CN112481235B - Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用 - Google Patents

Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用。本发明将里氏木霉出发菌株中的Trdrs2基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明显增加的Trdrs2基因敲除株。说明Trdrs2是与里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量相关的一个调控基因，敲除Trdrs2基因可提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。本发明为构建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技术基础。

Description

Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋 白能力中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用。
背景技术
利用纤维素酶将廉价而丰富的植物生物质材料降解为可用于微生物发酵的简单糖原来进行生物燃料或其他大宗化学品的生产具有相当广阔的应用前景。目前，用于工业生产纤维素酶的主要工业菌株为丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)，它是一种嗜温的腐生真菌，可用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。目前已成为研究纤维素降解的重要模式菌株。里氏木霉是FDA认证的安全生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化***，因此里氏木霉也是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，近年来作为一种优良的异源蛋白表达宿主被广泛使用。目前，生物质降解酶类的成本过高是木质纤维素类物质有效利用的主要障碍之一，为了进一步提高里氏木霉的纤维素酶半纤维素酶产量，同时提高其表达异源蛋白的分泌量，如何提高里氏木霉的胞外蛋白合成分泌量成为了近年来的研究热点。
目前研究表明里氏木霉纤维素酶基因的表达调控是在转录水平进行的，受到转录激活因子的促进和碳代谢抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人们采用基因克隆、酵母杂交等传统方法分离、仅仅鉴定了3个转录激活因子(Ace2、Hap2/3/5、Xyr1)和2个阻遏蛋白(CreⅠ、AceⅠ)。同时也有研究表明阻遏蛋白的缺失可以显著提高里氏木霉外分泌蛋白的表达水平。基于里氏木霉纤维素酶表达调控的复杂性，在其转录调控过程中应该还有许多关键的调控因子仍然没被发现。通过对一些具有转录因子典型结构的蛋白进行功能分析，研究其在纤维素酶半纤维素酶生物合成中的作用有望从机制本身进一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。
里氏木霉Trdrs2基因(GenBank登录号：NCU00352)，编码磷脂转移ATP酶(phospholipid-transporting ATPase)，参与核糖体的组装，目前尚未见其与蛋白分泌途径相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供来源于里氏木霉的Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉(Trichoderma reesei)合成和分泌蛋白能力中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下A-C中任一种物质在调控里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用；
A、Trdrs2蛋白；
B、编码所述Trdrs2蛋白的核酸分子；
C、含有所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组细胞；
所述Trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
为了实现上述目的，本发明又提供了b1)或b2)所示的物质在提高里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用：
b1)使里氏木霉(Trichoderma reesei)中Trdrs2蛋白活性丧失的物质；
b2)敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
所述Trdrs2蛋白为如下a1)-a4)中任一种：
a1)序列表中序列6所示的蛋白质；
a2)在a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
a3)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4)与a1)具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质。
上述应用中，所述编码Trdrs2蛋白的核酸分子为如下c1)-c3)中任一种：
c1)序列表中序列1或序列2所示的DNA分子；
c2)与c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)任一种限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。
其中，序列表中序列1所示的DNA分子为里氏木霉Trdrs2基因的cDNA序列，由4188个碱基组成；序列表中序列2所示的DNA分子为里氏木霉Trdrs2基因及其上下游各2500bp的基因组DNA序列，序列表中的序列2的第1-2500位为所述Trdrs2基因上游2500bp序列，序列表中的序列2的第6689-9188位为所述Trdrs2基因下游2500bp序列，所述Trdrs2基因及其上下游序列可见如下网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/CP016236.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&RID＝G7GAV51W014。
上述应用中，所述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的物质为敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段或含有所述DNA片段的重组载体或含有所述DNA片段的重组细胞。
进一步的，所述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段含有Trdrs2基因上游同源臂和Trdrs2基因下游同源臂。
其中，所述同源重组中采用的上游同源臂可选自Trdrs2基因上游序列，长度至少1000bp，所述同源重组中采用的下游同源臂可选自Trdrs2基因及其下游序列，长度至少1000bp。在本发明的实施例中，所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列可为序列表中序列3的第1-2000位(即序列2的第501-2501位)，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列可为序列表中序列3的第6189-8188位(即序列2的第6689-8688位)。
更进一步的，所述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段为序列表中序列4所示的DNA片段。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种重组里氏木霉菌的构建方法。
本发明提供的重组里氏木霉菌的构建方法为如下m1)或m2)：
m1)包括如下步骤：使里氏木霉(Trichoderma reesei)中Trdrs2蛋白活性丧失，得到所述重组里氏木霉菌；
m2)包括如下步骤：敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子，得到所述重组里氏木霉菌。
上述方法中，所述m2)中，所述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的方法可为同源重组、随机***突变或RNAi。
进一步的，所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第6189-8188位。
更进一步的，用于发生同源重组的组件(敲除组件)由Trdrs2基因上下游同源臂中***便于筛选转化子的筛选标记基因组成。在本发明的实施例中，所述同源重组通过将序列表中序列4所示的DNA片段导入所述里氏木霉(Trichoderma reesei)实现。序列表中序列4第1-2000位为Trdrs2的上游同源臂，第3914-5913位为Trdrs2的下游同源臂，第2001-3913位为pyr4基因。其中，pyr4为筛选标记基因，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的基因。
为了实现上述目的，本发明最后提供了如下n1)-n6)任一所述的生物材料：
n1)由上述方法构建得到的重组里氏木霉菌；
n2)上述使里氏木霉(Trichoderma reesei)中Trdrs2蛋白活性丧失的物质；
n3)上述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的物质；
n4)上述敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段；
n5)含有n4)所述DNA片段的重组载体；该重组载体用于保存敲除组件；
n6)含有n4)所述DNA片段的重组细胞；该重组细胞用于保存敲除组件。
上述方法或上述生物材料在制备或合成或表达胞外蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述应用或方法中，所述重组细胞可为非人的动物细胞、微生物细胞或植物细胞。
上述任一所述应用或方法中，所述胞外蛋白包括里氏木霉(Trichoderma reesei)的内源蛋白，如纤维素酶和/或半纤维素酶，还可包括导入里氏木霉(Trichoderma reesei)的外源蛋白。其中，在不包含外源蛋白的里氏木霉菌株中，所述调控里氏木霉(Trichodermareesei)胞外蛋白分泌量可体现为调控纤维素酶和/或半纤维素酶的分泌量。
上述任一所述应用或方法中，所述里氏木霉为里氏木霉菌株TU6△tku70。
本发明的实验证明，将里氏木霉出发菌株中的Trdrs2基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明显增加的Trdrs2基因敲除株，说明Trdrs2是与里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量相关的一个调控基因，敲除Trdrs2基因可提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。本发明为构建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技术基础。
