CN114539410B

CN114539410B - Cldn18.2结合抗体、探针及在cldn18.2表达细胞的单细胞测序中的应用

Info

Publication number: CN114539410B
Application number: CN202210256081.6A
Authority: CN
Inventors: 贾广帅
Original assignee: Suzhou Quantitative Cell Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Quantitative Cell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114539410A

Abstract

本发明提供了一种新的抗CLDN18.2的抗体。上述抗体能够以高亲和力和特异性结合CLDN18.2，能够简单地与量子点等荧光物质结合，并且该形式能够在高分选速度下保持其对于CLDN18.2的高亲和力和特异性。此外，本发明还提供一种基于所述探针的CLDN18.2表达细胞的分选方法，其与一般使用抗体探针进行的流式细胞分选相比，具有更好的分选效率和更高的分选准确性，通过该分选方法，可以以极高的可靠性对CLDN18.2表达细胞进行单细胞测序。

Description

CLDN18.2结合抗体、探针及在CLDN18.2表达细胞的单细胞测序中的应用

技术领域

本发明涉及细胞分选领域。具体而言，本发明涉及结合CLDN18.2的抗体及其与荧光标记物结合特别是与量子点结合的探针形式，及其在治疗单细胞分选特别是流式细胞分选中的应用。

背景技术

包括胃癌及食道癌在内的上消化道肿瘤是一种全球常见，预后较差的恶性肿瘤。胃癌在癌症相关死亡率中排名第三，被认为是全世界最难治愈的癌症之一。在晚期或转移性胃癌或胃食管交界处(GEJ)腺癌患者中，中位总生存期(mOS)不超过10个月。因此，在细胞层面上对胃癌进行研究以获取靶向治疗的新思路在医学上具有极大的意义。近年来，随着单细胞分析技术的发展，对于胃癌分子机理的研究手段越来越多，但同时，这也要求更为精确、更为高通量的细胞分选方法的支持。

紧密连接蛋白(Claudin)家族蛋白是广泛分布于上皮细胞中的紧密连接结构的主要组成部分，其作用是维持控制细胞间分子交换的紧密连接。紧密连接蛋白广泛分布于胃、胰腺和肺组织，可用于诊断和治疗。CLDN18.2的分子量约27.8kd，具有四个跨膜区，且具有两个较短的胞外区EC1和EC2。而与其它紧密连接蛋白家族蛋白不同的是，在正常组织中CLDN18.2非常特异地仅表达于胃部高度分化的上皮细胞中(Tureci O et al.，Gene，2011)。在来源于胃上皮细胞的肿瘤中，有很高比例的肿瘤细胞表面表达CLDN18.2。在胃癌细胞的***和其它组织转移肿瘤中，也可以检测到高水平的CLDN18.2表达(Woll S.etal.，Int.J.Cancer，2013)。除胃癌外，也有很高比例的胆管癌、食道癌和胰腺癌等肿瘤细胞中表达CLDN18.2。因此，作为特异性表面标志物，CLDN18.2也是一个极具研究利用价值的细胞分选用靶点。

量子点是一种重要的低维半导体材料，其三个维度上的尺寸都不大于其对应的半导体材料的激子玻尔半径的两倍。量子点一般为球形或类球形，其直径常在2-20nm之间。常见的量子点由IV、II-VI，IV-VI或III-V元素组成。具体的例子有硅量子点、锗量子点、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点、硒化锌量子点、硫化铅量子点、硒化铅量子点、磷化铟量子点和砷化铟量子点等。

量子点是一种纳米级别的半导体，通过对这种纳米半导体材料施加一定的电场或光压，它们便会发出特定频率的光，而发出的光的频率会随着这种半导体的尺寸的改变而变化，因而通过调节这种纳米半导体的尺寸就可以控制其发出的光的颜色，由于这种纳米半导体拥有限制电子和电子空穴(Electro n hole)的特性，这一特性类似于自然界中的原子或分子，因而被称为量子点。

与荧光蛋白等荧光标记物相比，量子点具有以下的优点：1、同一激光可激发更多颜色，可以有效地避免蛋白质带来的背景的干扰；2、光稳定性高；3、通道间荧光渗漏小；4、亮度高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题

抗体探针能够探测表达特定的目标蛋白的细胞，而流式细胞术可以以较高的精度将抗体探针标记的细胞分选出来，其组合是要从样本中分离出特定细胞群时所使用的主要手段之一，然而，蛋白质造成的背景荧光会对流式细胞术的准确度造成影响，此外由于抗体是从外部结合目标细胞的，并且抗体探针一般结合大分子的荧光标记，其结合活性有时会受到荧光标记的影响(如空间位阻等)，因此在高分选速率的条件下，回收率有降低的倾向。

