CN115836090A - 抗cldn18.2抗体及其诊断用途 - Google Patents

抗cldn18.2抗体及其诊断用途 Download PDF

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Abstract

本公开在本文中提供抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包含其的药物组合物和其诊断用途。

Description

抗CLDN18.2抗体及其诊断用途
技术领域
本公开大体上涉及新型抗CLDN18.2抗体及其诊断用途。
背景技术
密封蛋白-18(Claudin-18，CLDN18)分子(Genbank登录号：剪接变异体1(CLDN18A1或CLDN18.1)：NP_057453、NM_016369，和剪接变异体2(CLDN18A2或CLDN18.2)：NM_001002026、NP_001002026)为分子量为大约27.9/27.72kD的整合跨膜蛋白。CLDN18蛋白质位于上皮和内皮的紧密连接(tight junction)内，其在邻近细胞之间组织膜内颗粒的相互连接的股线的网络。CLDN18和闭合蛋白(occludin)是紧密连接中最主要的跨膜蛋白组分。归因于其强细胞间粘合特性，这些紧密连接蛋白质产生初级障壁以防止和控制溶质的细胞旁转运，并且还限制膜脂质和蛋白质的横向扩散以维持细胞极性。因此，其关键性地参与到上皮组织架构的组织中。
尽管靶向疗法和免疫疗法在过去十年中已经革命性地改变了各种癌症的全身性治疗，但晚期和/或转移性癌症的管理仍是极大挑战。举例来说，许多患有晚期胃肠癌(如胃癌、胰腺癌、胆管癌或肺癌)的患者仍不能显著受益于当前的标准治疗。化学疗法依然是大多数这些晚期癌症患者的主流治疗，并且其预后仍极差。鉴于在广泛类型的肿瘤中CLDN18.2表达高度受限和其异位活化频繁，在开发用于治疗表达CLDN18.2的实体肿瘤的药剂的过程中，CLDN18.2被视为治疗靶标，所述实体肿瘤包含但不限于GC/GEC、胰腺癌、胆管癌和肺癌等。
为了能够筛选和选择表达CLDN18.2的患者，需要具有高特异性和亲和力的IHC检测分析。
发明内容
在本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述(the)”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
本公开尤其提供了新型单克隆抗CLDN18.2抗体，其特异性地识别CLDN18.2而不与CLDN18.1交叉反应。本公开进一步提供编码所述抗CLDN18.2抗体的核苷酸序列，和所述抗CLDN18.2抗体例如出于诊断目的的用途。
在一个方面，本公开提供一种与CLDN18.2特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段表现出一种或多种以下特征：
a)与人CLDN18.1不具有交叉反应性；
b)如通过免疫组织化学分析(IHC)所测量的，除了胃上皮细胞以外，与非癌细胞不具有交叉反应性；
c)如通过IHC所测量的，与非癌人肺组织不具有交叉反应性；
d)能够与表达CLDN18.2的细胞特异性结合，任选地所述表达CLDN18.2的细胞经预处理，使得CLDN18.2变性或以其它方式不再呈现其天然构象；
e)如通过表面等离子共振(SPR)所测量的，能够以不超过10nM的Kd值，或如通过酶联免疫吸附分析(ELISA)所测量的，能够以不超过20ng/ml的EC50值与包含人CLDN18.2的第一胞外环的融合多肽结合；
f)如通过流式细胞术(FACS)分析所测量的，显示出与细胞表面的人CLDN 18.2没有可检测的结合；
g)如通过ELISA所测量的，能够与DQWSTQDLYN(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列内的表位特异性结合；和/或
h)如通过ELISA所测量的在1nM的抗体浓度下，或如通过IHC所测量在0.5μg/ml的抗体浓度下，与***固定的石蜡包埋(FFPE)样品中的人CLDN18.1不具有交叉反应性。
在一个方面，本公开提供一种与CLDN18.2特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含X1X2YX3H(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列，重链CDR2，其包含WIYPX4GX5X6X7X8YX9EKFKG(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含NYX10STFGY(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列；和/或
b)轻链CDR1，其包含RSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含KX11SNRFS(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含FQGSHVPFT(SEQ IDNO：6)的氨基酸序列；
其中X1为R或T，X2为N或Y，X3为F或I，X4为G或R，X5为F或G，X6为D或N，X7为I或T，X8为E或V，X9为S或N，X10为G或R且X11为V或I。
在某些实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
b)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7，重链CDR2序列，其包含SEQ ID NO：9，和重链CDR3序列，其包含SEQ ID NO：11。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段进一步包含：
a)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
b)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ D NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
b)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列；或
b)重链可变区，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段进一步包含一种或多种氨基酸残基突变，但仍保持对人CLDN 18.2的结合特异性，并且任选地保持对包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的线性表位的结合特异性。
在某些实施方式中，至少一种所述突变为保守取代，或所有所述突变为保守取代。
在某些实施方式中，至少一种所述突变在所述重链可变区或轻链可变区的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR序列中。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链CDR1(HCDR1)序列，其与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
b)重链CDR2(HCDR2)序列，其与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
c)重链CDR3(HCDR3)序列，其与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
d)轻链CDR1(LCDR1)序列，其与SEQ ID NO：2具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
e)轻链CDR2(LCDR2)序列，其与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
f)轻链CDR3(LCDR3)序列，其与SEQ ID NO：6具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和
所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体水平的结合亲和力。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，其中HCDR1在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，HCDR2在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，HCDR3在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，LCDR1在SEQ ID NO：2中具有不超过2或1个氨基酸突变，LCDR2在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，LCDR3在SEQ ID NO：6中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，且所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体水平的结合亲和力。
在某些实施方式中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：16具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地包含IgG的重链恒定区和/或轻链恒定区。在某些实施方式中，所述恒定区包含小鼠恒定区、兔恒定区、人恒定区或任何其它适合的恒定区。
在某些实施方式中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体、融合蛋白、二聚化抗体或多聚化抗体，或经修饰抗体(例如糖基化抗体)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段为双功能抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体或二价域抗体。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段，其与一个或多个部分连接。在某些实施方式中，所述部分包含放射性同位素、镧系元素、化学发光标记、发色部分、胶体金颗粒、荧光标记、酶-底物标记、地高辛标记、生物素/亲和素、半抗原、用于检测的DNA分子或颗粒标记。在某些实施方式中，所述部分包含生物素或半抗原。
在另一方面，本公开提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合CLDN18.2。
在另一方面，本公开提供一种分离的多核苷酸，其编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段。在另一方面，本公开提供一种载体，其包含本文所提供的分离的多核苷酸。在另一方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。
在又一方面，本公开提供一种表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达本文所提供的载体的条件下培养本文所提供的宿主细胞。
在又一方面，本公开提供一种检测样品中CLDN18.2的存在或表达水平的方法，其包括使所述样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与人CLDN18.2特异性结合的条件下接触，并且测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平。
在又一方面，本公开提供一种用于诊断受试者的CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；和
b)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，所述受试者被诊断为患有CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)。
在又一方面，本公开提供一种用于判定患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者用CLDN18.2靶向剂进行治疗的适当性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
b)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，判定所述受试者为适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，判定所述受试者为不适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗。
在又一方面，本公开提供一种预测CLDN18.2靶向剂在受试者中治疗CLDN18.2相关疾病或病状的治疗有效性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
b)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；
c)预测所述CLDN18.2靶向剂的治疗有效性，
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是有效的，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于所述阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是无效的。
在又一方面，本公开提供一种治疗患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者的方法，其包括：
a)选择适于所述治疗的受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；
iii)当发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，选择所述受试者为适于所述CLDN18.2相关疾病或病状的治疗；
b)给予所述选择的受试者治疗有效量的CLDN18.2靶向剂。
在又一方面，本公开提供一种治疗患有癌症或存在患有癌症风险的受试者的方法，其包括：
a)选择受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
iii)当未发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，选择所述受试者为不适于所述CLDN18.2相关疾病或病状的治疗；
b)给予所述选择的受试者除CLDN18.2靶向剂以外的标准治疗。
在某些实施方式中，所述样品为细胞样品或组织样品。在某些实施方式中，所述样品为固定的组织样品，任选地为***固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品。在某些实施方式中，所述CLDN18.2是细胞表面或膜结合的CLDN18.2。
在某些实施方式中，CLDN18.2的存在或表达水平通过免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光(IF)、酶免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)或免疫印迹来测定。
在某些实施方式中，所述表达水平基于所述样品中阳性染色细胞的百分比进行定量。在某些实施方式中，所述表达水平基于所述样品中CLDN18.2的染色强度进行定量。
在某些实施方式中，所述CLDN18.2相关疾病或病状为癌症。在某些实施方式中，所述样品包含肿瘤样品。在某些实施方式中，所述肿瘤样品包含肿瘤组织或循环肿瘤细胞。在某些实施方式中，所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。
在某些实施方式中，所述CLDN18.2相关疾病或病状为癌症。在某些实施方式中，所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是胃癌、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、***、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、***癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃癌、***癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合症、肉瘤、畸胎瘤、胆管癌和/或腺癌。
在某些实施方式中，所述癌症为胃癌、胰腺癌、胆管癌或肺癌。在某些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌或小细胞肺癌(NSCLC或SCLC)。
在某些实施方式中，所述CLDN18.2靶向剂能够诱导对表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性。在某些实施方式中，所述CLDN18.2靶向剂为治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子、靶向CLDN18.2的细胞疗法、靶向CLDN18.2的化合物或靶向CLDN18.2的治疗性核酸。
在某些实施方式中，所述治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子与细胞毒性剂缀合。在某些实施方式中，所述治疗性抗CLDN18.2抗体为双特异性抗体。在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的细胞疗法包括嵌合抗体受体工程改造T细胞(CAR-T)、基因修饰TCRT细胞(TCR-T)或表达结合CLDN18.2的嵌合抗体受体(CAR)的嵌合抗体受体工程改造NK细胞(CAR-NK)。
在某些实施方式中，所述受试者正在接受或已经接受抗癌疗法，或罹患癌症复发。
在又一方面，本公开提供一种试剂盒，其包含本文所提供的分离的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于检测与CLDN18.2结合的所述抗体或其抗原结合片段的复合物的试剂集合。在某些实施方式中，所述试剂集合包含抗小鼠抗体。
附图说明
图1示出了抗CLDN18.2抗体69H2F7E6、14G11G2D2与HEK293-hCLDN18.2细胞和HEK293-hCLDN18.1细胞结合的FACS分析。抗体18B10D3G9F3和EPR19202用作阳性对照物。
图2示出了在HEK293、HEK293-CLDN18.1、HEK293-CLDN18.2细胞块切片(cellblocksection)上筛选的抗体69H2和14G11的免疫细胞化学(ICC)染色。抗体GC182的染色用作对照。
图3示出了抗CLDN18.2抗体69H2F7E6、14G11G2D2和GC182与hCLDN18.2肽(hCLDN18.2的氨基酸残基28-37)结合的结合特性和EC50。
图4示出了如通过ELISA所测量的，抗CLDN18.2抗体69H2F7E6、14G11G2D2和GC182与重组hCLDN18.2变异蛋白的结合特性和EC50，所述重组hCLDN18.2变异蛋白包含hCLDN18.2的ECL1环的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图5示出了如通过ELISA所测量的，抗CLDN18.2抗体69H2F7E6、14G11G2D2和GC182与重组hCLDN18.1变异蛋白的结合特性和EC50，所述重组hCLDN18.1变异蛋白包含hCLDN18.1的ECL1环的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图6示出了如ForteBio进行的，抗CLDN18.2抗体69H2F7E6、14G11G2D2、GC182与重组hCLDN18.2变异蛋白的结合亲和力分析。示出了KD、kon和koff。
图7A和7B分别示出了在***固定的石蜡包埋(FFPE)的正常胃、肺、肠、肾、扁桃体、甲状腺、***和骨骼肌组织切片上的所选择的抗体14G11G2D2、69H2F7E6和GC182的免疫组织化学(IHC)分析。箭头示出了正常肺组织上GC182的阳性染色。
图8示出了胃和骨骼肌上抗CLDN18.2抗体14G11G2D2和EPR19202的IHC图像。EPR19202在胃组织和骨骼肌上都呈阳性染色，而14G11G2D2仅在胃组织上呈阳性染色。
图9示出了具有强(+++)、中(++)、弱(+)和阴性(-)染色强度的胃癌、胰腺癌、胆管癌和非小细胞肺癌(NSCLC)的各种组织上的14G11G2D2抗体的代表性IHC图像。
图10示出了在胃切片上抗体14G11G2D2与抗体缀合物14G11G2D2-生物素之间的IHC染色比较。
图11示出了本申请中的所有序列。
具体实施方式
以下对本公开的描述仅用于说明本公开的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。所属领域的技术人员可显而易见地，在不脱离本公开范围的情况下得到各种等效物、进行改变和修饰，且应理解所述等效实施方式也将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
如在本申请中所使用的，除非本申请中另外说明或与上下文明显矛盾，否则在本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)所用的术语“一(a/an)”、“所述(the)”和类似术语应解释为涵盖单数和复数。