附图说明
图1为Trdrs2敲除菌株的PCR鉴定图谱。PA：出发株；T1-T7：转化子。
图2为Trdrs2敲除菌株和出发菌株发酵上清液的SDS-PAGE分析。1-3：T.reesei出发株；4-6：T.reesei△drs2；M：蛋白分子标准。
图3为Trdrs2敲除菌株和出发菌株发酵上清液蛋白浓度测定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的所有引物均由上海生工合成。
下述实施例中所涉及的里氏木霉菌株TU6△tku70为尿嘧啶营养缺陷菌株，由奥地利维也纳大学Monika Schmoll实验室馈赠，TU6△tku70即为如下文献中的KU70.4转化子(将红褐肉座菌(Hypocrea jecorina，即Trichoderma reesei的有性型)TU-6菌株中的tku70缺失得到的转化子)：Gene targeting in a nonhomologous end joiningdeficient Hypocrea jecorina.Zhang Guangtaoa,et al.Journal of Biotechnology139(2009)146–151.，公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所涉及的培养基、试剂的配方如下：
1)土豆培养基PDA(100mL)：20g去皮马铃薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至100mL，115℃高压蒸气灭菌。
2)基本培养基(Minimal medium，MM)：溶剂为水，每升培养基中溶质及其质量为：0.05g(NH4)2SO4，0.15g KH2PO4，0.006g MgSO4，0.006g CaCl2，0.00005g FeSO4·7H2O，0.000016g MnSO4·H2O，0.000014g ZnSO4·7H2O，0.00002g CoCl2。
3)发酵培养基：在MM培养基中加入下列碳源(如2％纤维素、2％乳糖、2％葡萄糖、2％甘油，终浓度)之一，pH 5.2±0.1。
A1、含1.0M山梨醇但不含尿苷的MM培养基平板：在MM中加入山梨醇至终浓度为1.0M，再加入琼脂制成固体培养基。
A2、MM+0.1％Triton X100的平板：在含有2％葡萄糖的MM中加入Triton X100至体积终浓度为0.1％，再加入琼脂制成固体培养基。
A3、含2％葡萄糖的MM液体培养基：在MM中加入葡萄糖至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
A4、MM+2％微晶纤维素液体培养基：在MM中加入微晶纤维素至终浓度为2％(质量百分浓度)得到的液体培养基。
4)LB培养基：溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。
5)里氏木霉染色体DNA提取缓冲液(pH 7.5)：
EDTA 1mM
磷酸缓冲液 50mM
甘油 5％
6)原生质体制备及转化相关试剂：
0.2M磷酸缓冲液pH 7.4(每100mL)
0.2M Na2HPO4 81mL
0.2M NaH2PO4 19mL
1.2mol/L的MgSO4溶液
MgSO4 1.2M
磷酸缓冲液pH 7.4 10mM
0.6M的山梨醇溶液
山梨醇 0.6M
Tris.Cl pH 7.0 0.01M
1.0M的山梨醇溶液
山梨醇 1.0M
CaCl2 0.01M
Tris.Cl pH 7.5 0.01M
PEG溶液
PEG4000 50％
CaCl2 0.05M
Tris.Cl pH 7.5 0.01M
实施例1、敲除里氏木霉Trdrs2基因构建胞外蛋白分泌量增加的重组里氏木霉菌
本实施例中，通过将序列表中序列4所示的DNA片段(敲除组件)导入里氏木霉出发菌株-里氏木霉菌株TU6△tku70中通过同源重组将Trdrs2基因敲除得到了胞外蛋白分泌量明显增加的Trdrs2基因敲除株(重组里氏木霉菌)。
一、Trdrs2基因敲除的重组里氏木霉菌的构建
1、Trdrs2基因(含两侧同源臂)及pyr4基因表达盒的PCR扩增
1)以里氏木霉菌株TU6△tku70基因组DNA为模板，分别采用pDrs2-1F/pDrs2-1R引物对和pDrs2-3F/pDrs2-3R引物对进行PCR扩增，分别扩增得到大小为2000bp的Trdrs2上游同源臂、大小为2000bp的Trdrs2下游同源臂。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
2)以里氏木霉菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，采用pDrs2-2F/pDrs2-2R引物对进行PCR扩增，扩增得到大小为1913bp的营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的pyr4基因。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
3)将步骤1)和2)所得PCR产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小并测序，结果表明所扩增的上游同源臂为序列表中序列4第1-2055位所示的序列，所扩增的pyr4基因为序列表中序列4第1978-3933位所示的序列，所扩增的下游同源臂为序列表中序列4第3914-5913位所示的序列。
所用到的引物序列如下：
pDrs2-1F：ctccaaggtgttggggatcgtgtgccgcgtttcttgggcgttgctgg；
pDrs2-1R：gatacccgatattgcgactttgggggccggaggacgagcagtggttag；
pDrs2-2F：ctaaccactgctcgtcctccggcccccaaagtcgcaatatcgggtatc；
pDrs2-2R：caattttttctttgctttttcaactgcatccaaaccatcctac；
pDrs2-3F：gtaggatggtttggatgcagttgaaaaagcaaagaaaaaattg；
pDrs2-3R：tttggtgtgaagaggggagggggatatgtaaggggaaattggggtc。
2、PSK骨架的PCR扩增
以商业化质粒pBluescript II SK(+)(Stratagene公司)为模板，分别采用pSK-F/pSK-R引物对进行PCR扩增，得到大小为2899bp的PSK骨架，其末端分别含有大小为25bp的Trdrs2上游同源臂、大小为25bp的Trdrs2下游同源臂。
扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。
所用到的引物序列如下：
pSK-F：ccaccacatacatacagacagaccccaatttccccttacatatcc；
pSK-R：gcacacgatccccaacaccttggagcaattcgccctatagtgagt。
3、里氏木霉pDrs2敲除载体的构建及敲除组件的获得
1)采取NEB Gibson
Figure BDA0002798195610000061
Master Mix酶将上述扩增的大小为2000bp的Trdrs2上游同源臂片段、大小为1913bp的pyr4基因片段、大小为2000bp的Trdrs2下游同源臂片段以及大小为2899bp的PSK骨架混合，具体方法如下：
1-1)以骨架的加样量为30-50ng为标准来确定骨架片段的添加量。
1-2)根据骨架片段大小与所加体积将其换算成摩尔数。
1-3)以骨架为标准，保证加样时***片段和骨架片段的摩尔比例为1:2-1:3，***片段间的摩尔比为1:1，从而得到各个片段的摩尔数。
1-4)用摩尔数除以相应浓度得到各个片段所需的加样体积。
1-5)将每个片段添加相应的体积到PCR管中，随后添加等量(片段总体积)的Gibson
Figure BDA0002798195610000062
Master Mix酶，用枪轻轻吹吸混匀。
1-6)将混合液在50℃下孵育60min，最后取2μL反应液转化大肠杆菌感受态细胞。
2)将混合后的四个片段进行连接，然后转化大肠杆菌，再挑取转化子进行测序鉴定，即得到Trdrs2基因的敲除载体pDrs2。
3)以质粒pDrs2为模板，采用pDrs2-1F/pDrs2-3R引物对进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性30s，98℃变性10s，68℃退火20s，72℃延伸3.6min，30个循环；最后72℃扩展延伸5min。PCR扩增所得的产物即为包含Trdrs2基因上下游同源臂以及pyr4基因表达框的敲除组件片段，其序列如序列表中的序列4，序列4的第1-47位为pDrs2-1F，第5868-5913位为pDrs2-3R的反向互补序列，第1-2000位为Trdrs2的上游同源臂，第3914-5913位为Trdrs2的下游同源臂，第2001-3913位为pyr4基因片段。
4、里氏木霉菌株Tu6△tku70的原生质体制备
A.取新鲜培养的斜面或平板(培养基是PDA)上的里氏木霉菌株Tu6△tku70孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种至装有100mL MM培养基的500mL三角瓶中，28℃培养13-14h，至菌丝伸展。
B.将培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2M的MgSO4溶液洗涤一次，让溶液自然流尽。
C.将筛子上的菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg裂解酶和15mg纤维素酶的1.2M MgSO4溶液)，30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次。
D.当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6M的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。
E.沿着沉淀一侧倒去上清，原生质体沉淀用1.0M山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min。
F.重复步骤E，弃上清将原生质体悬浮于200μL 1.0M山梨醇溶液中，得到里氏木霉菌株Tu6△tku70的原生质体，血球板计数器观察并计数。
5、Trdrs2敲除组件转化里氏木霉菌株Tu6△tku70原生质体
A.将步骤3中用pDrs2-1F/pDrs2-3R引物对进行PCR扩增获得的敲除组件(其序列如序列表中的序列4)进行回收并用2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3.0M醋酸钠溶液(pH5.2)过夜沉淀，然后用70％乙醇溶液洗涤2次，再用灭菌ddH2O溶解，使敲除组件的浓度达每微升微克级。
B.将一定量(体积不超过20μL)制备好的敲除组件加入到步骤3制备的里氏木霉菌株Tu6△tku70原生质体中，轻轻混匀，再往其中加入50μL PEG4000，再次混匀，冰上放置30min；同时用等体积的无菌水代替DNA作为对照组。