解决技术问题的技术手段

本发明提供了一种新的抗CLDN18.2的抗体。上述抗体能够以高亲和力和特异性结合CLDN18.2，能够简单地与量子点等荧光物质结合，并且该形式能够在高分选速度下保持其对于CLDN18.2的高亲和力和特异性。此外，本发明还提供一种基于所述探针的CLDN18.2表达细胞的分选方法，其与一般使用抗体探针进行的流式细胞分选相比，具有更好的分选效率和更高的分选准确性。

在一个方面，本发明涉及一种结合CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，其包含结合CLDN18.2的抗原结合域，所述结合CLDN18.2的抗原结合域具有SEQ ID NO:1的重链可变区(VH)序列和SEQ ID NO:2的轻链可变区(VL)序列。

在本发明的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述抗体可以是双特异性抗体或多特异性抗体。

在本发明的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，所述抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型。在一些实施方案中，所述抗体可以选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。

在本发明的抗体或其抗原结合片段的任何实施方案中，所述抗原结合片段可以选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、scFv片段、ds-scFv片段、dAb片段、单链片段、二价抗体和线性抗体。

在一个方面，本发明涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明涉及一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。

在一个方面，本发明涉及一种抗体探针，所述抗体探针包含与荧光物质结合的本发明的抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本发明涉及一种抗体探针，其中，所述荧光物质为量子点。

在一个方面，本发明涉及一种分离CLDN18.2表达细胞的流式细胞分选方法，其中，使用了所述抗体探针对CLDN18.2表达细胞进行标记。

发明的效果

本发明提供一种新的特异结合CLDN18.2的抗体，其在与量子点形成探针时，其能够有效避免蛋白质导致的背景荧光，且在高分选速率下依旧能够以高分选纯度、回收率对CLDN18.2表达细胞进行分选。

本发明的具体实施方式

以下将通过具体的实施例来描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验1.天然噬菌体库的构建

噬菌体展示技术是一种用于识别蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。由Simth于1985年建立。其原理是将外源多肽或蛋白质的DNA序列***到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达，最终多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相对的空间结构和生物活性，可以利用靶蛋白对其进行筛选。

在本次筛选中，总计获取、提取了200份来自成年健康个体外周血及脾脏或新生儿脐带血的单核细胞的总RNA，由此以避免个体差异所导致的抗体库的偏向性，同时尽可能地提高了所构建的库的多样性。将所述RNA逆转录合成单链cDNA，并使用对免疫球蛋白重链可变区域家族特异的引物进行了PCR反应。用制限酶SfiI和XhoI对该PCR产物进行随机切断，并以同样的制限酶对MV1473噬菌粒载体[包含编码共通轻链的基因(人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖细胞系列型基因)]进行处理，将所述PCR产物***到所述噬菌粒载体中，从而构建了所述文库。

试验2.CLDN18.2稳定表达细胞株的制备

为了进行噬菌体展示的筛选，制备稳定表达CLDN18.2的HEK293T细胞株(HEK293T-CLDN18.2)。其具体实验过程如下：将人CLDN18.2的cDNA序列克隆到pCDH慢病毒载体中，然后和慢病毒包装载体共同转染到293t细胞中。培养48或72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清，直接感染HEK293T细胞、CT26细胞或SNU601细胞。将慢病毒感染后的细胞用嘌呤霉素进行筛选培养，2-3周后使用CLDN18.2特异性抗体(IMAB362，Ganymed)进行流式细胞法来检测细胞的CLDN18.2表达。

上述结果表明，经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选，获得了稳定表达CLDN18.2的HEK293T细胞(命名为HEK293T-CLDN18.2细胞系)、CT26细胞(CT26-CLDN18.2)和SNU601细胞(SNU601-CLDN18.2)。

试验3.从抗体噬菌体展示文库中筛选抗CLDN18.2抗体

利用HEK293T-CLDN18.2稳定表达细胞株，进行了噬菌体展示文库的淘选。

具体流程简述如下：将噬菌体文库和HEK293T-K1细胞一同孵育，离心后取上清液。再将所述上清液与HEK293T-CLDN18.2细胞孵育，以使对CLDN18.2具有特异性的噬菌体与细胞结合。离心后收集细胞沉淀，并清洗和收集细胞。然后使用75mM的柠檬酸钠缓冲液洗脱与细胞结合的噬菌体文库。中和噬菌体文库后，使用M13K07辅助噬菌体扩增100倍筛选后的噬菌体文库，然后以类似第一轮筛选的方法进行第二轮和第三轮筛选。噬菌体的富集情况通过每一轮筛选的起始噬菌体用量和筛选后收集到的噬菌体滴度监测，并用噬菌体文库和HEK293T或HEK293T-CLDN18.2稳定表达细胞株进行流式细胞检测。

