CN115851500A

CN115851500A - 一株植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115851500A
Application number: CN202211165147.7A
Authority: CN
Inventors: 岳碧松; 黄飞云; 范振鑫; 郭涛
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-09-23
Also published as: CN115851500B

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907及其应用。该菌株从采自自然保护区的中华蟾蜍肠道中分离筛选得到，在MRS琼脂培养基上生长良好，没有溶血现象，对多种抗生素敏感，不携带抗生素抗性基因，对酸、胆盐、人工胃液、人工肠液有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞HT‑29黏附能力强，产乳酸和乙酸能力强，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶血性葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌等具有较强的抑制能力，具有降低血糖和降低胆固醇的潜力，对DSS诱导的小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。因此，该菌株可应用于人和动物功能性食品领域。

Description

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有较强抑菌和抗炎作用的植物乳杆菌，特别涉及功能性乳酸菌及其制品生产开发领域。

背景技术

细菌性肠炎是多种细菌引起的消化***疾病(如小肠炎和结肠炎等)，临床表现主要有腹痛、腹泻、呕吐、便血等症状，常常由大肠杆菌、沙门菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、梭菌、痢疾杆菌等病原细菌感染所致。特别是婴儿患者机体免疫***发育尚不完善，若未及时治疗，可能导致患儿脱水、电解质紊乱、中毒性休克，严重威胁患儿生长发育。细菌性肠炎是人和家养动物的常见病，临床上主要使用各种抗生素进行治疗，但由于细菌容易产生抗生素抗性，常常达不到预期的效果。

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类无芽孢、***的总称。乳酸菌作为益生菌的一类，被美国食品和药品监督管理局(FDA)认定是高度安全的食品级微生物，国内应用也越来越普遍。杨艳丽(2020)使用枯草杆菌二联活菌颗粒联合头孢克肟治疗急性细菌性肠炎患儿疗效显著，可减少腹泻次数,减轻炎症反应,安全性高。梁远红等(2019)使用复方嗜酸乳杆菌联合赖氨葡锌治疗细菌性肠炎，可明显缓解患儿症状，疗效显著。郑倩(2019)使用双歧杆菌三联活菌胶囊联合左氧氟沙星注射液治疗细菌性肠炎患者，总有效率明显提高，缩短患者症状改善时间。

近年研究表明，植物乳杆菌作为肠道中的主要益生菌群之一，可调节肠道菌群，与病原菌竞争结合肠上皮细胞的黏附位点，增强机体免疫，其产生的抗菌肽、细菌素和有机酸等物质可以抑制病原微生物的生长繁殖，所以利用植物乳杆菌预防或抑制病原菌感染已引起人们的广泛关注。

蟾蜍，俗称癞蛤蟆是重要的两栖动物，全球300余种，适应力强，分布十分广泛，可以生活于密林、高山、草原、甚至荒漠。中华蟾蜍在我国分布广、数量多，是一种药用两栖动物。其耳后腺和皮肤腺分泌的白色浆液经收集加工制成的蟾酥，是我国传统的名贵中药材。蟾酥含有蟾蜍毒素、精氨酸等物质，还含具有强心作用的甾体类物质，有强心利尿、消肿开窍、解毒、麻醉止痛等功能，近年研究还发现蟾酥具有一定的抗癌作用。蟾衣是蟾蜍自然脱下的角质衣膜，具有清热解毒、消肿止痛、镇静、利尿等功效，对慢性肝病、多种癌症、慢性气管炎、腹水、疗毒疮痈等有较好的疗效。研究发现，蟾蜍体表和肠道都有丰富的微生物种类，其中乳酸菌也很丰富。因此，从保护区采集的野生中华蟾蜍肠道中分离筛选抑菌抗炎能力强的乳酸菌，将其应用于功能性食品领域，不仅具有广阔的前景，而且对人体健康也具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一株抑菌和抗炎作用较强的植物乳杆菌及其应用。