C.再往上述管中各加入1mL PEG4000，混匀，室温放置20min。
D.加入1mL 1.0M山梨醇溶液，混匀后分四次与四支4mL融化的MM培养基(58℃以下)混合，立即铺于含1.0M山梨醇但不含尿苷的MM培养基平板上，30℃培养4～7天。在不含尿苷的MM培养基中，只有转入pyr4的菌株才能生长。
6、转化子的筛选及分子鉴定
待转化子长出后，将其转移至PDA平板上，28℃培养3-5天有孢子生成后，将平板上的孢子用无菌水将孢子洗下来制备成孢子悬液，做梯度稀释后，将其涂布在MM+0.1％Triton X100的平板上分单孢。待菌丝长出后，抽提基因组DNA，PCR鉴定阳性转化子，所用鉴定引物如下：
pDrs2-4-F：TGTACATGTTGAGCTATGAC；
pDrs2-pyr4-R：GAGATGGCACAATTCTGCTGTG；
pDrs2-drs2-R：CCAGGTCGTCGTCATTGAG。
序列表中的序列2是Trdrs2基因及其上下游2500bp的片段。pDrs2-4-F对应于序列2的第372-391位，pDrs2-drs2-R对应于序列2的2612-2630位。序列表中的序列5是里氏木霉Trdrs2敲除菌株的Trdrs2基因被pyr4替换后的基因组序列。pDrs2-4-F对应于序列2的第372-391位，pDrs2-pyr4-R对应于序列5的第2743-2764位。
其中，pDrs2-4-F引物结合于敲除组件中同源臂的外侧序列，pDrs2-pyr4-R位于pyr4基因序列中，pDrs2-drs2-R位于drs2基因序列中，如果Trdrs2敲除组件定点整合在Trdrs2位点，则pDrs2-4-F/pDrs2-pyr4-R引物对理论上应该扩增出大小为2393bp的片段，pDrs2-4-F/pDrs2-drs2-R引物对不应该扩增出片段。而出发菌株里氏木霉菌株Tu6△tku70则为pDrs2-4-F/pDrs2-pyr4-R引物对无法扩增出片段，pDrs2-4-F/pDrs2-drs2-R引物对理论上应该扩增出大小为2259bp的片段。用pDrs2-4-F/pDrs2-pyr4-R扩增出大小为2393bp的PCR产物，用pDrs2-4-F/pDrs2-drs2-R引物对无法扩增出PCR产物的菌株即为Trdrs2敲除菌株(记作T.reesei△drs2)，其PCR鉴定结果如图1。其中，PA为里氏木霉菌株Tu6△tku70DNA为模板，T-1～T-7为筛选转化子DNA为模板。P1：采用pDrs2-4-F/pDrs2-pyr4-R引物对的PCR扩增产物；P2：采用pDrs2-4-F/pDrs2-drs2-R引物对的PCR扩增产物。最终筛选得到T-1、T-2、T-3、T-5和T-7为目标里氏木霉△drs2同核体，T-4和T-6则为杂合子。
Trdrs2敲除菌株(记作T.reesei△drs2)的基因组序列为将里氏木霉菌株Tu6△tku70基因组序列中的Trdrs2基因序列替换为pyr4基因序列后得到的序列。
二、对照株、敲除菌株发酵液蛋白表达分泌差异分析
在步骤一得到遗传稳定的转化株后，将里氏木霉菌株Tu6△tku70(T.reesei WT，简称WT)与Trds2敲除菌株(T.reesei△drs2，简称△drs2)转至PDA平板上产孢，然后用无菌水洗涤孢子并用200目筛子过滤制备成孢子悬液，添加孢子悬液于含有50mL含2％葡萄糖的MM液体培养基的250mL三角瓶中，使其终浓度为108个/mL，28℃，200rpm预培养48h，添加20％微晶纤维素液体培养基5mL，28℃，200rpm震荡培养168h，期间，从48h开始，每隔24h取发酵上清液(胞外发酵液)，进行SDS-PAGE电泳分析。里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trdrs2敲除菌株的培养条件及接种量完全相同。每次取样的里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trdrs2敲除菌株的发酵上清液体积相同。每次取样，里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trdrs2敲除菌株各取三瓶。对发酵168h后的里氏木霉菌株Tu6△tku70与Trdrs2敲除菌株的分泌蛋白进行SDS-PAGE电泳(图2)，结果表明，Trdrs2敲除菌株外分泌蛋白的量均显著高于里氏木霉菌株Tu6△tku70。
对168h发酵上清液的总蛋白浓度进行测定，具体方法如下：
(1)在酶标板中加入20μL适当稀释的样品液，均设置1个重复对照。同时设置标准组：7个标准品，各设1个重复，分别加入20μL浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL的BSA(牛血清血蛋白)标准液。
(2)各酶标孔同时加入200μL Bradford工作液，即刻混匀。
(3)室温(25-30℃)反应5min后，以0μg/mL样品孔读数值为空白参照，以酶标仪读取各孔的A595值。
(4)以标准组中的A595两对照平均值为纵坐标，所对应的蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
(5)以标准曲线为参照计算出其稀释后的蛋白质浓度值，并由稀释倍数计算得到原样品蛋白质浓度。
检测结果表明：里氏木霉Trdrs2敲除菌株△drs2的蛋白浓度为158.21μg/mL，里氏木霉菌株Tu6△tku70的蛋白浓度为55.54μg/mL(图3)，敲除Trdrs2基因后，里氏木霉的外分泌蛋白浓度是出发菌株蛋白浓度的3倍，Trdrs2敲除菌株比里氏木霉菌株Tu6△tku70胞外蛋白分泌量明显提高。说明Trdrs2基因具有调控里氏木霉胞外蛋白分泌量的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggctggac gacatcccat aggaggccat ggcgggccct cgaccaccga cgacctgctg 60
ctcgacctgg acaatgagca gcccgtctac aacgccggcc agcggtcggc cctcaatgac 120
gacgacctgg cgcgggccta cgagcacgac cacgacaacg acccccagag ccgcccgtcg 180
gtgtcgtacg acgactttgt cggcgccgag ccgtcatatc ccccagcagg gcgccccggc 240
ctggcgcagg cagcgcagcc gtcggggcag tcgtcgggcc cgtaccacgc tcagcagttc 300
agccagtcgt cggacctcga caacttcccg cgctacgccg acgacttcga cgacgacgac 360
atgtactacc agcacggcgg cgcggcgggc gcggggccgg cgtcggctgg cagggacaat 420
gcgagggccc gcaacagcgt gctgtcgctg ggaggcggcc tctttggcaa gctgaagcac 480
cgcctgggca tgggccaggg ctactccgag atggacctcc ccttgacgga gccgggccac 540
gatcgaggcg gccccatagc gggctcgtcg cagccgccgg accagcagcc cgcgggcaag 600
aaggcgggca acttcaagtt tggctttggc cgcggcaagc ccgatcccgc gtccctgggc 660
ccgagaatca tccacctcaa caacccgccc gccaacgcgg ccaacaagta cgtcggcaac 720
cacatctcga cggcaaagta caacgtcgcc acgttcctcc ccaagttcct ctttgagcag 780
ttctccaagg tcgccaacat cttcttcctc ttcacggccg cgttgcagca gatccccgga 840
ctgtcgccca ccaacaagta caccacaatc ggacccctgg ctgttgtgct cctggtttct 900
gctggcaagg aattggtgga ggattaccgg agaagagtgg cggacaatgc cctcaacaca 960
tccaaggcgc gagtcctgcg cggctcgacg tttacggaaa cgaaatggaa caccgtggcc 1020
gtgggcgacg tggttagggt cgagtccgag gagccgttcc ccgccgatct ggtgcttctg 1080
gcaagttccg agcccgaggg tctctgttat atcgaaacgg cgaacctgga tggcgagacc 1140
aacttgaaga tcaagcaggc cctccccgag acgtcgacgc tggtgtcccc cagcgaagtc 1200
agccggctgg gaggtcgcat caagtcggag cagcccaaca gcagtctgta cacgtacgaa 1260
gcgacgctga tcatgcaagc cggaggagga gaaaaggagc tggcactgaa ccctgagcag 1320
ctgcttctcc gaggtgccac tctgagaaac actccctgga tccacggcat cgtcgtcttc 1380
accggccacg agaccaagct gatgcgaaac gcgaccgcga cgccgatcaa gcggaccaag 1440
gtcgagaggc agctcaactg gctcgtgctc atgctggtcg gcatgctgct ggtgctcagc 1500
gtcatcagta ccattggaga cttggtgatg cgaggcgcca ccggcgattc gctttcgtat 1560
ctctacctgg acaagatcga cagcgctggc gttgcggcct cgacgttctt caaggacatg 1620
gtcacgtact gggtgctctt ctccgcgctg gtccccatct ccctctttgt cacggtggaa 1680
ttggtcaagt attggcacgg catcctcatc aacgacgacc tcgacatgta ctacgacaag 1740
acggatacgc cggccacttg ccgaacgtcg agtctggtcg aggagcttgg catggtcgag 1800
tacgtgttct ctgacaagac tggcacgctc acttgcaaca tgatggagtt caagcagtgc 1860
tcgattggcg gcatcatgta tgccgaagag gttcccgagg accgccgagc gagcggcgcc 1920
gacgacgaag agacggctat ttacgacttc aaggcgctcc aggccaacct gacccaaggc 1980
catccgaccg cgggcatgat tgatcatttc ctttcgctgc tcgcaacctg ccacacggtc 2040
atccccgaga tggatgaaaa gggtcagatc aagtaccaag cggcctctcc cgacgaaggt 2100