筛选三轮后得到经过了富集的噬菌体文库。使用该文库侵染细菌后，涂于琼脂糖平板培养。挑取单克隆菌落，放入96孔深孔板中用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2YT培养基于37℃震荡培养，得到含有单克隆噬菌体的上清。随后，使用流式细胞法检测噬菌体和细胞的结合，筛选得到结合HEK293T-CLDN18.2细胞而不结合HEK293T对照细胞的单克隆噬菌体CLD1-CLD3。

试验4.重组抗体的制备

将单克隆噬菌体的重链和轻链可变区的cDNA序列分别克隆到已含有抗体恒定区的pcDNA3.4载体(Invitrogen)中，共获得3个单克隆抗体的重链和轻链表达质粒。使用PEI法将质粒转染到EXPI-293细胞(Invitrogen)中，瞬时转染7-10天，离心并收取上清液。将上清液经过protein A纯化，获得纯化的抗体。上述3个单克隆抗体分别命名为CLD-1、CLD-2、CLD-3。这些抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列以及编码序列如以下表1所示。

表1

试验5.重组单克隆抗体的结合活性检测

检测了重组单克隆抗体对CLDN18.2的结合活性。具体而言，取生长良好的CT26-CLDN18.2稳定表达细胞株。将细胞用PBS清洗后，与倍比稀释的抗体混合，并在4℃孵育1小时。将细胞用流式细胞缓冲液清洗一次，加入PE标记抗人IgG抗体，并在4℃孵育30分钟。离心去除上清，使用流式细胞缓冲液清洗后，用流式细胞仪检测细胞表面的荧光强度。使用平均荧光强度计算每种抗体的相对结合活性。结果如下表2所示。

表2

	CLD-1	CLD-2	CLD-3
				EC50	1.312	0.712	0..693

试验6.量子点偶联抗体探针的制备

将上述抗体与量子点结合，具体流程简述如下：(1)清洗量子点(使用从昆道生物购买的QBC620(CdSe/ZnS量子点)，大小为100nm)：用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液清洗量子点至保存量子点的原缓冲液完全除去，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液保存量子点并超滤浓缩。所述pH＝7.2的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L。所述超滤浓缩为在20℃和7000r/min的条件下，用100K的超滤管离心6min。(2)活化：按比例分别称取EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，并将EDC和NHS直接加入步骤(1)所得的量子点溶液中，用振荡器混合5次后在23℃下反应50-70min，使得量子点活化；所述EDC、NHS和量子点的物质的量之比为25000：5000:1。(3)二次清洗量子点：用pH＝8.3的硼酸盐缓冲液清洗步骤(2)中所得活化量子点至EDC、NHS和磷酸盐缓冲液被完全除去，用pH＝8.3硼酸-盐缓冲液保存活化量子点并超滤浓缩，备用。所述pH＝8.5的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L；所述超滤浓缩在20℃和7000r/min的条件下进行，用100K的超滤管离心6min。(4)清洗抗体：用pH＝8.3的硼酸盐缓冲液清洗抗体并超滤浓缩除去抗体原保存液中的NaN₃，用pH＝8.3硼酸盐缓冲液保存抗体，备用。所述pH＝8.3的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L；所述超滤浓缩为在4℃和3000r/min的条件下，用50K的超滤管离心10min。(5)偶联：将步骤(3)所得活化量子点溶液与步骤(4)将所得抗体溶液混合均匀，在23℃及不断摇动下反应7h，得到蛋白-量子点偶联物反应液；活化量子点与抗体的摩尔比为1:10，活化量子点的浓度为0.8μmol/L。(6)分离：通过排阻层析分离步骤(5)的反应液得蛋白-量子点偶联物溶液和抗体回收液；蛋白-量子点偶联物溶液经超滤浓缩后加入封闭液并在4℃下保存；抗体回收液经超滤浓缩后回收再利用。排阻层析中使用的排阻层析柱的填料为Sephacryl300，流速为1.5ml/min，柱长为60cm。所述封闭液为Gly封闭液，Gly的浓度为1mg/mL，溶剂为50mmol/L、pH＝8.3的硼酸盐缓冲液。步骤(6)中浓缩后的蛋白-量子点偶联物溶液中加入NaN₃，使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN₃的浓度为0.05mg/mL，以使蛋白-量子点偶联物溶液可长期保存。

需要说明的是，在本实施例中使用了edc-nhs反应将100nm的CdSe/ZnS量子点与抗体结合，但是量子点并不限于CdSe/ZnS量子点，且连接方式不限于edc-nhs反应。