如在本申请中所使用的，术语“抗体”包含与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)和第一、第二和第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的主干由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包含单条重链的可变区和第一恒定区，其与单条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3)。本申请所公开的抗体和抗原结合域的CDR边界可由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani惯例来定义或鉴别(Al-Lazikani，B.，Chothia，C.，Lesk，A.M.，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，273(4)，927(1997)；Chothia，C.等人，《分子生物学杂志》12月5日；186(3)：651-63(1985)；Chothia，C.和Lesk，A.M.，《分子生物学杂志》，196，901(1987)；N.R.Whitelegg等人，《蛋白质工程(ProteinEngineering)》，v13(12)，819-824(2000)；Chothia，C.等人，《自然(Nature)》.12月21-28日；342(6252)：877-83(1989)；Kabat E.A.等人，美国国家卫生研究院(NationalInstitutes ofHealth)，Bethesda，Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc等人，《发展与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》，27：55-77(2003)；Marie-PauleLefranc等人，《免疫组学研究(Immunome Research)》，1(3)，(2005)；Marie-PauleLefranc，《B细胞分子生物学(第二版)(Molecular Biology of B cells(secondedition))》，第26章，481-514，(2015))。三个CDR***于称为框架区(FR)的侧翼片段之间，框架区比CDR更高度保守，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不涉及抗原结合，但展现出各种效应子功能。基于重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别以α、δ、ε、γ和μ重链的存在为特征。将若干主要抗体类别划分为子类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。本公开包含如本申请所述的所有抗体和抗体衍生物，其出于本发明的目的由术语“抗体”涵盖。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一药剂的缀合物、抗体片段或包含抗体或抗体片段的融合蛋白。
如在本申请中所使用的，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个CDR的抗体片段，或任何其它与抗原结合但不包含完整的天然抗体结构的抗体部分形成的抗体片段。抗原结合片段的实例包含但不限于双功能抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体片段、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可包含来自特定抗体的一个或多个CDR。
关于抗体的“Fab”是指抗体的单价抗原结合片段，其由经二硫键连接到单条重链的可变区和第一恒定区的单条轻链(可变区和恒定区)组成。Fab可以通过木瓜蛋白酶消化抗体铰链区重链之间的二硫键的N端附近残基而获得。
“Fab′”是指包含铰链区的一部分的Fab片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体铰链区重链之间的二硫键的C端附近残基而获得，且因此在铰链区中的少量残基(包含一个或多个半胱氨酸)与Fab不同。
“F(ab′)2”是指Fab′的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
关于抗体的“Fc”是指抗体部分，其由经二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合的第一重链的第二和第三恒定区组成。IgG和IgM Fc区含有三个重链恒定区(每条链中的第二、第三和第四重链恒定区)。其可以通过木瓜蛋白酶消化抗体获得。抗体的Fc部分负责各种效应子功能，例如ADCC、ADCP和CDC，但不在抗原结合中起作用。
关于抗体的“Fv”是指带有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由与单条重链的可变区结合的单条轻链的可变区组成。“dsFv”是指二硫键稳定化的Fv片段，其中在单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的键联是二硫键。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指工程改造的抗体，其由轻链可变区和重链可变区直接或通过肽连接子序列彼此连接而组成(Huston JS等人《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》，85：5879(1988))。“scFv二聚体”是指具有连接子的包含两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体或二价scFv(BsFv)，其包含VH-VL(由肽连接子连接)与另一VH-VL部分二聚，使得一个部分的VH与另一部分的VL配位并形成可靶向同一抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包含与VL1-VH2(也由肽连接子连接)结合的VH1-VL2(由肽连接子连接)，使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指工程改造的抗体，其由连接至抗体Fc区的scFv组成。
“骆驼化单域抗体”、“重链抗体”、“纳米抗体”或“HCAb”是指含有两个VH域且不含轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》.12月10日；231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.，《生物技术杂志(J Biotechnol)》.6月；74(4)：277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初是从骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰驼和美洲驼)获得的。虽然不含轻链，但骆驼化抗体具有可靠的抗原结合组库(Hamers-Casterman C.等人，《自然》6月3日；363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等人，《骆驼科重链抗体：进化创新案例(Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation)》，《免疫遗传学(Immunogenetics)》.4月；54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等人，《免疫学(Immunology)》.5月；109(1)：93-101(2003))。重链抗体的可变域(VHH域)代表由后天免疫反应产生的已知最小的抗原结合单元(Koch-Nolte F.等人，《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J)》.11月；21(13)：3490-8.Epub.2007年6月15日(2007))。
“双功能抗体”包含具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在单条多肽链中与VL域连接的VH域(VH-VL或VL-VH)(参见例如Holliger P.等人，《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14)：6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。因为连接子太短，所以同一条链上的两个域无法配对，因此，迫使所述域与另一条链的互补域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可靶向相同或不同的抗原(或表位)。
“域抗体”是指仅含重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些实施方式中，两个或更多个VH域通过肽连接子共价接合以形成二价或多价域抗体。二价域抗体的两个VH域可靶向相同或不同的抗原。
“(dsFv)2”是指包含三条肽链的二硫键稳定化的Fv片段：两个VH部分由肽连接子连接，并通过二硫桥键与两个VL部分结合。
“双特异性ds双功能抗体”是指靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。其可包含通过VH1与VL1之间的二硫桥键与VL1-VH2(通过肽连接子连接)结合的VH1-VL2(也通过肽连接子连接)。
“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”是指靶向两种不同抗原(或表位)的二硫键稳定化的Fv片段。其可以包含三条肽链：VH1-VH2部分，其中重链通过肽连接子(例如长柔性连接子)结合并且通过二硫桥键分别与VL1和VL2部分配对。每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如在本申请中所使用的，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包含来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，和当适用时，来源于人的恒定区。
如在本申请中所使用的，术语“嵌合”意指重链和/或轻链的一部分来源于一个物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一说明性实例中，嵌合抗体可以包含来源于人的恒定区和来源于非人物种(如小鼠)的可变区。
如在本申请中所使用的，“抗CLDN18.2抗体”或“针对CLDN18.2的抗体”意指能够以足够亲和力与CLDN18.2特异性结合(例如人CLDN18.2或非人CLDN18.2)的抗体，可以用于例如诊断和/或治疗用途。
如在本申请中所使用的，术语“亲和力”意指免疫球蛋白分子(即抗体)或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。
如在本申请中所使用的，术语“特异性结合(specific binding/specificallybinds)”或“结合特异性”意指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大对应性之后，与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列中的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的进行的比对可例如使用以下可公开获得的工具实现，如BLASTN、BLASTp(可见于美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information；NCBI)的网站，另外参见Altschul S.F.等人，《分子生物学杂志》，215：403-410(1990)；Stephen F.等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，25：3389-3402(1997))、ClustalW2(可见于欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)网站，另外参见Higgins D.G.等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，266：383-402(1996)；Larkin M.A.等人，《生物信息学(Bioinformatics)》(英格兰牛津(Oxford，England))，23(21)：2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可使用所述工具所提供的默认参数，或可例如通过选择适合的算法来自定义适于比对的参数。
如在本申请中所使用的，术语“氨基酸”意指含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每种氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸的名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，其概述如下。
Figure BDA0003979514590000141
Figure BDA0003979514590000151
与氨基酸序列有关的“保守取代”是指用具有类似物理化学特性侧链的不同氨基酸残基来置换氨基酸残基。举例来说，可在具有疏水性侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水性侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的残基(例如Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的残基(例如Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如所属领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。
“分离”的物质已通过人工方式自天然状态改变。如果“分离”的组合物或物质存在于自然界中，则所述组合物或物质已经从其原始环境改变或从其原始环境移出，或这两种情况都有。例如，天然地存在于活动物体内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但如果相同多核苷酸或多肽与其天然状态的共存材料充分地分离，由此以实质上纯的状态存在，那么所述多核苷酸或多肽是“分离”的。分离的“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，且是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指如通过电泳法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱法(如离子交换色谱或反相HPLC)所测定，纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段。
术语“受试者”包含人和非人动物。非人动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)、猫、兔、羊、犬、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在更优选实施方式中，受试者为人。除指出的以外，术语“患者”、“受试者”和“个体”在本申请中可互换地使用。
如在本申请中所使用的，“效应子功能”是指由抗体Fc区与其效应子，如C1复合物和Fc受体结合引起的生物活性。示例性效应子功能包含：由抗体与C1复合物上的C1q的相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；由抗体Fc区与效应细胞上的Fc受体的结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上结合的抗体并且随后引起所述目标细胞的吞噬。效应子功能包含在抗原结合之后起作用的功能和独立于抗原结合起作用的功能。
如在本申请中所使用的，病状的“治疗(treating/treatment)”或“疗法”包含预防或减轻病状，减缓病状的发作或发展速率，降低罹患病状的风险，预防或延迟与病状相关的症状的发展，减少或结束与病状相关的症状，产生病状的完全或部分消退，治愈病状或其某一组合。
“具有风险”意指被鉴别为与一般群体相比，具有高于正常的罹患疾病，尤其癌症机率的受试者，即患者。此外，曾患有或当前患有疾病，尤其癌症的受试者为罹患疾病的风险增加的受试者，由此所述受试者可能继续罹患疾病。当前患有或曾患有癌症的受试者还具有增加的癌转移风险。在本发明的上下文中，例如“保护”、“预防(prevent/prophylactic)”的术语涉及预防或治疗或预防并治疗受试者中疾病的发生和/或传播，并且尤其是，涉及使受试者将罹患疾病的机率最小化或延迟疾病的发展。举例来说，存在患肿瘤风险(如上文所描述)的人会是肿瘤预防疗法的候选者。免疫疗法可以使用多种技术中的任一种进行，其中药剂用以从患者中去除抗原表达细胞。
如在本申请中所描述的“标准治疗”疗法包含给予患者标准治疗疗法。如在本申请中所使用的，“标准治疗”为治疗方法，包含药物或药物的组合、放射疗法(RT)、手术或其它医疗干预，其被执业医生认可为适当的、可接受的和/或广泛用于某一类型的患者、疾病或临床情况。用于不同类型的癌症的标准疗法为所属领域的技术人员众所周知的。举例来说，美国21个主要癌症中心的联盟-美国国家综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork，NCCN)发布了《NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN Clinical Practice Guidelinesin Oncology)》(NCCN
Figure BDA0003979514590000161
)，其提供了多种癌症的标准治疗的详细最新信息(参见NCCN
Figure BDA0003979514590000171
2013)。
关于治疗的术语“有效”和“有效性”包含药理学有效性和生理安全性。药理学有效性是指药物促进患者癌症消退的能力。生理安全性是指由给予药物产生的细胞、器官和/或生物体层面上的毒性或其它不良生理作用(不良作用)的水平。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”的药物或治疗剂(如本公开的抗体)为当单独使用或与另一治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病或病状发作，或促进疾病/病状消退的任何量的药物，所述消退通过疾病/病状症状的严重程度降低、无疾病/病状症状阶段的频率和持续时间增加或预防由疾病/病状病痛引起的障碍或残疾来证明。治疗剂促进疾病消退的能力可以使用熟练的从业者已知的多种方法来评价，例如在临床试验期间在人受试者中、在可预测人体中功效的动物模型***中或通过在体外分析中分析药剂的活性来评价。治疗有效量的药物包含“预防有效量”，其为当单独给予或与抗赘生剂组合给予存在罹患CLDN18.2相关疾病或病状(如癌症)的风险(例如患有癌前病状的受试者)或存在疾病/病状复发的风险的受试者时，抑制疾病/病状的发展或复发的任何量的药物。在优选实施方式中，预防有效量完全预防CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)的发展或复发。“抑制”疾病/病状(例如癌症)的发展或复发意指减小疾病/病状发展或复发的可能性，或完全预防疾病/病状的发展或复发。
如在本申请中所使用的，术语“载体”是指一种运载体，可将遗传元件可操作地***其中，以实现所述遗传元件的表达，从而产生由所述遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA，或复制所述遗传元件。
如在本申请中所使用的，“宿主细胞”是指已将外源多核苷酸和/或载体引入其中的细胞。
术语“CLDN18”是指密封蛋白18(claudin 18)并且包含CLDN18的任何剪接变异体，如CLDN18.1和CLDN18.2。CLDN18.1和CLDN18.2在包含第一跨膜(TM)区和环1的N端部分不同，而C端的主要蛋白质序列相同。
术语“CLDN18.2”是指来源于哺乳动物(如灵长类动物(例如人、猴)和啮齿动物(例如小鼠))的密封蛋白-18(Claudin-18)剪接变异体2。在某些实施方式中，CLDN18.2为人CLDN18.2。人CLDN18.2的示例性序列包括人CLDN18.2蛋白质(NCBI参考序列号NP_001002026.1或SEQ ID NO：20)。CLDN18.2的示例性序列包括小家鼠(小鼠)CLDN18.2蛋白质(NCBI参考序列号NP_001181852.1)，食蟹猕猴(Macaca fascicularis/crab-eatingmacaque)CLDN18.2蛋白质(NCBI参考序列号XP_015300615.1)。
术语“CLDN18.1”是指来源于哺乳动物(如灵长类动物(例如人、猴)和啮齿动物(例如小鼠))的密封蛋白-18(Claudin-18)剪接变异体1。在某些实施方式中，CLDN18.1为人CLDN18.1。人CLDN18.1的示例性序列包括人CLDN18.1蛋白质(NCBI参考序列号NP_057453.1或SEQ ID NO：21)，小家鼠(小鼠)CLDN18.2蛋白质(NCBI参考序列号NP_001181851.1)，食蟹猕猴(Macaca fascicularis/crab-eating macaque)CLDN18.2蛋白质(NCBI参考序列号XP_005545920.1)。