gccctggtgg ccggagcggt taccatggga tacaagttta ctgcacgaaa gccaaagtcg 2160
gtcattatag aagccaacgg gcgagagatg gaatacgagc tgctggccgt ctgcgaattc 2220
aactcgacgc gcaagcgaat gtctgccatc ttccgctgcc cggacggaaa gattcgagtc 2280
tactgcaaag gtgccgacac cgtcattctt gagcggctca acgatcagaa cccccacgtc 2340
gaaatcaccc tgcggcacct ggaggagtac gcctcggagg ggctgcggac gctctgcttg 2400
gccatgcgcg aggtgcccga acaggagtac cgcgaatggc gccagatctt tgacacggcg 2460
gcgacgacgg tgggcggcaa ccgagccgat gagctggaca aggctgccga aatcattgaa 2520
cacgactttt acctcctggg agctactgcc attgaggacc gcctgcaaga cggcgttccg 2580
gagacgatcc acacgctgca gcaagccaac atcaaggtct gggttctgac aggagaccga 2640
caggaaacgg ccatcaacat tggcatgagt tgcaagctcc tgagcgagga catgatgctc 2700
ttgattgtca acgaagagtc gtcggccgca actcgtgata acatccaaaa gaagctcgat 2760
gccatcagga cgcaaggcga cggtaccatt gagatggagt ccctggcgct cgtcattgac 2820
ggcaagtccc tgacatatgc gctcgagaag gacatggaga agcttttcct cgatctcgcc 2880
atcatgtgca aggccgtcat ctgctgccgt gtgtcccccc tgcaaaaggc cctggtcgtc 2940
aagctcgtca agaagtacca gaagcagtcg attctcctcg ccattggcga cggggccaac 3000
gacgtctcca tgatccaggc ggcgcacatt ggcgtcggca tcagcggtgt tgaaggtctg 3060
caggccgctc ggagcgccga cgtggccatt gcccagttca ggtacctccg gaagctgctg 3120
cttgtccacg gcgcgtggag ttaccagcgc gtgagcaaga cgattctgtt ttcgttctac 3180
aagaacattg ccctgtatct gacgcagttc tggtacacgt tccaaaacgt cttctccggc 3240
caggtcattt acgagtcgtg gacgttgtcc ttctacaacg tcttctacac cgttcttccg 3300
ccgctggcca ttggcattct ggaccagttc atctctgcgc gcctgctcga tcgctacccc 3360
cagctgtaca tgatgggcca gcagaattcc gccttcaagc tcaaggtctt tgcgcagtgg 3420
atcgccaacg ccatctacca ctccctcctc ctctacgtct ttgccgagct catctggtac 3480
ggcgacgtga ttgacggcca ggggcagacc gacggccact gggtgtgggg aaccgccctg 3540
tacggctccg tcctgctcac cgtgctgggc aaggcggcct tggtgaccaa caactggacc 3600
aagtaccatg tcatggccat cccgggcagc atggtcatct ggtgggtgtt catcgccgtg 3660
tacggcactg tggcgcccaa ggtcaagatt tcccccgagt actttggcgt catccccaag 3720
ctgtacagca gccccgtctt ctggctgcag atattcgtcc ttgccctgct gtgtctgtcg 3780
cgcgatattg cttggaagta cgccaagcgc atgtactggc cgcagacgta ccaccacatt 3840
caggagattc aaaaatacaa cattcaggac taccggccta ggtatgtaca cgtgcccagc 3900
acagcccctc tcctcccctc ttcttgcccc aggaatccat ctgcggtttg aatagaggca 3960
tgtctatata tgagagagag ccacgcgcta acgtgccatg acaggatgga gcaattccag 4020
aaagccatcc gcaaggttcg gcaggtgcag cgtatgcgca agcagcgtgg ctatgccttt 4080
tcgcaggccg acgagagcca gacgcgcgtg cttcaggcat acgacacgac caagcaccga 4140
ggccgatatg gagaaatggc cagctcacga cctatagacg ggatataa 4188
<210> 2
<211> 12500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaaggacgag atggaccgcg ccaagaacgg gccgccgctg aggtttgaga tgccggcgct 60
gtttgttgcg gcgagcaagg acaatgcttt gccgccggcc atgtccaagg gcatggacgc 120
tttctacaag gaccttacca gggccgaggt ggatgctacg cattgggctt tgacgcaggc 180
tggggatgag gtcaatcggg tgattggaga gtggttgaac aaggcgctca atggtgcgac 240
caaggctgcg ttgtagaaat cgaggagaat attcaaatga tcatgaattg ggctaacata 300
aggaaacccc cgacttgctt ggatctcagc atttgctaga catctggtag cagcttgctg 360
taactccctt ttgtacatgt tgagctatga ccgtataccc ctgaatatag ttcccgtaga 420
atctagttgt gccgtccata tcgtttcgag gttgacaggt atcaagtaaa catttcttcg 480
tgactctgcc tccaacatgt ctccaaggtg ttggggatcg tgtgccgcgt ttcttgggcg 540
ttgctggtgt tgaacaaaca tgctgttgct ttgtggccac acgcacatac acacacacgc 600
cgctttgggg agattccgtt cactgcttcg cgccccttct gctttagtac cttcaagagt 660
ccattaattg attcattcct ggcgagtcat ttcacttcag agtgtttttg taagcatcaa 720
cagtcggtgc cttggaggtg gactttttgt ttggctttcc acacatggga catgctgtgt 780
gctaatgtga gcttgggtgt tcatgtgaag ggggaaaagg cggagagact cacagtccgt 840
ctggtaggca cacttctggc aataggaatg gccttgagtg attttggttt tgcactttga 900
gcacgaacta ttcccactgt cagtcaaaag cgcaatgcac atatagagaa tgcgattgcg 960
taggtaggat ggtgcacata cctggagtac tgtgcgtatg gattctttgc tgcttttgac 1020
agcagcttgc tctggaggcc cgttagcgag cattatcgag gaatgacggg aagcagtctt 1080
cgtttacctt tgacactccg gtgttgccca gagttgctga tttggagctg cctgcctttg 1140
cgctggctgg cgagccgtag tacatttcgc tcttcttctt gacctctgga gtcgcaagct 1200
tggtgctctt ggtgagcttc agacacttgc tgcacaccat cgcggcgtct gaatgggggg 1260
tttatctgat tgagtcgggt tgagtatcga tggatttgat aaggaatatg tcagatagcg 1320
ttcgatacta ttgtccgtgg ttcagcttga tggccgcatg ctcgactttc tggtgtttga 1380
tgggtgaatc gcagtggcaa ggctgacatc aacggcaacg cgaaacccgg cactccgtac 1440
ggcttccgcg gccatactgt tccgaattcc caacgaccag ctgcaaagta tcctcaaccg 1500
tgctctggca ttcggcaagg taccatgctc gcacaatctc gctggtgggg gactttgtcg 1560
caaaagggac aacgctcagg gggacccgcc aaacaggcct ctcagcagtg gagcagcagc 1620
agcacatcag tgcagttcaa ggcgaggtcc agcctgtggc atccccccaa gcgatccatg 1680
gatgcgctag agcacttgca gagagagcgc tggagccctt ggacgacgtt gaccccggac 1740
ggcccccttt caggccactt ggcgcaagag agcttccagg tcatcaaggg ttcaagacgg 1800
gctcgtatgc atcagatcaa atcaaacagc atcccagggg agcgctggag aacttgagct 1860
tacaggtgtt tggcattgat ccgtgctccc agtctataat tattacccta cgggggacct 1920
ctcgggtatc agcgccttgg tcgcagaact gcactgagct ttcgtgcccc caagattcaa 1980
atcgtcgggt ccaactgcgc ctctgtttca ctgccgacag tgctgacgta ccaaacgcct 2040
gagcctcgac agcgtcccgc tacggagtgg gagcgattta gcggcagctc gccgaaacga 2100
