KR20230146591A - 신규 항pad4 항체 - Google Patents

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KR20230146591A
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유야 미야모토
고이치 와다
유이치 이무라
겐지 사이토
도모코 사카타
다카나리 시게미쓰
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미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션
가부시키 가이샤 파마푸즈
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Abstract

HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 제공한다.

Description

신규 항PAD4 항체
본 발명은, 신규 항PAD4 항체에 관한 것이다.
PAD4(Peptidylarginine deiminase 4)는, 단백질 중의 아르기닌의 시트룰린화에 관여하는 효소로서 알려져 있다. 이 시트룰린화는, 단백질을 구성하는 아미노산 중에서 가장 염기성이 강한 아르기닌이 중성의 시트룰린으로 변환되는 반응이기 때문에, 단백질의 구조와 반응에 있어서 중요하다.
시트룰린화는, 관절 류머티즘(RA)으로의 관련성이 보고되어 있다. 예를 들면, RA에서는 비멘틴, 콜라겐 및 피브린 등이 활막에 항원으로서 존재하고 있으므로, 이들에 대한 항체인 항환형 시트룰린화 펩티드 항체(항CCP 항체) 검출 키트가 RA의 진단약으로서 판매되고 있다.
PAD4와 RA에 관한 보고도 몇 가지 존재한다. 예를 들면, 비특허문헌 1에는, RA의 발증과 PAD4 유전자의 단일염기 다형과의 사이에 상관이 있는 것이 보고되어 있다. 또한, 비특허문헌 2에는, RA를 진단하기 위해 항PAD4 항체를 사용한 것이 보고되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는, 4종류의 항PAD4 항체의 혼합물을 마우스에 투여함으로써, RA를 억제하는 시도가 기재되어 있다(특허문헌 1의 실시예 2 참조). 또한, 특허문헌 2에는, PAD4로의 친화성, 및 시트룰린화 활성 저해능이 보다 우수한 항PAD4 항체가 기재되어 있다.
PAD4와 전신성 홍반루푸스(SLE)에 관한 보고로서는 PAD4 녹아웃 마우스를 이용한 SLE 모델(이미퀴모드 유발 모델)에 있어서 야생주에 비하여 신장염이 억제된 보고나 저분자 PAD 저해제(Cl-Amidine 및 BB-Cl-Amidine) 투여에 의해, SLE 모델(MRL/lpr 모델) 마우스의 신장염이 억제된 보고가 있다(비특허문헌 3, 4, 5). 또한, PAD4를 녹아웃된 MRL/lpr 마우스에서 SLE 증상이 야생주와 마찬가지로 발증하였다고 하는 보고나 저분자 저해약(Cl-Amidine)을 신장염 모델(항GBM 항체 유발 모델 및 SLE 환자 혈청 이입 마우스)에 투여해도 신장염의 발증 억제가 불가능하였다는 보고가 있다(비특허문헌 6).
이와 같은 질환과 PAD4의 관련으로부터, 결합 친화성이나 안정성 등이 더욱 우수한 항PAD4 항체가 기대되고 있다.
WO/2012/026309 WO/2016/143753
"Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis.", Suzuki et al., Nat Genet. 2003 Aug;34(4): 395-402. "Two novel sandwich ELISAs identify PAD4 levels and PAD4 autoantibodies in patients with rheumatoid arthritis.", Ishigami et al., Mod Rheumatol. 2013 Jul;23(4): 794-803. "Peptidylarginine deiminases 2 and 4 modulate innate and adaptive i㎜une responses in TLR-7-dependent lupus", Yudong et al., JCI Insight. 2018 Dec 6;3(23):e124729. "Peptidylarginine deiminase 4 Promotes the Renal Infiltration of Neutrophils and Exacerbates the TLR7 Agonist-Induced Lupus Mice", Hanata et al., Front I㎜unol. 2020 Jun 23;11:1095. "Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice", Knight et al., Ann Rheum Dis. 2015 Dec;74(12):2199-2206. "Lupus and proliferative nephritis are PAD4 independent in murine models", Gordon et al., JCI Insight. 2017 May 18;2(10): e92926.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어 것이며, 우수한 특성을 가지는 항PAD4 항체를 제공하는 것, 또는 우수한 RA 또는, 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병 등의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것 등을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭 행하였다. 그 결과, 특정한 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 가지는 항PAD4 항체가, 우수한 결합 특성, 보존 안정성을 가지는 것을 찾아냈다. 또한, 특정한 프레임워크 영역(FR) 서열을 가지는 항PAD4 항체가, 우수한 화학적 안정성을 가지는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 요지는, 하기에 관한 것이다.
[1] HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[2] HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 7∼10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13∼15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, [1]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[3] a-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
b-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
c-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
d-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로부터 선택되는, [1] 또는 [2]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[4] a-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
b-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
c-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
d-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로부터 선택되는, [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[5] a-3) 중쇄(重鎖) 가변 영역이 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄(輕鎖) 가변 영역이 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
b-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
c-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
d-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[6] a-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
b-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
c-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
d-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로부터 선택되는, [5]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
[7] a-5) 중쇄가 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
b-5) 중쇄가 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
c-5) 중쇄가 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
d-5) 중쇄가 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로부터 선택되는, [5] 또는 [6]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[8] 중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, [1]∼[7] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[9] PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하인, [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[10] [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
해당 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 40℃에서 1개월간 보존했을 때, 해당 보존 전의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편이 가지는 PAD4 결합량에 비하여, 90% 이상의 결합량을 가지는 것인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[11] e-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[12] e-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, [11]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[13] e-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 28의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[14] e-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 28의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, [13]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[15] e-5) 중쇄가 서열번호 28로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 27로 이루어지는, [13] 또는 [14]에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[16] [11]∼[15] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서, 생성 시에 생기는 절단이 총생성량의 3% 미만인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[17] 항체가 중화 항체인, [1]∼[16] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[18] 항체가 서열번호 29로 표시되는 PAD4의 결합 항체인, [1]∼[17] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
[19] [1]∼[15] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 핵산 분자.
[20] [19]에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.
[21] [20]에 기재의 재조합 벡터를 포함하는, 형질전환체.
[22] [1]∼[18] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는, 의약 조성물.
[23] 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방제 또는 치료제인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[24] 단백질에서의 시트룰린화의 억제제인, [22] 또는 [23]에 기재된 의약 조성물.
[25] 세포에서의 네토시스(NETosis)의 억제제인, [22]∼[24] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.
[26] 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 예방 또는 치료하기 위한, [1]∼[18] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 [22]∼[25] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물의 사용.
[27] 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방제 또는 치료제를 제조하기 위한, [1]∼[18] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 [22]∼[25] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물의 사용.
[28] [1]∼[18] 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 [22]∼[25] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 유효량 투여하는 것에 의한, 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료 방법.
본 발명에 의해, 우수한 특성을 가지는 항PAD4 항체, 및 우수한 RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료 방법 등이 제공된다.
[도 1] 도 1은, CAIA 모델 마우스의 제작 방법, 및 본 발명의 항PAD4 항체에 의한 CAIA 모델에서의 관절염으로의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는, 본 발명의 항PAD4 항체에 의한 CIA 모델에서의 관절염으로의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 본 발명의 항PAD4 항체에 의한 cGvHD 모델에서의 요단백로의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 본 발명의 항PAD4 항체에 의한 cGvHD 모델에서의 발증율로의 효과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해, 이하에 본 발명에 사용되는 용어를 설명한다.
[중화]
본 발명에 있어서 「중화」란 목적의 표적에 결합하고, 또한, 그 표적의 어느 하나의 기능을 저해할 수 있는 작용을 말한다. 즉, 「PAD4의 활성을 중화한다」란, 항PAD4 항체가 PAD4에 결합하는 것에 의해, PAD4의 활성을 저해하는 것을 말한다. PAD4의 활성은, 당 분야에 있어서 알려진 몇 가지의 in vitro 또는 in vivo 분석의 하나 또는 그 이상에 의해 평가할 수 있다. PAD4의 활성은 예를 들면 단백질 중의 아르기닌의 시트룰린화 활성이며, 항PAD4 항체의 중화 활성은, 본 명세서에 기재된 시트룰린화 저해 시험에 의해 평가할 수 있다.