术语“CLDN18.2”和“CLDN18.2”还涵盖示例性序列的变异体，例如突变体、构象变异体、同功异构物、等位基因变异体、物种变异体和物种同源物，尤其是天然存在的那些。
如在本申请中所使用的，“CLDN18.2相关疾病或病状”是指由CLDN18.2的表达或活性增加或降低所引起、加剧或以其它方式与其有关的任何疾病或病状。在一些实施方式中，CLDN18.2相关病状为例如癌症。
如在本申请中所使用的，“癌症”是指特征在于恶性细胞生长或赘瘤、异常增殖、浸润或转移的任何医学病状，并且包含实体肿瘤和非实体癌症(例如恶性血液病)，如白血病。
如在本申请中所使用的，“实体肿瘤”是指赘生性和/或恶性细胞的实体块。
术语“药学上可接受”指示，指定载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成制剂的其它成分相容，且在生理上与其接受者相容。
如在本申请中所使用的，术语“转移”或“转移性癌症”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移形成是极复杂的过程，且依赖于恶性细胞从原发性肿瘤脱离、侵袭胞外基质、穿透内皮基底膜进入体腔和血管，且随后在由血液运输之后，浸润目标器官。最后，目标部位处新肿瘤(即继发性肿瘤或转移性肿瘤)的生长依赖于血管生成。肿瘤转移甚至在去除原发性肿瘤之后也常常发生，因为肿瘤细胞或组分可保持且产生转移潜能。在一个实施方式中，根据本发明的术语“转移”涉及与远离原发性肿瘤和局部******的转移有关的“远端转移”。继发性肿瘤或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞相同。这意味着例如，如果胃癌转移到肝，那么继发性肿瘤由异常胃细胞，而非异常肝细胞构成。因此将肝中的肿瘤称为转移性胃癌，而非肝癌。
如本申请中提及的“约”一值或参数包含(并描述)针对该值或参数本身的实施方式。举例来说，提到“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包含界定所述范围的数值。一般来说，术语“约”是指变量的指示值和在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内(以较大者为准)的所有值。在时间段(年、月、周、日等)的上下文使用术语“约”时，术语“约”意指时间段加上或减去下一下级时间段的一个量(例如，约1年是指11-13个月；约6个月是指6个月加上或减去1周；约1周是指6-8天等)，或在指示值的10％以内，以较大者为准。
抗CLDN18.2抗体
本公开提供抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段。
CLDN18.2是密封蛋白-18(CLDN18)的剪接变异体。CLDN18是四次穿膜蛋白家族的成员并且具有4个疏水区。CLDN18呈现数种不同构象，可以通过抗体选择性地针对所述不同构象(参见Sahin U等人《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》，2008，14(23)：7624-7634)。如针对绝大部分CLDN家族成员所描述，CLDN18-构象-1具有充当跨膜域(TM)的所有四个疏水区，并且具有两个胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围；环2被疏水区3和疏水区4包围)。第二构象(CLDN18-构象-2)表明如针对PMP22所描述，第二和第三疏水域并不完全穿过质膜，使得第一和第四跨膜域之间的部分(环D3)为胞外的。第三构象(CLDN18-构象-3)示出了具有由第一和第四疏水区包围的两个内部疏水区的大型胞外域。由于环D3中的经典N-糖基化位点，CLDN-18拓扑变异体CLDN18拓扑-2和CLDN18拓扑-3具有额外的胞外N-糖基化位点。
CLDN18具有两种不同剪接变异体，其存在于小鼠和人类中。剪接变异体CLDN18.1和CLDN18.2在包含第一TM和环1的N端处的前21个氨基酸处不同，而C端的蛋白质序列是相同的。尽管这两种同功异构物的氨基酸序列共有92％的同一性，但其表达模式不存在交集，CLDN18.1主要表达于正常肺组织中，CLDN18.2主要表达于正常胃组织中(参见Niimi T等人《分子细胞生物学(Molecular and cellular biology)》，2001，21(21)：7380-7390)。人CLDN18.1和CLDN18.2的氨基酸序列分别示于下文中。
人密封蛋白18.2(登录号：NP_001002026.1)氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：
Figure BDA0003979514590000191
Figure BDA0003979514590000201
人密封蛋白18.1(登录号：NP_057453.1)氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：
Figure BDA0003979514590000202
在正常组织中，CLDN18.2的表达受限于粘膜细胞的基膜且是治疗性抗体不可获取的。在病理性条件(如肿瘤细胞)中，胃粘膜细胞的极性受到干扰并且CLDN18.2暴露于细胞表面上。CLDN18.2蛋白质是在数种人癌症类型(包含胃、食道、胰和肺的肿瘤以及人癌细胞系)的原发性病灶和转移中表达的泛癌症目标(参见Sahin Ugur等人，《临床癌症研究》2008；14(23)；MatsudaY等人《癌症科学(Cancer science)》，2007，98(7)：1014-1019)。多个研究报道了CLDN18.2的异常异位表达出现于胰腺癌、卵巢癌、胆管癌和肺腺癌中(参见例如Karanjawala ZE等人，《美国外科病理学杂志(Am J Surg Pathol.)》2008年2月；32(2)：188-96；Micke P等人，《国际癌杂志(Int J Cancer.)》2014年11月1日；135(9)：2206-14；Keira Y等人，《欧洲病理学杂志(Virchows Arch.)》2015年3月；466(3)：265-77；Coati等人，《英国癌症杂志(Br J Cancer.)》2019年7月；121(3)：257-263；Dottermusch等人，《欧洲病理学杂志》2019年11月；475(5)：563-571；Rohde等人，《日本临床肿瘤学杂志(Jpn J ClinOncol.)》2019年9月1日；49(9)：870-876；Woll等人，《国际癌杂志》2014年2月1日；134(3)：731-9；Espinoza等人，《组织病理学(Histopathology)》.2019年3月；74(4)：597-607；Shinozaki等人，《欧洲病理学杂志》2011年7月；459(1)：73-80)。
在一个方面，本公开提供单克隆抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段。本申请所提供的单克隆抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段能够与CLDN18.2特异性结合(例如人CLDN18.2)、CLDN18.2的片段或包含CLDN18.2的片段的融合多肽。在某些实施方式中，CLDN18.2的片段包含人CLDN18.2的第一胞外环，或人CLDN18.2的第一胞外环内的序列。在某些实施方式中，人CLDN18.2的片段包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，融合多肽包含与CLDN18.2片段的N端和/或C端连接的额外氨基酸残基。在某些实施方式中，融合多肽中所含的CLDN18.2片段形成环。
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段能够与表达CLDN18.2的细胞特异性结合。在某些实施方式中，表达CLDN18.2的细胞为预处理的细胞。如本申请中关于细胞所使用，术语“预处理”意指已经处理细胞以使得其表面蛋白(如CLDN18.2)变性或以其它方式不再呈现其天然构象。举例来说，表达CLDN18.2的细胞可以通过一种或多种化学物质(例如***、石蜡或丙酮)预处理，或通过物理干预(例如冷冻或加热)预处理。在某些实施方式中，表达CLDN18.2的细胞为***固定的石蜡包埋(FFPE)的细胞。
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段与抗原的结合可表示为“半最大效应浓度”(EC50)值，这是指观察到50％其最大作用(例如结合)时抗体的浓度。EC50值可以通过所属领域中已知的方法，例如夹心分析，如ELISA、蛋白质印迹(Westem Blot)和其它结合分析来测量。EC50可以在适当的结合分析中测量，其中检测抗体的连续稀释液与抗原的结合，并且测定50％最大结合的浓度。在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与人CLDN18.2、人CLDN18.2的片段、包含人CLDN18.2的片段的融合多肽、表达人CLDN18.2的细胞或经预处理的表达人CLDN18.2的细胞特异性地结合。在某些实施方式中，如通过ELISA所测量的，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段以不超过50ng/ml(例如不超过40ng/ml、不超过35ng/ml、不超过30ng/ml、不超过20ng/m1、不超过18ng/ml、不超过16ng/ml、不超过15ng/ml、不超过14ng/ml、不超过13ng/ml、不超过12ng/m1)的EC50与包含人CLDN18.2的第一胞外环的融合多肽特异性结合。
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段与人CLDN18.2的结合亲和力还可以例如通过KD来表征，KD是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。KD可通过使用所属领域中已知的任何常规方法确定，所述方法包含但不限于表面等离子共振(SPR)法、微量热泳法和HPLC-MS法。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段如SPR所测量的，以不超过10-6M(例如不超过10-7M、10-7.5M、10-8M或10-8.5M)的KD与包含人CLDN18.2的第一胞外环的融合多肽结合。KD值越低，亲和力越高。
在某些实施方式中，抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段不与人CLDN18.1交叉反应。“不与人CLDN18.1交叉反应”或“与人CLDN18.1不具有交叉反应性”的抗CLDN18.2抗体为在针对人CLDN18.2的检测分析(例如IHC分析)中不产生非所需结果，如假阳性的抗体。在某些实施方式中，在检测分析(例如IHC分析或流式细胞分析)中不可检测到与人CLDN18.1的结合。结合水平可以确定为在给定浓度的抗体和给定浓度的抗原下形成的抗原-抗体复合物的含量。在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和其抗原结合片段以低于(例如，低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)抗体GC182与人CLDN18.1的结合的水平或亲和力与人CLDN18.1结合。
在某些实施方式中，在IHC分析中检测到不超过5％、4％、3％、2％、1％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％的表达人CLDN18.1的细胞对本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段呈阳性。在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段在IHC分析中不表现出可检测的与人CLDN18.1的结合。在某些实施方式中，在非癌人肺组织样品中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段在IHC分析中不表现出可检测的与人CLDN18.1的结合。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段如通过ELISA所测量的在1nM的抗体浓度下，或如通过IHC所测量在0.5μg/ml的抗体浓度下，与***固定的石蜡包埋(FFPE)样品中的人CLDN18.1不具有交叉反应性。IHC可以根据如实施例8或9中所概述的程序和条件进行。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段除了胃上皮细胞以外，与非癌细胞不具有交叉反应性。在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段与非癌人组织(如肺组织、肠组织、肾组织、扁桃体组织、甲状腺组织、骨骼肌组织或***组织)不具有交叉反应性。这将本申请所提供的抗体与现有单克隆抗CLDN18.2抗体区分开来。举例来说，抗体43-14A显示出与人CLDN18.1的结合，且因此显示出与非癌人肺组织的交叉反应性，参见Ventana说明书的IHC结果(参见VentanaCLDN18(43-14A)分析，参考790-7027，08504148001)。再举例来说，还发现抗体GC182与CLDN18.1交叉反应，并且因此将非癌人肺组织染色(参见本公开的实施例4和图2)。再举例来说，抗CLDN18.2抗体EPR19202(可从Abcam购得，产品名ab222512)显示出与骨骼肌组织非特异性结合，并且因此显示出与非癌骨骼肌组织的交叉反应性。
示例性抗CLDN18.2抗体
在某些实施方式中，本公开提供与CLDN18.2特异性结合(例如人CLDN18.2)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含X1X2YX3H(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列，重链CDR2，其包含WIYPX4GX5X6X7X8YX9EKFKG(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列，和/或重链CDR3，其包含NYX10STFGY(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列；和/或
b)轻链CDR1，其包含RSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含KX11SNRFS(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列，和/或轻链CDR3，其包含FQGSHVPFT(SEQ IDNO：6)的氨基酸序列；
其中X1为R或T，X2为N或Y，X3为F或I，X4为G或R，X5为F或G，X6为D或N，X7为I或T，X8为E或V，X9为S或N，X10为G或R且X11为V或I。
在某些实施方式中，本公开提供与CLDN18.2特异性结合(例如人CLDN18.2)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR，其选自由SEQ IDNO：1-6组成的序列集合或选自由SEQ ID NO：2、6、7和9-11组成的序列集合。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段包含SEQ IDNO：5或11的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并且因此被认为与抗原接触最多，并为抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。另外，根据多种多样化机制，认为就长度、氨基酸组成和构象来说，重链CDR3是迄今为止抗原结合位点最多样化的CDR(Tonegawa S.《自然》302：575-81(1983))。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL，Davis MM.《免疫(Immunity)》13：37-45(2000))以及所需的抗原结合亲和力(Schier R等《分子生物学杂志》263：551-67(1996))。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段包含：重链CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7，和/或重链CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9，和/或重链CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11；和/或轻链CDR1，其包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和/或轻链CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10，和/或轻链CDR3，其包含选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供一种与CLDN18.2特异性结合(例如人CLDN18.2)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
b)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7，重链CDR2序列，其包含SEQ ID NO：9，和重链CDR3序列，其包含SEQ ID NO：11。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
b)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列；或
b)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
己知CDR负责抗原结合，然而，已发现并非所有6个CDR都一定是必不可少的或不可改变的。换句话说，有可能置换或改变或修饰以上提供的1、2或3个CDR(例如对应于SEQ IDNO：1-6或SEQ ID NO：2、6、7和9-11中的任一个)，但实质上仍保持与CLDN18.2的特异性结合亲和力。具有所述经修饰或变异CDR的抗体也涵盖于本公开中。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列；或
b)重链可变区，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列。
如本申请所使用的，抗体“14G11”是指具有SEQ ID NO：13的重链可变区和SEQ IDNO：14的轻链可变区的小鼠抗体。
如本申请所使用的，抗体“69H2”是指具有SEQ ID NO：15的重链可变区和SEQ IDNO：16的轻链可变区的小鼠抗体。
表1示出了抗CLDN18.2抗体14G11和69H2的CDR序列。重链和轻链可变区序列还提供于如下表2中。
表1.CLDN18.2抗体的CDR区的序列
Figure BDA0003979514590000251
表2.小鼠/重组抗体VH/VL区的序列
Figure BDA0003979514590000252
在某些实施方式中，本申请提供的抗体及其抗原结合片段包含适合的框架区(FR)序列，只要抗体及其抗原结合片段可以与CLDN18.2(例如人CLDN18.2)特异性地结合即可。表1中所提供的CDR序列获自小鼠抗体，但其可使用所属领域中已知的适合的方法(如重组技术)与任何适合的物种(尤其如小鼠、人、大鼠、兔)的任何适合的FR序列嫁接。FR序列可由所属领域的技术人员基于以上表1中的CDR序列和以上表2中的可变区序列容易地鉴别，因为所属领域周知，可变区中CDR区由两个FR区侧接。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。恒定区任选地包含IgG的重链恒定区和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其片段进一步包含小鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段包含小鼠IgG1同种型的恒定区。在某些实施方式中，小鼠IgG1的重链恒定区包含SEQ ID NO：17或与其具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或小鼠IgG1的轻链恒定区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列。
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体、融合蛋白、二聚化抗体或多聚化抗体，或经修饰抗体(例如糖基化抗体)。重组抗体为使用重组方法在体外而非在动物中制备的抗体。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是二价、四价、六价或多价的。任何大于二价的分子被视为多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
在一些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段包含全部或一部分重链可变域和/或全部或一部分轻链可变域。在一个实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段为由全部或一部分本申请提供的重链可变域组成的单域抗体。所述单域抗体的更多信息可在所属领域中获得(参见例如美国专利第6,248,516号)。
抗体变异体