ggctgtgcag ggacgggaac cttcattgga ttggaacacc ttctcgaacg ctttttttta 2160
gcggaacagc atcagactct acagcgagcg gccctgccct atcgatatcg cgggaccaga 2220
ccaggtgtcg accccgatcg ttctcgagct gctgtgcgag tccgtctcct gcatacctaa 2280
cctaaggaac ctctacctat agacatccaa tacattcgca tccacccgcg agcggctgcg 2340
gtttcacatt ccagccctcc cacggacgca gcgaaacagc cgcgaaacat ccaaaaacac 2400
cacaacacac acagcttctc gggctggccc accctcatcg aagcccgcat gcgttgcccc 2460
tccgcctcag cgaccgccta accactgctc gtcctccggc atggctggac gacatcccat 2520
aggaggccat ggcgggccct cgaccaccga cgacctgctg ctcgacctgg acaatgagca 2580
gcccgtctac aacgccggcc agcggtcggc cctcaatgac gacgacctgg cgcgggccta 2640
cgagcacgac cacgacaacg acccccagag ccgcccgtcg gtgtcgtacg acgactttgt 2700
cggcgccgag ccgtcatatc ccccagcagg gcgccccggc ctggcgcagg cagcgcagcc 2760
gtcggggcag tcgtcgggcc cgtaccacgc tcagcagttc agccagtcgt cggacctcga 2820
caacttcccg cgctacgccg acgacttcga cgacgacgac atgtactacc agcacggcgg 2880
cgcggcgggc gcggggccgg cgtcggctgg cagggacaat gcgagggccc gcaacagcgt 2940
gctgtcgctg ggaggcggcc tctttggcaa gctgaagcac cgcctgggca tgggccaggg 3000
ctactccgag atggacctcc ccttgacgga gccgggccac gatcgaggcg gccccatagc 3060
gggctcgtcg cagccgccgg accagcagcc cgcgggcaag aaggcgggca acttcaagtt 3120
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caacccgccc gccaacgcgg ccaacaagta cgtcggcaac cacatctcga cggcaaagta 3240
caacgtcgcc acgttcctcc ccaagttcct ctttgagcag ttctccaagg tcgccaacat 3300
cttcttcctc ttcacggccg cgttgcagca gatccccgga ctgtcgccca ccaacaagta 3360
caccacaatc ggacccctgg ctgttgtgct cctggtttct gctggcaagg aattggtgga 3420
ggattaccgg agaagagtgg cggacaatgc cctcaacaca tccaaggcgc gagtcctgcg 3480
cggctcgacg tttacggaaa cgaaatggaa caccgtggcc gtgggcgacg tggttagggt 3540
cgagtccgag gagccgttcc ccgccgatct ggtgcttctg gcaagttccg agcccgaggg 3600
tctctgttat atcgaaacgg cgaacctgga tggcgagacc aacttgaaga tcaagcaggc 3660
cctccccgag acgtcgacgc tggtgtcccc cagcgaagtc agccggctgg gaggtcgcat 3720
caagtcggag cagcccaaca gcagtctgta cacgtacgaa gcgacgctga tcatgcaagc 3780
cggaggagga gaaaaggagc tggcactgaa ccctgagcag ctgcttctcc gaggtgccac 3840
tctgagaaac actccctgga tccacggcat cgtcgtcttc accggccacg agaccaagct 3900
gatgcgaaac gcgaccgcga cgccgatcaa gcggaccaag gtcgagaggc agctcaactg 3960
gctcgtgctc atgctggtcg gcatgctgct ggtgctcagc gtcatcagta ccattggaga 4020
cttggtgatg cgaggcgcca ccggcgattc gctttcgtat ctctacctgg acaagatcga 4080
cagcgctggc gttgcggcct cgacgttctt caaggacatg gtcacgtact gggtgctctt 4140
ctccgcgctg gtccccatct ccctctttgt cacggtggaa ttggtcaagt attggcacgg 4200
catcctcatc aacgacgacc tcgacatgta ctacgacaag acggatacgc cggccacttg 4260
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taccatggga tacaagttta ctgcacgaaa gccaaagtcg gtcattatag aagccaacgg 4680
gcgagagatg gaatacgagc tgctggccgt ctgcgaattc aactcgacgc gcaagcgaat 4740
gtctgccatc ttccgctgcc cggacggaaa gattcgagtc tactgcaaag gtgccgacac 4800
cgtcattctt gagcggctca acgatcagaa cccccacgtc gaaatcaccc tgcggcacct 4860
ggaggagtac gcctcggagg ggctgcggac gctctgcttg gccatgcgcg aggtgcccga 4920
acaggagtac cgcgaatggc gccagatctt tgacacggcg gcgacgacgg tgggcggcaa 4980
ccgagccgat gagctggaca aggctgccga aatcattgaa cacgactttt acctcctggg 5040
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gcaagccaac atcaaggtct gggttctgac aggagaccga caggaaacgg ccatcaacat 5160
tggcatgagt tgcaagctcc tgagcgagga catgatgctc ttgattgtca acgaagagtc 5220
gtcggccgca actcgtgata acatccaaaa gaagctcgat gccatcagga cgcaaggcga 5280
cggtaccatt gagatggagt ccctggcgct cgtcattgac ggcaagtccc tgacatatgc 5340
gctcgagaag gacatggaga agcttttcct cgatctcgcc atcatgtgca aggccgtcat 5400
ctgctgccgt gtgtcccccc tgcaaaaggc cctggtcgtc aagctcgtca agaagtacca 5460
gaagcagtcg attctcctcg ccattggcga cggggccaac gacgtctcca tgatccaggc 5520
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ggaccagttc atctctgcgc gcctgctcga tcgctacccc cagctgtaca tgatgggcca 5880
gcagaattcc gccttcaagc tcaaggtctt tgcgcagtgg atcgccaacg ccatctacca 5940
ctccctcctc ctctacgtct ttgccgagct catctggtac ggcgacgtga ttgacggcca 6000
ggggcagacc gacggccact gggtgtgggg aaccgccctg tacggctccg tcctgctcac 6060
cgtgctgggc aaggcggcct tggtgaccaa caactggacc aagtaccatg tcatggccat 6120
cccgggcagc atggtcatct ggtgggtgtt catcgccgtg tacggcactg tggcgcccaa 6180
ggtcaagatt tcccccgagt actttggcgt catccccaag ctgtacagca gccccgtctt 6240
ctggctgcag atattcgtcc ttgccctgct gtgtctgtcg cgcgatattg cttggaagta 6300
cgccaagcgc atgtactggc cgcagacgta ccaccacatt caggagattc aaaaatacaa 6360
cattcaggac taccggccta ggtatgtaca cgtgcccagc acagcccctc tcctcccctc 6420
ttcttgcccc aggaatccat ctgcggtttg aatagaggca tgtctatata tgagagagag 6480
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gcaggtgcag cgtatgcgca agcagcgtgg ctatgccttt tcgcaggccg acgagagcca 6600
gacgcgcgtg cttcaggcat acgacacgac caagcaccga ggccgatatg gagaaatggc 6660
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agcaacagtt ttgtgtttta ggggtgggct gtaatgattt ttatctgcca tcacgtctca 6780
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tgccgattcg gaagccagac gagggctatg atggttgatt ttgtttgctg tttgcggttt 6960
ttctgaaact agctattatg ccatatatga tgtctttgtc tggggtgtct cttgttgggt 7020
