGG-55中。表現系統pGG-55係模仿pDP-2028 (Chen CJ、Hsu LS、Lin LS、Lin SH、Chen MK、Wang HK、Hsu JD、Lee H、Yeh KT (2012). Loss of nuclear expression of Kruppel-like factor 4 is associated with poor prognosis in patients with oral cancer. Human Pathology, 43, 1119-1125)。將hly-E6融合基因及prfA選殖至pAM401(多複本穿梭質體)中，得到pGG-55。hly啟動子驅使hly基因產物之藉由XhoI位點連接至E6基因之前441個aa(LLO)表現。得到經轉錄且經分泌為LLO-E6之hly-E6融合基因。藉由刪除LLO的溶血性C端，消除在融合蛋白質中之溶血性活性。pGG-55上亦包含多潛能轉錄因子(prfA)。藉由用pGG-55轉化李斯特菌之prfA陰性菌株(XFL-7)(賓夕法尼亞州大學Hao Shen博士的一個成果)，吾人選擇質體在活體內滯留。使用引物5'-GGG GGC TAG CCC TCC TTT GAT TAG TAT ATT C-3'(SEQ ID NO:8)(NheI位點加下劃線)及5'-CTC CCT CGA GAT CAT AAT TTA CTT CAT C-3'(SEQ ID NO:9)(XhoI位點加下劃線)來產生hly啟動子及基因片段。使用引物5'-GAC TAC AAG GAC GAT GAC CGA CAA GTG ATA ACC CGG GAT CTA AAT AAA TCC GTT T-3'(SEQ ID NO:10)(XbaI位點加下劃線)及5'-CCC GTC GAC AG CTC TTC TTG GTG AAG-3'(SEQ ID NO:11)(SalI位點加下劃線)來PCR擴增prfA基因。藉由將包含驅使E6之表現及分泌之hly啟動子及信號序列之表現盒引入至單核細胞增多性李斯特菌基因組的orfZ域中來產生Lm-E6。藉由PCR，使用引物5'-GCG GAT CCC ATG GAG ATA CAC CTA C-3'(SEQ ID NO:12)(BamHI位點加下劃線)及5'-GCT CTA GAT TAT GGT TTC TGA G-3'(SEQ ID NO:13)(XbaI位點加下劃線)，擴增E6。接著將E6接合至pZY-21穿梭載體中。所得質體(pZY-21-E6)為表現系統，其包含先前所述的插在對應於單核細胞增多性李斯特菌基因組之orf X、Y、Z域之1.6-kb序列中間之表現盒。用pZY-21-E6轉化單核細胞增多性李斯特菌菌株10403S。同源域允許藉由同源重組將E6基因盒***至orfZ域中。純系係經篩選以用於將E6基因盒整合至orfZ域中。使細菌生長在含(Lm-LLO-E6及Lm-LLO-NP)或不含(Lm-E6及ZY-18)氯黴素(20 μg/ml)之腦心浸液培養基中。在-80℃下以等分試樣冷凍細菌。 2. Lm-LLO-E6疫苗對已確立之腫瘤生長的影響 六至八週齡雌性BALB/c裸小鼠及C57Bl/6小鼠係購自國家實驗室動物中心(台灣台北市)。依NLAC動物照護及使用委員會核准的方案照護該等小鼠。TL1細胞由Cheng YW博士友好提供。從ATCC(Manassas, VA)獲得藉由共轉染人類乳頭瘤病毒株16(HPV16)早期蛋白質6及7(E6及E7)及經活化之ras致癌蛋白至初代C57BL/6小鼠肺上皮細胞衍生得的TC-1細胞，並在37℃與5% CO
2
下使該等細胞生長在補充10% FBS、青黴素與鏈黴素(各100 U/ml)及L-麩醯胺酸(2 mM)之RPMI 1640中。含或不含人類乳頭瘤病毒-16 (HPV-16) E6及E7之李斯特菌疫苗載體 (Lm-LLO、LLO-E6及Lm-LLO-E7)由Advaxis Inc.提供。以5 ´ 10