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段还涵盖各种类型的抗体14G11和69H2变异体。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含以上表1所提供的一个或多个CDR序列中的一个或多个突变，以上表2所提供的重链可变区或轻链可变区中一个或多个非CDR序列的一个或多个突变，和/或如SEQ ID NO：17或18所示的恒定区(例如Fc区)序列中的一个或多个突变，但仍保持对CLDN18.2的结合特异性，确切地说，对人CLDN18.2的结合特异性，或更确切地说，对SEQ ID NO：19的氨基酸序列内的表位的结合特异性。这些也被称作抗体14G11和69H2的变异体或抗原结合片段的变异体。在某些实施方式中，变异体以类似于或甚至高于其亲本抗体(例如抗体14G11或69H2)的水平保持结合亲和力。如本申请所使用的，“突变(mutation/mutated)”包含氨基酸序列或多核苷酸序列中的取代、***和/或缺失。在某些实施方式中，至少一个(或所有)突变包含保守取代。
在某些实施方式中，抗体变异体在抗体14G11和69H2的CDR序列中、FR序列中或可变区序列中总共包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在某些实施方式中，抗体变异体包含1、2或3个与表1中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的CDR序列，且所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体(例如抗体14G11或69H2)水平的结合亲和力。
在某些实施方式中，抗体变异体包含与SEQ ID NO：13或15的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的重链可变区序列，和/或与SEQ ID NO：14或16的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的轻链可变区序列，且所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体(例如抗体14G11或69H2)水平的结合亲和力。在一些实施方式中，总共1-10个氨基酸残基已经在选自SEQ ID NO：13-16的序列中突变。在一些实施方式中，突变发生于CDR外的区域中(即，FR中)。在一些实施方式中，一个或多个突变为保守取代。在一些实施方式中，所有突变为保守取代。
在某些实施方式中，本公开提供抗体14G11或69H2的变异体，其中所述变异体包含：
a)重链CDR1(HCDR1)序列，其与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
b)重链CDR2(HCDR2)序列，其与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
c)重链CDR3(HCDR3)序列，其与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
d)轻链CDR1(LCDR1)序列，其与SEQ ID NO：2具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
e)轻链CDR2(LCDR2)序列，其与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
f)轻链CDR3(LCDR3)序列，其与SEQ ID NO：6具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和
所述变异体在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体(例如抗体14G11或69H2)水平的结合亲和力。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗体变异体包含：HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和/或LCDR3，其中HCDR1在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，HCDR2在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，HCDR3在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，LCDR1在SEQ ID NO：2中具有不超过2或1个氨基酸突变，LCDR2在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，LCDR3在SEQ ID NO：6中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，且所述抗体变异体在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体(例如抗体14G11或69H2)水平的结合亲和力。在一些实施方式中，一个或多个突变为保守取代。在一些实施方式中，所有突变为保守取代。
在某些实施方式中，本申请所提供的抗体变异体保持其亲本抗体的CLDN18.2特异性结合特异性，但具有由一个或多个突变赋予的一种或多种所需特性。举例来说，抗体变异体可以具有提高的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基、降低或耗乏的一种或多种效应子功能、pH依赖性方式改进的FcRn受体结合、增加的药物动力学半衰期、pH敏感性和/或缀合相容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。所述变异体也被称为亲和力变异体、糖基化变异体、半胱氨酸变异体、Fc变异体等，其更详细描述如下。
a)亲和力变异体
亲和力变异体可以在一个或多个如以上表1中所提供的CDR序列、一个或多个本申请所提供的框架(FR)序列或以上表2中所提供的重链或轻链可变区序列中含有修饰或取代。
亲和力变异体保持亲本抗体的CLDN18.2特异性结合亲和力，或甚至具有优于亲本抗体的提高的CLDN18.2特异性结合亲和力。所属领域中已知的各种方法可用于实现此目的。举例来说，可以产生抗体变异体(如Fab或scFv变异体)库并且用噬菌体展示技术表达，随后针对人CLDN18.2的结合亲和力进行筛选。再举例来说，可以使用计算机软件虚拟模拟抗体与人CLDN18.2的结合，并且鉴别形成结合界面的抗体上的氨基酸残基。所述残基可以在突变中避免以防止结合亲和力降低，或靶向突变以提供更强的结合。
b)糖基化变异体
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变异体，其可以获得以增加或降低抗体或其抗原结合片段的糖基化程度。
抗体或其抗原结合片段可以包含引入或去除糖基化位点的一种或多种修饰。糖基化位点是侧链可与碳水化合物部分(例如寡糖结构)连接的氨基酸残基。抗体的糖基化通常是N-连接型或O-连接型。N-连接型是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如三肽序列，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)的侧链的连接。O-连接型糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见地与丝氨酸或苏氨酸的连接。天然糖基化位点的去除可方便地实现，例如通过改变氨基酸序列以使得上文所描述的三肽序列中的一个(对于N-连接型糖基化位点)或序列中存在的丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接型糖基化位点)被取代来实现。可以类似方式，通过引入所述三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基来产生新的糖基化位点。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段包含在N297(例如N297A、N297Q或N297G)的突变以去除糖基化位点。
c)半胱氨酸工程改造的变异体
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程改造的变异体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基为不是二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程改造的变异体适用于在工程改造的半胱氨酸位点处，通过例如顺丁烯二酰亚胺或卤代乙酰基与尤其例如细胞毒性和/或成像化合物、标记或放射性同位素缀合。用于工程改造抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是所属领域中已知的，参见例如WO2006/034488。
d)Fc变异体
本申请所提供的抗CLDN18.2抗体和抗原结合片段还涵盖Fc变异体，其在其Fc区和/或铰链区处包含一个或多个氨基酸残基修饰或取代，例如以提供改变的效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc变异体的实例为所属领域中已知的，参见例如Wang等人，《蛋白质与细胞(ProteinCell)》2018，9(1)：63-73和Kang等人，《实验和分子医学(Exp&Mol.，Med.)》(2019)51：138，其全文并入本文中。
抗原结合片段
本申请还提供抗CLDN18.2抗原结合片段。在一些实施方式中，本申请提供的抗体和抗原结合片段包含全部或一部分重链可变域和/或全部或一部分轻链可变域。各种类型的抗原结合片段是所属领域中已知的，并且可以基于本申请提供的抗CLDN18.2抗体产生，所述抗体包含例如CDR序列如表1所示的示例性抗体和其不同变异体(如亲和力变异体、糖基化变异体、Fc变异体、半胱氨酸工程改造的变异体等)。
在某些实施方式中，本申请提供的抗CLDN18.2抗原结合片段为双功能抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体或二价域抗体。
各种技术可用于产生所述抗原结合片段。说明性方法包含酶消化完整抗体(参见例如Morimoto等人，《生物化学与生物物理学方法杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)》24：107-117(1992)；和Brennan等人，《科学(Science)》，229：81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌(E.Coli))重组表达(例如对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上所述从噬菌体展示库筛选(例如对于ScFv)和将两个Fab′-SH片段化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等人，《生物技术(Bio/Technology)》10：163-167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练技术人员将是显而易见的。
表位
在某些实施方式中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与DQWSTQDLYN(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列内的表位结合。
如本申请所使用的，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。表位可以是构象表位或线性表位。在本公开的某些实施方式中，由本申请所提供的抗CLDN18.2抗体结合的表位是线性的。所属领域的技术人员将认识到，有可能在无过度实验的情况下，通过确定一抗体与本公开抗体(例如杂交瘤/小鼠抗体14G11和69H2)是否竞争结合CLDN18.2抗原多肽，来确定所述抗体是否与本公开抗体结合相同或重叠或邻近的表位。
本公开提供针对位于CLDN18.2的N端部分内的某一表位的单克隆抗体，其适用于检测和鉴定表达CLDN18.2的细胞，而不与CLDN18.1交叉反应。根据人CLDN18.1和CLDN18.2的序列，氨基酸28-70(即，包含第一跨膜(TM)区和环1的N端部分)之间存在8个不同氨基酸，而人CLDN18.1和CLDN18.2的C端序列相同。位于人CLDN18.2的N端中的线性表位(第一胞外域中的氨基酸28-37，即SEQ ID NO：19)已由Sahin U等人报道(参见Sahin Ugur等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》2008；14(23)2008年12月1日)。然而，到目前为止，未报道有针对所述肽片段的单克隆抗体，并且就本发明人所知，本公开是首次提供与SEQ ID NO：19的肽片段结合的单克隆抗体。
在另一方面，本公开提供与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段(如14G11和69H2)竞争结合CLDN18.2的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本申请所使用的，术语“竞争结合”关于两种抗原结合蛋白(例如抗体)，意指一种抗原结合蛋白将另一蛋白与抗原(例如人CLDN18.2)的结合阻断或降低到任何可检测的程度，如通过竞争性结合分析所测定。竞争性结合分析是所属领域所周知的，包含例如直接或间接放射免疫分析(RIA)、直接或间接酶免疫分析(EIA)和夹心竞争分析(参见例如Stahli等人，1983，《酶学方法(Methods in Enzymology)》9：242-253)。通常，所述分析涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或带有抗原的细胞、未标记的测试抗体和标记的参考抗体。竞争性抑制通过确定在测试抗体存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常测试抗体过量存在。如果两种抗体竞争结合CLDN18.2，那么两种抗体与同一或重叠表位结合，或者与相邻表位结合，而该相邻表位足够接近于另一抗体结合的表位从而得以发生位阻。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将使测试抗体与共同抗原的特异性结合抑制(例如降低)至少50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％或更多。
多核苷酸和重组方法
本公开提供编码抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段的分离的多核苷酸。如本申请所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外说明，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变异体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确说明的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人，《核酸研究》19：5081(1991)；Ohtsuka等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，《分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8：91-98(1994))。
编码单克隆抗体的DNA使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码DNA也可以通过合成方法获得。
本公开提供了包含本申请提供的分离的多核苷酸的载体(例如表达载体)。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因元件在宿主细胞内表达。载体的实例包含质粒、噬菌粒、粘粒和人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包含有助于其进入细胞的材料，包含但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。
在某些实施方式中，本申请所提供的载体为表达载体。在某些实施方式中，本申请所提供的表达载体包含编码本申请所提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、至少一个可操作地与多核苷酸序列连接的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记。
载体的实例包含但不限于逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入宿主细胞中进行克隆或基因表达。用于克隆或表达本申请载体中的DNA的适合宿主细胞是上述原核生物、酵母或更高等真核生物细胞。用于此目的的适合的原核生物包含真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。
除原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)为抗CLDN18.2抗体编码载体的适合克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物体中最常用的。然而，多种其它属、种和菌株是通常可用且本申请适用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁维雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本申请提供的糖基化抗体或抗原片段的适合的宿主细胞来源于多细胞生物体，如无脊椎动物细胞，例如植物和昆虫细胞。已经鉴定出多种杆状病毒株和变异体和相应的来自如下宿主的容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且所述病毒可以根据本发明用作本申请中的病毒，尤其是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，对于脊椎动物细胞的兴趣最大，脊椎动物细胞的培养繁殖(组织培养)已成为常规程序。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚肾系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞；Graham等人，《普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)》36：59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，《美国国家科学院院刊》77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠***肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。在一些优选实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养细胞系，如CHO、BHK、NS0、293和其衍生物。
用上述用于产生抗CLDN18.2抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在按需改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一实施方式中，抗体可通过所属领域中已知的同源重组产生。
用于产生本申请提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等人，《酶学方法》58：44(1979)；Barnes等人，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102：255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的培养基中的任一种都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种都可以视需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以所属领域的技术人员已知的适当浓度包含任何其它必需的补充剂。培养条件，如温度、pH等，是与选择用于表达的宿主细胞一起已经使用过的条件，并且对所属领域的普通技术人员来说将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，那么作为第一步，将微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)例如通过离心或超滤去除。Carter等人，《生物技术》10：163-167(1992)描述了一种用于分离抗体的程序，该抗体分泌到大肠杆菌的周质空间。简单来说，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下经约30分钟解冻。细胞碎片可通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，来自所述表达***的上清液一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元进行浓缩。可在前述任一步骤中包含蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包含抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗CLDN18.2抗体及其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白质A用于进行抗体及其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白质A作为亲和配体的适当性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，《免疫学方法杂志》62：1-13(1983))。建议蛋白质G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》5：15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最通常是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质，如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，可以实现比琼脂糖更快的流动速率和更短的加工时间。当抗体包含CH3域时，BakerbondABXTM树脂(新泽西州菲利普斯堡(Phillipsburg，N.J.)J.T.Baker)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱焦聚、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，取决于待回收的抗体也是可用的。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