试验7.使用流式细胞分选法对上述探针进行评价

使用上述制备的CLDN18.2表达HEK293T细胞株，制备了于AAVS1位点处敲入了GFP的CLDN18.2表达HEK293T细胞株(以下也称为HEK293T-CLDN18.2-GFP)。使用HEK293T-CLDN18.2-GFP对上述制备的探针的效果进行检测，简要步骤如下：(1)使用胰蛋白酶消化普通HEK293T细胞和HEK293T-CLDN18.2-GFP后离心，用PBS缓冲液(含2％FBS)重悬细胞，制备单细胞悬液，计数，并以1：1的比例将2种细胞混合以作为测试细胞。(2)根据计数结果决定抗体用量，在冰浴中使用各探针，与测试细胞孵育30min,避光。(3)800rpm,5min离心，弃去上清。(4)用500μL PBS缓冲液(含2％FBS)重悬细胞，800rpm，5min离心，弃去上清。(5)用PBS缓冲液(含2％FBS)调整各样品细胞浓度至10⁶个/ml。(6)使用BD FACSCalibur流式细胞仪，以475nm为激发光波长，以625nm为发射光波长，流速设定为5000个/秒，进行流式细胞分选，得到回收组细胞和非回收组细胞。(7)将细胞接种到96孔板中，培养一天，洗去死细胞后用于下述评价。结果如下表所示。

回收率评价：

在荧光显微镜下观察非回收组细胞，统计表达GFP的细胞比例，从100％中减去该比例，以作为回收率。

回收纯度评价：

在荧光显微镜下观察回收组细胞，统计表达GFP的细胞比例，以作为回收纯度。

试验结果如下表3所示。

表3

	回收率	回收纯度
			CLD-1量子点探针	99.8％	99.1％
CLD-2量子点探针	93.3％	90.3％
			CLD-3量子点探针	96.2％	93.1％

试验8.高流量下的分选评价

在连接有较大的量子点的情况下，一旦流速较高，抗体被洗脱的可能性也较大，因此，对于所述CLD-1量子点探针，进一步进行了在流速设定为7000个/秒，10000个/秒，12000个/秒的条件下的回收率评价以及回收纯度评价，结果如下表4所示。

表4

	回收率	回收纯度
			7000个/秒	99.8％	99.1％
10000个/秒	99.2％	98.9％
			12000个/秒	99.0％	99.3％

根据以上的结果，可以看出，虽然CLD-1的结合活性为候选中的第3位，但CLD-1量子点探针对于HEK293T-CLDN18.2-GFP的分选纯度、回收率最高，都为百分之99以上，在12000个/s的高流速下依旧能够保持该分选性能，可见该抗体在与较大量子点结合后，其结合活性不受到影响，且在高分选通量下依旧能够以高分选纯度、回收率对CLDN18.2表达细胞进行分选。

试验9.在单细胞测序中的应用

以上述实施例8中记述的12000个/秒的条件，分选单个细胞10个，分别培养过夜后对AAVS1位点处进行测序，确认了分离得到的细胞均为HEK293T-CLDN18.2-GFP细胞，可靠性为100％。

产业上的利用可能性

本发明所提供的抗体能够用于与量子点结合而制备即使在高分选速率下依旧能够以高分选纯度、回收率对CLDN18.2表达细胞进行分选的探针，在科研、临床上都有较大的实用价值。

序列表

<110>

<120> CLDN18.2结合抗体、探针及在CLDN18.2表达细胞的单细胞测序中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagtgcaac tggttgaaag gagaagacaa tcagtaaagc ctggaggctc cctcaaactc 60

agttgcgccg cttccggttt tacattcaac acttatgcca gcctggaatg ggtggcacgg 120

cccggaaaag gcctggaatg ggtggcacgg atcaggagca aatacaacaa ttacgccaca 180

tattacgctg actccgttaa agacagattc acaatttcca gagatgattc caagaatact 240

gcttatctcc agatgaacaa cctgaagagt gcctcgcagc tctctgggca cacaaacata 300

catttgcgac aagactcaca cttccagcaa cacaaaagtg gatacagaag gtggagccaa 360

agagttgcga caagactcac acttgtccac cttgcccagc acccgaagct gccggcggtc 420

caagatctct cgcactcctc aaactcaaca taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtgctg 480

