CN115851752B - R2基因在提高植物青枯病抗性中的应用 - Google Patents
R2基因在提高植物青枯病抗性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物病害防控领域，具体涉及R2基因在提高植物青枯病抗性中的应用。本发明通过在R2基因上游连接ADC1p173启动子构成一个转基因载体ADC1p_R2，再经酶切与载体pCHF3连接后转化大肠杆菌感受态Top10，最后侵染植物，得到抗青枯病植物。本发明的有益效果；(1)实现了青枯病抗病基因的侵染诱导表达，即青枯病的病原菌不侵染时抗病基因不表达，不影响植物的正常生长，而青枯病病原菌侵染时则快速诱导表达；(2)证实了R2抗病基因对青枯菌的抗性。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防控领域，具体涉及R2基因在提高植物青枯病抗性中的应用。
背景技术
由青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染所引起的青枯病是一种毁灭性的植物病害，青枯病能在50多个科的400多种植物上发生危害，在茄科作物如烟草、番茄、辣椒等上的危害尤为严重，给农业生产造成了严重影响。青枯菌常年在土壤中存活，通过植物的根部入侵，最后在植物的维管束定殖并引起植株全株萎蔫，我国南方地区高温高湿的气候条件有利于青枯病的发生，发病严重的田块可导致作物减产70％，根据其学术及经济重要性，青枯菌被认为是世界上第二大类的植物病原细菌。
目前对青枯病的防控主要有农业防治、生物防治和化学防治，农业防治主要包括轮作、间作、套作、田间卫生管理等措施，农业防治不涉及杀菌处理，因此对青枯病的防控效果通常不理想；生物防治主要采用对青枯菌具有抑菌作用的生防菌，将其制成菌肥或菌剂，用于防治青枯病，生物防治的防控效果受环境影响较大，因此防效通常不稳定；化学防治是目前主要的防控手段，尽管生产中常用的化学农药如农用链霉素等对青枯菌具有很强的杀菌作用，但由于青枯菌是维管束病害，青枯病发生后再施用化学农药很难达到理想的防治效果，因此，开发新型的青枯病防控方法尤为重要。
抗病品种的培育是一种绿色可持续的防控措施，抗病育种的一种途径是将已知的外源抗病基因通过转基因技术转入性状优良的感病品种中，从而获得性状优良的抗性品种。R2基因是来源于茄科植物马铃薯野生种Solanum demissum中的一个抗病蛋白，编码包含核苷酸结合位点和亮氨酸重复结构(nucleotide binding site leucine-rich repeat，NBS-LRR)，R2蛋白能识别马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)中效应蛋白PiAVR2，从而介导对马铃薯晚疫病的抗性(Lokossou et al.，MPMI,2009,22:630-641)，但R2基因能否介导对青枯病的抗性，目前还不清楚。
抗病基因的持续表达会消耗大量能量，不利于植物正常的生长发育。因此，如何实现抗病基因的病原菌侵染诱导型表达即通常情况下抗病基因不表达，不影响植物的生长发育，而病原菌侵染时能立刻表达，从而提高植物的抗病性，是一个亟需解决的技术难题。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明公开以下技术方案：
R2基因在下述1)-3)中任一种应用，所述R2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用。
优选地，所述植物为烟草。
一种提高植物青枯病抗性的表达盒，所述表达盒包括R2基因和连接于R2基因上游的启动子，所述R2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述启动子为ADC1p173启动子，所述ADC1p173启动子的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用。
一种提高植物青枯病抗性的载体，所述载体包含R2基因或包括R2基因和连接于R2基因上游的启动子的表达盒。载体在下述1)-3)中任一种应用，所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用。
优选地，所述植物为烟草。
一种培育抗青枯病的植物的方法，所述方法包括以下步骤：在受体植物导入R2基因或启动子的表达盒或表达盒的载体，得到抗青枯病的植物；所述R2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其中表达盒包括R2基因和连接于R2基因上游的启动子；其中载体包括R2基因和连接于R2基因上游的启动子的表达盒。
本发明的有益效果；
(1)实现了青枯病抗病基因的侵染诱导表达，即青枯病的病原菌不侵染时抗病基因不表达，不影响植物的正常生长，而青枯病的病原菌侵染时则快速诱导表达；
(2)证实了R2抗病基因对青枯菌的抗性。
附图说明
图1为病原菌诱导表达型R2转基因载体设计；
图2为ADC1p173_R2转基因株系的PCR鉴定；
图3为青枯菌侵染依赖的R2基因表达；
图4为ADC1p173_R2转基因烟草对青枯病的抗性；