本公开提供表达本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达本申请所提供的载体的条件下培养本申请所提供的宿主细胞。
缀合物
在一些实施方式中，抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与一个或多个部分连接或缀合。所述部分的实例包含但不限于治疗剂(例如，DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物)、可检测标记、药物动力学修饰部分(例如，延长半衰期的聚合物，如PEG)或纯化部分(例如磁珠或纳米粒子)。
部分与抗体或其抗原结合片段的连接可以是直接的，或通过连接子的，或通过另一部分的，例如通过共价结合、亲和结合、***、配位结合、复合、缔合、共混或添加以及其它方法。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段通过连接子与一个或多个部分连接。在某些实施方式中，连接子为腙连接子、二硫键连接子、双官能连接子、二肽连接子、葡糖苷酸连接子或硫醚连接子。
在某些实施方式中，本申请提供的抗体或其抗原结合片段可以经工程改造以含有除表位结合部分外的可以用于与一个或多个部分连接的特定位点。举例来说，所述位点可以包含一个或多个反应性氨基酸残基，如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与部分的共价键结。
在一些实施方式中，抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段与一个或多个部分连接，所述部分用以(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测信号，例如荧光共振能量传递(FRET)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或(iv)提供捕获部分，例如亲和力、抗体/抗原或离子复合。
所述部分包含但不限于可通过成像、酶反应等直接检测的标记或部分(如放射性同位素、镧系元素、化学发光标记、发色部分、酶标记、胶体金颗粒和荧光标记)，以及可例如通过分子相互作用间接检测的部分。间接可检测标记的实例包含生物素/亲和素、生物素/抗生蛋白链菌素、地高辛标记、半抗原、用于检测的DNA分子和颗粒标记(顺磁颗粒、金属颗粒标记、磁性颗粒标记和聚合颗粒标记等)。
放射性同位素的实例包含如S、C、I、H和I。抗体可以使用如《免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)》第1卷和第2卷，Coligen等人编，纽约州纽约Wiley-Interscience出版(1991)中所描述的技术用放射性同位素标记，且放射性可使用闪烁计数测量。其它放射性核素包含123I、124I、125I、131I、35S、3H、99Tc、90y、111In、112In、32P、14C、150、13N、18F、86Y、88Y、90Y、51Cr、57To、225Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、64Cu、67Cu、217Ci、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、212pb、47Sc、109pd、234Th、40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
荧光或发光标记包含但不限于稀土螯合剂(铕螯合剂)、荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、丹酰基、伞酮、荧光素、鲁米诺(1uminal)标记、异鲁米诺(isoluminal)标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2，3-二氢酞嗪二酮、德克萨斯红(Texas Red)、丹酰基、丽丝胺(Lissamine)、伞酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白或市售荧光团(如SPECTRUM
Figure BDA0003979514590000371
和SPECTRUM
Figure BDA0003979514590000372
)和/或以上中的任何一个或多个的衍生物。例如，荧光标记可以使用例如同上《免疫学最新方案》中所公开的技术与抗体缀合。荧光可以使用荧光计定量。
另一类型的有用标记为酶-底物标记。多种酶-底物标记是可用的(参见美国专利第4,275,149号)。酶一般催化可以使用各种技术进行测量的发色底物的化学变化。举例来说，酶可以催化底物中的颜色变化，其可以分光光度法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光改变的技术在上文已有描述。化学发光底物通过化学反应变得电子激发，随后可发射可测量(例如使用化学发光计)或将能量供给到荧光接受体的光。
所属领域的技术人员可用许多酶-底物组合(参见美国专利第4,275,149号和第4,318,980号)，如：(i)具有过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前体，例如3，3′二氨基联苯胺(DAB)，其产生棕色最终产物；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，其在氧化后形成玫瑰红色最终产物；4-氯-1-萘酚(CN)，其沉淀为蓝色最终产物；和对苯二胺二盐酸盐/邻苯二酚，其产生蓝黑色产物；邻苯二胺(OPD)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)；(ii)碱性磷酸酶(AP)和对磷酸硝基苯基酯、萘酚AS-MX磷酸酯、固红TR和固蓝BB、萘酚AS-BI磷酸酯、萘酚AS-TR磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸酯(BCIP)、固红LB、固石榴红GBC、硝基蓝四唑(NBT)和碘硝基四唑紫(INT)；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，其具有发色底物(例如，对硝基苯基-P-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基伞形基-P-D-半乳糖苷酶)。
其它适用的酶标记包含荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4,737,456号)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化酶(如辣根过氧化酶(HRPO))、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化酶、微过氧化酶等。将酶与抗体缀合的技术描述于O′Sullivan等人，《制备酶免疫分析中使用的酶-抗体缀合物的方法(Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for usein Enzyme Immunoassay)》，《酶学方法》(J.Langbne和H.Van Vunakis编)，纽约Academic出版社，73：147-166(1981)中。
CLDN18.2的检测和使用方法
本公开提供检测样品中CLDN18.2的存在或表达水平的方法，其包括使所述样品与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2(例如人CLDN18.2)特异性结合的条件下接触，并且测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平。
在另一方面，提供用于诊断受试者的CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；和
b)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，所述受试者被诊断为患有CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)。在某些实施方式中，样品不是胃上皮组织。
在另一方面，提供用于判定患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者用CLDN18.2靶向剂进行治疗的适当性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；和
b)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，判定所述受试者为适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，判定所述受试者为不适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗。
在另一方面，提供预测CLDN18.2靶向剂在受试者中治疗CLDN18.2相关疾病或病状的治疗有效性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
b)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；和
c)预测所述CLDN18.2靶向剂的治疗有效性，
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是有效的，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于所述阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是无效的。
在又一方面，提供治疗患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者的方法，其包括：
a)选择适于所述治疗的受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；和
iii)当发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，选择所述受试者为适于用所述CLDN18.2靶向剂进行治疗；和
b)给予所述选择的受试者治疗有效量的CLDN18.2靶向剂。
在又一方面，提供治疗患有癌症或存在患有癌症风险的受试者的方法，其包括：
a)选择受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；和
iii)当未发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，选择所述受试者为不适于用CLDN18.2靶向剂治疗进行治疗；和
b)给予所述选择的受试者除CLDN18.2靶向剂以外的标准治疗。
根据本发明，“样品”可以是根据本公开适用的任何样品，尤其生物样品，如组织样品，包含体液和/或细胞样品，并且可以用常规方式获得，例如通过组织活检，包含钻取活检，和通过获取血液、支气管抽吸物、痰液、尿液、粪便或其它体液获得。根据本发明，术语“样品”还包含经加工样品，如生物样品的洗脱份或分离物，例如核酸和肽/蛋白质分离物。
可在本申请所提供的方法中检测任何疑似含有CLDN18.2的生物样品。在一些实施方式中，适合样品可为获自需要检测的受试者的细胞样品或组织样品。举例来说，样品可以包含胃、肺、乳腺、结肠、肾、骨、脑、肌、胰、膀胱、卵巢、子宫以及心、胚胎或胎盘组织的正常和癌性组织。优选地，样品含有待检查，例如待针对癌症进行诊断的器官的细胞或组织。举例来说，如果待诊断的癌症为胃癌，那么样品可含有获自胃的细胞或组织。在一些实施方式中，样品为肿瘤样品。在某些实施方式中，组织样品为具有CLDN18.2相关疾病或病状的样品。
适合样品可以是来源于含有或预期含有肿瘤或癌细胞的患者的身体样品。身体样品可以是任何组织样品(如血液)、从原发性肿瘤或从肿瘤转移获得的组织样品或含有肿瘤或癌细胞的任何其它样品。术语“原发性肿瘤”是指在癌症起源部位生长的肿瘤。术语“转移瘤”是指在不同于癌症起源部位的部位处生长的继发性肿瘤。
组织或细胞样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品或活检或抽吸物；血液或任何血液成分；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。在一些实施方式中，样品获自体外组织或细胞培养物。
本申请中的样品的实例包含但不限于肿瘤活检、循环肿瘤细胞、血清或血浆、腹水、来源于肿瘤或展现肿瘤样特性的初级细胞培养物或细胞系，以及保藏的肿瘤样品，如***固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
在某些实施方式中，细胞样品由细胞块产生。“细胞块”为制备细胞学材料以使得其可被加工、切片、染色且被视为组织学区段的方法。其可提供除从细胞学载玻片获得的诊断信息之外的诊断信息。在某些实施方式中，细胞块可以由残余积液、痰液、尿液沉积物、胃肠流体、细胞刮擦物或细针抽吸物制备。细胞通过离心或膜过滤来浓缩或堆积。
已经开发了许多用于制备细胞块的方法。代表性程序包含固定沉积、细菌琼脂或膜过滤方法。在固定沉积方法中，将细胞沉积物与固定剂(如Bouin氏液、苦味酸或缓冲***)混合，随后将混合物离心以使固定细胞集结。收集集结粒并且将其放置于组织盒中，将所述盒置于具有额外固定剂的罐中并加工为组织样品。琼脂方法极类似，但将集结粒切成两半，且将切割侧放入玻璃载片上的一滴熔融琼脂中。使琼脂硬化，随后修整掉任何过量琼脂。或者，集结粒可以在65℃下直接悬浮于2％液体琼脂中并且使样品离心。使琼脂细胞集结粒在4℃下固化一小时。可以从离心管中移出固体琼脂并且将其切成两半。将其置于组织盒中且加工完成组织。在任何这些程序中离心可以替换成膜过滤。这些过程中的任一个可用于产生“细胞块样品”。
在某些实施方式中，细胞块可以使用包含Lowicryl树脂、LR White、LR Gold、Unicryl和MonoStep的特殊化树脂制备。这些树脂具有低粘度并且可以在低温下用紫外(UV)光聚合。包埋过程依赖于在脱水期间逐渐冷却样品，将样品转移到树脂，和在适当UV波长下在最终低温下聚合块。
细胞块切片可以用苏木精-曙红、Hoechst染色剂或DAPI染色以进行细胞形态检查，而额外切片用于通过在适合条件下暴露于抗CLDN18.2抗体(即一抗)持续足够时间段以允许抗体与细胞块切片中的CLDN18.2蛋白质结合来检查CLDN18.2。可以洗涤和去除未结合的和过量的一抗。
在一些实施方式中，样品可含有例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、养分、抗生素等。在某些实施方式中，样品已暴露于和/或含有一种或多种固定剂。适用于本申请所提供的方法的示例性固定剂包含***、戊二醛、四氧化锇、乙酸、乙醇、丙酮、苦味酸、氯仿、重铬酸钾和氯化汞和/或通过微波加热或冷冻稳定化。
在一些实施方式中，样品包含固定的组织样品。在一些实施方式中，固定的组织样品为***固定的石蜡包埋(FFPE)组织。FFPE组织切片可以是约3-4毫米，优选4-40微米，其封固并干燥在显微镜载玻片上。石蜡的实例包含但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。对于例如FFPE组织样品的固定的组织样品，样品可以在与本申请所提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段接触之前去石蜡。
在一些实施方式中，可以进一步处理去石蜡样品以允许抗原修复。抗原修复是指其中表位的遮蔽被逆转且表位-抗体结合被恢复的任何技术。虽然固定对于组织形态的保存是必不可少的，但此过程还可对抗体结合和检测具有负面影响。固定可以改变蛋白质的生物化学，使得所关注的表位被遮蔽并且可不再与抗体结合。表位的遮蔽可由表位内的氨基酸的交联、在表位处或附近交联的不相关肽、改变表位的构象或改变抗原的静电电荷引起。对于抗原修复的需求取决于多种变量，包含但不限于目标抗原、所使用的抗体、组织类型和固定的方法和持续时间。抗原修复技术一般包含蛋白酶诱导的表位修复(PIER，通过使用酶，如蛋白酶K、胰蛋白酶和/或胃蛋白酶)和热诱导的表位修复(HIER，通过使用微波炉、高压锅、蔬菜蒸笼、高压釜或水浴)。
在某些实施方式中，在本申请所提供的方法中检测或测定细胞表面或膜结合的CLDN18.2的存在或表达水平。短语“细胞表面或膜结合的CLDN18.2”意指CLDN18.2与细胞的质膜结合且位于细胞的质膜处，其中CLDN18.2的至少一部分暴露于所述细胞的胞外空间且可从所述细胞的外部(例如，由细胞外部的抗体)获取。在某些实施方式中，胞外暴露的CLDN18.2的部分包含至少4个、至少8个、至少10个、至少12个或至少20个氨基酸残基。在除胃上皮细胞以外的正常组织中，CLDN18.2位于上皮和内皮的紧密连接内，并且被认为是抗体不可从细胞外部获取的，并且因此被认为不是细胞表面或膜结合的CLDN18.2。
样品中CLDN18.2蛋白质的存在或表达水平可以基于本申请所公开的抗体或其抗原结合片段结合CLDN18.2抗原的复合物的存在或含量来确定。任何适合的方法可以用于检测抗体-抗原复合物，例如通过免疫分析，如免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光(IF)、免疫印迹(例如蛋白质印迹)、流式细胞术(例如FACSTM)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)和放射免疫分析(RIA)检测。关于免疫学和免疫分析程序的综述，参见《基础临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》(Stites和Terr编，第7版，1991)。此外，免疫分析可以若干配置中的任一个进行，所述配置在《酶免疫分析(EnzymeImmunoassay)》(Maggio编，1980)；和同上的Harlow和Lane中充分综述。关于一般免疫分析的综述，还参见《细胞生物学方法：细胞生物学抗体(Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology)》，第37卷(Asai编，1993)；《基础临床免疫学》(Stites和Terr编，第7版，1991)。
在某些实施方式中，本申请所公开的抗体或其抗原结合片段经可检测地标记(例如，一抗)，或未标记但可与可检测标记的第二分子(例如，可检测标记的二抗)反应。
在某些实施方式中，根据IHC或ICC测定样品中CLDN18.2蛋白质的存在或表达水平。IHC是指检测组织切片的细胞(例如本申请所提及的组织的细胞)中的抗原(例如蛋白质)的过程。免疫组织化学染色广泛用于诊断异常细胞，如癌性肿瘤中所见的细胞。在一些实施方式中，本申请所公开的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段可以用作IHC或ICC中的一抗。一般来说，可以进行IHC或ICC以直接检测或间接检测样品中的CLDN18.2蛋白质(例如人CLDN18.2蛋白质)，并且可以使用适当成像设备评价CLDN18.2的表达。
为了允许直接检测抗原(例如CLDN18.2)，可以使用与可检测标记连接的本申请所公开的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，这允许直接观察而无需进一步抗体相互作用。
对于抗原(例如CLDN18.2)的间接检测，可以使用未标记但可与可检测标记的第二分子(例如，可检测标记的二抗)反应的本申请所公开的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。举例来说，本申请所公开的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段可未标记，并且进一步与和可检测标记缀合的二抗(例如，抗同种型抗体)接触，以允许间接检测抗原。再举例来说，本文所提供的抗CLDN18.2抗体可以与生物素缀合，所述生物素可以与可检测标记的亲和素反应，或反过来。生物素选择性地与亲和素结合，并且因此允许间接检测抗体-抗原复合物。在又一个实例中，本申请所提供的抗CLDN18.2抗体可以与小半抗原缀合，所述小半抗原可以与如本申请所描述的可检测标记连接的抗半抗原抗体反应。本申请中以上描述了示例性类型的标记，并且可以使用任何适合的可检测标记。