caccaagaca gtttctttct gtacagtaac aagtgcaaag tgagcaataa ggccctgcca 540

gcacctattg agaagacaat cagtaaagcc aagggtcagc ctcgcgagcc tcaggtgtac 600

accctgctat gtactattgc gtgcggcaag tgcaaagtga gcaatactat gtcagttggt 660

ttgcctactg gggacaggga actctcgtta ctgtcagctc cgccagtacc aagggcccat 720

ccgttttccc tctggcaccc tcctccaaat caacaagcgg cgggactgcc gccctcgggt 780

gtctggtaca agactacttc ccagaacccg tcaccgtcag ttggaacagt ggcgccctcg 840

gtcgcccaag gacaccctga tgatctctcg ccatgtggat ggcgtggagg ttcacaacgc 900

caaaactcag ccaagagagg agcagtatac ctctggagtc catacctttc cagccgtcca 960

ccttgcccag cacccgtatt ccctctccag tgtggtgacc cgacatcgca gttgaatggg 1020

cctccttcac gggacgaact cacaaagaat cagcgaccgt gctgcaccaa gaccaaggga 1080

ttttatccct ccagaggata cagagagcaa tggtcagccc gagaacaatt acaaaaccac 1140

tcagaagaag ctggattcag atggcagttt ctttctgtac agtcaactca ccgttcacaa 1200

gagtcggtgg cagcagggtc acgtgttctc ctgtcgtgtc atgcacgaag cactgcatca 1260

tcactacact cagaagtctc tcagtctgtc tcctggaaag tga 1303

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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caagagagct ccagggactc ctgtctgaga agcaggtcaa gtgactcatc agggactcag 120

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ggaacaattt ctacccttgt ccacaaactc actacaagcc ctggaggcac cgttacactg 600

acctgtcgct cttccactgg cgccgtgacg gctactgtct gctcgtgt 648

<210> 3

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaagtgcaat ccatacctac atttaaacac agatcacaag ggtggcacga tggcgtggac 60

tccagatcaa caacctccat ggagatctct caaagtcacc ctcagcctga cgctgacgcc 120

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ttggttctac tgtcagtgga aagtgca 1167

<210> 4

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatattcacg agttcgcgaa ccactggcga gtgagggact cctgtctcag aacatggagc 60

aaccgaagga aagagtctgg gacaacccgc ggaggcggcg atgtcccaaa ttccaacact 120

gcgatggttc agatgggtgt tcggttcatc tttcccgagg cacaaacagc atcaatatcg 180

ccgaaatcag aaaaatcgcc aactgggtct ctgatcggtg ggaaggcagc tctgacaatc 240

actgttgcaa cgctccagcc gtcacgaaac gtccgggata tctggctcaa tcagccctcc 300

gatgctctca cggaggggct ccgaaaggga ggcaccgtta cagcctcgct cactcacgta 360

ctccaactat cacaagcacc aagtctttca acaggggaga cgggaggccc agagaactgc 420

agctcttgga ctatttctca cagcctccgt cgtctgacag ggtctcgtgc tctccgaggt 480

ggaaccagcc tgcacagcgt gcattcgtgg ccgagatcaa gccttaccct tagctcccac 540

atgctcgtg 549

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagtgcaac tggaatttcc agagatgatt ccaagaatac tgcttatctg gcaccctcct 60

ccaaatcaac aaggccaaag agttgcgaca agcctggagg ctctggagtc catacctttg 120

tacgcacctc cgccagtacc aagggcccat ccgttttccc tggttcacaa cgccaaaact 180

cagccaagac gtgtctgtgc ctactggtca acctattcag aagacaatca gtcaagccaa 240

gggtcagcct cgcgagcctc acggcgggac tgccgccctc aagtgcaagg gattttatcc 300

ctccagagga tacagagagc aatggtcagc ccgagaacaa ttacaatgat ctctcgtcct 360

caagtggatg gcgtggactc cagatcaaca acctcaagag tgcctcggga cagggaactc 420

tcaagaccca gaactcaaca taccgggtcg tacgcgtgca aaccgtgctg caccaagaca 480

gtttctttct gtacagtaag tggaggtgta caccctgcta tgtactattg cgtgcggcaa 540

gtgcaaagtg agcaatacta tgtcagttgg ttctcagttg cgccgcttcc ggttttacat 600

tcaacactta tgccagcctg gaatgggtgg cacagattca cacttgtcca ccttgcccag 660

cacccgaagc tgccggcggt ccaagatctc tcaaagtcac ccaaggacac cctgaaaggc 720

ctggaatggg tggcacggat caggagcaaa tacaacaatt acgccacata ttacgctgac 780

tccgtgtacc tgactcaccc agccgtccac cttgcccagc acccgtattc cctctccgca 840

ataagtgtgg tgacccgaca tcgcagtaaa atgggcctcc ttcacgggac gaactcacaa 900

agaatcagcg accgtgctgc acctggccct gccagcaccc tcaaattgaa aggagaagac 960

aatcagcagc tctctgggca cacaaacata catttgcgac aagactcaca cttccagcaa 1020

cacaaaagtg gatcgaagcg gtcattactg tcagccatgg agcagtcgaa gaagctggat 1080

tcagatggca gtttctttct gtacagtcaa ctcaccgttc acaagagtcg gtggcagcag 1140

ggtcacgtgt tctcctgtcg tgtcatgcac gaagcactgc atcatcacta cactcagaag 1200

tctctcagtc tgtctcctgg aaagtgc 1227

<210> 6

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatattcacg tggaaagaga actgggtgca gttcgcagct ccatccgtgg tactcaaatc 60