gttcttttct tgacatttat tatcatggct tgttactgaa ggggatgtga gatttctagg 7080
tagaaggata ggaaggcggt tgaatggaaa tttacattga catgagatgc ttggttattt 7140
gaagtgagga gaggtaagag tgatggtagt gttggtatat ggatgatgtt gcacggtgcg 7200
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tacgctgtgt cacatgttta tatgccgcga tgctgttgta tcggcatctg ttgcattgta 7860
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ctatgaatag tctacctact ttatatcgca cgcaaggggc gaagacaatg cgtggcgttg 7980
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cagcatcatg tacgagacgg tattcttgac ctgcatcaag ctttcgcccc cccccccccc 8460
cccccccccc cccccccccc ccccccatat gcgtacgtcc cgtatcacag gcatcaaaat 8520
cccaccgata tcccatgcag gtcccccttc catctctcac agcttccccc cctctgtaac 8580
accacatgat gtacagtaca agccacgctg caccgcagct ctcctacata atgatactac 8640
tactaacacc accacataca tacagacaga ccccaatttc cccttacata tccccctccc 8700
ctcttcacac caaaaacgga aagaaaaaaa aataagagga gagagagata aggtccgtat 8760
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tggttctctt gattctgaat cctcaggcca gaagacgcgc cgacatcgct gatgtactcg 8880
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cataacagtc tttgtgaagt actaagagaa acaggaggaa aagggaagtg aagaaaagga 9240
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catctcaggg cctcaaacaa ttaacccccc cgccagcaca cccacctggc tgcgtccgaa 10080
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ccccgtaggc caggtcgagg gtgctcgggt ggctgtacag aaggctggcc gatggtcgcg 10260
tgtacgagtt gttggggctg gtagctgagc tgcggctgaa gggccagatg ccactccccg 10320
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tgtggtagtt gagcgcggtg tctggtgaag ccggcggaga gttggtgaag tgcatcgagc 10440
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tacagaacca gctcgtcgtg ggtgtggaat tccttttcgc aaatcatgct gcaggaacac 10740
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tactgaggga agctctctcg ctcgtcgttg tcccaaatct ccgtgtcggt ctcgcgacca 10860
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aggaggagga agaggtcgga aaagactggc gtgtgagacg cttttgttgt cgtgcttctg 11760
cttctccgta tttgtgcagg ctgtaagagg tacttgtata atatgcaatc tgatggcagc 11820
cgaaagcgga gactcgcagt tcactgcttg gtgacaaagt ttccagcagg gcgatcggcg 11880
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ggactttgct tggggggggc aggcagcgat gactcttttg tttttgtggg ctctcttgtc 12060
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aataaaacgt aaattgtgga acacagtctg gcaggctctt gtcgaagtcg ggcgtggtgc 12240
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gtttcagttg cttgtcttgc 12500
<210> 3
<211> 8188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctccaaggtg ttggggatcg tgtgccgcgt ttcttgggcg ttgctggtgt tgaacaaaca 60
tgctgttgct ttgtggccac acgcacatac acacacacgc cgctttgggg agattccgtt 120
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ttctcgagct gctgtgcgag tccgtctcct gcatacctaa cctaaggaac ctctacctat 1800
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acgctccggg gtcaggattg gtggattgca gtcacactat gcggtgcatg gtgacaagca 7080
agagcggctg ataagagaag ctcgagttgg gatgttgaaa aagcgccgtg aggggcccag 7140
attgaagccg tccaaagtgg gaaaggatcc gaaatcccct cgctgccgga ccactaatga 7200
cagtgatcga acagtgaaaa cagttgaaaa catcaaaact tttgttgtgc gtaagtgtgt 7260
atctccctga agaacgccaa agggaaaaaa aaagaaagga agaatagaag aataacagtt 7320
gtgcggagtg tggtgcgaat gggctcggca acagcaaagg agccggacga gaccaggacc 7380
tcaagtcggt tggaggtggc acaacagcgt gctgccagtc gacggcgaga cccttgccgc 7440
tgggcatccg cacccctgta accccgcagt ccgaatcaat gcgccgtttg gccagaattc 7500
tggcaaaatg cggaggcgcg gtgtgcgtcg gaggtcccat cacgacatct gcacgcgcca 7560
gtccttgttc gtctgcgtct tattgcctgg ccacccccac agcggtggcc gacgctccca 7620
ggccagtctg gtgataggcc gctgcgagcc cagctgctgc tagccggcgt gccgtgcgca 7680
agggggggga aaggggccgc tagagacgct cgaggcggat gggactgcag ccaaccgctt 7740
cgtcccatct cagggcctca aacaattaac ccccccgcca gcacacccac ctggctgcgt 7800
ccgaaatcac cgagtcagca tggggatgac aagctcgacg ctctttggcc gcgagctgcc 7860
gcctggggtc ctcgagggca gcggccggtc catggcccca gaccctgcct cgtgcgagta 7920
ggtgcccccg taggccaggt cgagggtgct cgggtggctg tacagaaggc tggccgatgg 7980
tcgcgtgtac gagttgttgg ggctggtagc tgagctgcgg ctgaagggcc agatgccact 8040
ccccgacggc gacggggggc tgggtggcct cacgttgagg gatcgcaggg cagacatggc 8100
cgaggtgtgg tagttgagcg cggtgtctgg tgaagccggc ggagagttgg tgaagtgcat 8160
cgagctgggc cgtgagggcg aggcccgtgg cacaatgtct cgcggctcgg acccggccaa 8220
ggactcggtc aggatgcggc gctggttgac gtagacagag gagtaatagc tgcgaaccga 8280
cttggcctgc gcggacgagt cttggtctac ccggcggcat ctacacacat gtgtgttagt 8340
ggacgtgatc aacccagctc ctccaaggtt cgtcgtcaag aagagaaaca tacgcatcgg 8400
agcagtacag aaccagctcg tcgtgggtgt ggaattcctt ttcgcaaatc atgctgcagg 8460
aacacaaaag gtcagttaca tggcctcagc agcgtcacaa acaacaggag tggcttccat 8520
accagtactg agggaagctc tctcgctcgt cgttgtccca aatctccgtg tcggtctcgc 8580
gaccacctcg ccccaacttc tgggcggcgg acggagtgtg tcgtcgagtc atggttggtc 8640
gcttgtactg agcgggtgtt gcggtcactg cctttcgcac gtctgttgtc gatgcggtgg 8700
cagtgtaagg gccggacttg cgtcgctggt gaggcatttg gaatgcagat agaagaggag 8760
caagggaaaa agtgcgtggg cgaactcgag gtgttatcct ggcagctcgg agagcgtggg 8820