[단리된]
단리된 항PAD4 항체 등의 「단리된」이란, 동정되고, 또한, 분리된, 및/또는, 자연 상태에서의 성분으로부터 회수되었다는 의미이다. 자연 상태에서의 불순물은 그 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타의 단백질성의 용질 또는 비단백질성의 용질을 들 수 있다. 일반적으로, 항PAD4 항체를 단리하기 위해서는, 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제하면 되고, 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제된 항PAD4 항체를 「단리된 항PAD4 항체」라고 할 수 있다.
[인간 항체]
인간 항체란, 경쇄, 중쇄 모두 인간 면역 글로불린 유래의 항체를 말한다. 인간 항체는 중쇄의 정상 영역의 차이에 따라, γ쇄의 중쇄를 가지는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함), μ쇄의 중쇄를 가지는 IgM, α쇄의 중쇄를 가지는 IgA(IgA1, IgA2를 포함함), δ쇄의 중쇄를 가지는 IgD, 또는 ε쇄의 중쇄를 가지는 IgE를 포함한다. 또한 원칙으로서 경쇄는, κ쇄와 λ쇄 중 어느 한쪽을 포함한다.
[인간화 항체]
인간화 항체는, 비인간 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역과, 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 가변 영역, 및 인간 항체 유래의 정상 영역으로 이루어지는 항체를 말한다.
[키메라 항체]
키메라 항체란, 경쇄, 중쇄, 또는 그 양쪽이, 비인간 유래의 가변 영역과, 인간 유래의 정상 영역으로 이루어지는 항체를 말한다.
[항PAD4 항체]
본 발명에 있어서 항PAD4 항체는, PAD4에 결합하는 면역 글로불린 분자 또는 그 개변 분자를 말한다. 개변 분자에는, 다중특이성(multispecific) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 기능 개변 항체, 및 콘쥬게이트 항체를 포함하는 것으로 한다.
[다중특이성 항체]
다중특이성 항체란, 2개 이상의 상이한 항원특이성을 가지는 2개 이상의 독립된 항원 인식 부위를 가진 비대칭의 항체이며, 2개의 항원특이성을 가지는 이중특이성 항체, 3개의 항원특이성을 가지는 삼중특이성 항체 등을 들 수 있다.
[기능 개변 항체]
본 발명에 있어서 기능 개변 항체란, 항체 서열, 당쇄 등을 개변하는 것에 의해, 항체가 가지는 항원 결합 기능 이외의 기능, 예를 들면, 세포 살상 기능, 보체(補體) 활성화 기능이나 혈중 반감기 연장 기능을 변형한 항체를 말한다.
[콘쥬게이트 항체]
본 발명에 있어서 콘쥬게이트 항체란, 항체에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자, 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 항체를 말한다.
[항체 단편]
본 발명에 있어서 항체 단편이란 특별히 한정되지 않는 한, 항원 결합 단편을 의미한다. 항체 단편을 항원 결합 분자라고 할 수도 있다. 항원 결합 단편이란, 항체의 일부분을 포함하는 단백질이며, 항원에 결합할 수 있는 것을 말한다. 항원 결합 단편의 예로서는, F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), 디설파이드 결합 Fv, 단쇄 항체(scFv), 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 항원 결합 단편은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본 발명의 항PAD4 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합시키고 있는 콘쥬게이트 항원 결합 단편을 포함하는 것으로 한다.
[상보성 결정 영역]
상보성 결정 영역(CDR)이란 면역 글로불린 분자의 가변 영역 중, 항원 결합 부위를 형성하는 영역을 말하며, 초가변 영역으로도 불리고, 면역 글로불린 분자마다 특히 아미노산 서열의 변화가 큰 부분을 말한다. CDR에는 경쇄 및 중쇄 각각에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3, 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 있다. 본 발명에서는, 면역 글로불린 분자의 CDR은 카밧(Kabat)의 넘버링 시스템(Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)에 따라서 결정된다.
[아미노산 서열의 퍼센트(%) 동일성]
가변 영역 등의, 동정한 참조 폴리펩티드 서열에 관한 「퍼센트(%) 동일성」이란, 서열을 정렬시키고, 최대의 % 동일성을 얻기 위해 필요하면 간극을 도입하고, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다고 한 후의, 특정한 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. % 동일성을 측정하는 목적을 위한 정렬(alig㎚ent)은, 당업자의 기량의 범위에 있는 각종 방법, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성 가능하다. 당업자라면, 비교되는 서열의 완전길이에 대하여 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 여기에서의 목적을 위해서는, % 동일성 값은, 쌍정렬(pairwise alignment)에 있어서, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용함으로써 얻어진다.
아미노산 서열 비교에 BLAST가 사용되는 상황에서는, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B와의 % 동일성은 다음과 같이 계산된다:
분률 X/Y의 100배
여기에서, X는 서열 정렬 프로그램 BLAST의 A 및 B의 프로그램 정렬에 의해 동일하다고 일치한 스코어의 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기수다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 상이한 경우, A의 B에 대한 % 동일성은, B의 A에 대한 % 동일성과는 상이한 것은 이해될 것이다. 특별히 한정하지 않는 한은, 여기에서의 모든 % 동일성 값은, 바로 위의 단락에서 나타낸 바와 같이 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 얻어진다.
[경합한다]
본 발명에 있어서, 본 발명의 항PAD4 항체와 「경합한다」란, 본 명세서에 기재된 표면 플라즈몬 공명(SPR)법에 의해 측정한 경우에, 해당 항PAD4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 존재에 의해, 유의차를 가지고 본 발명의 항PAD4 항체와 PAD4의 결합이 저하되는 것을 말한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<PAD4>
PAD4는, 일반적으로, 단백질 중의 아르기닌의 시트룰린화에 관여하는 효소로서 알려져 있다. 또한, PAD4는, 세포의 네토시스에 관여하는 효소로서도 알려져 있다. PAD4의 아미노산 서열 등의 상세한 것은, NCBI(National Center for Biotechnology Information), 또는 HGNC(HUGO Gene Nomenclature Co㎜ittee) 등의 WEB 사이트에서 볼 수 있다. NCBI에 기재되어 있는 PAD4의 기탁번호는, 예를 들면 NP_036519.2이다. PAD4의 아미노산 서열은 예를 들면 서열번호 29이다. PAD4는 PAD4 활성을 가지고 있으면, 그 생물 유래는 한정되지 않는다.
<항PAD4 항체>
본 발명의 일 실시형태는, 신규 항PAD4 항체이다. 이 항체는, 종래의 항PAD4 항체에 대하여, 보다 우수한 결합 특성, 보존 안정성이나 화학적 안정성을 가지는 항PAD4 항체이다. 보존 안정성 및 화학적 안정성에 대해서는 각각 후술하지만, 이들을 통합하여 안정성이라고 부르는 경우가 있다.
이 항체를 이용하면, 예를 들면, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료를 행할 수 있다. 이 예방 또는 치료 방법은 항체를 사용하므로, 부작용이 작고, 안전성의 관점에서 우수하다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화 활성을 억제하는 항체라도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는, 세포에서의 네토시스를 억제하는 항체라도 된다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는 PAD4와의 결합성이 우수하다. 본 발명의 항PAD4 항체가 PAD4에 결합한다란, PAD4 특이적인 결합을 의미하지만, PAD4(바람직하게는 인간 PAD4)에 대한 해리 상수(KD)가 낮은 것이 더욱 바람직하고, 상한값으로서, 예를 들면, 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 더욱 바람직하게는 80pM 이하이며, 하한값으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 20pM 이상, 보다 바람직하게는 30pM 이상, 더욱 바람직하게는 40pM 이상일 수 있다. 해리 상수(KD)는 예를 들면 본 명세서에 기재된 표면 플라즈몬 공명(SPR)법에 의해 측정된 값이다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는 PAD4의 항PAD4 항체 활성을 중화한다. 항PAD4 항체의 중화 활성은 예를 들면 후술하는 실시예에 나타내는, 시트룰린화 저해 시험에 의해 평가할 수 있다. 항PAD4 항체를 첨가함으로써, PAD4에 의한 시트룰린화가 저해된다. 본 발명의 항PAD4 항체는 PAD4에 의한 시트룰린화 활성을 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 중화할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는 보존(보관) 안정성이 우수하다. 보존 안정성은 일정 기간 보존 후의 PAD4와의 결합의 저하에 의해 평가할 수 있고, 항PAD4 항체의 PAD4 결합량은, 구체적으로는, 실시예 5에 기재된 표면 플라즈몬 공명 장치를 이용한 항원 결합 활성 측정에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는, 예를 들면 40℃에서 1개월간 보존했을 때, 해당 보존 전의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편이 가지는 PAD4 결합량에 비하여, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 이상의 PAD4 결합량을 가질 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체가 PAD4에 결합할 때의 결합 부위는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 PAD4(예를 들면, 서열번호 29)의 345, 347, 및 348위를 포함하는 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항PAD4 항체는, PAD4 또는 그의 부분 단편을 항원으로서, 해당 항원을 마우스 등의 포유동물이나 닭 등에 면역하고, 하이브리도마를 제작하여 얻어지는 모노클로날 항체, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조되는 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물 등을 사용하여 제조되는 인간 항체 등이 포함된다. 또한, 상기에서 얻어진 항체를 친화성 성숙하여 얻어진 항체도 포함한다. 예를 들면, 친항체는 후술하는 G8을 사용할 수 있다. 본 발명의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 의약으로서 인간에게 투여하는 경우에는, 부작용의 관점에서, 인간화 항체 혹은 인간 항체 또는 이들의 항체 단편이 바람직하다.