ICC或IHC分析可以使用自动化病理学***进行，其可以包含自动化染色(常规染色剂、组织化学技术、免疫染色剂)；自动化原位杂交***；自动载片制备(盖玻片、载片干燥)和整合的载片和盒标记，如Roia等人，《用于病理学日常实践中的整合定量免疫组织化学的成像溶液的综述(Review of imaging solutions for integrated，quantitativeimmunohistochemistry in the Pathology daily practice)》，《组织化学和细胞生物学杂志(Folia Histochemica et Cytobiologica)》，第47卷，第3期，349-354，2009中所描述。
示例性IHC分析可采用市售Dako EnVisionTM FLEX检测***，其意图与Dako自动染色仪器(Dako，丹麦格洛斯楚普(Glostrup，Denmark)，一家Agilent Technologies公司)一起使用。这些试剂可以直接用于其它自动染色仪或在不使用自动染色仪的情况下用于手动地进行染色。
在完成染色过程之后，由人(例如病理学家)或通过经编程以区分特异性和非特异性染色结果的计算机分析样品(例如载片)的CLDN18.2染色。可以直接通过低、中(10-20×)和高倍(40-60×)显微镜观察样品，或通过观察在低、中和高倍下采集的载片的高分辨率图像进行分析。
样品中CLDN18.2表达的存在可以通过阳性染色细胞的存在，例如具有抗CLDN18.2抗体染色的任何强度的至少部分膜染色的细胞来确认。在某些实施方式中，正常样品可以用作对照样品，并且可以相对于对照样品确定测试样品中CLDN18.2表达的存在。如在术语“正常样品”或“正常组织”中所用的术语“正常”是指来自健康或非癌受试者的样品或组织，或来自健康或非癌组织的样品或组织。优选地，测试和对照样品在样品类型方面是相当的，例如两者都是固定的组织样品。如果测试样品与对照样品相比显示染色强度的增加或阳性染色细胞数目的增加，那么测试样品可确定为对于CLDN18.2表达呈阳性。
在某些实施方式中，CLDN18.2的表达水平可以使用所属领域中已知的任何适合的方法定量，例如，通过测定阳性染色细胞的相对比例和细胞膜上的染色强度。
在某些实施方式中，基于样品中阳性染色细胞(即CLDN18.2阳性细胞)的百分比对CLDN18.2表达水平进行定量。CLDN18.2阳性细胞为具有抗CLDN18.2抗体染色的任何强度的至少部分膜染色的细胞。举例来说，为了评估样品中的CLDN18.2表达，观察者可以在显微镜下检查一个或多个所选择的区域中的膜CLDN18.2+细胞的数目并且计算或估计对于CLDN18.2呈阳性的细胞的百分比。如果样品高度非均质，那么可将样品分区，分别对每一区进行评分且随后组合成单个百分比值集合。
在某些实施方式中，基于样品中的CLDN18.2(例如膜结合的CLDN18.2)的染色强度对表达水平进行定量。举例来说，可以基于0(无染色)、1+(弱染色)、2+(明显染色)、3+(强染色)和4+(极强/饱和信号)范围内的染色强度并乘以每一强度下染色的细胞百分比(0到100％)计算强度评分，如4点HSCORE(细节参见McCarty，K.S.Jr等人，《癌症研究》46(增刊8)：4244s-4248s(1986))。再举例来说，可通过将比例评分(PS)与强度评分(IS)相加来基于总评分(TS，范围0-8)计算Alfred分数。PS为0到5范围内的阳性肿瘤细胞的比例(0＝无阳性细胞，1＝1/100个细胞为阳性，2＝1/10个细胞为阳性，3＝1/3个细胞为阳性，4＝2/3个细胞为阳性，5＝所有肿瘤细胞为阳性)。IS意指在0-3范围内的阳性肿瘤细胞的平均染色强度(0＝阴性，1＝弱，2＝中等染色，3＝强染色)(细节参见Alfred DC等人《现代病理学(ModPathol.)》11：155-168(1998))。
在某些实施方式中，由独立操作的两个观察者评估样品并且随后整合百分比或评分。在某些其它实施方式中，使用适当软件执行阳性细胞和阴性细胞的鉴定或对其评分。
在某些实施方式中，可以例如通过针对对照值或标准曲线归一化来确定CLDN18.2的含量。对照值可从阴性对照样品或空白对照样品预先确定或同时确定。
在某些实施方式中，对于诊断或临床应用，将测试样品中(例如暴露于细胞表面上)的CLDN18.2的表达水平与阈值水平相比较。
关于CLDN18.2表达的“阈值水平”或“阈值”是指允许区分细胞表面CLDN18.2表达为阳性或阴性的表达水平，或允许确定或排除受试者中CLDN18.2相关病状(例如癌症)或癌症的发作或癌症发作的风险的表达水平，或允许监测接受癌症治疗的受试者中的治疗反应的阈值水平。在某些实施方式中，相对于对照表达水平确定阈值。
举例来说，阈值可以是大于使样品评分为具有CLDN18.2的阳性表达，并且因此适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗的含量。如果样品中的CLDN18.2含量达到或高于阈值，那么其可以指示CLDN18.2相关疾病或病状的存在和/或对CLDN18.2靶向剂有反应的可能性。
阈值水平可由所属领域的技术人员考虑多种因素来确定，所述因素包含例如样品类型、检测方法、待诊断的疾病或病状和/或待使用的CLDN18.2靶向剂。
在某些实施方式中，与阈值水平相比，例如与不患有CLDN18.2相关病状的受试者(例如非癌受试者)相比，CLDN18.2或表达CLDN18.2的细胞的存在和/或CLDN18.2或表达CLDN18.2的细胞的量的增加指示患者中CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症疾病)的存在或风险(即罹患潜能)。
在某些实施方式中，阈值水平为具有任何强度的至少部分膜染色的CLDN18.2阳性细胞百分比(％)。在一个实施方式中，CLDN18.2阳性细胞百分比(％)的阈值水平为1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。
在某些实施方式中，样品来自患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者。如本申请所使用的，术语“CLDN18.2相关疾病或病状”是指特征在于相比于除胃以外的健康或非癌组织或器官中的状态，病变组织或器官的细胞中CLDN18.2的表达增加的疾病或病状。增加可例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或甚至更多。在某些实施方式中，CLDN18.2在病变组织或器官的细胞中的表达高于检测极限和/或足够高以允许加入的CLDN18.2特异性抗体与细胞结合。在一些实施方式中，CLDN18.2的表达增加仅发现于病变组织中，而CLDN18.2在正常组织中的表达不可检测。
在一些实施方式中，CLDN18.2相关疾病或病状的特征在于细胞表面或膜结合的CLDN18.2的表达增加。
在一些实施方式中，CLDN18.2相关疾病或病状为癌症。在一个实施方式中，癌细胞表达或异常表达CLDN18.2，而对应的正常细胞不表达CLDN18.2或以较低量表达CLDN18.2。据信，作为紧密连接蛋白的CLDN18.2可以是CLDN18.2相关疾病(如肿瘤)的良好治疗目标，并且因此可以用于选择适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗的患者。不同于其中CLDN结合以形成经典紧密连接的正常上皮组织(除胃上皮细胞外)，在肿瘤细胞中表达的CLDN通常不形成所述经典紧密连接，并且因此，肿瘤细胞可能具有暴露的，且胞外抗体结合和免疫疗法可获取的游离CLDN。
CLDN18.2为预防和/或治疗原发性肿瘤的有价值的目标，所述肿瘤如胃癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC，鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌(SCLC))、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌(包含基底乳腺癌、导管癌和乳腺小叶癌)、肝癌(liver cancer)、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌(head and neck cancer)、脊柱癌、脑癌、***、子宫癌、子宫内膜癌、肝癌(hepatic cancer)、头颈癌(head-neck cancer)、胆囊癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、***癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃癌、***癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合症、肉瘤、畸胎瘤、胆管癌和/或腺癌，和/或其转移，尤其胃癌转移，如库肯勃瘤(Krukenberg tumor)、腹膜转移和***转移。
样品优选地为癌细胞或组织，且尤其选自由以下组成的群组：肿瘤发生型胃、食道、胰、肺、卵巢、结肠、肝、头颈和胆囊癌细胞或组织。
在某些实施方式中，癌症包含但不限于肾细胞癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、子***、胸腺癌、骨髓瘤、蕈样真菌病(mycoses fungoids)、梅克尔细胞癌(merkel cellcancer)、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性病、基底细胞癌、汗腺癌、甲状腺髓质癌、***状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、髓质癌、支气管癌、肝瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯瘤(Wilms′ tumor)、子***、睾丸肿瘤、***瘤、经典霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓细胞性(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞衍生肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、成浆细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和骨髓异常增生、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
在某些实施方式中，癌症为表达CLDN18.2的癌症。样品中CLDN18.2的存在或表达水平指示癌细胞是否表达CLDN18.2，并且因此癌症是否可能对用CLDN18.2靶向剂进行治疗作出反应。
如在本申请中所使用的，“CLDN18.2靶向剂”是指一种或多种靶向细胞、组织或活体中的CLDN18.2蛋白或核酸(DNA或mRNA)的药剂。CLDN18.2靶向剂可以降低/消除CLDN18.2基因产物的表达，抑制/破坏CLDN18.2的信号传导，或诱导对异常表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性。
在某些实施方式中，CLDN18.2靶向剂包含治疗性抗CLDN18.2抗体、CLDN18.2结合分子、靶向CLDN18.2的细胞疗法、靶向CLDN18.2的化合物或靶向CLDN18.2的治疗性核酸。在某些实施方式中，CLDN18.2靶向剂能够诱导对表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性。
在某些实施方式中，CLDN18.2靶向剂包含治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子。在某些实施方式中，治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子可以诱导对表达CLDN18.2的细胞的ADCC、CDC或ADCP。或者，治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子可以与细胞毒性剂缀合，例如以形成抗体-药物缀合物(ADC)。在某些实施方式中，细胞毒性剂可为对细胞有害或可损害或杀灭细胞的任何药剂。在某些实施方式中，细胞毒性剂任选地是毒素、化学治疗剂(如DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、生长抑制剂或其它抗癌药物)或放射性同位素。在其它实施方式中，治疗性抗CLDN18.2抗体可以是与不同抗原或CLDN18.2蛋白质上的不同表位结合的双特异性抗体。
在某些实施方式中，CLDN18.2靶向剂包含靶向CLDN18.2的细胞疗法。在某些实施方式中，所述靶向CLDN18.2的细胞疗法包含表达结合CLDN18.2的嵌合抗体受体(CAR)的嵌合抗体受体工程改造T细胞(CAR-T)、基因修饰TCR T细胞(TCR-T)或嵌合抗体受体工程改造NK细胞(CAR-NK)。嵌合抗原受体(CAR)是将抗体的抗原结合域与T细胞活化的一个或多个信号传导域组合的工程改造嵌合受体。如T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫细胞可以经基因工程改造以表达CAR或经基因修饰的TCR(细节参见D.Li等人，《信号转导与靶向治疗(SigTransduct Target Ther)》4，35(2019)，S.Kloess等人，《输血医学与血液疗法(TransfusMed Hemother)》；46：4-13(2019)，Wang W.等人，《癌症快报(Cancer Letters)》，472：175-180(2020))。表达CAR的T细胞称为CAR-T细胞。CAR可以介导T细胞中的抗原特异性细胞免疫活性，使得CAR-T细胞能够消除表达靶向抗原的细胞(例如肿瘤细胞)。在一个实施方式中，本申请所提供的CAR-T细胞与表达于细胞(如癌细胞)上的CLDN18.2的结合引起所述CAR-T细胞的增殖和/或活化，其中所述活化的CAT-T细胞可以释放细胞毒性因子，例如穿孔素、颗粒酶和粒溶素，并且引发癌细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡。
在某些实施方式中，靶向CLDN18.2的治疗性核酸可以是能够介导针对CLDN18.2基因序列或表达CLDN18.2的细胞中的另一基因序列的RNA干扰(RNAi)的短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子。
在某些实施方式中，CLDN18.2靶向剂促进受试者的癌症消退。在优选实施方式中，治疗有效量的CLDN18.2靶向剂促进癌症消退到消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独或与抗赘生剂组合给予有效量的药物使得肿瘤生长或大小减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状阶段的频率和持续时间增加或预防由疾病病痛引起的障碍或残疾。
在某些实施方式中，受试者正在接受或已经接受抗癌疗法，或罹患癌症复发。抗癌疗法包含例如但不限于化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫疗法、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、缓和照顾、用于治疗癌症的手术(例如肿瘤切除术)，或用于由化学疗法引起的并发症的一种或多种止吐药或其它治疗。
当受试者再次受在过去影响其的病状影响时，发生复发(relapse/recurrence)。例如患者曾罹患癌症疾病，已接受所述疾病的成功治疗，且再次罹患所述疾病的情况。所述新罹患的疾病可以被视为复发(relapse/recurrence)。然而，根据本公开，癌症疾病的复发(relapse/recurrence)可以但不一定发生于原始癌症疾病的部位处。因此，举例来说，如果患者曾罹患胃肿瘤并且已接受成功治疗，那么复发(relapse/recurrence)可以是出现胃肿瘤或出现在不同于胃的部位的肿瘤。肿瘤的复发(relapse/recurrence)还包含肿瘤在与原始肿瘤的部位不同的部位处以及在原始肿瘤的部位处出现的情形。优选地，患者已经接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤并且在不同于原始肿瘤部位的部位处的肿瘤是二级肿瘤或转移瘤。
试剂盒
在某些实施方式中，本公开提供包含本申请所提供的分离的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。在某些实施方式中，本申请所公开的试剂盒为诊断试剂盒。试剂盒可用于检测生物样品中CLDN18.2的存在或量，或可用于本申请所提供的诊断方法。
在某些实施方式中，试剂盒包含任选地可检测标记的本申请所提供的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与间接可检测部分缀合。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于检测与CLDN18.2结合的所述抗体或其抗原结合片段的复合物的试剂集合，其可用于多种检测分析，包含例如免疫分析，如IHC、ICC或ELISA(夹心式或竞争性形式)。
在本发明的又一实施方式中，可用于对FFPE肿瘤组织切片进行免疫组织化学的试剂连同用于进行IHC分析的说明书一起提供于试剂盒中。
可以使用本申请所公开的间接可检测标记或部分中的任一种。在某些实施方式中，间接可检测部分包含生物素。在所述实施方式中，所述试剂集合包含可检测标记的亲和素或链霉亲和素(steptavidin)。
在某些实施方式中，可检测标记与本申请所提供的抗体或其抗原结合片段缀合。在某些实施方式中，试剂盒包含本申请所提供的分离的抗体或其抗原结合片段和与可检测标记缀合的二抗。在一些实施方式中，二抗包含与一抗(例如本申请所提供的抗体或其抗原结合片段)特异性结合的抗体。在一些实施方式中，二级抗体可以是抗小鼠抗体、抗兔抗体或抗人抗体。
可检测标记可能需要在使用之前与一种或多种组分，例如缓冲剂、抗体-酶缀合物、酶底物等组合，并且所述试剂可以包含于试剂盒中。举例来说，当可检测部分包含酶时，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包含其它试剂，如用于减少与固相表面的非特异性结合的封闭试剂、洗涤试剂、酶底物等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质上优化分析灵敏度的试剂在溶液中的浓度。确切地说，试剂可以干粉(通常冻干)形式提供，包含溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。指示检测和/或分析***制备指南的呈插页或标签形式的说明书也可以包含于试剂盒中。
试剂盒的组分可以预先附着于固体支撑物，或可以在使用试剂盒时施加于固体支撑物的表面。固相表面可以呈管、珠粒、微量滴定板、微球或适于固定蛋白质、肽或多肽的其它材料的形式。
用于所述试剂盒的容器可通常包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它适合容器，检测组合物中的一种或多种可置于所述容器中，并且优选地适当地等分。本申请中所公开的试剂盒还将通常包含用于严密容纳一个或多个小瓶以便商业销售的构件，例如其中保持一个或多个所需小瓶的注塑或吹塑塑料容器。在试剂盒内包含放射性标记、发色、发荧光或其它类型的可检测标记或检测构件的情况下，标记试剂可以在与检测组合物自身相同的容器中提供，或可以替代地放入第二不同容器构件中，其中可以放置并且适当地等分此第二组合物。或者，检测试剂可以制备于单一容器构件中，并且在大多数情况下，试剂盒还将通常包含用于严密容纳一个或多个小瓶以便商业销售和/或方便包装和运送的构件。
还提供用于执行本申请中所描述的检测或监测方法的装置或设备。所述设备可包含可输入样品的腔室或管、任选地包含阀或泵以引导样品流动穿过装置的流体处理***、任选地用于从血液分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获剂或检测试剂的混合腔室，和任选地用于检测与捕获剂免疫复合物结合的可检测标记的量的检测装置。样品的流动可以是被动的(例如，通过毛细管、流体静力或在施加样品后不需要进一步操纵装置的其它力)或主动的(例如，通过施加由机械泵、电渗泵、离心力或增大的气压产生的力)，或通过主动和被动力的组合。
实施例
虽然已经参考具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体示出和描述了本公开，但所属领域的技术人员应理解，可以在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，在其中进行形式上和细节上的各种改变。
实施例1：用于免疫接种的抗原的制备
1.抗原肽的设计
为了将抗体的表位限制于CLDN18.2而非CLDN18.1，针对CLDN18.2的独特的肽(Genbank登录号：NP_001002026)由迈博斯生物医药(苏州)有限公司(MabSpaceBiosciences(Suzhou)Co.，Limited)设计。该肽的编码序列(SEQ ID No.19：DQWSTQDLYN)位于CLDN18.2的氨基酸残基Asp28-Asn37(D28到N37)处。
2.肽合成
抗原肽在生工生物工程(上海)(SANGON BIOTECH(Shanghai))合成并且用于动物免疫接种。
实施例2：抗体产生
1.免疫接种和杂交瘤融合
用CFA作为佐剂，用40μg/小鼠肽(与KLH缀合)对不同品系的6-8周小鼠进行免疫接种，在初次免疫接种之后3天，每只小鼠一周3次持续4周接受11次加强(多个部位皮下注射)，且随后以一周为间隔接受2次加强。为了测定血清效价，将100μl/孔连续稀释的小鼠血清添加到抗原肽涂布的板中，随后4℃孵育30分钟。使用洗涤缓冲液洗涤板3次，随后添加100μl/孔山羊抗mIgG-HRP，再在4℃下孵育。使用洗涤缓冲液洗涤后，添加TMB与板上的HRP反应。随后，通过微板读数仪读取板的OD450nm，并且通过Graphpad Prism 6软件分析效价。选择具有较高效价的小鼠用于以下融合步骤。