tggctcaatc agccctccga tgctctcacg gaggggctcc gagctcatca cccgttagtg 120

gcacagcctc cgtcgtctga cagggtctcg tgctctctga ggtggaacca ggacacaact 180

ctaagagatg aggacaagaa ccaacactgc gatggttcag atgggtgttc ggttcatctt 240

tcccgaggca caaacacgag caaccgaaac ctggaggcac cgttacaccg acctgtcgct 300

cttccactgg cgccgtcacg gctaacgcga gtctggaccc aagcagctcc agggactcct 360

gtctcagaac atggagcagg tcaagtgact ctggttgatc gagatcaagc cttccaacta 420

tcacaagcac caagtctttc aacaggggag acgggaggcc aaggtccagg cgcaaagatc 480

agtccggaaa tagccaactg ggtctctgat cggtgggaag gcagctctga caatcactgg 540

agtgcaaccc gaggaacaat ttctaccctt agctcccaca tgctcgtg 588

<210> 7

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Arg Arg Arg Gln Ser Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Ser Leu Glu Trp Val Ala Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ser Ala Ser Gln Leu Ser Gly

85 90 95

His Thr Asn Ile His Leu Arg Gln Asp Ser His Phe Gln Gln His Lys

100 105 110

Ser Gly Tyr Arg Arg Trp Ser Gln Arg Val Ala Thr Arg Leu Thr Leu

115 120 125

Val His Leu Ala Gln His Pro Lys Leu Pro Ala Val Gln Asp Leu Ser

130 135 140

His Ser Ser Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asn Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Leu Cys Thr Ile Ala Cys

195 200 205

Gly Lys Cys Lys Val Ser Asn Thr Met Ser Val Gly Leu Pro Thr Gly

210 215 220

Asp Arg Glu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Pro Pro Val Pro Arg Ala His

225 230 235 240

Pro Phe Ser Leu Trp His Pro Pro Pro Asn Gln Gln Ala Ala Gly Leu

245 250 255

Pro Pro Ser Gly Val Trp Tyr Lys Thr Thr Ser Gln Asn Pro Ser Pro

260 265 270

Ser Val Gly Thr Val Ala Pro Ser Val Ala Gln Gly His Pro Asp Asp

275 280 285

Leu Ser Pro Cys Gly Trp Arg Gly Gly Ser Gln Arg Gln Asn Ser Ala

290 295 300

Lys Arg Gly Ala Val Tyr Leu Trp Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Arg Pro

305 310 315 320

Pro Cys Pro Ala Pro Val Phe Pro Leu Gln Cys Gly Asp Pro Thr Ser

325 330 335

Gln Leu Asn Gly Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Arg

340 345 350

Pro Cys Cys Thr Lys Thr Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Arg Gly Tyr Arg

355 360 365

Glu Gln Trp Ser Ala Arg Glu Gln Leu Gln Asn His Ser Glu Glu Ala

370 375 380

Gly Phe Arg Trp Gln Phe Leu Ser Val Gln Ser Thr His Arg Ser Gln

385 390 395 400

Glu Ser Val Ala Ala Gly Ser Arg Val Leu Leu Ser Cys His Ala Arg

405 410 415

Ser Thr Ala Ser Ser Leu His Ser Glu Val Ser Gln Ser Val Ser Trp

420 425 430

Lys Val

<210> 8

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Cys Ser Leu Val Leu Lys Ser Gly Ser Ser Arg Ser Asp

1 5 10 15

Trp Arg His Lys Gln Glu Ser Ser Arg Asp Ser Cys Leu Arg Ser Arg

20 25 30

Ser Ser Asp Ser Ser Gly Thr Gln Leu Thr Arg Tyr Gln Val Phe Gln

35 40 45

Gln Gly Arg Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

50 55 60

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Met Arg Thr Arg Thr Asn Thr Ala Arg

65 70 75 80

Asn Leu Leu Leu Ser Arg Thr Leu Arg Ile Gln Pro Thr Ala Ser Pro

85 90 95

Ala Pro Lys Leu Ser Ala Arg Gln Ile Ile Trp Phe Ser Gly Trp Val

100 105 110

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Pro Leu Pro Thr Met Gln

115 120 125

Thr Gly Cys Ser Ser Gln Leu His Pro Cys Ser Ser Phe His Pro Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Arg Lys Val Ala Gln Pro Pro Ser Ser Asp Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ala Trp Thr Val Ser Asp Arg Trp Glu Gly Ser Ser Asp Asn His Trp

165 170 175

Ser Ala Thr Arg Gly Thr Ile Ser Thr Leu Val His Lys Leu Thr Thr

180 185 190

Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala

195 200 205

Val Thr Ala Thr Val Cys Ser Cys

210 215

<210> 9

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Ser Ile Pro Thr Phe Lys His Arg Ser Gln Gly Trp His