항원은 그대로 면역에 사용해도 되고, 운반 단백질과의 복합체로서 사용해도 된다. 항원과 운반 단백질의 복합체의 조제에는 글루타르알데히드, 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르 등의 축합제를 사용할 수 있다. 운반 단백질은 소 혈청 알부민, 티로글로불린, 헤모시아닌, KLH 등이 예시된다.
면역되는 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 말 혹은 소 등의 포유동물이나 닭을 들 수 있고, 접종 방법은 피하, 근육 혹은 복강내의 투여를 들 수 있다. 투여에 있어서는 완전 프로인드 아쥬반트나 불완전 프로인드 아쥬반트와 혼화하여 투여해도 되고, 투여는 통상 2∼5주마다 1회씩 행해진다. 면역된 동물의 비장 혹은 림프절로부터 얻어진 항체 산생 세포는 골수종 세포와 세포융합시키고, 하이브리도마로서 단리된다. 골수종 세포로서는 동물 유래, 예를 들면 마우스, 래트, 인간, 닭 등 유래의 것이 사용된다.
<모노클로날 항체>
모노클로날 항체는, 구체적으로는 하기와 같이 하여 취득할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같은 항원을 면역원으로 하고, 해당 면역원을, 필요에 따라 프로인드 아쥬반트(Freund's Adjuvant)와 함께, 상기와 같은 동물의 피하, 근육내, 정맥내, 풋패드내 혹은 복강내에 1∼수회 주사하거나 혹은 이식함으로써 면역감작을 실시한다. 통상, 첫회 면역으로부터 약 1∼14일마다 1∼4회 면역을 행하여, 최종 면역보다 약 1∼5일 후에 면역감작된 해당 동물로부터 항체 산생 세포가 취득된다.
모노클로날 항체는, 당업자에게 주지 방법을 이용하여 얻을 수 있다(예를 들면, 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)).
모노클로날 항체를 분비하는 「하이브리도마」의 조제는, 쾰러 및 밀스타인 등의 방법(네이처(Nature, 256, 495, 19)75) 및 그것에 준하는 수식 방법에 따라서 행할 수 있다. 즉, 면역감작된 동물로부터 취득되는 비장 등에 포함되는 항체 산생 세포와, 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간 유래의 자기항체 산생능이 없는 미엘로마 세포를 세포융합시키는 것에 의해 조제된다.
세포융합에 사용되는 미엘로마 세포로서는, 예를 들면 마우스 유래 미엘로마P3/X63-AG8.653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/O, Sp2), PAI, F0 혹은 BW5147, 래트 유래 미엘로마 210RCY3-Ag.2.3., 인간 유래 미엘로마 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 혹은 CEM-T15 등을 사용할 수 있다.
융합 촉진제로서는 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있고, 통상에는, 20∼50% 정도의 농도의 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 1000∼4000)을 사용하여 20∼40℃, 바람직하게는 30∼37℃의 온도 하, 항체 산생 세포수와 골수종 세포수의 비는 통상 1:1∼10:1 정도, 약 1∼10분간 정도 반응시킴으로써 세포융합을 실시할 수 있다.
모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트 중에서 배양하고, 웰의 배양 상청의 면역항원에 대한 반응성을 ELISA 등의 면역화학적 방법에 의해 측정하는 것에 의해 행할 수 있다.
목적의 항체를 산생하는 하이브리도마를 포함하는 웰로부터, 한계희석법에 의해 클로닝을 더 행하고, 클론을 얻을 수 있다. 하이브리도마의 선별, 육종은, 통상, HAT(히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)을 첨가하여, 10∼20% 소태아혈청을 포함하는 동물세포용 배지에서 행해진다.
하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는, 하이브리도마를 인비트로에서 배양하거나, 또는 마우스, 래트, 닭 등의 동물의 복수(腹水) 중 등에 있어서의 인비보에서 증식시키고, 얻어진 배양 상청, 또는 동물의 복수로부터 단리하는 것에 의해 행할 수 있다.
인비트로에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성 및 배양 방법 등의 각종 조건에 맞추어, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 산생시키는 데에 적합한 영양배지를 이용하는 것이 가능하다.
기본 배지로서는, 예를 들면 Ham'F12 배지, MCDB153 배지 혹은 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘 배지 및 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지 혹은 RD 배지 등의 고칼슘 배지 등을 들 수 있고, 해당 기본 배지는 목적에 따라, 예를 들면 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 각종 무기 혹은 유기 물질 등을 함유시킬 수 있다.
모노클로날 항체의 단리, 정제는, 전술한 배양 상청 혹은 복수를 포화 황산 암모늄, 유글로불린 침전법, 카프로산법, 카푸릴산법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항면역글로불린 컬럼 혹은 프로테인 A 컬럼 등의 친화성(affinity) 컬럼 크로마토그래피에 제공하는 것 등에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 모노클로날 항체의 정제는 면역 글로불린의 정제법으로서 기지(旣知)의 방법을 이용하면 되고, 예를 들면, 유안 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, 음이온 교환체의 이용, 또한 PAD4를 사용하는 친화성 크로마토그래피 등의 수단에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
모노클로날 항체는 파지 디스플레이법에 의해 취득할 수도 있다. 파지 디스플레이법에서는, 임의의 파지 항체 라이브러리로부터 선별한 파지를, 목적의 면역원을 이용하여 스크리닝을 행하고, 면역원에 대한 원하는 결합성을 가지는 파지를 선택한다. 다음으로, 파지 내에 포함되는 항체 대응 서열을 단리 또는 서열 결정하고, 단리된 서열 또는 결정된 서열 정보에 기초하여, 항체 또는 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 구축한다. 그리고, 이러한 발현 벡터를 트랜스펙션된 세포주를 배양하는 것에 의해, 모노클로날 항체를 산생시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리로서, 인간 항체 라이브러리를 이용하는 것에 의해, 원하는 결합성을 가지는 인간 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체의 바람직한 태양(態樣)으로서 키메라 항체를 예로 들 수 있다. 「키메라 항체」로서는, 가변 영역이 비인간 동물(마우스, 래트, 햄스터, 닭 등)의 면역글로불린 유래의 가변 영역이고, 정상 영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역인, 키메라 항체가 예시된다. 예를 들면, 항원을 마우스에 면역하고, 그 마우스 모노클로날 항체의 유전자로부터 항원과 결합하는 가변 영역을 잘라내고, 인간 골수 유래의 항체 정상 영역과 결합하여 제작할 수 있다. 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1, IgA2), IgD 및 IgE 등의 아이소타입에 의해 각각 고유의 아미노산 서열을 가지지만, 본 발명에서의 재조합 키메라 항체의 정상 영역은 어느 아이소타입에 속하는 인간 면역글로불린의 정상 영역으로 해도 된다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상 영역이다. 이와 같이 제작한 키메라 항체의 유전자를 이용하여 발현 벡터를 제작할 수 있다. 해당 벡터에서 숙주 세포를 형질전환하는 것에 의해 키메라 항체 산생 형질전환 세포를 얻고, 해당 형질전환 세포를 배양하는 것에 의해 배양 상청 중에서 목적의 키메라화 항체를 얻는다.