6
CFU/小鼠的劑量經腹膜內注射兩種Lm-LLO、LLO-E6及Lm-LLO-E7。抗-PD-L1及抗-PD-1單株抗體係從CureTech(Israel)獲得並以50 μg/小鼠的劑量經靜脈內注射。用於流式細胞術之所有經螢光標記之抗體及適宜的同型對照係購自BD Biosciences (San Jose, CA)，如早先所述進行旨在分析腫瘤生長及存活期之治療實驗。簡言之，於第0天，在右脇中以皮下方式，以500,000個細胞/小鼠，C57Bl/6小鼠植入TC-1細胞及BALB/c裸小鼠植入TL-1細胞。第8天(腫瘤尺寸為~3至4 mm直徑)，適宜組的動物(每組5隻小鼠)經腹膜內注射Lm-LLO或Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7，含或不含經靜脈內注射抗-PD-L1或抗-PD-1抗體。在植入腫瘤後的第15天再次用疫苗及單株抗體處理該等小鼠。另一組小鼠不進行處理。每3至4天使用數位游標卡尺測量腫瘤，並利用公式V = (W
2
× L) /2(其中V為體積，L為長(長徑)及W為寬(短徑))計算得腫瘤體積。
實例 2 抗 -PD-L1 或抗 -PD-1 單株抗體及 / 或與 Lm-LLO 或 Lm-LLO-E6 或 Lm-LLO-E7 疫苗的組合物於轉移性腫瘤中之治療實驗
1. 抗-PD-L1(BioLegend目錄號329716，RRID:AB_11149168)或抗-PD-1單株抗體及/或與Lm-LLO-E6或-E7疫苗的組合在TC-1-誘導的轉移性肺腫瘤形成中之治療實驗。 六至八週齡雌性BALB/c裸小鼠及C57Bl/6小鼠係購自國家實驗動物中心(台灣台北市)。依NLAC動物照護及使用委員會核准的方案照護該等小鼠。含或不含人類乳頭瘤病毒-16 (HPV-16) E6及E7之李斯特菌疫苗載體(Lm-LLO、Lm-LLO-E6及Lm-LLO-E7)由Advaxis Inc.提供。以5 × 10
6
CFU/小鼠的劑量經腹膜內注射Lm-LLO、Lm-LLO-E6及Lm-LLO-E7。抗-PD-L1及抗-PD-1單株抗體係從BioLegend (目錄號329716、329926)獲得並分別以0.1 mg/kg至30 mg/kg的劑量經靜脈內注射。用於流式細胞術之所有經螢光標記之抗體及適宜的同型對照係購自BD Biosciences (San Jose, CA)。如先前所述(參考)進行旨在分析腫瘤生長及存活期之治療實驗。簡言之，第0天以500,000個TC-1細胞/小鼠在右脇中皮下植入該等小鼠。第8天(腫瘤尺寸為~3至4 mm直徑)，適宜組的動物(每組5隻小鼠)經腹膜內注射Lm-LLO或Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7及含或不含經靜脈內注射抗-PD-L1或抗-PD-1抗體。在植入腫瘤後的第15天用Lm-LLO、或Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7疫苗及抗-PD-L1或抗-PD-1抗體再次處理該等小鼠。另一組小鼠不進行處理。每3至4天使用數位游標卡尺測量腫瘤，且利用公式V = (W
2
´ L)/2(其中V為體積，L為長(長徑)及W為寬(短徑)計算得腫瘤體積。在m-LLO、LLO-E6或Lm-LLO-E7組合抗-PD-L1或抗-PD-1抗體的組中，腫瘤體積幾乎減小100%，而在單獨抗-PD-L1的組中，腫瘤體積減小約10%。 2. 小鼠樹突細胞之單離、純化及PD-L1表現之分析 如吾人先前所述從骨髓單離出小鼠樹突細胞(DC)並純化。為獲得人類DC，從健康成年血液供體(國家健康研究所血液庫)單離單核細胞。簡言之，藉由梯度離心，使用Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences)，單離周邊血液單核細胞(PBMC)，且洗滌後，允許其在37℃下黏附至組織培養板2 h。藉由洗滌移除未黏附的細胞，且在37℃、5% CO