1 5 10 15

Asp Gly Val Asp Ser Arg Ser Thr Thr Ser Met Glu Ile Ser Gln Ser

20 25 30

His Pro Gln Pro Asp Ala Asp Ala Lys Thr Gln Pro Arg Arg Val Leu

35 40 45

Leu His Pro Tyr Ser Leu Ser Ala Met Ser Ser Phe Leu Glu Ser Pro

50 55 60

Ser Asp Arg Ser Leu Leu Val Asn Leu Pro Arg Asp Gln Glu Gln Ile

65 70 75 80

Gln Gln Leu Arg His Ile Pro Arg Lys Val Gly Phe Arg Trp Gln Phe

85 90 95

Leu Ser Val Gln Ser Thr His Arg Ser Pro Leu Leu Gln Ile Asn Lys

100 105 110

Ala Lys Glu Leu Arg Gln Ala Trp Arg Leu Trp Ser Ser Gln Ser Val

115 120 125

Cys Ala Ala Lys Leu Pro Ala Val Gln Asp Phe Gln Gln Thr Thr Ser

130 135 140

Cys Thr Gln Pro Ser Thr Phe Val Arg Thr Leu Ser Gly Phe Thr Phe

145 150 155 160

Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Lys Cys Phe Pro Trp Phe Lys Arg Ser Phe

165 170 175

Gln Glu Tyr Trp Asn Gly Trp Gln Ser Arg Val Leu Leu Ser Cys His

180 185 190

Ala Arg Ser Thr Ala His Pro Arg Phe Tyr Pro Val Gln Gln Val Glu

195 200 205

Gly Ser Lys Met Gly Leu Leu His Gly Thr Asn Ser Gln Arg Asn Phe

210 215 220

Leu Thr Thr Leu Arg Ser Leu Glu Cys Ala Ser Ala Arg Gly Arg Val

225 230 235 240

Pro Pro Glu Asp Thr Glu Ser Asn Gly Gln Lys Val Glu Ile His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Ser Ala Ala Ser Ile Trp His Ala Ser Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Lys Glu Arg Arg Arg Gln Ser Ala Ala Leu Trp Ala His Lys

275 280 285

Gln Gly Ser Thr Cys Glu Val Cys Asn Cys Asp Pro Thr Ser Arg Glu

290 295 300

Pro His Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Pro Lys Lys Thr Ile

305 310 315 320

Asn Lys Thr His Gln Ser Lys Lys Leu Gly Pro Thr Gly Ser Tyr Ala

325 330 335

Cys Lys Pro Cys Cys Thr Lys Thr Val Arg Gln Tyr Gln Gly Pro Ile

340 345 350

Arg Phe Ser Asp Arg Ala Ala Pro Gly Pro Ala Ser Thr Leu Lys Leu

355 360 365

Arg Thr Pro Ser Lys Ala Arg Ala Ile Leu Cys Gln Leu Val Leu Leu

370 375 380

Ser Val Glu Ser Ala

385

<210> 10

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile His Glu Phe Ala Asn His Trp Arg Val Arg Asp Ser Cys Leu

1 5 10 15

Arg Thr Trp Ser Asn Arg Arg Lys Glu Ser Gly Thr Thr Arg Gly Gly

20 25 30

Gly Asp Val Pro Asn Ser Asn Thr Ala Met Val Gln Met Gly Val Arg

35 40 45

Phe Ile Phe Pro Glu Ala Gln Thr Ala Ser Ile Ser Pro Lys Ser Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Thr Gly Ser Leu Ile Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile

65 70 75 80

Thr Val Ala Thr Leu Gln Pro Ser Arg Asn Val Arg Asp Ile Trp Leu

85 90 95

Asn Gln Pro Ser Asp Ala Leu Thr Glu Gly Leu Arg Lys Gly Gly Thr

100 105 110

Val Thr Ala Ser Leu Thr His Val Leu Gln Leu Ser Gln Ala Pro Ser

115 120 125

Leu Ser Thr Gly Glu Thr Gly Gly Pro Glu Asn Cys Ser Ser Trp Thr

130 135 140

Ile Ser His Ser Leu Arg Arg Leu Thr Gly Ser Arg Ala Leu Arg Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ser Leu His Ser Val His Ser Trp Pro Arg Ser Ser Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Ser His Met Leu Val

180

<210> 11

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Glu Phe Pro Glu Met Ile Pro Arg Ile Leu Leu Ile

1 5 10 15

Trp His Pro Pro Pro Asn Gln Gln Gly Gln Arg Val Ala Thr Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Leu Glu Ser Ile Pro Leu Tyr Ala Pro Pro Pro Val Pro Arg