본 발명의 항PAD4 항체의 다른 바람직한 태양으로서 인간화 항체를 들 수 있다. 본 발명에서의 「인간화 항체」는, 마우스 등의 비인간 동물 항체의 항원 결합 부위(CDR; 상보성 결정 영역)의 DNA 서열만을 인간 항체 유전자에 이식(CDR 그라프팅)한 항체이다. 예를 들면, 일본특표 평4-506458호 공보 및 특허 제2912618호 명세서 등에 기재된 방법을 참조하여 제작할 수 있다. 구체적으로는, 그 CDR의 일부또는 전부가 비인간 동물(마우스, 래트, 햄스터, 닭 등)의 모노클로날 항체에 유래하는 CDR이고, 그 가변 영역의 프레임워크 영역이 인간 면역글로불린 유래의 가변 영역의 프레임워크 영역이며, 또한 그 정상 영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역인 것을 특징으로 하는 인간화 항체를 의미한다.
본 발명에서의 인간화 항체는 예를 들면 다음과 같이 하여 제조할 수 있다. 그러나, 그와 같은 제조 방법에 한정되는 것이 아님은 말할 필요도 없다.
항체를 인간화하는 방법에는, 해당 기술분야에서 기지의 각종 방법을 이용할 수 있고(예를 들면, Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-1633.), 구체적으로는, 예를 들면, CDR 그라프팅(Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1;93(11): 3922-3930.), Re-surfacing(roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Feb 1;91(3):969-973.), 또는 FR 셔플(Damschroder et al., Mol I㎜unol. 2007 Apr;44(11):3049-3060. Epub 2007 Jan 22.) 등을 들 수 있다. 항원 결합을 개변 또는 개선하기 위하여, 인간 FR 영역의 아미노산 잔기를 CDR 도너 항체로부터의 대응하는 잔기로 치환해도 된다. 이 FR 치환은, 해당 기술분야에서 주지의 방법에 의해 실시 가능하다(Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-327.). 예를 들면, CDR과 FR 잔기의 상호 작용의 모델링에 의해 항원 결합에 중요한 FR 잔기를 동정해도 된다. 또는, 서열 비교에 의해, 특정 위치에서 이상한 FR 잔기를 동정해도 된다. 그리고, Nishibori et al., Mol I㎜unol. 2006 Feb;43(6):634-42에 기재된 방법으로 인간화해도 된다.
단리한 마우스 중쇄 CDR 부분의 DNA를 이식한 인간 중쇄 유전자를 발현 가능하도록 적당한 발현 벡터에 도입하고, 마찬가지로 마우스 경쇄 CDR 부분의 DNA를 이식한 인간 경쇄 유전자를 발현 가능하도록 적당한 또 하나의 발현 벡터에 도입한다. 또는, 마우스의 CDR을 이식한 인간의 중쇄 및 경쇄 유전자를 동일한 발현 벡터에 발현 가능하도록 도입할 수도 있다. 이와 같이 하여 제작된 발현 벡터에서 숙주 세포를 형질전환하는 것에 의해 인간화 항체 산생 형질전환 세포를 얻고, 해당 형질전환 세포를 배양하는 것에 의해 배양 상청 중에서 목적의 인간화 항체를 얻는다.
본 발명의 항PAD4 항체의 다른 바람직한 태양으로서 인간 항체를 들 수 있다. 인간 항체란, 면역글로불린을 구성하는 중쇄의 가변 영역 및 중쇄의 정상 영역 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄의 정상 영역을 포함하는 모든 영역이 인간 면역글로불린을 코딩하는 유전자에 유래하는 면역글로불린으로 되고 있는 항체로서, 인간 항체 유전자를 마우스에 도입하여 제작할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 적어도 인간 면역글로불린 유전자를 마우스나 닭 등의 인간 이외의 동물의 유전자 좌중에 삽입하는 것에 의해 제작된 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역감작하는 것에 의해, 전술한 모노클로날 항체의 제작법과 동일하게 하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 인간 항체를 산생하는 트랜스제닉 마우스는, Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 일본특표 평4-504365호 공보; 일본특표 평7-509137호 공보; 국제공개 제94/25585호 팜플렛; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 일본특표 평6-500233호 공보 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 보다 구체적으로는, HuMab(등록상표) 마우스(Medarex, Princeton NJ), KMTM 마우스(Kirin Pharma Company, Japan), KM(FCγRIIb-KO) 마우스 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서 구체적으로는,
a) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체,
b) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체,
c) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체,
d) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체, 및
e) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체로서, 중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인 항PAD4 항체 등을 들 수 있다.
상기 a)∼d)에 기재된 항체는 PAD4에 대한 결합 친화성이 현저하게 향상된 것이고, 또한 상기 a)∼d)에 기재된 항체는 PAD4에 대한 결합 활성의 보존 안정성이 향상된 것이고, 상기 e)에 기재된 항체는 절단이 억제되고, 화학적 안정성이 현저하게 향상된 것이며, 상기 a)∼d)에 기재된 항체는 상기 e)에 기재된 항체와 동등한 높은 화학적 안정성을 가지는 것이다.
그리고, 상기 a)∼e)에 기재된 아미노산 서열은, 후술하는 실시예에 기재된 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25, 및 G8ss의 항체가 가지는 각 CDR의 아미노산 서열에 대응하고 있다.
즉, 2-1-47의 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열이다.
3-1-39의 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열이다.
3-2-37의 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열이다.
4-2-25의 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열이다.
G8ss의 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 24, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 25로 나타내어지는 아미노산 서열이다.
상기 a)의 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)를 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열로서, 각각 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
상기 b)의 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)를 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열로서, 각각 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
상기 c)의 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열로서, 각각 서열번호 1, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
상기 d)의 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
상기 e)의 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1, 2, 3, 경쇄 CDR1, 2, 및 3의 아미노산 서열로서, 각각 서열번호 1, 서열번호 24, 서열번호 11, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 25로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1이 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 중쇄 CDR2가 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 중쇄 CDR3이 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR1이 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR2가 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR3이 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
그리고, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서는, 11위의 아미노산이 Tyr, Thr 또는 Ile이고, 12위의 아미노산이 Gly, Ser 또는 Pro이며, 13위의 아미노산이 Thr, Val, Tyr 또는 Pro이고, 14위의 아미노산이 Pro 또는 Asn이며, 15위의 아미노산이 Tyr, Ala, Gln 또는 Leu이고, 17위의 아미노산이 Gly, Thr 또는 Ser이며, 각 위치에서의 아미노산이 상기의 아미노산으로부터 선택되는 임의의 조합인 아미노산 서열을 포함한다.
그리고, 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서는, 1위의 아미노산이 AlA 또는 Gly이고, 구체적으로는 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열을 포함한다.
그리고, 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서는, 4위의 아미노산이 Thr, Leu 또는 Tyr이고, 구체적으로는 서열번호 13, 14 및 15의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄 CDR1이 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 중쇄 CDR2가 서열번호 7∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 중쇄 CDR3이 서열번호 11 또는 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR1이 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR2가 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 되고, 경쇄 CDR3이 서열번호 13∼15 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 것이라도 된다.
그리고, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 본 발명의 항PAD4 항체의 특성이 유지되는 한, 이들 CDR의 1개 이상에 있어서, 1∼수개의 아미노산이 치환되어도 된다. 여기에서, 1∼수개란, 예를 들면 1개, 2개, 또는 3개이다. 그리고, 해당 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다. 여기서 「보존적 치환」이란, 펩티드의 활성을 실질적으로 개변하지 않도록, 아미노산 잔기를 별도의 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 어떤 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 어떤 극성 잔기를 동일한 전하를 가지는 다른 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이와 같은 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산의 예로서, 비극성(소수성) 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 가지는 (염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌, 히스티딘, 라이신 등을 들 수 있다. 또한, 음전하를 가지는 (산성) 아미노산으로서는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다. 항체의 특성이 유지된다란, 이들 특성이 CDR의 아미노산 서열 개변 전과 비교하여 같은 정도, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상으로 유지되는 것을 말한다. 그리고, 유지는 향상도 포함한다.
CDR 이외의 영역은 항체로서의 구조를 유지하고, 기능을 발휘할 수 있는 서열이면 특별히 제한되지 않고, 마우스 유래의 서열, 인간 유래의 서열, 다른 포유동물 유래의 서열, 닭 유래의 서열, 이들의 키메라 서열, 인공서열 중 어느 것이라도 된다. 정상 영역을 포함하는 경우에 있어서는, 중쇄 및 경쇄의 정상 영역의 아미노산 서열은, Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 및 Cell vol. 22, p197, 1980에 기재된 것이 예시된다.