本发明的技术方案为：一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907，于2022年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25426。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在非疾病治疗目的的抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌上的应用。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备治疗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌导致疾病的药品中的应用。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备降低血糖或降低胆固醇的药物中的应用。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备抗肠炎药物中的应用。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。

本发明的植物乳杆菌CC0907是从自然保护区采集的野生中华蟾蜍消化道中分离筛选获得。植物乳杆菌CC0907在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状。通过采用细菌通用引物16SrRNA的27F/1492R对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到由1015个碱基对(bp)组成的目的基因序列，序列如SEQ ID No.1所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的标准菌株Lactobacillus plantarum strain SDM-SB1S-2015相似率达99.60％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

本发明的植物乳杆菌CC0907通过耐酸、耐胆盐和黏附试验表明，其对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力较强。模拟胃液存活率显著高于鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusATCC 53103。

本发明的植物乳杆菌CC0907具有较强的产乳酸和乙酸能力，具有降低血糖和降低胆固醇的潜力。

本发明的植物乳杆菌CC0907对多种致病菌具有较强的抑制活性，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌抑菌能力显著优于鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus GG。

本发明的植物乳杆菌CC0907通过动物实验表明，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的植物乳杆菌CC0907分离筛选自自然保护区采集的野生中华蟾蜍消化道，在MRS琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力强。

2、植物乳杆菌CC0907对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌等常见病原细菌抑菌能力较强。

3、本发明提供的植物乳杆菌CC0907通过动物实验表明，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。因此，应用于功能性食品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人和动物健康也具有非常重要的意义。

保藏信息：

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907，于2022年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25426。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌CC0907菌株在MRS琼脂培养基上的菌落形态图(A)和革兰氏染色图(B)；

图2 DSS处理后小鼠血便；

图3植物乳杆菌CC0907菌株的溶血活性实验；

图4正常小鼠(A)和DSS诱导结肠炎小鼠(B)结肠组织切片HE染色。

图5植物乳杆菌CC0907与其它菌株的***进化关系。

图6植物乳杆菌CC0907发酵液短链脂肪酸测定GC-MS图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

本发明中所述的标准菌株LGG是指鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusATCC53103。

实施例1植物乳杆菌CC0907的分离、筛选及分子生物学鉴定：

1.材料准备

中华蟾蜍采自四川自然保护区；

16s rRNA通用引物27F和1492R通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：

27F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

MRS肉汤培养基的配方(每升)：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，酵母膏粉4.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80，最终pH为5.7左右。使用时称取该品54.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装于锥形瓶，于121℃高压条件灭菌15min。

MRS琼脂培养基的配方(每升)：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g，最终pH为6.2左右。使用时称取该品64.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装于锥形瓶，于121℃高压条件灭菌15min。

2.具体方式

在无菌条件下将中华蟾蜍麻醉后，破腹取出肠道，挤出肠道内容物少许，接种于50mLMRS肉汤中，充分振荡混匀，置于37℃恒温摇床培养24h。吸取培养液1ml，采用10倍梯度稀释，取菌液各20μL，涂布接种于MRS琼脂培养基，37℃培养24h后挑取单菌落，并纯化分离3次。将纯化后的菌株接种于600μL MRS肉汤培养基中，37℃摇床培养18h，加入400μL浓度50％(V/V)的灭菌甘油，于-80℃超低温冰箱中冻存备用。纯化之后的菌株，用相应的液体培养基进行增殖培养后，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，16S rRNA扩增采用菌落PCR技术完成，PCR产物测序由生工生物工程(上海)有限公司完成，其中一株菌株的16S rRNA序列如SEQ ID No.1，序列进行NCBI BLAST比对，与GenBank中的Lactobacillusplantarum标准菌株Lactobacillus plantarum strain SDM-SB1S-2015相似率达99.60％，初步鉴定该菌株为一株Lactobacillus plantarum，命名为植物乳杆菌CC0907。该菌株与其它菌株的***发育关系如附图5。将该菌株于2022年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25426。