35 40 45

Ala His Pro Phe Ser Leu Val His Asn Ala Lys Thr Gln Pro Arg Arg

50 55 60

Val Cys Ala Tyr Trp Ser Thr Tyr Ser Glu Asp Asn Gln Ser Ser Gln

65 70 75 80

Gly Ser Ala Ser Arg Ala Ser Arg Arg Asp Cys Arg Pro Gln Val Gln

85 90 95

Gly Ile Leu Ser Leu Gln Arg Ile Gln Arg Ala Met Val Ser Pro Arg

100 105 110

Thr Ile Thr Met Ile Ser Arg Pro Gln Val Asp Gly Val Asp Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Thr Ser Arg Val Pro Arg Asp Arg Glu Leu Ser Arg Pro Arg

130 135 140

Thr Gln His Thr Gly Ser Tyr Ala Cys Lys Pro Cys Cys Thr Lys Thr

145 150 155 160

Val Ser Phe Cys Thr Val Ser Gly Gly Val His Pro Ala Met Tyr Tyr

165 170 175

Cys Val Arg Gln Val Gln Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Ser Trp Phe Ser

180 185 190

Val Ala Pro Leu Pro Val Leu His Ser Thr Leu Met Pro Ala Trp Asn

195 200 205

Gly Trp His Arg Phe Thr Leu Val His Leu Ala Gln His Pro Lys Leu

210 215 220

Pro Ala Val Gln Asp Leu Ser Lys Ser Pro Lys Asp Thr Leu Lys Gly

225 230 235 240

Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr

245 250 255

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Tyr Leu Thr His Pro Ala Val His Leu Ala

260 265 270

Gln His Pro Tyr Ser Leu Ser Ala Ile Ser Val Val Thr Arg His Arg

275 280 285

Ser Lys Met Gly Leu Leu His Gly Thr Asn Ser Gln Arg Ile Ser Asp

290 295 300

Arg Ala Ala Pro Gly Pro Ala Ser Thr Leu Lys Leu Lys Gly Glu Asp

305 310 315 320

Asn Gln Gln Leu Ser Gly His Thr Asn Ile His Leu Arg Gln Asp Ser

325 330 335

His Phe Gln Gln His Lys Ser Gly Ser Lys Arg Ser Leu Leu Ser Ala

340 345 350

Met Glu Gln Ser Lys Lys Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

355 360 365

Ser Gln Leu Thr Val His Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly His Val Phe

370 375 380

Ser Cys Arg Val Met His Glu Ala Leu His His His Tyr Thr Gln Lys

385 390 395 400

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Cys

405

<210> 12

<211> 196

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ile His Val Glu Arg Glu Leu Gly Ala Val Arg Ser Ser Ile Arg

1 5 10 15

Gly Thr Gln Ile Trp Leu Asn Gln Pro Ser Asp Ala Leu Thr Glu Gly

20 25 30

Leu Arg Ala His His Pro Leu Val Ala Gln Pro Pro Ser Ser Asp Arg

35 40 45

Val Ser Cys Ser Leu Arg Trp Asn Gln Asp Thr Thr Leu Arg Asp Glu

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Asp Lys Asn Gln His Cys Asp Gly Ser Asp Gly Cys Ser Val His Leu

65 70 75 80

Ser Arg Gly Thr Asn Thr Ser Asn Arg Asn Leu Glu Ala Pro Leu His

85 90 95

Arg Pro Val Ala Leu Pro Leu Ala Pro Ser Arg Leu Thr Arg Val Trp

100 105 110

Thr Gln Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Ser Glu His Gly Ala Gly Gln

115 120 125

Val Thr Leu Val Asp Arg Asp Gln Ala Phe Gln Leu Ser Gln Ala Pro

130 135 140

Ser Leu Ser Thr Gly Glu Thr Gly Gly Gln Gly Pro Gly Ala Lys Ile

145 150 155 160

Ser Pro Glu Ile Ala Asn Trp Val Ser Asp Arg Trp Glu Gly Ser Ser

165 170 175

Asp Asn His Trp Ser Ala Thr Arg Gly Thr Ile Ser Thr Leu Ser Ser

180 185 190

His Met Leu Val

195

Claims

1.一种CLDN18.2抗体或抗体片段，其包含SEQ ID NO:7所示的重链序列，和SEQ ID NO:8所示的轻链序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab片段、Fab'片段、Fv片段、F(ab')2片段和scFv片段。

3.一种抗体探针，其包含权利要求1-2中任一项所述的抗体或抗体片段和荧光标记物。

4.根据权利要求3所述的抗体探针，其中，荧光标记物为量子点。

5.一种非疾病诊断和治疗目的CLDN18.2表达细胞的分选方法，其使用了权利要求3所述的抗体探针。

6.根据权利要求5所述的方法，其为流式细胞分选法。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，流速为10000个/s～12000个/s。

8.一种非疾病诊断和治疗目的CLDN18.2表达细胞的单细胞测序方法，其使用了权利要求5所述的分选方法。