CDR 이외의 영역을 개변으로 한 것으로서, 본 발명의 바람직한 일 실시형태로서는, 항체의 중쇄(예를 들면, 서열번호 26)의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산(통상, 아스파라긴)이 세린인 항체를 들 수 있다. 여기에서 「상당하는 아미노산」이란, 목적 아미노산 서열을 서열번호 26과 정렬했을 때, 서열번호 26의 84번째의 아미노산인 아스파라긴의 위치에 존재하는 아미노산(통상, 아스파라긴)을 말한다. 이와 같은 본 발명의 일 실시형태의 항PAD4 항체는, 항체의 화학적 안정성, 구체적으로는, 생성 시에 발생하는 절단의 억제가 우수하다. 절단의 억제는, 펩티드 맵핑에 의한 중쇄의 84번째의 아스파라긴 잔기와 85번째의 세린 잔기 사이에서 절단되는 항체량의 저하에 의해 평가할 수 있고, 구체적으로는, 예를 들면 실시예 1에 기재된 방법으로 절단 펩티드의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 관련된 생성 시에 발생하는 절단의 억제가 우수한 항PAD4 항체는, 예를 들면 4℃에서 2주간 보존했을 때, 절단된 항체가 해당 보존 전의 항체에 비하여, 3%, 2%, 1% 이하일 수 있다.
또한, CDR 이외를 인간 유래로 한 인간화 항체도 예시된다. 이와 같은 인간화 항체로서는,
a) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이, 각각 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
b) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이, 각각 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
c) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이, 각각 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
d) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이, 각각 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체, 및
e) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이, 각각 서열번호 26의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체가 예시된다.
또는, 본 발명의 일 실시형태에 관련된 항PAD4 항체는,
a) 중쇄 및 경쇄가, 각각 서열번호 16 및 17로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
b) 중쇄 및 경쇄가, 각각 서열번호 18 및 19로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
c) 중쇄 및 경쇄가, 각각 서열번호 20 및 21로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체,
d) 중쇄 및 경쇄가, 각각 서열번호 22 및 23으로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체, 및
e)중쇄 및 경쇄가, 각각 서열번호 26 및 27로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체라도 된다.
그리고, 인간화 항체의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 있어서는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 해당 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
상기의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 있어서 치환, 결실 등이 포함된 본 발명의 항PAD4 항체의 아미노산 서열은, 중쇄 가변 영역이, 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열, 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열, 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열, 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 또는 서열번호 26의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열일 수 있고, 경쇄 가변 영역이, 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열, 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열, 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열, 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열 또는 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체는 또한, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 중쇄가 서열표의 서열번호 16, 18, 20, 22, 26과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열일 수 있고, 경쇄가 서열표의 서열번호 17, 19, 21, 23, 27과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 항PAD4 항체일 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체에는, 상기 특정한 아미노산 서열로 이루어지는 CDR, 또는 상기 특정한 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 가지는 다중특이성 항체, 기능 개변 항체, 콘쥬게이트 항체가 포함된다.
본 발명의 항PAD4 항체는, 그 자체에 PAD4 이외의 다른 항원 결합 특이성을 가지는 항체를 유전자공학적인 방법에 의해 결합하는 것에 의해, 이중특이성 항체 등의 다중특이성 항체를 제작할 수 있다. 해당 유전자공학적인 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다. 예를 들면, 가변 영역을 직렬로 연결한 DVD-Ig(Wu 등, Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007))이나, 항체의 Fc 영역을 개변하는 것에 의해, 다른 항원에 결합하는 2종류의 항체의 중쇄가 조합되는 ART-Ig의 기술(Kitazawa 등, Nature Medicine 18(10), 1570(2012))을 이용하면 원하는 이중특이성 항체를 취득할 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체의 개변 분자로서 기능 개변 항체를 들 수 있다. 기능 개변 항체는 항체 서열, 당쇄 등을 개변하는 것에 의해, 세포 살상 기능이나 보체 활성화 기능, 혈중 반감기 연장 기능 등의 기능을 변형한 항체를 의미한다(시타라 겐야, 약학 잡지, 2009, Vol.129(1), p3; 이시이 아키코 등, 일본 약리학 잡지, 2010, Vol.136(5), p280; 하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol.82(8), p710).
항PAD4 항체의 기능 개변 항체는, 다음과 같은 방법으로 조제된다. 예를 들면, 본 발명 항PAD4 항체를, 숙주 세포로서 α1,6-푸코오스 전이 효소(FUT8) 유전자를 파괴한 CHO 세포를 이용하여 제조하면, 당쇄의 푸코오스 함량이 저하되어 세포 살상 기능이 높아진 항체가 얻어지고, FUT8 유전자를 도입한 CHO 세포를 숙주 세포로서 제조하면, 세포 살상 기능이 낮은 항체가 얻어진다(국제공개 제2005/035586호, 국제공개 제2002/31140호, 국제공개 제00/61739호). 또한, Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 보체 활성화 기능을 조절할 수 있다(미국특허 제6737056호, 미국특허 제7297775호, 미국특허 제7317091호). 또한, Fc 수용체의 하나인 FcRn으로의 결합을 향상시킨 Fc 영역의 이변체를 사용하는 것에 의해, 혈중 반감기의 연장을 도모할 수 있다(하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol.82(8), p710). 이들 기능 개변 항체는 유전자공학적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 항PAD4 항체의 개변 분자로서 콘쥬게이트 항체를 들 수 있다. 콘쥬게이트 항체로서는, 항PAD4 항체에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자, 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본 발명의 항PAD4 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 콘쥬게이트 항체를 들 수 있다.
기능 분자로서 PEG를 결합하는 경우, 통상 사용되는 것이면 되고, 직쇄형이라도 되고, 브랜치형의 것이라도 된다. PEG는, 예를 들면 NHS 활성기를 이용하는 것에 의해, 항체의 아미노기 등에 결합할 수 있다.
기능 분자로서 방사성 물질을 사용하는 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu또는 211At 등이 사용된다. 방사성 물질은 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다.
기능 분자로서, 효소를 사용하는 경우, 루시페라제(예를 들면, 반딧불이 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제4737456호), 말산 디하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다제(예를 들면, 글루코오스옥시다제, 갈락토오스옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 복소환식 옥시다제(예를 들면, 우리카아제 및 크산틴옥시다제 등), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 사용된다.
독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로서는, 2가 라디칼(예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌), -(CR2)nO(CR2)n-(R은 임의의 치환기, n은 양의 정수)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들면, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들면, 폴리에틸렌아미노, Jeffamine TM), 및 이산(dioic acid) 에스테르 및 아미드(숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드 등을 들 수 있음)를 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol.93: 8681).
본 발명에서의 항체의 「항원 결합 단편」이란, 전술한 바와 같은 항체의, 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), 디설파이드 결합 Fv, 단쇄 항체(scFv), 및 이들의 중합체 등을 들 수 있고, 또한, 항원 결합 단편에는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본 발명의 항PAD4 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합시키고 있는 콘쥬게이트 항원 결합 단편이 포함된다.
여기에서, 「F(ab')2」 및 「Fab」란, 면역글로불린을 단백 분해 효소인 펩신 혹은 파파인 등으로 처리하는 것에 의해 제조되고, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 플래그먼트를 의미한다. 예를 들면, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄간에 존재하는 디설파이드 결합의 상류에서 절단되어 VL(경쇄 가변 영역)과 CL(경쇄 정상 영역)으로 이루어지는 경쇄, 및 VH(중쇄 가변 영역)과 CHγ1(중쇄 정상 영역 중의 γ1 영역)으로 이루어지는 중쇄 플래그먼트가 C말단 영역에서 디설파이드 결합에 의해 결합한 상동한 2개의 항체 플래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2개의 상동한 항체 플래그먼트를 각각 Fab라고 한다. 또한, IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab가 힌지 영역에서 연결된 것보다 약간 큰 항체 플래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 플래그먼트를 F(ab')2라고 한다.
본 발명의 항PAD4 항체의 항원 결합 단편의 개변 분자로서 콘쥬게이트 항원 결합 단편을 들 수 있다. 콘쥬게이트 항원 결합 단편으로서는, 항PAD4 항체의 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자, 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본 발명의 항PAD4 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 콘쥬게이트 항원 결합 단편을 들 수 있다.