2.融合
在融合前四天，每只小鼠用20μg肽腹腔内加强免疫接种。融合当日，无菌移出脾，随后加工成单细胞悬浮液。使红细胞裂解，得到脾细胞。在融合培养基中，以1∶1比率混合活的对数期骨髓瘤细胞(SP2/0)与鼠类脾细胞，随后电融合1分钟。将细胞重悬，在96孔培养板中置于37℃、5％CO2培育箱中培养。培养7天之后，将生长培养基更换为新鲜生长培养基。更换新鲜生长培养基2-3天之后开始筛选杂交瘤上清液。
实施例3：结合筛选、阳性杂交瘤克隆的亚克隆和小规模抗体生产
1.通过ELISA分析进行的结合筛选
收集杂交瘤上清液以进行抗原结合筛选。将100μl/孔杂交瘤上清液添加到抗原肽涂布的板中，随后4℃孵育1小时。使用洗涤缓冲液洗涤板3次，随后添加100μl/孔山羊抗mIgG-HRP，再在4℃下孵育。使用洗涤缓冲液洗涤后，添加TMB与板上的HRP反应。随后，通过微板读数仪读取板的OD490nm。选择并扩增ELISA结合的阳性克隆。2天后，以相同方式测试所选克隆的杂交瘤上清液的结合，对阳性克隆进行亚克隆。
2.阳性杂交瘤克隆的亚克隆
选择来自具有所需结合特性的阳性杂交瘤孔的细胞在96孔板中有限稀释。稀释后的细胞生长7天。达到足够的细胞质量后，收集每个孔的上清液并通过使用上述相同ELISA结合分析来重新筛选。
将每个96孔板中具有最高细胞结合活性的克隆扩增，第2轮有限稀释到96孔板中，每孔200μl杂交瘤生长培养基。7天后，通过相同ELISA结合分析来分析96孔板中细胞的上清液。进行亚克隆多于2次直至超过90/96孔呈现阳性结合信号。每一克隆鉴定出具有最高结合活性的两个亚克隆(即69H2和14G11)，扩增、培养以产生纯化抗体。使用标准方法测定同种型。
3.小规模抗体生产
接种杂交瘤细胞，培养14天。通过蛋白质A亲和色谱(蛋白质A高效(Protein AHigh Performance)(Bio-Rad))从杂交瘤细胞培养物中纯化单克隆抗体(mAb)。
色谱纯化之后，在PBS中通过透析配制这些mAb，接着进行过滤步骤。
实施例4：细胞块上的抗体免疫细胞化学筛选
1.细胞块切片制备
HEK293-人CLDN18.2细胞(下文称为HEK293-CLDN18.2)和HEK293-人CLDN18.1细胞(下文称为HEK293-CLDN18.1)由迈博斯生物医药(苏州)有限公司构造。简单来说，HEK293细胞(上海生命科学研究院(Shanghai Institutes for Biological Sciences)，目录号GNhu43)用pcDNA3.1/hCLDN18.2或pcDNA3.1/hCLDN18.1质粒转染，用G418选择以获得稳定表达细胞系HEK293-CLDN18.2或HEK293-CLDN18.1。通过FACS，分别使用阳性对照抗体测试和确认CLDN18.1在HEK293-CLDN18.1上的表达和CLDN18.2在HEK293-CLDN18.2上的表达。如图1中所示，HEK293-CLDN18.1细胞显示抗体EPR19203(可从Abcam购得，产品名ab222513)与CLDN18.1结合的阳性结合信号，HEK293-CLDN18.2细胞显示抗体18B10(参见PCT申请PCT/CN2019/101563)与人CLDN18.2特异性结合的阳性结合信号。
收集HEK293和具有高表达水平的人CLDN18.2(HEK293-CLDN18.2)或CLDN18.1(HEK293-CLDN18.1)的HEK293细胞，室温下固定于4％中性缓冲多聚甲醛(PFA)中30分钟。离心之后，将细胞重悬于PBS中，随后在57℃下分散于200μl熔融琼脂中，并且立即在4℃下固化。将琼脂-细胞混合物在梯度醇中脱水，在二甲苯中透明。60℃下渗透到石蜡中后，根据标准程序将琼脂-细胞混合物包埋于石蜡中，以3μm的厚度切成片，立即封固到带正电的载玻片上。
2.细胞块切片上的抗体免疫细胞化学筛选
为了筛选CLDN18.2特异性和敏感性抗体，使用石蜡包埋(FFPE)的HEK293、HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1细胞块切片进行免疫细胞化学(ICC)。去石蜡化和复水之后，将所有切片在EnVisionTM FLEX目标修复溶液(Dako，K8002)中97-99℃沸腾25分钟，随后淬灭，用EnVisionTM FLEX过氧化酶封闭剂(Dako，K8002)封闭，并用适当稀释的抗体孵育进行抗原修复。使用EnVisionTM FLEX+小鼠(LINKER)，接着EnVisionTM FLEX/hRP和EnVisionTMFLEX底物工作溶液(Dako，K8002)来观察抗体结合。最后用苏木精复染切片，且用永久封固剂封固。未观察到染色模式的显著差异，并且抗体之间的染色强度从弱到强变化。
如表3和图2所示，1nM抗体69H2和14G11的克隆在HEK293-CLDN18.2表面上强烈且特异性染色，但在HEK293和HEK293-CLDN18.1上显阴性，进一步滴定至0.5nM以测试敏感性。69H2F7E6、69H2D3B1、69H2E1D3均为抗体69H2的克隆，并且与69H2共有相同重链和轻链序列。14G11G2D2、14G11A4E1和14G11F5E1均为抗体14G11的克隆，并且与14G11共有相同重链和轻链序列。
使用抗CLDN18.2抗体GC182的染色作为对照，其在HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1细胞上均呈阳性染色。抗体GC182具有SEQ ID NO：22的重链可变区序列和SEQ IDNO：23的轻链可变区序列，由迈博斯生物医药根据WO2013167259所公开的序列产生。表3中的结果指示抗体GC182可与CLDN18.1交叉反应，因此对CLDN18.2不具有特异性。
GC182重链可变区序列(SEQ ID NO：22)：
Figure BDA0003979514590000542
GC182轻链可变区序列(SEQ ID NO：23)：
Figure BDA0003979514590000543
表3通过免疫细胞化学染色在细胞块切片上进行的抗体筛选
Figure BDA0003979514590000541
Figure BDA0003979514590000551
实施例5：所选择抗体的克隆和重组生产
重组抗体的产生
由候选杂交瘤细胞系经聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠抗人CLDN18.2抗体14G11和69H2的轻链和重链可变区中的序列。经测序分析和确认之后，将可变区基因(包含融合到小鼠κ恒定区的轻链可变区(VL)序列和融合到小鼠IgG1恒定区的重链可变区(VH)序列)克隆到重组表达载体pcDNA3.1(+)中进行抗体生产和纯化。
14G11和69H2抗体的重链和轻链分别与如下所示的小鼠IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区连接：
小鼠IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：17)：
Figure BDA0003979514590000552
小鼠κ轻链恒定区(SEQ ID NO：18)：
Figure BDA0003979514590000561
重组抗体的表达和纯化
使用ExpiCHO转染试剂盒、以等量的来自重链载体和轻链载体的DNA转染ExpiCHO细胞。经转染的细胞置于震荡烧瓶中以125rpm培养在37℃、8％CO2培养箱中。第10天收集细胞培养物，通过亲和色谱纯化所收集的抗体。分析所得抗体，使用SDS-PAGE和尺寸排阻色谱(TSK gel G3000SWXL，TOSOH)测定纯度水平。
实施例6：通过ELISA和FACS分析进行的hCLDN18.2和hCLDN 18.1的结合选择性评价
通过ELISA分析的与hCLDN18.2肽(aa28-37)的特异性结合
将1μg/ml肽(100μL/孔)涂布到高结合透明聚苯乙烯96孔板上，用封闭缓冲液封闭。随后加入封闭缓冲液中的连续稀释抗体(150-0.0732ng/ml)，室温孵育1.5小时。使用洗涤缓冲液洗涤板6次，随后加入100μl/孔针对Ms IgG(HRP)的山羊pAb，室温孵育1.5小时。在用洗涤缓冲液洗涤之后，添加TMB与板上的HRP反应。随后，通过SpectraMax i3x(MolecularDevices)读取板的OD450nm。14G11G2D2和69H2F7E6可以高亲和力与该肽特异性结合，而GC182不能识别线性肽中的表位。(图3)
通过ELISA进行的重组抗密封蛋白18.2抗体与重组hCLDN18.2和hCLDN18.1蛋白质 的结合选择性分析
在此分析中使用人重组CLDN18.2(N-6His)变异体(获自Novoprotein，目录号NC101)和人重组CLDN18.1(N-8His)变异体(获自Novoprotein，目录号CR54)。人重组CLDN18.2(N-6His)变异体为含有人CLDN 18.2胞外域(残基Ala24-Ala81，SEQ ID NO：26)的融合多肽，胞外域侧接有序列，所述序列可以折叠或缔合以允许人CLDN 18.2的胞外域形成环。类似地，人重组CLDN18.1(N-8His)变异体为含有人CLDN 18.1胞外域(残基Asp28-Leu76，SEQ ID NO：27)的融合多肽，胞外域侧接有序列，所述序列可以折叠或缔合以允许人CLDN 18.1的胞外域形成环。
将1μg/ml人重组CLDN18.2(N-6His)变异体或人重组CLDN18.1(N-8His)变异体(100μL/孔)涂布到高结合透明聚苯乙烯96孔板上，用封闭缓冲液封闭。加入封闭缓冲液中的连续稀释抗体(100-0.0244ng/ml)，室温孵育1.5小时。使用洗涤缓冲(PBS+0.1％Tween)洗涤剂洗涤板6次，随后加入100μl/孔针对Ms IgG(HRP)的山羊pAb，室温孵育1.5小时。在用洗涤缓冲液洗涤之后，添加TMB与板上的HRP反应。随后，通过SpectraMax i3x(MolecularDevices)读取板的OD450nm。14G11G2D2和69H2F7E6都可以高亲和力与人重组CLDN18.2(N-6His)特异性地结合，其EC50分别为12.75ng/ml和13.87ng/ml(图4)。14G11G2D2和69H2F7E6都未显示与人重组CLDN18.1(N-8His)蛋白质的特异性结合(图5)。作为对照，GC182未显示与人重组CLDN18.2(N-6His)或人重组CLDN18.1(N-8His)的特异性结合(图4、图5)。这表明14G11G2D2和69H2F7E6与CLDN18.2的胞外域内的表位结合，但GC182不识别所述表位。
HEK293-hCLDN18.2和HEK293-hCLDN 18.1细胞系上的FACS分析
收集对数期HEK293-hCLDN18.2或HEK293-hCLDN18.1细胞，洗涤并重悬。加入封闭缓冲液中的稀释抗体(20μg/mL)，4℃孵育1小时。然后用封闭缓冲液洗涤细胞两次，随后加入封闭缓冲液中的二抗(山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488，ThermoFisher)。4℃孵育细胞1小时，然后用封闭缓冲液洗涤两次，在封闭缓冲液中重悬。随后将细胞转移到FACS管中，使用流式细胞仪(BDAccuri C6)检测抗体与细胞的结合。抗体18B10和EPR19203分别用作HEK-hCLDN18.2细胞和HEK-hCLDN 18.1细胞上的分析的阳性对照物。如图1所示，抗体14G11G2D2和69H2F7E6都不可结合具有天然构象的表达于细胞表面上的人密封蛋白18.2或密封蛋白18.1。
实施例7：通过ForteBio进行的重组抗密封蛋白18.2与重组hCLDN18.2蛋白质的结合亲和力测定
将1×Kinetics缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.02％Tween 20)中的100nM人重组CLDN18.2(N-6His)(Novoprotein，NC101)蛋白质装载到预湿的Ni-NTA生物传感器(PALL，18-5101)上，持续200秒。以1×Kinetics缓冲液作为基线平衡(60秒)之后，将传感器分别浸没到具有1×Kinetics缓冲液的连续稀释抗体(50nM、25nM)中，孵育200秒以确定缔合(kon)，接着在1×Kinetics缓冲液中解离200秒(koff)。生物传感器在再生缓冲液中再生5秒，随后在中和缓冲液中中和5秒，进行3次。所有程序都在30℃下使用Octet RED 96(PALL)进行。使用koff与kon的比率计算并分析结合亲和力KD(图6)。69H2F7E6显示1.48nM的KD值，14G11G2D2显示0.213nM的KD值。
实施例8：使用正常组织的抗体特异性验证
CLDN18.2为高度选择性的胃谱系抗原，其表达受限于胃粘膜的短寿命分化上皮细胞，而CLDN18.1表达受限于肺。在此基础上，在各种相关正常组织上分析所选择的抗体以确认与CLDN18.2而非CLDN18.1的特异性结合。对4％中性缓冲***固定的石蜡包埋(FFPE)正常肠、肾、扁桃体、甲状腺、骨骼肌、胃、肺和乳腺切片进行免疫组织化学(IHC)。在去石蜡化和复水之后，将所有切片在EnVisionTM FLEX目标修复溶液(Dako，K8002)中97-99℃沸腾25分钟，随后淬灭，用EnVisionTM FLEX过氧化酶封闭剂(Dako，K8002)封闭，并用适当稀释的抗体孵育进行抗原修复。使用EnVisionTM FLEX+小鼠(LINKER)，接着EnVisionTMFLEX/hRP和EnVisionTM FLEX底物工作溶液(Dako，K8002)来观察抗体结合。最后用苏木精复染切片，且用永久封固剂封固。
选择克隆14G11G2D2和69H2F7E6以进行FFPE正常组织上的进一步特异性分析。69H2F7E6和14G11G2D2染色强度、模式和选择性表现都很好。69H2F7E6和14G11G2D2在FFPE胃切片中都显示强染色强度，但对肺、肠、肾、骨骼肌、扁桃体、甲状腺和乳腺切片的染色可以忽略(参见表4和图7A和图7B)。所有染色细胞为上皮细胞，而不是其它细胞类型，包括淋巴细胞、血管、纤维细胞或平滑肌细胞。相比之下，抗CLDN18.2抗体GC182在FFPE胃和肺切片中分别显示强和中度染色强度，证实其与CLDN18.2和CLDN18.1结合。比较起来，14G11G2D2比69H2F7E6表现更好，选择14G11G2D2为进一步IHC测试的候选物。IHC染色的分析结果示于表4和图7A和图7B中。
此外，还在正常组织上比较了所选择抗体和现有抗CLDN18.2抗体EPR19202(Abcam，ab222512)的特异性和敏感性。如上文所描述进行IHC。如图8所示，浓度为0.374μg/ml的抗体EPR19202在胃组织上显示比浓度更低(即0.15μg/ml)的抗体14G11G2D2更弱的染色强度，表明ERP19202比14G11G2D2敏感性更低。尤其是，抗体EPR19202在骨骼肌上显示非特异性染色(图8)，而抗体14G11G2D2保持对CLDN18.2的特异性且不与其中不存在CLDN18.2的正常组织中的任一种交叉反应。
表4正常胃、肠、肾、骨骼肌和肺FFPE组织上的特异性分析
Figure BDA0003979514590000581
Figure BDA0003979514590000591
实施例9：使用不同肿瘤类型的肿瘤组织样品应用所鉴定的抗体进行基于IHC的CLDN18.2表达评价
已有报道患有胃癌的日本患者中CLDN18.2的表达率在87％肿瘤样品中可检测，且在52％肿瘤样品中观察到中到强的CLDN18.2表达(Rohde等人，《日本临床肿瘤学杂志》2019年9月1日；49(9)：870-876)。此外，也有报道表明CLDN18.2的异常异位表达出现在其它癌细胞中，包括胰腺癌、卵巢癌、胆管癌和肺腺癌(Sahin U等人《临床癌症研究》，2008，14(23)：7624-7634；Karanjawala ZE等人，《美国外科病理学杂志》2008年2月；32(2)：188-96；MickeP等人，《国际癌杂志》2014年11月1日；135(9)：2206-14；Keira Y等人，《欧洲病理学杂志》2015年3月；466(3)：265-77)。
另外在各种相关癌症组织上分析14G11G2D2以确保染色强度、模式和阳性。在4％中性缓冲***固定的石蜡包埋(FFPE)胃癌、胰腺癌和胆管癌和非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤切片上进行免疫组织化学(IHC)。在去石蜡化和复水之后，将所有切片在EnVisionTMFLEX目标修复溶液(Dako，K8002)中97-99℃下沸腾25分钟，随后淬灭，用EnVisionTM FLEX过氧化酶封闭剂(Dako，K8002)封闭，并用适当稀释的14G11G2D2抗体孵育进行抗原修复。使用EnVisionTM FLEX+小鼠(LINKER)，接着EnVisionTM FLEX/hRP和EnVisionTM FLEX底物工作溶液(Dako，K8002)来观察抗体结合。最后用苏木精复染切片，且用永久封固剂封固。通过相对于具有不同强度(阴性(-)、弱(+)、中(++)、强(+++))的膜染色的所有可见肿瘤细胞的阳性染色肿瘤细胞的相对比例来分析所有样品。仅将膜染色视为阳性，人正常胃作为每一染色的阳性对照物。14G11G2D2分别在胃癌、胰腺癌、胆管癌和NSCLC癌症组织中产生弱到强的膜信号(参见图9)，阳性肿瘤细胞的百分比在不同个体间和不同肿瘤类型间变化(胃癌参见表5-1、胰腺癌参见表5-2、胆管癌参见表5-3，NSCLC癌症组织参见表5-4)。胃癌、胰腺癌、胆管癌和NSCLC癌症组织中CLDN18.2表达阳性和发生率汇总在表6中。
表5-1使用重组14G11G2D2小鼠单克隆抗体分析胃癌组织中CLDN18.2的表达
Figure BDA0003979514590000601
Figure BDA0003979514590000611
表5-2使用重组14G11G2D2小鼠单克隆抗体分析胰腺癌组织中CLDN18.2的表达
Figure BDA0003979514590000612
Figure BDA0003979514590000621
Figure BDA0003979514590000631
表5-3使用重组14G11G2D2小鼠单克隆抗体分析胆管癌中CLDN18.2的表达
Figure BDA0003979514590000632
Figure BDA0003979514590000641
表5-4使用重组14G11G2D2小鼠单克隆抗体分析NSCLC癌性组织中CLDN18.2的表达
Figure BDA0003979514590000642
Figure BDA0003979514590000651
表6.不同癌症类型中CLDN18.2表达的阳性和发生率分析
Figure BDA0003979514590000652
实施例10：使用生物素化14G11G2D2进行针对胃的CLDN18.2 IHC染色验证
制备生物素化14G11G2D2(14G11G2D2-生物素)。简单来说，在无水DMF中制备20mg/mL生物素酰氨己酸NHS酯(Biotinamidocaproate NHS ester)(Sigma，B2643-10MG)作为储备溶液。每1mg待标记的14G11G2D2抗体加入10μl储备溶液，且在室温下温和混合1小时。根据制造商说明书在ZebaTM旋转脱盐柱(ThermoFisher，89890)上将产物脱盐而去除低分子量的反应产物。
在4％中性缓冲***固定的石蜡包埋的胃样品的载玻片上进行免疫组织化学(IHC)。在去石蜡化和复水之后，所有载玻片通过在EnVisionTM FLEX目标修复溶液(Dako，K8002)中97-99℃沸腾25分钟来进行抗原修复，随后淬灭，根据说明书用IHC生物素封闭试剂盒(MaiXin，BLK-0001)封闭，且与3μg/mL自产生物素化单克隆小鼠抗密封蛋白18.2(14G11G2D2-生物素)抗体一起在37℃下孵育30分钟。使用辣根过氧化酶标记的抗生蛋白链菌素(MaiXin，SP KIT-D1)和EnVisionTM FLEX底物工作溶液(Dako，K8002)观察抗体结合。最后用苏木精复染切片，且用永久封固剂封固。
如图10所示，对于强度和特异性，14G11G2D2-生物素表现出与14G11G2D2相同的染色模式。
序列表
<110> 迈博斯生物医药（苏州）有限公司
<120> 抗CLDN18.2抗体及其诊断用途
<130> 063694-8004CN01
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
Arg Asn Tyr Phe His
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Phe Asp Ile Glu Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Gly Tyr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Thr Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 位置1处的Xaa可以为Arg或Thr, 位置2处的Xaa可以为Asn
或Tyr。
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 位置4处的Xaa可以为Phe或Ile。
<400> 8
Xaa Xaa Tyr Xaa His
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
Trp Ile Tyr Pro Arg Gly Gly Asn Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Asn Tyr Arg Ser Thr Phe Gly Tyr
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa可以为Gly或Arg。
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(10)