图5 R2转基因不影响烟草的正常生长。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1基于青枯菌转录激活类效应蛋白Brg11调控R2基因表达的设计
青枯菌在侵染植物过程中，通过III型分泌***向宿主细胞中注射转录激活类效应蛋白Brg11，Brg11通过结合到番茄ADC1(Arginine Decarboxylase 1)基因的启动子区域并激活ADC1基因的表达(Wu et al.,Cell Host&Microbe，2019，26:638-649)，基于此，我们将番茄ADC1基因启动子3’区域173bp(SEQ ID NO:2，ADC1p173)克隆至R2基因(SEQ ID NO:1)的上游，构成一个转基因载体ADC1p_R2(图1)，选择ADC1启动子3’区域173bp的主要原因是这173bp通常情况下不会造成基因的转录，因此，在无青枯菌侵染时，ADC1p173所驱动的R2基因不表达，在有青枯菌侵染时，青枯菌的效应蛋白Brg11会结合ADC1p173并转录激活R2基因的表达。
SEQ ID NO:2(ADC1p173启动子)
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SEQ ID NO:1(R2基因)
atggctgatgcctttctatcatttgcagttcaaaaattgggtgatttcctcattcaacaagtttctctgcgtaaaaatctgagaaaggaaattgagtggctgagaaatgagctactcttcatacagtctttcctcagagatgcagaactaaagcaatatggagatcaaagagttcaacaatgggtgtttgagatcaactctattgctaatgatgttgttgctatactcgagacttacaccttcgaggctggtaaaggtgctagtcgtctcaaggcttgcgcttgcatatatacgaaggagaagaaattctacaatgttgccgaggagatccaatcactcaagcaacgaatcatggatatctctcgcaaacgagagacttatggtattacaaatatcaataataattcaggagaagggccaagtaatcaggttagaacattgaggagaactacctcatatgtggatgaccaggattacatttttgttggacttcaggatgttgtacaaaaattgctagctcaacttctcaaagcagagccccgtcgaaccgtcctctccattcatggcatgggcggattgggcaagaccactcttgcgagaaaactttacaacagttctgctatactcaatagcttccctacacgcgcttggatatgtgtctctcaagagtacaacacaatggatcttcttaggaatatcataaaatccgtccaaggtcgcaccaaggaaactctagatttgttggaaaggatgacagaaggagatctagaaatctatcttcgtgatctattaaaagaacgcaaataccttgtgatggttgatgatgtatggcagaaagaagcatgggatagtttgaagagagcattcccggatagcaagaatggcagcagagtcattattaccacgcgcaaacaggatgtcgctgaaagagcagacgacataggttttgttcataaacttcgtttcctaagtcaagaagaaagttgggatctctttcgtaagaaactacttgatgttcgatcaatggttccagaaatggaaaatctagctaaggatatggtggaaaagtgtagaggcttacctcttgcaattgttgtattgagcggactactttcgcataaaaaggggctaaaccaatggcaaaaggtgaaagatcacctttggaagaacattaaagaagataaatctattgaaatctctaacatactatccttaagctacaatgatttgtcaactgcgctcaagcagtgttttctctactttggtatttttccagaagatcaagtggtaaaggctgatgacataatacggttgtggatggcggagggtttcatacccagaggagaagaaagaatggaggatgtggctgacggcttcttgaatgaactgataagacgaagcttggttcaagtagctaaaacattttgggaaaaagttactgactgtagggttcatgatttacttcgtgatcttgcgatacaaaaggtattggaggtaaacttctttgacatttatgatccaagaagccactccatatcctctttatgtatcagacatggcattcatagtgaaggagaaaggtacctctcatcacttgatctttctaacttgaagttgaggtcaattatgttcttcgatccatatatttgtaatgtgttccaacatatagatgtgtttcgacatctatatgtgttgtacttggatacgaattttgggtatgtgtctatggtacctgatgccataggaagtttgtaccacctcaagttgttaagattgagaggtatccatgatattccgtcttccattggcaacctcaagaatttacaaacacttgtcgttgtaaatggttacacatttttttgcgaactaccctgcaagacagctgacctaataaatctaagacatttagttgttcaatatacagagcctttaaaatgtataaacaaactcactagtcttcaagttcttgatggtgttgcttgtgatcagtggaaagatgttgaccctgttgatttagtcaatcttcgagaattaagcatggatcgtatcaggagctcttactccctaaacaacattagcagcttgaaaaaccttagcactctcaaattgatttgtggagaacgtcaatcatttgcatcccttgaatttgttaattgttgtgaaaagctccagaaattgtggttacaagggagaatagaggaactgcctcatctgttttcaaactccatcacaatgatggttctgagtttctcagaactgacagaagatccgatgcctattttgggaaggtttccaaacctaaggaatctcaaattagatggagcttacgaaggaaaagaaataatgtgcagtgataacagcttcagtcaactagagttccttcatcttcgtgatctttggaagctagaaagatgggatttaggcacaagtgccatgcctctgattaaaggtcttggtatccataactgtccaaatttaaaggagattcctgagagaatgaaagacgtggagctgttgaagcggaattatatgttg
实施例2 ADC1p173_R2转基因烟草的获得与鉴定
首先在华大基因人工合成C端带3*FLAG标签的ADC1p173_R2全长DNA序列，随后使用引物ADC1p F:ATGACCATGATTACGAATTCGTGATTATCTTTTGATTAAG和3*FLAG R:GATCCCCGGGTACCGAGCTCAGTGACTCCGTCTCTTCA扩增ADC1p173_R2_3*FLAG全长，反应体系如下：
随后将上述反应液放入PCR仪中，按如下步骤进行反应：
反应结束后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR产物，利用同源重组的方法将PCR产物克隆至经EcoRI和KpnI双酶切后的载体pCHF3中，转化大肠杆菌感受态Top10，涂含有卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养后挑取单菌落，提取质粒用于测序验证。
将阳性质粒pCHF3 ADC1p173_R2_3*FLAG转化至农杆菌LBA4404菌株中，转化方法如下：将100ng质粒与50ul农杆菌感受态混匀，置于冰上5min,37℃5min，液氮5min，冰上5min，加入200ul YEB培养液，28℃摇床培养2h，涂在含有利福平和卡那霉素的YEB板子上，28℃孵育两天，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，保存阳性转化子于-80℃保存。
取K326野生型烟草种子，用无菌水浸泡1天，再用75％的酒精对种子表面消毒1min，用10％双氧水浸泡10min，无菌水清洗种子3-4次，将种子点播于MS培养基上，待长出3-4片真叶时，将烟草幼苗转移到含有MS培养基的无菌组培瓶中，生长40天。将保存于-80℃的阳性农杆菌加入到YEB液体培养基中进行摇床培养，至OD600接近0.6，收集菌液并离心，用预冷的MS培养液重悬菌体，再次离心并重悬浮，加入终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮，准备用于侵染。用无菌剪刀将烟草叶片的边缘剪掉，随后将叶片剪成长宽均为1cm左右的叶碟，放入农杆菌中浸泡5min，捞出叶碟后进行组织培养，获得转基因烟草。
收集T1代的转基因烟草种子后，播种于土壤中，待其生长至四周左右时，提取转基因烟草叶片的DNA，并进行PCR鉴定，PCR鉴定的引物为pCHF3 F:GCGGATAACAATTTCACACA和pCHF3 R:CGTTGTCGAAACCGATGATA。
结果与分析：共检测了6个ADC1p173_R2转基因株系，发现其中5个转基因株系出现阳性PCR条带(2893bp)，野生型和另外1个株系则没有出现条带(图2)。
实施例3青枯菌依赖的R2基因表达分析
将阳性ADC1p173_R2转基因株系播种于土壤中，待其生长至四周时，接菌青枯菌，接菌具体方法为：往烟草叶片的左半部分注射清水作为阴性对照，右半部分注射OD600为0.1的青枯菌菌悬液(所用青枯菌菌株为CQPS-1)，注射后的烟草放置于28℃温室，24小时后，将清水或青枯菌注射过的叶片组织取下，液氮速冻，提取RNA，并反转录合成cDNA，用R2基因特异的定量引物qR2 F:CCTACACGCGCTTGGATATG、qR2 R:GCTATCCGGGAATGCTCTCT检测R2的表达量。
结果与分析：在接水的情况下(Mock)，R2基因几乎不表达，接种青枯菌CQPS-1后，R2基因的表达量显著上升(图3)，说明ADC1p173_R2转基因烟草中R2基因的表达依赖于青枯菌的侵染，符合实验预期。