기능 분자로서 PEG를 결합하는 경우, 통상 사용되는 것이면 되고, 직쇄형이라도 되고, 브랜치형의 것이라도 된다. PEG는 예를 들면 NHS 활성기를 이용하는 것에 의해, 항PAD4 항체의 아미노기 등에 결합할 수 있다.
기능 분자로서 방사성 물질을 사용하는 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu또는 211At 등이 사용된다. 방사성 물질은, 클로라민 T법 등에 의해 항PAD4 항체의 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역에 직접 결합시킬 수 있다.
기능 분자로서, 효소를 사용하는 경우, 루시페라제(예를 들면, 반딧불이 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제4737456호), 말산 디하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다제(예를 들면, 글루코오스옥시다제, 갈락토오스옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 복소환식 옥시다제(예를 들면, 우리카아제 및 크산틴옥시다제 등), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 사용된다.
독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로서는, 2가 라디칼(예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌), -(CR2)nO(CR2)n-(R은 임의의 치환기, n은 양의 정수)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들면, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들면, 폴리에틸렌아미노, Jeffamine TM), 및 이산 에스테르 및 아미드(숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드 등을 들 수 있음)를 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol.152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol.93: 8681).
본 발명의, 특정한 아미노산 서열을 가지는 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항PAD4 항체는, 혈중 반감기를 길게 유지하고자 하는 점에서 해당 정상 영역이 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 정상 영역인 것이 바람직하다.
본 발명의 항PAD4 항체 및 그의 항원 결합 단편에는, PAD4와의 결합능(바람직하게는, PAD4에 대한 KD값이 100pM 이하, 보다 바람직하게는 90pM 이하, 보다 더 바람직하게는 80pM 이하)을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 상기와 같은 특정 CDR의 아미노산 서열을 가지는 항체와, PAD4의 결합에 있어서 경합하는 항PAD4 항체, 및 그의 항원 결합 단편도 포함된다. 상기와 같은 특정 CDR의 아미노산 서열을 가지는 항체와 PAD4의 결합에 있어서 경합하는 항체로서는, PAD4의 345, 347, 및 348위를 포함하는 영역에 에피토프를 가지는 항체가 예시된다. 다만, G8항체는 포함되지 않는다.
해당 항체는, 상기와 같은 CDR 서열을 가지는 항체와 PAD4의 결합계에 있어서, 공존시키는 것에 의해, 취득(스크리닝)하거나, 평가하거나 할 수 있다. 예를 들면, 국제공개 제2016/175236호에 기재된 표면 플라즈몬 공명(SPR)법에 의해 스크리닝함으로써 취득할 수 있다.
상기한 특정 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 항PAD4 항체에 대하여, PAD4와의 결합이 경합하는, 항PAD4 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등, 임의의 동물 유래의 항체라도 되고, 이들 항체의 조합인 키메라 항체나 인간화 항체라도 되지만, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편은, 예를 들면 본 발명의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 하기의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체(숙주) 세포를 이용하여 제조할 수 있다.
<핵산 분자>
본 발명의 일 실시형태는, 본 발명의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 핵산 분자이다. 전술한 CDR, 가변 영역, 또는 전장의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자라면 특별히 제한되지 않지만, 예로서,
a) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열,
b) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열,
c) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열,
d) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열, 및
e) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 서열번호 28의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열 및 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 각각 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서,
a) 중쇄 및 경쇄인, 서열번호 16 및 17로 나타내어지는 아미노산 서열,
b) 중쇄 및 경쇄인, 서열번호 18 및 19로 나타내어지는 아미노산 서열,
c) 중쇄 및 경쇄인, 서열번호 20 및 21로 나타내어지는 아미노산 서열,
d) 중쇄 및 경쇄인, 서열번호 22 및 23으로 나타내어지는 아미노산 서열, 및
e) 중쇄 및 경쇄인, 서열번호 28 및 27로 나타내어지는 아미노산 서열을 각각 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서,
항PAD4 항체의 중쇄 전장인, 서열번호 32로 나타내어지는 염기서열, 및 항PAD4 항체의 경쇄 전장인, 서열번호 33으로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
항PAD4 항체의 중쇄 전장인, 서열번호 34로 나타내어지는 염기서열, 및 항PAD4 항체의 경쇄 전장인, 서열번호 35로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
항PAD4 항체의 중쇄 전장인, 서열번호 36으로 나타내어지는 염기서열, 및 항PAD4 항체의 경쇄 전장인, 서열번호 37로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
항PAD4 항체의 중쇄 전장인, 서열번호 38로 나타내어지는 염기서열, 및 항PAD4 항체의 경쇄 전장인, 서열번호 39로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
항PAD4 항체의 중쇄 전장인, 서열번호 40로 나타내어지는 염기서열, 및 항PAD4 항체의 경쇄 전장인, 서열번호 31로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
그리고, 본 발명의 핵산 분자는 PAD4와의 결합능을 가지고, PAD4의 시트룰린화 활성을 중화하는 모노클로날 항체를 코딩하는 한, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 염기서열의 상보쇄 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이라도 된다. 여기에서, 엄격한 조건으로서는, 예를 들면, 서던 하이브리다이제이션 후, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로 세정을 행하는 조건을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는, 중쇄와 경쇄의 정상 영역과 가변 영역 전체를 코딩하는 것이라도 되지만, 중쇄과 경쇄의 가변 영역만을 코딩하는 것이라도 된다. 정상 영역과 가변 영역 전체를 코딩하는 경우에서의 중쇄 및 경쇄의 정상 영역의 염기서열은, Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 및 Cell vol.22, p197, 1980에 기재된 것이 바람직하다.
국제공개 제2016/143753호에 기재된 인간화 항PAD4 항체 G8의 중쇄 및 경쇄의 전장을 코딩하는 염기서열을 서열번호 30 및 31에 나타낸다. 예를 들면, 이 염기서열을 개변함으로써 본 발명의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자를 얻는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들면 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 먼저, 하이브리도마 등의 세포로부터, 시판되 있는 RNA 추출 키트를 이용하여 총RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 사용하여, 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서, 기지의 인간 항체 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 가변 영역에 있어서, 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해, 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코딩하는 서열에 대해서는, 기지의 서열을 PCR법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기서열은 서열 결정용 플라스미드에 삽입하는 등, 상법에 의해 결정할 수 있다.
혹은, 가변 영역 또는 그 일부의 서열을 화학 합성하고, 정상 영역을 포함하는 서열에 결합하는 것에 의해서도 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 해당 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체(숙주 세포)를 제공한다.
재조합 벡터로서는, 대장균(Echerichia coli)과 같은 원핵세포에 있어서 발현 가능한 벡터(예를 들면, pBR322, pUC119 또는 이들의 파생물)이라도 되지만, 진핵세포에 있어서 발현 가능한 벡터가 바람직하고, 포유동물 유래의 세포에 있어서 발현 가능한 벡터가 보다 바람직하다. 포유동물 유래의 세포에 있어서 발현 가능한 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA 3.1(Invitrogen사 제조), pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA 3.1, pREP4와 같은 플라스미드 벡터, pDON-AI DNA(타카라 바이오사 제조) 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다. 중쇄 코드 서열과 경쇄 코드 서열을 포함하는 1개의 벡터라도 되고, 중쇄 코드 서열 포함하는 벡터와 경쇄 코드 서열을 포함하는 벡터의 2개의 벡터라도 된다.
본 발명의 재조합 벡터를 도입하는 형질전환체는 대장균, 고초균과 같은 원핵세포라도 되지만, 진핵세포가 바람직하고, 포유동물 유래의 세포가 보다 바람직하다. 포유동물 유래의 세포로서는, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO 세포), COS, 미엘로마, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa, YB2/0 등을 들 수 있다.
명세서 중에 기재된 방법 또는 공지의 방법에 의해 얻어지는 항PAD4 항체나 그의 항원 결합 단편은 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체 등의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택, 조합시키면, 항체를 분리, 정제할 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피에 이용하는 컬럼으로서는, 프로테인 A 컬럼, 프로테인 G 컬럼, 항면역글로불린 항체 결합 컬럼, 항원 결합 컬럼 등을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A 컬럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다.