采用平板划线法，将植物乳杆菌CC0907接种于MRS琼脂培养基上，37℃培养24h后，观察并记录单菌落的形状、大小、颜色和透明度等特征。使用革兰氏染色试剂盒，对植物乳杆菌CC0907进行革兰氏染色，在显微镜下观察并记录染色后的细菌形态。植物乳杆菌CC0907在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落形态乳白色、圆形凸起、边缘平整、表面光滑，如图1所示。革兰氏染色后，在光学显微镜下可见菌体呈杆状、紫色，符合革兰氏阳性菌的染色特征。

实施例2植物乳杆菌CC0907的主要发酵特征检测

1、耐酸性和耐胆盐性评估：将待测菌株植物乳杆菌CC0907在MRS琼脂平板上进行复苏并活化3代，并调节菌液初始浓度达到1×10⁶CFU/mL。使用盐酸和猪胆盐分别配制酸碱度(pH＝3.0)及胆盐浓度(0.3％)的MRS肉汤培养基。将1mL待测菌株植物乳杆菌CC0907菌液接种于pH＝3.0的肉汤培养基(4mL)中，37℃培养12h。培养完毕，适当摇晃离心管，吸取20μL菌液涂布于MRS琼脂平板培养基，设置3个重复，于37℃培养24h。观察培养后MRS平板表面是否有菌落生长。同样，将1mL待测菌株植物乳杆菌CC0907菌液接种于胆盐浓度为0.3％的MRS肉汤培养基(4mL)，37℃培养12h后，涂平板，37℃培养24h，查看菌落生长情况。

耐酸性试验结果表明，植物乳杆菌CC0907在pH＝3.0的MRS肉汤培养基中处理12h后仍可在MRA琼脂平板上长出正常菌落；耐盐性试验结果表明，植物乳杆菌CC0907在胆盐浓度为0.3％MRS肉汤培养基中处理12h后仍可在MRA琼脂平板上长出正常菌落；说明植物乳杆菌CC0907具有较强的耐酸和耐胆盐特性。

2、细胞粘附性试验：将待测菌株植物乳杆菌CC0907复苏并活化3代，挑单菌接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。培养完毕，将其置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，并用无菌PBS缓冲液洗涤2-3次。调整菌悬液浓度至1×10⁶CFU/mL，备用。复苏人结肠癌细胞HT-29，将其接种至细胞培养板，添加DMEM完全培养基并置于37℃、CO₂浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养，每隔一天更换一次培养液。当细胞贴壁生长融合状态达70％-80％时，使用0.25％胰酶-EDTA混合消化液进行传代培养。培养完毕，用细胞血球计数板对其进行计数，并将细胞浓度调整至5×10⁶个/mL。将1mL细胞悬浮液加至一细胞培养孔中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。待培养板中的细胞长至单层，弃掉DMEM培养液，用无菌PBS将每孔冲洗3-4次。将1mL已制备好的菌悬液加入细胞孔，轻微晃动细胞培养板，使菌液在细胞孔中均匀分布，吸取孔中少量菌液用于平板计数，其结果作为菌悬液中的初始活菌数。将细胞板置于37℃孵育2h，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液洗涤3-4次。使用0.7mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化细胞10min，待细胞完全脱落后加入0.3mL DMEM培养液终止消化，收集黏附实验结束后的培养液进行平板计数，其结果作为黏附活菌数。并用标准菌株LGG作为对照。