实施例4ADC1p173_R2转基因烟草能显著提高烟草抗青枯病能力
将阳性ADC1p173_R2转基因株系和野生型烟草播种于土壤中，待其生长至18天时，接种青枯菌，接种方法为：将青枯菌菌悬液OD600调节至0.2，往每株烟草根部浇灌15毫升青枯菌菌悬液，接种后的烟草放置于28℃温室中，每日观察烟草发病情况，在第十二天时进行拍照，记录发病表型。
结果与分析:在接菌后的第12天，野生型烟草几乎全部发病萎蔫，而R2转基因株系表现出了明显的青枯病抗性，仅1颗苗子出现萎蔫(图4)，因此，ADC1p173_R2转基因烟草能显著提高烟草青枯病抗性。
实施例5 ADC1p173_R2转基因烟草不影响烟草的正常生长
将阳性ADC1p173_R2转基因烟草和野生型烟草播种于土壤中，待其生长至四周时，观察烟草的生长势，并称取单株鲜重。
结果与分析：ADC1p173_R2转基因烟草和野生型烟草生长势基本一致，对单株鲜重进行统计分析发现，转基因烟草和野生型烟草并没有显著差异(图5)，因此，R2转基因烟草不影响烟草的正常生长。
序列表
<110> 湖南大学
<120> R2基因在提高植物青枯病抗性中的应用
<141> 2022-06-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2535
<212> DNA
<213> Solanum demissum
<400> 1
atggctgatg cctttctatc atttgcagtt caaaaattgg gtgatttcct cattcaacaa 60
gtttctctgc gtaaaaatct gagaaaggaa attgagtggc tgagaaatga gctactcttc 120
atacagtctt tcctcagaga tgcagaacta aagcaatatg gagatcaaag agttcaacaa 180
tgggtgtttg agatcaactc tattgctaat gatgttgttg ctatactcga gacttacacc 240
ttcgaggctg gtaaaggtgc tagtcgtctc aaggcttgcg cttgcatata tacgaaggag 300
aagaaattct acaatgttgc cgaggagatc caatcactca agcaacgaat catggatatc 360
tctcgcaaac gagagactta tggtattaca aatatcaata ataattcagg agaagggcca 420
agtaatcagg ttagaacatt gaggagaact acctcatatg tggatgacca ggattacatt 480
tttgttggac ttcaggatgt tgtacaaaaa ttgctagctc aacttctcaa agcagagccc 540
cgtcgaaccg tcctctccat tcatggcatg ggcggattgg gcaagaccac tcttgcgaga 600
aaactttaca acagttctgc tatactcaat agcttcccta cacgcgcttg gatatgtgtc 660
tctcaagagt acaacacaat ggatcttctt aggaatatca taaaatccgt ccaaggtcgc 720
accaaggaaa ctctagattt gttggaaagg atgacagaag gagatctaga aatctatctt 780
cgtgatctat taaaagaacg caaatacctt gtgatggttg atgatgtatg gcagaaagaa 840
gcatgggata gtttgaagag agcattcccg gatagcaaga atggcagcag agtcattatt 900
accacgcgca aacaggatgt cgctgaaaga gcagacgaca taggttttgt tcataaactt 960
cgtttcctaa gtcaagaaga aagttgggat ctctttcgta agaaactact tgatgttcga 1020
tcaatggttc cagaaatgga aaatctagct aaggatatgg tggaaaagtg tagaggctta 1080
cctcttgcaa ttgttgtatt gagcggacta ctttcgcata aaaaggggct aaaccaatgg 1140
caaaaggtga aagatcacct ttggaagaac attaaagaag ataaatctat tgaaatctct 1200
aacatactat ccttaagcta caatgatttg tcaactgcgc tcaagcagtg ttttctctac 1260
tttggtattt ttccagaaga tcaagtggta aaggctgatg acataatacg gttgtggatg 1320
gcggagggtt tcatacccag aggagaagaa agaatggagg atgtggctga cggcttcttg 1380
aatgaactga taagacgaag cttggttcaa gtagctaaaa cattttggga aaaagttact 1440