2
下於板中的由RPMI 1640、2 mM L-麩醯胺酸、青黴素(100 U/ml)、鏈黴素(100 ug/ml)、10 mM HEPES、10%胎牛血清、10 mM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉及5 × 10
-5
M 2-巰基乙醇組成之完全RPMI 1640中培養黏附的單核細胞。在GM-CSF (1000 U/ml)及IL-4 (500 U/ml)的存在下培養該等細胞4天以成為不成熟的DC。第3天連同新鮮培養基一起再次添加GM-CSF及IL-4。使用臺盼藍(trypan blue)拒染法評估培養物中DC之生存力。臺盼藍陰性細胞被視為是活的。培養來自單核細胞的DC 4至5天後，收集DC並轉移至6孔板(1 × 10
6
個細胞/ml)。添加不同濃度的Lm-LLO或Lm-LLO-E6或Lm-LLO-E7至DC培養物(0、10
7
、10
8
及10
9
CFU/ml)一小時，接著添加健大黴素(gentamicin)(50 ug/ml)以殺死李斯特菌，並培養48小時。用適宜的經螢光標記之抗-PD-L1抗體(PE抗小鼠PD-L1及FITC抗人類PD-L1)染色DC。同型匹配mAb用作陰性對照。使用FACSCalibur細胞儀及CellQuest軟體(BD Biosciences)分析經染色之細胞。 3. 周邊及腫瘤中抗原特異性細胞免疫反應、Treg、MDSC之分析。 如製造商(BD Biosciences, San Jose, CA)所建議，使用ELISPOT以偵測來自經處理及對照小鼠之經E6-或E7再刺激(10 μg/ml)之脾細胞培養物中IFNγ之生成。使用CTL Immunospot分析儀(Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)以分析點。從經E7再刺激之培養物減去來自經不相干肽(hgp 10025-33-KVPRNQDWL-Celtek Bioscience, Nashville, TN)再刺激之脾細胞之點的數量。如製造商(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)所建議，使用GentleMACS離解器及實體腫瘤均質化方案處理腫瘤樣本。如先前所述，使用流式細胞術檢定分析CD45+造血細胞群體中腫瘤浸潤性CD8+、CD4+ Foxp3+(Treg)及CD11b+Gr-1+(MDSC)細胞的數量。亦使用相同流式細胞術檢定評估具有腫瘤之經處理及對照小鼠之脾臟中Treg細胞及MDSC之水平。
實例 3 E6 及 PD-L1 之表現與肺腫瘤正相關且與 NSCLC 患者的不良預後相關聯
吾人收集122個來自NSCLC患者之經手術切除的肺腫瘤以檢驗E6表現是否與PD-L1表現相關聯。從先前研究獲得E6表現之資料。免疫組織化學分析顯示，E6陽性肺腫瘤展現更高的陽性PD-L1表現頻率(66.7%對47.9%，P = 0.039；圖1)。PD-L1表現與臨床參數(諸如年齡、性別、吸煙狀況及階段)無關聯，但其與腫瘤組織學相關聯，這表明陽性PD-L1在腺癌中比在鱗狀細胞癌中表現更為頻繁(63.8%對45.3，P = 0.042)。 檢驗NSCLC患者中E6及PD-L1表現(單獨及組合)與總存活期(OS)及無復發存活期(RFS)間的可能關係。卡普蘭-邁爾分析顯示，在具有陽性PD-L1腫瘤之患者中相比在具有陰性PD-L1腫瘤之患者中觀察到OS及RFS更短(對於OS，P = 0.001，對於RFS，P = 0.003；圖2B)，但在該研究群體中E6致癌蛋白未顯示預後價值(圖2A)。然而，PD-L1及E6表現之組合對於OS而言具有預後價值，但對於RFS而言不存在預後價值(對於OS，P = 0.017，對於RFS，P = 0.121；圖2C)。