粘附率(％)＝粘附乳酸菌的数目/初始接种数目×100％

结果见表1。所述植物乳杆菌CC0907对人结肠癌细胞HT-29的粘附率为55.26％，与标准菌株LGG的粘附能力相当。

表1植物乳杆菌CC0907对人结肠癌细胞HT-29的粘附率

菌株	初始活菌数/CFU	粘附活菌/CFU	粘附率(％)
				植物乳杆菌CC0907	152	84	55.26
标准菌株LGG	140	78	55.71

3、模拟胃液、肠液耐受实验：模拟胃液和肠液购自上海源叶生物科技有限公司。人工胃液模拟液成分为稀盐酸、胃蛋白酶和氯化钠，最终pH 2.5；人工肠液模拟液成分为磷酸二氢钾和胰蛋白酶，最终pH 6.8。将植物乳杆菌CC0907菌株复苏并活化3代，将菌液浓度调整至1×10⁸CFU/mL，取1mL菌液加人9mL模拟人工胃液液中，充分混匀后进行10倍梯度稀释，吸取20μL涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的初始活菌值；接菌的模拟胃液于37℃培养3h后，再次涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的结束活菌值。同理，将1mL浓度为1×10⁸CFU/mL所述植物乳杆菌CC0907发酵液加入9mL模拟肠液中，并进行活菌计数，37℃培养6h后再次计活菌数，计算存活率。

存活率＝结束时活菌数/初始活菌数*100％)。

结果表明，植物乳杆菌CC0907菌株对于人工模拟胃、肠液有较好的耐受能力，人工胃液中3h后存活率为136.0％，人工肠液6h后存活率为55.0％(表2)。

表2植物乳杆菌CC0907菌株对于人工模拟胃、肠液的耐受能力(％)

菌株	模拟胃液3h存活率(％)	模拟肠液6h存活率(％)
			植物乳杆菌CC0907	136.0	55.0
标准菌株LGG	51.2	49.5

实施例3植物乳杆菌CC0907菌株溶血活性及抗生素抗性评估

将植物乳杆菌CC0907菌株复苏并活化3代后，划线接种于哥伦比亚血平板上，37℃培养24h后观测待测菌落周围是否出现溶血环。采用纸片琼脂扩散法(K-B法)测试菌株的抗生素抗性。将植物乳杆菌CC0907菌株复苏并活化3代，菌液浓度调整至1×10⁶CFU/mL，用无菌棉签将菌液均匀地涂抹于MRS培养基平板表面，室温10min后放入药敏纸片，37℃培养24h后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围的抑菌圈直径，每种抗生素重复3次，试验结果参照NCCLS标准判断菌株的药物敏感性，结果以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)表示。

溶血性实验结果表明，在菌落周围没有出现溶血环现象；对测试的6种抗生素表现为敏感(S)，说明所述植物乳杆菌CC0907菌株的安全性(表3)。

表3植物乳杆菌CC0907菌株对几种抗生素的敏感性

编号

四环素

氨苄西林

头孢曲松

克林霉素

克拉霉素

氯霉素

CC0907

S

实施例4：植物乳杆菌CC0907产酸性能测定

1.植物乳杆菌CC0907发酵液短链脂肪酸含量测定方法

发酵液的制备：将所述植物乳杆菌CC0907保存菌株活化培养24h后，吸取4ul菌液加入到4mL肉汤培养基中，37℃培养24h备用。

短链脂肪酸的检测：检测仪器为日本岛津公司气质联用仪(GCMS-QP2010 Plus)，色谱柱为美国RESTEK(瑞斯泰克)公司Rtx-5熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)。GC升温程序为初始温度40℃保持5min，每分钟5℃升至150℃，以每分钟10℃升到280℃，并维持2min。载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)，流速：1.0mL/min。MS条件：电离方式为EI；温度为200℃，接口温度220℃，质量扫描范围m/z 33-500。取发酵液4mL,加入浓度为200ug/mL2-乙基丁酸内标液10ul，样品以分流模式1:3的方式进样1μL，溶剂延迟时间设定为0.1min，进样口温度270℃。5种短链脂肪酸(乙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、异己酸)的浓度采用内标法计算。

测定结果表明所述植物乳杆菌CC0907发酵液中含多种短链脂肪酸，其中乙酸含量最高，达到8.077ug/mL，其次是异戊酸，其它几种短链脂肪酸含量较低(表4)。

表4植物乳杆菌CC0907发酵液短链脂肪酸含量(ug/mL)