gactgtaggg ttcatgattt acttcgtgat cttgcgatac aaaaggtatt ggaggtaaac 1500
ttctttgaca tttatgatcc aagaagccac tccatatcct ctttatgtat cagacatggc 1560
attcatagtg aaggagaaag gtacctctca tcacttgatc tttctaactt gaagttgagg 1620
tcaattatgt tcttcgatcc atatatttgt aatgtgttcc aacatataga tgtgtttcga 1680
catctatatg tgttgtactt ggatacgaat tttgggtatg tgtctatggt acctgatgcc 1740
ataggaagtt tgtaccacct caagttgtta agattgagag gtatccatga tattccgtct 1800
tccattggca acctcaagaa tttacaaaca cttgtcgttg taaatggtta cacatttttt 1860
tgcgaactac cctgcaagac agctgaccta ataaatctaa gacatttagt tgttcaatat 1920
acagagcctt taaaatgtat aaacaaactc actagtcttc aagttcttga tggtgttgct 1980
tgtgatcagt ggaaagatgt tgaccctgtt gatttagtca atcttcgaga attaagcatg 2040
gatcgtatca ggagctctta ctccctaaac aacattagca gcttgaaaaa ccttagcact 2100
ctcaaattga tttgtggaga acgtcaatca tttgcatccc ttgaatttgt taattgttgt 2160
gaaaagctcc agaaattgtg gttacaaggg agaatagagg aactgcctca tctgttttca 2220
aactccatca caatgatggt tctgagtttc tcagaactga cagaagatcc gatgcctatt 2280
ttgggaaggt ttccaaacct aaggaatctc aaattagatg gagcttacga aggaaaagaa 2340
ataatgtgca gtgataacag cttcagtcaa ctagagttcc ttcatcttcg tgatctttgg 2400
aagctagaaa gatgggattt aggcacaagt gccatgcctc tgattaaagg tcttggtatc 2460
cataactgtc caaatttaaa ggagattcct gagagaatga aagacgtgga gctgttgaag 2520
cggaattata tgttg 2535
<210> 2
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtgattatct tttgattaag ttcttttttt gcttcttttg agggggtagc cggggctctg 60
gcctcggcgg gttctaaagc ccccagctat tacaacattg gtcaacaaat catttctgta 120
taattagttt tacacattct ttgattcttt tttttttgtg aagattttac gag 173
Claims (5)
1. R2基因在下述1）-3）中任一种应用，其特征在于，所述R2基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用；
所述植物为烟草。
2.一种表达盒在下述1）-3）中任一种应用，其特征在于，所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用；
所述植物为烟草；
所述表达盒包括R2基因和连接于R2基因上游的启动子，所述R2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述启动子为番茄ADC1基因的ADC1p173启动子，所述ADC1p173启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种载体在下述1）-3）中任一种应用，其特征在于，所述应用为：
1)在提高植物青枯病抗病性中的应用；
2)在制备提高植物青枯病抗病性的产品中的应用；
3)在培育青枯病抗病植物中的应用；
所述植物为烟草；
所述载体包含权利要求1中所述的R2基因或权利要求2或3中所述的表达盒。
5. 一种培育抗青枯病的植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在受体植物导入R2基因或权利要求2或3中所述的表达盒或权利要求4中所述的载体，得到抗青枯病的植物；所述R2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述受体植物为烟草。
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