<조성물>
본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 조성물이다. 이 조성물을 이용하면, PAD4를 효율적으로 검출할 수 있다. 또한, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화를 효율적으로 억제할 수 있다. 또한, 세포에서의 네토시스를 효율적으로 억제할 수 있다. 또한, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 예방 또는 치료할 수 있다. 이 조성물이 함유하는 성분은, 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 항체 단편을 포함하고 있으면, 그 이외는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 완충액을 포함해도 된다. 이 조성물에 대하여, 후술하는 억제제 및 의약 조성물에 관한 각종 실시형태(예를 들면, 담체를 함유 가능한 것 등)의 1개 이상을 적용해도 된다.
본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화 억제제다. 이 억제제를 이용하면, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화를 효율적으로 억제할 수 있다. 상기 억제제에 의한 시트룰린화 활성의 저하율은 20, 30, 40, 60, 80% 이상이라도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위 내라도 된다. 이 저하율은, 예를 들면 PBS를 사용했을 때의 저하율을 0%로 했을 때의 상대 비율로 표시해도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서 「제」는, 예를 들면 연구 또는 치료에 사용되는 조성물을 포함한다. 상기 억제제는 예를 들면 RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료제를 포함한다. 상기 억제제는 예를 들면 in vitro 또는 in vivo에서 사용할 수 있다. 상기 억제제는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 조성물을 포함해도 된다. 본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편과, PAD4를 접촉시키는 공정을 포함하는, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화 억제 방법이다. 본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화 억제 방법이다. 상기 억제 방법은, 연구 또는 치료를 위해 행해지는 억제 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태는, PAD4에 의한 단백질의 시트룰린화 억제제를 생산하기 위한, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편의 사용이다.
본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는, 세포에서의 네토시스의 억제제다. 이 억제제를 이용하면, PAD4에 의한 세포에서의 네토시스를 효율적으로 억제할 수 있다. 상기 억제제에 의한 세포에서의 네토시스 활성의 저하율은 20, 30, 40, 60, 80% 이상이라도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위 내라도 된다. 이 저하율은, 예를 들면 PBS를 사용했을 때의 저하율을 0%으로 했을 때의 상대 비율로 표시해도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서 「제」는, 예를 들면, 연구 또는 치료에 사용되는 조성물을 포함한다. 상기 억제제는 예를 들면 RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료제를 포함한다. 상기 억제제는 예를 들면 in vitro 또는 in vivo에서 사용할 수 있다. 상기 억제제는 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 조성물을 포함해도 된다. 본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편과, PAD4를 접촉시키는 공정을 포함하는, 세포에서의 네토시스 억제 방법이다. 본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 세포에서의 네토시스 억제 방법이다. 상기 억제 방법은 연구 또는 치료를 위해 행해지는 억제 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태는, 세포에서의 네토시스 억제제를 생산하기 위한, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편의 사용이다.
본 발명의 일 실시형태는, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 의약 조성물이다. 이 의약 조성물을 이용하면, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 예방, 치료, 재발 예방할 수 있다. 상기 의약 조성물은 약리학적으로 허용되는 1개 이상의 담체를 포함해도 된다. 상기 의약 조성물은 예를 들면 RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 치료용 의약 조성물, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방용 의약 조성물을 포함한다. 상기 의약 조성물은 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 조성물을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시형태는, 유효량의 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편(또는 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 의약 조성물)을 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방 방법이다. 상기 질환은 예를 들면 RA 또는, 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태는, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 예방, 치료 또는 재발 예방하기 위한, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편(또는 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 의약 조성물)의 사용이다.
본 발명의 일 실시형태는, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방제, 치료제 또는 재발 예방제를 생산하기 위한, 상기의 본 발명의 실시형태에 관련된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편(또는 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 의약 조성물)의 사용이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서 「제」는 유효 성분과, 약리학적으로 허용되는 1개 이상의 담체를 포함하는 의약 조성물이라도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서 「의약 조성물」은, 예를 들면 유효 성분과 상기 담체를 혼합하고, 제제학의 기술 분야에 있어서 알려지는 임의의 방법에 의해 제조해도 된다. 또한 의약 조성물은, 예방 또는 치료를 위해 사용되는 것이라면 사용 형태는 한정되지 않고, 유효 성분 단독이라도 되고, 유효 성분과 임의의 성분의 혼합물이라도 된다.
의약 조성물의 RA에서의 치료 및/또는 예방 효과는, 예를 들면 관절염 스코어, RA 스코어, 종창 폭, 화상 진단, modified Total Sharp 스코어, Disease Activity Score(DAS), 미국·류머티즘 협회(ACR)가 작성한 류머티즘의 활동성 평가 기준의 달성율을 표시하는 ACR20, ACR50, ACR70 또는 질환 마커에 의해 평가해도 된다. 관절염 스코어로 평가하는 경우, 예를 들면, 의약 조성물 투여 시의 환자의 관절염 스코어가, 비투여 시의 관절염 스코어에 비하여 유의하게 감소한 경우에 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 관절염 스코어가, 네거티브 컨트롤 물질 투여 시의 환자의 관절염 스코어에 비하여, 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 상기 감소는 예를 들면 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1점 이하이라도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위 내라도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 관절염 스코어의 그래프 면적이, 비투여 시의 관절염 스코어 그래프 면적에 비하여 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 관절염 스코어 그래프 면적이, 네거티브 컨트롤 물질 투여 시의 환자의 관절염 스코어 그래프 면적에 비하여, 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 상기 감소는 예를 들면 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% 이하라도 되고, 이들 중 2개의 값의 범위 내라도 된다.
의약 조성물의 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염에서의 치료 및/또는 예방 효과는, 예를 들면 각 장기에서의 장애, 요단백량, 요단백 스코어, 생존율, 병리평가 스코어, 혈중 자기 항체 산생량, 혈중 보체 제3 및 제4 보체 성분(C3 및 C4) 양 또는 질환 마커에 의해 평가해도 된다. 또한, 이들을 점수화한 SLE disease activity index(SLEDAI), 질환 활동성을 1개월 전과 비교하는 British Isles Lupus Assessment Group(BILAG) index, 의사에 의한 환자의 전반적인 질환 활동성을 평가하는 physician's global assessment(PGA), 이들을 종합적으로 평가하는 SLE responder index(SRI) 4 등에 의해 평가해도 된다. 요단백량으로 평가하는 경우, 예를 들면, 의약 조성물 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비가, 비투여 시에 비하여 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비가, 네거티브 컨트롤 물질 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비에 비하여, 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비의 그래프 면적이, 비투여 시의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비 그래프 면적에 비하여 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 또는, 의약 조성물 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비가, 네거티브 컨트롤 물질 투여 시의 환자의 요중 알부민량 혹은 알부민/크레아티닌 비에 비하여, 유의하게 감소한 경우에, 치료 및/또는 예방 효과가 있었다고 판단해도 된다. 상기 감소는 예를 들면 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% 이하이도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위 내라도 된다.
의약 조성물의 이식편대숙주병에서의 치료 및/또는 예방 효과는, 예를 들면 특징적인 장기 소견의 개선 효과나 스테로이드 감량 효과 등으로 평가할 수 있다. 피부 병변에서는 다형피부위축이나 강피증용 경화성 병변의 개선, 간 병변에 대해서는, 예를 들면 총빌리루빈이나 ALP, AST, ALT의 개선에 의해 평가할 수 있다. 또한, 신장 병변에 대해서는, 예를 들면 요단백량, 요중 알부민/크레아티닌 비로 평가해도 된다. 그 경우의 치료 및/또는 예방 효과의 판정은 상기의 SLE의 경우와 마찬가지로 할 수 있다.
여기에서, 「환자」는 인간, 또는 인간을 제외한 포유동물(예를 들면, 마우스, 모르모트, 햄스터, 래트, 쥐, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 고양이, 개, 마머세트, 원숭이, 또는 침팬지 등의 1종 이상)을 포함한다. 또한 환자는 RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 발증하고 있으면 진단된 환자라도 된다. 또한 환자는, 세포에서의 시트룰린화의 억제에 의해 치료 가능한 질환을 발증하고 있다고 진단된 환자라도 된다. 또한 환자는, 세포에서의 네토시스의 억제에 의해 치료 가능한 질환을 발증하고 있으면 진단된 환자라도 된다.