考克斯(Cox)回歸分析進一步證實，具有陽性PD-L1腫瘤之患者當與具有陰性PD-L1腫瘤之患者相比時具有更短的OS及RFS期(對於OS而言，風險比(HR)，1.69，95% CI，1.06-2.67，P = 0.026；對於RFS而言，HR，1.55，95% CI，0.97-2.48，P = 0.045；表1)。五年存活百分比在具有陽性PD-L1腫瘤之患者中相比在具有陰性PD-L1腫瘤之患者中更低(對於OS而言，10.0對27.3%，對於RFS而言，8.6對13.3%；表1)。然而，該研究群體中E6致癌蛋白未顯示預後價值。有趣的是，當PD-L1
-
/E6
-
組合用作參考時，PD-L1
+
/E6
+
及PD-L1
+
/E6
-
組合顯示OS及RFS之預後價值(表1)。當與其他三種組合相比時，在具有PD-L1
+
/E6
+
組合之患者中觀察到最低的OS及RFS之五年存活百分比(對於OS而言，6.4%，對於RFS而言，5.7%；表1)。該等結果顯示PD-L1表現可用作受HPV感染的NSCLC中不良結果之獨立預測因子。
實例 4 E6 致癌蛋白增加 PD-L1 表現以促進受 HPV 感染的肺癌細胞中之群落形成及軟瓊脂生長
吾人檢驗E6致癌蛋白表現可增加PD-L1表現以促進受HPV感染的肺癌細胞中群落形成及軟瓊脂生長之可能性。收集HPV16陽性TL-1細胞用於以E6或E7小髮夾(sh)RNA轉染，及用於與經E6或E7表現載體轉染之HPV16陰性TL-4細胞比較。該比較將驗證E6(而非E7)致癌蛋白是否造成肺癌細胞中PD-L1表現的結果(圖3A)。西方墨點法表明E6及E7蛋白質表現如藉由E6或E7操縱預期般減少及增加(圖3A)。有趣的是，PD-L1表現藉由TL-1細胞中E6之敲低顯著減少，但藉由TL-4細胞中E6之過度表現而增加(圖3A)。藉由兩種細胞類型中E7操縱，PD-L1表現無變化(圖3A)。在經過相同處理之HPV16陽性及HPV16陰性子宮頸SiHa及C33A細胞中看到相似的反應(圖3A)。該等結果顯示E6(而非E7)致癌蛋白可造成受HPV感染的肺癌細胞中PD-L1表現的結果。 吾人接下來檢驗藉由E6操縱PD-L1表現是否會減弱肺癌細胞中群落形成及軟瓊脂生長之能力。瓊脂板中之代表性群落生長及軟瓊脂板中之軟瓊脂生長群落顯示於圖2B(上方小圖)中。藉由TL-1細胞中E6之敲低，群落形成及軟瓊脂生長之能力顯著減小，但藉由TL-4細胞中E6之過度表現，兩種能力明顯增大(圖3B)。然而，TL-4細胞中PD-L1之敲低幾乎完全挽救群落形成及軟瓊脂生長能力藉由E6致癌蛋白之增大(圖2B)。在經過相同處理之SiHa及C33A子宮頸癌細胞中觀察到相似的發現結果(圖3B)。該等結果清楚地顯示由E6介導的PD-L1表現可造成受HPV感染的肺癌細胞中群落形成及軟瓊脂生長的結果。
實例 5 抗 -PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6 疫苗幾乎完全地抑制裸小鼠中由 TL-1 細胞誘導的皮下腫瘤生長
抗-PD-L1 mAb可提供晚期NSCLC中持久的腫瘤抑制及臨床效益(15)。PD-L1可造成受HPV感染之肺癌中由E6介導的群落形成及軟瓊脂生長的結果(圖2)之發現結果因此表明，抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗組合可能對裸小鼠中由TL-1細胞誘導的腫瘤生長具有優異的抑制效應。將裸小鼠隨機分成七個組(每組五隻裸小鼠)，該等裸小鼠係注射TL-1細胞且接著用抗-PD-L1 mAb、Lm-LLO-E6疫苗、Lm-LLO-E7疫苗、抗-PD-L1 mAb + Lm-LLO-E6疫苗、抗-PD-L1 mAb + Lm-LLO-E7疫苗或抗-PD-L1 mAb + Lm-LLO-E6/E7疫苗中任一者處理。僅用TL-1細胞處理對照組小鼠。每個組的代表性腫瘤負荷顯示於圖4中。