菌株号

菌种名

乙酸

正丁酸

异丁酸

异戊酸

正己酸

2-甲基丁酸

CC0907

植物乳杆菌

8.077

0.052

0.06

0.14

0.024

0.058

2.植物乳杆菌CC0907发酵液乳酸含量测定方法：

乳酸含量测定严格按照乳酸测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书进行。将植物乳杆菌CC0907菌种活化培养后，接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24h,取100ul培养液加入1mL提取液一，4℃12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g离心10min后取上清液待测。

测定结果表明，所述植物乳杆菌CC0907发酵液中乳酸浓度达到69.12umol/mL。

表5植物乳杆菌CC0907发酵液乳酸含量(umol/mL)

菌株号	菌种名	重复1	重复2	重复3	平均
						CC0907	植物乳杆菌	66.42	71.11	69.83	69.12

实施例5植物乳杆菌CC0907菌株的抑菌活性评估

将乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella para-typhi B CMCCB 50094)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCCB 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusCMCCB50094)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCCB 10104)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuriumATCC 14028)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida ATCC51689)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus ATCC29970)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica ATCC 23715)分别接种于营养琼脂培养基，复苏并传代3次。吸取适量胰酪大豆胨液体培养基至离心管，将活化好的致病菌接种于肉汤培养基中，并调节菌液浓度达到1×10⁸CFU/mL。吸取上述致病菌和肉汤的混合液1mL加至500mL灭菌后暂处于液体状态的营养培养基内(温度冷却至50℃左右)，充分混匀后按每皿20mL的量分装至培养皿中。待培养基冷却凝固后，使用直径6mm的打孔器在平板上打孔，制成致病菌琼脂板，每板对应一株菌，并设置三孔作为重复。将待测菌株进行复苏并活化3次，调节培养后的菌液浓度达到1×10⁸CFU/mL。吸取50μL的待测菌菌液加至上述致病菌琼脂板孔内，于37℃培养24h。培养后，使用游标卡尺测量打孔点周围的抑菌圈直径大小并记录。将标准菌株LGG作为对照菌株，与待测菌株同时进行以上实验操作。

结果表明，植物乳杆菌CC0907菌株的发酵液对乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等致病菌的生长具有较强的抑制活性，大多优于LGG标准菌株(表6)。

表6植物乳杆菌CC0907菌株的抑菌活性评估(直径：mm)

实施例6植物乳杆菌CC0907菌株降糖、降胆固醇活性体外检测

1.植物乳杆菌CC0907菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制作用：

α-葡萄糖苷酶参与碳水化合物的分解利用，研究表明抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以降低人体血液中的血糖水平。将所述植物乳杆菌CC0907菌株保存菌种复苏培养24h后，按2％接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，菌液在4℃4000r/min条件下离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤得到发酵上清液(CFS)备用；取上清液25μL，加入PBS缓冲液(pH＝6.8)50μL、20mmol/L的PNPG溶液50μL，37℃水浴10min；加入20U/mlα-葡萄糖苷酶溶液30μL，37℃下继续反应10min；加入50μL 1mol/L Na₂CO3溶液终止反应，重复三次；用酶标仪在405nm处测定吸光值(OD值)，计算得到α-葡萄糖苷酶抑制率(％)。计算公式为：

其中A组为仅含α-葡萄糖苷酶溶液的OD值；B组为PBS缓冲液的OD值；C为待测样品组，含α-葡萄糖苷酶和待测样品的OD值；D组仅含待测样品的OD值。

检测结果表明，所述植物乳杆菌CC0907菌株发酵上清液具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率为12.90％，与标准菌株鼠李糖乳杆菌LGG的活性相当，表明所述植物乳杆菌CC0907菌株具有降低动物和人血液血糖水平的潜力。

表7植物乳杆菌CC0907发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)

2.植物乳杆菌CC0907对胆固醇的降解作用

研究表明，一些乳酸菌能够吸附或吸收胆固醇，通过排出体外达到降低动物体内胆固醇的目的。因此，在胆固醇-MRS培养基(MRS-CHOL培养基)中加入一定量的胆盐和胆固醇，培养后测定胆固醇浓度变化即可计算对胆固醇的降解能力。具体操作方法如下：