<223> 位置7处的Xaa可以为Phe或Gly, 位置8处的Xaa可以为Asp
或Asn, 位置9处的Xaa可以为Ile或Thr,位置10处的Xaa
可以为Glu或Val。
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 位置12处的Xaa可以为Ser或Asn。
<400> 12
Trp Ile Tyr Pro Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Tyr Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Gly Phe Asp Ile Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Val
115
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Gly Gly Asn Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asn Tyr Arg Ser Thr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 324
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 17
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 18
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 21
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 22
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Phe Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Ile Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Asn Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Val
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa可以为Gly或Arg。
<400> 24
Asn Tyr Xaa Ser Thr Phe Gly Tyr
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa可以为Val或Ile。
<400> 25
Lys Xaa Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro
1 5 10 15
Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg
20 25 30
Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala
50 55
<210> 27
<211> 49
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly
20 25 30
Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met
35 40 45
Leu

Claims (54)

1.一种与CLDN18.2特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段表现出一种或多种以下特征：
a)与人CLDN 18.1不具有交叉反应性；
b)如通过免疫组织化学分析(IHC)所测量的，除了胃上皮细胞以外，与非癌细胞不具有交叉反应性；
c)如通过IHC所测量的，与非癌人肺组织不具有交叉反应性；
d)能够与表达CLDN18.2的细胞特异性结合，任选地所述表达CLDN18.2的细胞经预处理，使得CLDN18.2变性或以其它方式不再呈现其天然构象；
e)如通过表面等离子共振(SPR)所测量的，能够以不超过10nM的Kd值，或如通过酶联免疫吸附分析(ELISA)所测量的，能够以不超过20ng/ml的EC50值与包含人CLDN18.2的第一胞外环的融合多肽结合；
f)如通过流式细胞术(FACS)分析所测量的，显示出与细胞表面的人CLDN 18.2没有可检测的结合；
g)如通过ELISA所测量的，能够与DQWSTQDLYN(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列内的表位特异性结合；和/或
h)如通过ELISA所测量的在1nM的抗体浓度下，或如通过IHC所测量在0.5μg/ml的抗体浓度下，与***固定的石蜡包埋(FFPE)样品中的人CLDN18.1不具有交叉反应性。
2.一种与CLDN18.2特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含X1X2YX3H(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列，重链CDR2，其包含WIYPX4GXsX6X7X8YX9EKFKG(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含NYX10STFGY(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列；和/或
b)轻链CDR1，其包含RSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含KX11SNRFS(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含FQGSHVPFT(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列；
其中X1为R或T，X2为N或Y，X3为F或I，X4为G或R，X5为F或G，X6为D或N，X7为I或T，X8为E或V，X9为S或N，X10为G或R且X11为V或I。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7，和/或
b)重链CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ D NO：3和SEQ ID NO：9，和/或
c)重链CDR3，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：11；和/或
d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和/或
e)轻链CDR2，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10，和/或
f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
4.一种与CLDN18.2特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
g)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
h)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和重链CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含：
a)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
b)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1，其包含SEQ DNO：1的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或
b)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链可变区，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；或
b)重链可变区，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一种或多种氨基酸残基突变，但仍保持对人CLDN 18.2的结合特异性。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，至少一种所述突变为保守取代，或所有所述突变为保守取代。
10.根据权利要求8或9所述的抗体或其抗原结合片段，其中至少一种所述突变在所述重链可变区或轻链可变区的一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个非CDR序列中。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链CDR1(HCDR1)序列，其与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
b)重链CDR2(HCDR2)序列，其与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
c)重链CDR3(HCDR3)序列，其与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
d)轻链CDR1(LCDR1)序列，其与SEQ ID NO：2具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
e)轻链CDR2(LCDR2)序列，其与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和/或
f)轻链CDR3(LCDR3)序列，其与SEQ ID NO：6具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，和
所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体水平的结合亲和力。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和/或LCDR3，其中HCDR1在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，HCDR2在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，HCDR3在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11中具有不超过6、5、4、3、2或1个氨基酸突变，LCDR1在SEQ ID NO：2中具有不超过2或1个氨基酸突变，LCDR2在SEQ D NO：4或SEQ IDNO：10中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，LCDR3在SEQ ID NO：6中具有不超过3、2或1个氨基酸突变，且所述抗体或其抗原结合片段在与CLDN18.2保持结合特异性的同时，任选地具有类似于或甚至高于其亲本抗体水平的结合亲和力。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地包含IgG的重链恒定区和/或轻链恒定区。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述恒定区包含小鼠恒定区、兔恒定区或人恒定区。
16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体、融合蛋白、二聚化抗体或多聚化抗体，或经修饰抗体(例如糖基化抗体)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为双功能抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体或二价域抗体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与一个或多个部分连接。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述部分包含放射性同位素、镧系元素、化学发光标记、发色部分、胶体金粒子、荧光标记、酶-底物标记、地高辛标记、生物素/亲和素、半抗原、用于检测的DNA分子或粒子标记。
21.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述部分包含生物素或半抗原。
22.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合CLDN18.2。
23.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
24.一种载体，其包含根据权利要求23所述的分离的多核苷酸。
25.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的载体。
26.一种表达根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达根据权利要求24所述的载体的条件下培养根据权利要求25所述的宿主细胞。
27.一种检测样品中CLDN18.2的存在或表达水平的方法，其包括使所述样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与人CLDN18.2特异性结合的条件下接触，并且测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平。
28.一种用于诊断受试者的CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；和
b)测定所述样品中CLDN1 8.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，所述受试者被诊断为患有CLDN18.2相关疾病或病状(例如癌症)。
29.一种用于判定患有与CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者用CLDN18.2靶向剂进行治疗的适当性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
b)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，判定所述受试者为适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，判定所述受试者为不适合用CLDN18.2靶向剂进行治疗。
30.一种预测CLDN18.2靶向剂在受试者中治疗CLDN18.2相关疾病或病状的治疗有效性的方法，其包括：
a)使从所述受试者获得的样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
b)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；
c)预测所述CLDN18.2靶向剂的治疗有效性，
其中当发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是有效的，或
其中当未发现CLDN18.2的存在时或当CLDN18.2的表达水平低于所述阈值水平时，预测所述CLDN18.2靶向剂对于治疗所述受试者是无效的。
31.一种治疗患有CLDN18.2相关疾病或病状或存在患所述疾病或病状风险的受试者的方法，其包括：
a)选择适于所述治疗的受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中人CLDN18.2的存在或表达水平；
iii)当发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平达到阈值水平时，选择所述受试者为适于所述CLDN18.2相关疾病或病状的治疗；
b)给予所述选择的受试者治疗有效量的CLDN18.2靶向剂。
32.一种治疗患有癌症或存在患有癌症风险的受试者的方法，其包括：
a)选择受试者，其包括：
i)使从所述受试者获得的样品与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在允许所述抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2特异性结合的条件下接触；
ii)测定所述样品中CLDN18.2的存在或表达水平；
iii)当未发现CLDN18.2的存在时或当所述样品中CLDN18.2的表达水平低于阈值水平时，选择所述受试者为不适于用CLDN18.2靶向剂治疗进行治疗；
b)给予所述选择的受试者除CLDN18.2靶向剂以外的标准治疗。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述样品为细胞样品或组织样品。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述样品为固定的组织样品，任选地为***固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品。
35.根据权利要求27-34中任一项所述的方法，其中所述CLDN18.2是细胞表面或膜结合的CLDN18.2。
36.根据权利要求27-35中任一项所述的方法，其中CLDN18.2的存在或表达水平通过免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光(IF)、酶免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)或免疫印迹来测定。
37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述表达水平基于所述样品中阳性染色细胞的百分比进行定量。
38.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述表达水平基于所述样品中CLDN18.2的染色强度进行定量。
39.根据权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述CLDN18.2相关疾病或病状为癌症。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述样品包含肿瘤样品。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述肿瘤样品包含肿瘤组织或循环肿瘤细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述癌症是胃癌、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、***、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、***癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、***癌、垂体癌、胃癌、***癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合症、肉瘤、畸胎瘤、胆管癌和/或腺癌。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症为胃癌、胰腺癌、胆管癌或肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)。
45.根据权利要求29-44中任一项所述的方法，其中所述CLDN18.2靶向剂能够诱导对表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性。
46.根据权利要求29-45中任一项所述的方法，其中所述CLDN18.2靶向剂为治疗性抗CLDN18.2抗体或CLDN18.2结合分子(例如，与细胞毒性剂缀合的抗CLDN18.2抗体，或双特异性抗体)、靶向CLDN18.2的细胞疗法(例如，CAR-T、TCR-T或表达结合CLDN18.2的CAR的CAR-NK细胞)、靶向CLDN18.2的化合物或靶向CLDN18.2的治疗性核酸。
47.根据权利要求27-46中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受或已经接受抗癌疗法，或罹患癌症复发。
48.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其进一步包含用于检测与CLDN18.2结合的所述抗体或其抗原结合片段的复合物的试剂集合。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂集合包含与根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合的二级抗体，任选地所述二级抗体被可检测地标记。
51.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。
52.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段与间接可检测部分缀合。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述间接可检测部分包含生物素。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述试剂集合包含可检测标记的亲和素或链霉亲和素(steptavidin)。
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