ggaaaactac caggaccgtc caaggcgtga gacgaccaaa atcagggaag ccagacagaa 8880
cgctgtgctg gctttatctc cggcaggcag cgcagccaaa tcaggcgggt gtatgcgaca 8940
cgtcgtattg gagagtgcgc gagattaata agagagtgac gctttgctcg acaggcgtga 9000
cttgggctga agaatgacgg gaggtcacac cggcgtagag agggtgaaga ttgatcgaca 9060
ggacccggaa gatggaagga tgctgcagat cgattcgtcg ggcagatttg ctgttatcca 9120
ctcttggtgt tcagttgaca ggagcagagc gtcgactgct gagtagctta aaagggccaa 9180
atatagcagt ggtatcgacg gtcagatgat aagcaccgca gagggtgaga tgaggtggat 9240
gggagggcgt ttggtgtaag tggtggcacg ggatgaaggt ctagtgctgg gttgaccgga 9300
ggctgagctg gactgtgatg tgtcgtcgat aatggggtgg tggtgtaagg cgtattcgca 9360
gattgatgga ggaagggaaa agaacggatg aggaagtaga tttgaacgag agtgagagga 9420
ggaagaggag gaggaagagg tcggaaaaga ctggcgtgtg agacgctttt gttgtcgtgc 9480
ttctgcttct ccgtatttgt gcaggctgta agaggtactt gtataatatg caatctgatg 9540
gcagccgaaa gcggagactc gcagttcact gcttggtgac aaagtttcca gcagggcgat 9600
cggcgcggac gggagtaact ttgcgtccag ggcgggtgcc agcagcagca gcaggtaccg 9660
atggtgacac actgtcgacg ccgggctcca caatgtcgcg atagtggtac tttggccctc 9720
gactcggact ttgcttgggg ggggcaggca gcgatgactc ttttgttttt gtgggctctc 9780
ttgtctcctt ttttctttct tgcgttaagc ttctttttgt gaatgctatt tttttttctt 9840
ctcctttatt ccgctttaat atattttccc cttcagaaac agaaagaagc tttccaatgt 9900
ttcaaaataa aacgtaaatt gtggaacaca gtctggcagg ctcttgtcga agtcgggcgt 9960
ggtgcgaatc gctcggatga agcctcggtg gtagggctgg actcgttcgg gcggatgtac 10020
tacccagtac tcgtgtggag gtacctgtaa gacgggatcg cgccggagag gtacttgtgt 10080
gcacaggtgg gagcggtcgc aaggccgtag cgtttattga gttgctgacg tgcttatggg 10140
ccaagattcg tacagtatta gaagctggag cacgaataat acccaagcat ggggtgcagc 10200
agttggtttc agttgcttgt cttgc 10225
<210> 6
<211> 1354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Ala Gly Arg His Pro Ile Gly Gly His Gly Gly Pro Ser Thr Thr
1 5 10 15
Asp Asp Leu Leu Leu Asp Leu Asp Asn Glu Gln Pro Val Tyr Asn Ala
20 25 30
Gly Gln Arg Ser Ala Leu Asn Asp Asp Asp Leu Ala Arg Ala Tyr Glu
35 40 45
His Asp His Asp Asn Asp Pro Gln Ser Arg Pro Ser Val Ser Tyr Asp
50 55 60
Asp Phe Val Gly Ala Glu Pro Ser Tyr Pro Pro Ala Gly Arg Pro Gly
65 70 75 80
Leu Ala Gln Ala Ala Gln Pro Ser Gly Gln Ser Ser Gly Pro Tyr His
85 90 95
Ala Gln Gln Phe Ser Gln Ser Ser Asp Leu Asp Asn Phe Pro Arg Tyr
100 105 110
Ala Asp Asp Phe Asp Asp Asp Asp Met Tyr Tyr Gln His Gly Gly Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Gly Pro Ala Ser Ala Gly Arg Asp Asn Ala Arg Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Val Leu Ser Leu Gly Gly Gly Leu Phe Gly Lys Leu Lys His
145 150 155 160
Arg Leu Gly Met Gly Gln Gly Tyr Ser Glu Met Asp Leu Pro Leu Thr
165 170 175
Glu Pro Gly His Asp Arg Gly Gly Pro Ile Ala Gly Ser Ser Gln Pro
180 185 190
Pro Asp Gln Gln Pro Ala Gly Lys Lys Ala Gly Asn Phe Lys Phe Gly
195 200 205
Phe Gly Arg Gly Lys Pro Asp Pro Ala Ser Leu Gly Pro Arg Ile Ile
210 215 220
His Leu Asn Asn Pro Pro Ala Asn Ala Ala Asn Lys Tyr Val Gly Asn
225 230 235 240
His Ile Ser Thr Ala Lys Tyr Asn Val Ala Thr Phe Leu Pro Lys Phe
245 250 255
Leu Phe Glu Gln Phe Ser Lys Val Ala Asn Ile Phe Phe Leu Phe Thr
260 265 270
Ala Ala Leu Gln Gln Ile Pro Gly Leu Ser Pro Thr Asn Lys Tyr Thr
275 280 285
Thr Ile Gly Pro Leu Ala Val Val Leu Leu Val Ser Ala Gly Lys Glu
290 295 300
Leu Val Glu Asp Tyr Arg Arg Arg Val Ala Asp Asn Ala Leu Asn Thr
305 310 315 320
Ser Lys Ala Arg Val Leu Arg Gly Ser Thr Phe Thr Glu Thr Lys Trp
325 330 335
Asn Thr Val Ala Val Gly Asp Val Val Arg Val Glu Ser Glu Glu Pro
340 345 350
Phe Pro Ala Asp Leu Val Leu Leu Ala Ser Ser Glu Pro Glu Gly Leu
355 360 365
Cys Tyr Ile Glu Thr Ala Asn Leu Asp Gly Glu Thr Asn Leu Lys Ile
370 375 380
Lys Gln Ala Leu Pro Glu Thr Ser Thr Leu Val Ser Pro Ser Glu Val
385 390 395 400
Ser Arg Leu Gly Gly Arg Ile Lys Ser Glu Gln Pro Asn Ser Ser Leu
405 410 415
Tyr Thr Tyr Glu Ala Thr Leu Ile Met Gln Ala Gly Gly Gly Glu Lys
420 425 430
Glu Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gln Leu Leu Leu Arg Gly Ala Thr Leu
435 440 445
Arg Asn Thr Pro Trp Ile His Gly Ile Val Val Phe Thr Gly His Glu
450 455 460
Thr Lys Leu Met Arg Asn Ala Thr Ala Thr Pro Ile Lys Arg Thr Lys
465 470 475 480
Val Glu Arg Gln Leu Asn Trp Leu Val Leu Met Leu Val Gly Met Leu
485 490 495
Leu Val Leu Ser Val Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Met Arg Gly
500 505 510
Ala Thr Gly Asp Ser Leu Ser Tyr Leu Tyr Leu Asp Lys Ile Asp Ser
515 520 525
Ala Gly Val Ala Ala Ser Thr Phe Phe Lys Asp Met Val Thr Tyr Trp
530 535 540
Val Leu Phe Ser Ala Leu Val Pro Ile Ser Leu Phe Val Thr Val Glu
545 550 555 560
Leu Val Lys Tyr Trp His Gly Ile Leu Ile Asn Asp Asp Leu Asp Met
565 570 575
Tyr Tyr Asp Lys Thr Asp Thr Pro Ala Thr Cys Arg Thr Ser Ser Leu
580 585 590
Val Glu Glu Leu Gly Met Val Glu Tyr Val Phe Ser Asp Lys Thr Gly
595 600 605
Thr Leu Thr Cys Asn Met Met Glu Phe Lys Gln Cys Ser Ile Gly Gly
610 615 620
Ile Met Tyr Ala Glu Glu Val Pro Glu Asp Arg Arg Ala Ser Gly Ala
625 630 635 640
Asp Asp Glu Glu Thr Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Ala Leu Gln Ala Asn
645 650 655
Leu Thr Gln Gly His Pro Thr Ala Gly Met Ile Asp His Phe Leu Ser