胆固醇溶液的制备：胆固醇0.06g、牛胆盐0.12g、蔗糖脂肪酸脂0.06g、冰乙酸5mL、吐温0.6mL，超声震荡至完全溶解，无菌条件下用0.22μm滤膜过滤后备用；

胆固醇-MRS培养基(MRS-CHOL培养基)制备：在300mL MRS液体培养基中加入胆固醇溶液5mL、6mol/L NaOH溶液12mL；

接种培养：将所述植物乳杆菌CC0907菌种活化培养24h，以2％的接种量接种于MRS-CHOL液体培养基中，37℃培养48h，另一份不接菌的为空白对照。

胆固醇标准曲线的绘制：

混合酸配制：浓硫酸和冰乙酸按1:1比例混合摇匀；

邻苯二甲醛溶液(1mg/mL)：25ml无水乙醇与25mg邻苯二甲醛混溶至棕色容量瓶中，4℃冰箱保存；

标准胆固醇工作液：0.05g胆固醇，使用冰乙酸定容至50mL，配置成质量浓度为1mg/mL的胆固醇标准溶液；使用冰乙酸稀释10倍，制成标准胆固醇工作液；

按下表加样，震荡摇匀后静置30min。在550nm波长下测定吸光度(OD值),以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；

表8标准曲线绘制中各试剂的用量(mL)

胆固醇含量测定：分别取菌悬液和空白对照500μL于5mL试管中,缓缓加入4.5ml无水乙醇，静置10min，3000r/min离心15min；取上清0.5ml于试管中加入1mg/ml邻苯二甲醛0.2ml、混合酸4.3ml，震荡摇匀，静置30min；在550nm波长下测定吸光值；由标准曲线计算样品中胆固醇含量：

其中C₀为空白对照组的OD值；C₁为实验组OD值；

实验结果

实验结果表明，所述植物乳杆菌CC0907对胆固醇的降解率为40.00％，优于标准菌株鼠李糖乳杆菌-LGG，说明所述植物乳杆菌CC0907在动物和人体内具有降低胆固醇的潜力。

表9植物乳杆菌CC0907对胆固醇的降解能力

实施例7植物乳杆菌CC0907对小鼠结肠炎模型的预防和治疗作用试验

1、实验动物及分组

共60只小鼠，随机分成12笼，每笼5只。随机分为4组，每组3笼，分组包括空白对照组(CK)、自然恢复组(DSS)、标准菌株组(LGG)和CC0907处理组。实验处理如表10所示。

表10动物实验处理

2、实验内容

葡聚糖硫酸钠盐溶液(DSS)：无菌水溶解葡聚糖硫酸钠盐配制浓度3％的DSS水溶液。菌悬液的制备：将标准菌株LGG和植物乳杆菌CC0907复苏并活化3代。将菌液于-4℃、6000r/min条件下离心5min，弃掉上清液。使用无菌PBS缓冲液重悬菌体，调节菌液浓度为5×10⁹CFU/mL，低温保存备用。

实验期间，每天观察其活动状况、粪便状态、血便现象。在预防期和治疗期结束时，分别随机处死3只小鼠，取血进行血清炎症因子检测。新鲜血样用无菌离心管收集，3000r/min离心10min，获得血清。使用ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)测定血清的炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

血清炎症因子测定结果如表11所示。从表11可知，在预防期和治疗期TNF-α、IL-6和IL-1β三个炎症因子指标都明显低于DSS组，说明植物乳杆菌CC0907菌株对DSS诱导的小鼠结肠炎有明显的缓解作用，将其应用于功能性食品领域，不仅具有广阔的前景，而且对人体健康十分有益。

表11小鼠血清炎症因子测定结果(pg/ml)

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Claims

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907，于2022年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25426。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在非疾病治疗目的的抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌上的应用。

3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备治疗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性葡萄球菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌导致疾病的药物中的应用。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备降低血糖或降低胆固醇的药物中的应用。

5.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在制备抗肠炎药物中的应用。

6.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CC0907在调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。