當與對照組比較時，由TL-1細胞誘導的皮下腫瘤負荷幾乎完全受到抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗或抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6/E7疫苗抑制。然而，在Lm-LLO-E6疫苗組中相比在抗-PD-L1 mAb或抗-PD-L1+Lm-LLO-E7疫苗組中觀察到更高的抗腫瘤活性。由TL-1細胞誘導的腫瘤受Lm-LLO-E7疫苗處理幾近未變(圖4)。該等結果支持細胞模型之發現結果，這指明PD-L1可造成受HPV感染的癌症中由E6介導的腫瘤生長及轉移的結果。
實例 6 藉由抗 -PD-L1 mAb + Lm-LLO-E6 疫苗組合療法有效地抑制裸小鼠中由 TL-1 細胞誘導的轉移性肺腫瘤結節
吾人亦使用尾靜脈動物模型以驗證抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6組合是否可抑制裸小鼠中由TL-1細胞誘導的轉移性肺腫瘤結節形成。該等實驗係在第77天結束。將每組中由TL-1細胞誘導的代表性轉移性肺腫瘤結節與彼等由SiHa細胞誘導者進行比較。藉由H & E染色證實腫瘤(圖5A)。每組肺腫瘤結節之代表性免疫染色結果顯示當與對照組比較時藉由抗-PD-L1 mAb及Lm-LLO-E6疫苗顯著抑制該等肺腫瘤結節中PD-L1及E6之表現。當與對照組比較時，受抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗抑制的由TL-1細胞誘導的轉移性肺腫瘤結節數最多，其次是E6疫苗、抗-PD-L1 mAb、抗-PD-L1+Lm-LLO-E7疫苗、及Lm-LLO-E7疫苗(圖5A)。在經過相同處理的裸小鼠之由SiHa細胞誘導的轉移性肺腫瘤結節中觀察到相似的發現結果(圖5B)。 經TL-1細胞注射之對照小鼠的體重明顯低於經抗-PD-L1 mAb、Lm-LLO-E6疫苗、抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗及抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E7疫苗注射之小鼠的其等體重，但其與彼等接受Lm-LLO-E7疫苗治療者並無差異。對經過相同治療之經SiHa細胞注射之小鼠的體重進行相似的觀測。當與對照組比較時，藉由抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗組合明顯地延長經TL-1或SiHa細胞注射之裸小鼠的存活天數(圖6)。第77天，經TL-1及SiHa細胞處理之抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗及抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E7疫苗組中五分之三的小鼠存活。經TL-1及SiHa細胞處理之對照組中最後一隻小鼠分別死於第49天及第58天。當與抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E7疫苗、Lm-LLO-E6疫苗或抗-PD-L1 mAb比較時，抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗明顯延長經TL-1細胞注射之裸小鼠的存活天數(對於抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E7疫苗而言，P = 0.004，對於Lm-LLO-E6疫苗而言，P = 0.037，對於抗-PD-L1 mAb而言，P = 0.043，圖6)。該等結果表明抗-PD-L1 mAb+Lm-LLO-E6疫苗具有抑制受HPV感染的肺及子宮頸癌中之轉移性肺腫瘤結節形成及因此延長該等小鼠之存活期的最大潛能。