660 665 670
Leu Leu Ala Thr Cys His Thr Val Ile Pro Glu Met Asp Glu Lys Gly
675 680 685
Gln Ile Lys Tyr Gln Ala Ala Ser Pro Asp Glu Gly Ala Leu Val Ala
690 695 700
Gly Ala Val Thr Met Gly Tyr Lys Phe Thr Ala Arg Lys Pro Lys Ser
705 710 715 720
Val Ile Ile Glu Ala Asn Gly Arg Glu Met Glu Tyr Glu Leu Leu Ala
725 730 735
Val Cys Glu Phe Asn Ser Thr Arg Lys Arg Met Ser Ala Ile Phe Arg
740 745 750
Cys Pro Asp Gly Lys Ile Arg Val Tyr Cys Lys Gly Ala Asp Thr Val
755 760 765
Ile Leu Glu Arg Leu Asn Asp Gln Asn Pro His Val Glu Ile Thr Leu
770 775 780
Arg His Leu Glu Glu Tyr Ala Ser Glu Gly Leu Arg Thr Leu Cys Leu
785 790 795 800
Ala Met Arg Glu Val Pro Glu Gln Glu Tyr Arg Glu Trp Arg Gln Ile
805 810 815
Phe Asp Thr Ala Ala Thr Thr Val Gly Gly Asn Arg Ala Asp Glu Leu
820 825 830
Asp Lys Ala Ala Glu Ile Ile Glu His Asp Phe Tyr Leu Leu Gly Ala
835 840 845
Thr Ala Ile Glu Asp Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Glu Thr Ile His
850 855 860
Thr Leu Gln Gln Ala Asn Ile Lys Val Trp Val Leu Thr Gly Asp Arg
865 870 875 880
Gln Glu Thr Ala Ile Asn Ile Gly Met Ser Cys Lys Leu Leu Ser Glu
885 890 895
Asp Met Met Leu Leu Ile Val Asn Glu Glu Ser Ser Ala Ala Thr Arg
900 905 910
Asp Asn Ile Gln Lys Lys Leu Asp Ala Ile Arg Thr Gln Gly Asp Gly
915 920 925
Thr Ile Glu Met Glu Ser Leu Ala Leu Val Ile Asp Gly Lys Ser Leu
930 935 940
Thr Tyr Ala Leu Glu Lys Asp Met Glu Lys Leu Phe Leu Asp Leu Ala
945 950 955 960
Ile Met Cys Lys Ala Val Ile Cys Cys Arg Val Ser Pro Leu Gln Lys
965 970 975
Ala Leu Val Val Lys Leu Val Lys Lys Tyr Gln Lys Gln Ser Ile Leu
980 985 990
Leu Ala Ile Gly Asp Gly Ala Asn Asp Val Ser Met Ile Gln Ala Ala
995 1000 1005
His Ile Gly Val Gly Ile Ser Gly Val Glu Gly Leu Gln Ala Ala
1010 1015 1020
Arg Ser Ala Asp Val Ala Ile Ala Gln Phe Arg Tyr Leu Arg Lys
1025 1030 1035
Leu Leu Leu Val His Gly Ala Trp Ser Tyr Gln Arg Val Ser Lys
1040 1045 1050
Thr Ile Leu Phe Ser Phe Tyr Lys Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Thr
1055 1060 1065
Gln Phe Trp Tyr Thr Phe Gln Asn Val Phe Ser Gly Gln Val Ile
1070 1075 1080
Tyr Glu Ser Trp Thr Leu Ser Phe Tyr Asn Val Phe Tyr Thr Val
1085 1090 1095
Leu Pro Pro Leu Ala Ile Gly Ile Leu Asp Gln Phe Ile Ser Ala
1100 1105 1110
Arg Leu Leu Asp Arg Tyr Pro Gln Leu Tyr Met Met Gly Gln Gln
1115 1120 1125
Asn Ser Ala Phe Lys Leu Lys Val Phe Ala Gln Trp Ile Ala Asn
1130 1135 1140
Ala Ile Tyr His Ser Leu Leu Leu Tyr Val Phe Ala Glu Leu Ile
1145 1150 1155
Trp Tyr Gly Asp Val Ile Asp Gly Gln Gly Gln Thr Asp Gly His
1160 1165 1170
Trp Val Trp Gly Thr Ala Leu Tyr Gly Ser Val Leu Leu Thr Val
1175 1180 1185
Leu Gly Lys Ala Ala Leu Val Thr Asn Asn Trp Thr Lys Tyr His
1190 1195 1200
Val Met Ala Ile Pro Gly Ser Met Val Ile Trp Trp Val Phe Ile
1205 1210 1215
Ala Val Tyr Gly Thr Val Ala Pro Lys Val Lys Ile Ser Pro Glu
1220 1225 1230
Tyr Phe Gly Val Ile Pro Lys Leu Tyr Ser Ser Pro Val Phe Trp
1235 1240 1245
Leu Gln Ile Phe Val Leu Ala Leu Leu Cys Leu Ser Arg Asp Ile
1250 1255 1260
Ala Trp Lys Tyr Ala Lys Arg Met Tyr Trp Pro Gln Thr Tyr His
1265 1270 1275
His Ile Gln Glu Ile Gln Lys Tyr Asn Ile Gln Asp Tyr Arg Pro
1280 1285 1290
Arg Met Glu Gln Phe Gln Lys Ala Ile Arg Lys Val Arg Gln Val
1295 1300 1305
Gln Arg Met Arg Lys Gln Arg Gly Tyr Ala Phe Ser Gln Ala Asp
1310 1315 1320
Glu Ser Gln Thr Arg Val Leu Gln Ala Tyr Asp Thr Thr Lys His
1325 1330 1335
Arg Gly Arg Tyr Gly Glu Met Ala Ser Ser Arg Pro Ile Asp Gly
1340 1345 1350
Ile

Claims (10)

1.敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的物质在提高里氏木霉（Trichoderma reesei）胞外蛋白分泌量中的应用；
所述Trdrs2蛋白为如下a1）-a4）中任一种：
a1）序列表中序列6所示的蛋白质；
a2）在a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
a3）将a1）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
a4）与a1）具有98％以上同一性且与里氏木霉胞外蛋白分泌量相关的蛋白质；
所述敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的物质为敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段或含有所述DNA片段的重组载体或含有所述DNA片段的重组细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码Trdrs2蛋白的核酸分子为如下c1）-c3）中任一种：
c1）序列表中序列1或序列2所示的DNA分子；
c2）与c1）具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
c3）在严格条件下与c1）或c2）任一种限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段含有Trdrs2基因上游同源臂和Trdrs2基因下游同源臂，所述Trdrs2基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述Trdrs2基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的6189-8188位。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的DNA片段为序列表中序列4所示的DNA片段。
5.一种重组里氏木霉菌的构建方法，包括如下步骤：敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子，得到所述重组里氏木霉菌；所述重组里氏木霉菌的胞外蛋白分泌量高于所述里氏木霉（Trichoderma reesei）。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述敲除里氏木霉（Trichoderma reesei）中编码Trdrs2蛋白的核酸分子的方法为同源重组、随机***突变或RNAi。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-2000位，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3的第6189-8188位。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述同源重组通过将序列表中序列4所示的DNA片段导入所述里氏木霉（Trichoderma reesei）实现。
9.由权利要求5-8任一所述方法构建得到的重组里氏木霉菌。
10.权利要求5-8任一所述的方法或权利要求9所述的重组里氏木霉菌在制备或合成或表达胞外蛋白中的应用。
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