여기에서, 「치료」란, 포유동물, 특히 인간의 질환의 임의의 치료를 포함하고, 질환 증상을 저해하는, 즉, 그 진행을 저지 또는 질병 또는 증상을 소멸시키는 것, 및 질환 증상을 경감되는 것, 즉, 질병 또는 증상의 후퇴, 또는 증상의 진행의 지연을 야기하는 것을 포함한다.
또한, 「예방」이란, 포유동물, 특히 인간에 있어서, 상기 질환의 발증을 방지하는 것을 포함한다.
또한, 「재발 예방」이란, 포유동물, 특히 인간에 있어서, 관해(寬解), 재발을 반복하는 상기 질환의 재발을 방지하는 것을 포함한다.
본 발명의 항PAD4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 의약 조성물의 투여 형태는 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 정맥주사, 근육주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 뇌내 투여, 척수내 투여, 기타 국소 투여) 중 어느 하나의 투여 경로로 인간을 포함하는 포유류에 투여할 수 있다.
경구 투여 및 비경구 투여를 위한 제형 및 그 조제 방법은 당업자에게 주지하며, 본 발명에 의한 항체를 약학적으로 허용되는 담체 등과 배합함으로써 의약 조성물을 제조할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 주사용 제제(예를 들면, 점적주사제, 정맥주사제, 근육주사제, 피하주사제, 피내주사제, 뇌내 투여 제제, 척수내 투여 제제), 외용제 (예를 들면, 연고제, 팝제, 로션제), 좌제 흡입제, 안제(眼劑), 안연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등을 들 수 있다. 특히, 중추신경 조직에 직접 작용시키고 싶은 경우에는 침투압 펌프의 의료용 마이크로 펌프를 이용하여 지속적으로 주입할 수도 있고, 피브린 풀 등과 혼합하고 서방형 제제로 하고 나서 환부 조직에 유치할 수도 있다.
예를 들면, 주사용 제제는 통상, 항체를 주사용 증류수에 용해하여 조제하지만, 필요에 따라 용해 보조제, 완충제, pH 조정제, 등장화제, 무통화제, 보존제, 안정화제 등을 첨가할 수 있다. 또한, 용사(用事)조제용의 동결건조 제제로 할 수도 있다.
경구 투여를 위한 제형은 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제, 피복 정제, 환제, 세립제(細粒劑), 과립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제, 주사제, 트로키제 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 치료상 유효한 다른 약제를 더 함유해도 되고, 또한, 필요에 따라, 살균제, 소염제, 비타민류, 아미노산 등의 성분을 배합할 수도 있다.
약리학적으로 허용되는 담체로서는, 예를 들면 고형제제에서의 부형제(賦形劑), 활택제, 결합제 및 붕괴제, 혹은 액상제제에서의 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 및 무통화제 등을 들 수 있다. 또한 필요에 따라, 통상의 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제, 흡착제, 습윤제 등의 첨가물을 적절히 적량 사용할 수도 있다.
본 발명에 의한 항체의 투여량은, 예를 들면 투여 경로, 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중독도, 약품 동태 및 독물학적 특징 등의 약리학적 지견, 약물송달계의 이용의 유무, 및 다른 약물의 조합의 일부로서 투여될 것인지 등 여러가지 인자를 기초로, 의사에 의해 결정되지만, 통상, 성인(체중 60kg)당, 경구 투여에서는 1∼5000μg/일, 바람직하게는 10∼2000μg/일, 더욱 바람직하게는 50∼2000μg/일을, 주사 투여에서는 1∼5000μg/일, 바람직하게는 5∼2000μg/일, 더욱 바람직하게는 50∼2000μg/일을, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 전신으로의 비경구 투여에서는 체중당 10∼100000μg/kg, 보다 바람직하게는 100∼50000μg/kg, 더욱 바람직하게는 500∼20000μg/kg를 1일, 1주일, 1개월 동안에 1회, 또는 1년 동안에 1∼7회의 간격으로 투여할 수 있다. 침투압 펌프 등을 이용한 국소 투여에서는, 통상, 성인(체중 60kg)당, 10∼100000μg/일, 보다 바람직하게는 100∼10000μg/일, 더욱 바람직하게는 500∼5000μg/일의 속도로 지속 주입할 수 있다.
[실시예]
이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 항PAD4 항체의 화학적 안정성 확인
국제공개 제2016/143753호에 기재된 인간화 항PAD4 항체 G8의 CDR을 포함하는 가변 영역의 화학적 안정성을 평가하였다. 피험 항체 G8의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 CMV 프로모터의 하류에 삽입하는 것에 의해, lgG를 발현하는 포유 세포용 발현 벡터를 구축하였다. 경쇄 및 중쇄의 DNA 서열은 각각, 서열표의 서열번호 27 및 26을 이용하였다. 유전자 도입 시약 ExpiFectamine CHO Transfection Kit(LifeTechnologies)를 사용하여, 상기 발현 벡터를 ExpiCHO(LifeTechnologies)에 도입하였다. 유전자 도입 후 14일간 배양한 후에 배양 상청을 취득하였다. 오픈 컬럼을 사용하고, Protein A 수지(GE Healthcare, MabSelect SuRe)를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청으로부터 IgG를 정제하였다. Protein A 수지에 결합한 IgG를 6 Column Volume의 PBS(pH 7.2)에 의해 세정하였다. 그리고, pH 4.0의 Arg-Antibody Elution Buffer(Nacalai)에서 용출하고, 신속하게 중화함으로써 pH를 중성 부근으로 하였다. 정제 순도를 높이는 목적으로, AKTA prime plus(GE Healthcare)을 사용하고, Protein A 컬럼 정제 후의 IgG를 CHT(ceramic hydroxyapatite Type II 수지)(Bio-rad)로 정제하였다. CHT에 결합한 IgG를 NaCI 농도의 그래디언트로 용출하고, 목적의 프랙션을 회수 후, PD-10(GE Healthcare)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 PBS(pH 7.4)로 용액치환하였다. 피험 항체를 약 10mg/mL의 농도로 농축하여, 4℃ 혹은 37℃에서 2주간 보존하였다.
피험 항체 G8의 CDR을 포함하는 가변 영역의 화학적 안정성은 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC-MS)을 사용한 펩티드 맵핑 분석에 의해 평가하였다. 피험 항체에 대하여 염산 구아니딘(와코 준야쿠) 존재 하에 있어서 환원제 디티오트레이톨(와코 준야쿠)과 37℃에서 2시간 반응시켜 환원 처리를 실시하였다. 알킬화제 iodoacetamide(와코 준야쿠)를 첨가하여 30분 반응시킴으로써, 환원 반응에서 생긴 티올기를 알킬화하였다. 다음으로, 반응액을 탈염 컬럼 Zeba Spin column(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 버퍼 교환을 행하고, 2mol/L urea(SIGMA), 0.1mol/L NH4HCO3(와코 준야쿠), 1㎜ol/L CaCl2(와코 준야쿠), 0.8μg 트립신(와코 준야쿠)의 조건으로 37℃에서 밤새 반응시켰다. 얻어진 효소 소화물을 LC-MS 측정 샘플로 하였다.
트립신 소화에 의해 얻어진 펩티드를 역상 크로마토그래피 분리하고, 질량 분석 장치에서 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 취득함으로써 펩티드 맵핑 분석을 실시하였다.
LC는 이하의 파라미터에서 실시하였다.
장치: ACQUITY UPLC(Waters)
이동상: A=0.1% 포름산을 포함하는 초순수(超純水), B=0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴
분리 방법: 선형 그래디언트 분리(60분간 %B=1에서 40)
유속: 0.2mL/min
컬럼: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 column, 300옹스트롬, 1.7μm, 2.1×150㎜(Waters)
컬럼 오븐의 온도: 40℃
샘플량: 30μL
검출 파장: 215㎚
MS 및 MS/MS는 이하의 파라미터로 실시하였다.
장치: Synapt(Waters)
TOF 모드: V mode
이온화법: ESI Positive
MS 측정 범위: 50-2000Da
MS cone voltage : 24V
Scan time : 0.4s
MS/MS 방식: MSE
Trap CE voltage : Low energy 6V, High energy ramp 20-40V
얻어진 질량 데이터를 Biopharma Lynx Ver. 1.3.3(Waters)을 이용하여 해석하였다.
번역 후 수식의 비율은 이하의 방법으로 산출하였다. 먼저, Biopharma Lynx를 이용하여 피험 항체의 서열과 일치한 펩티드를 추출하고, MS/MS를 취득할 수 있는 펩티드(MS/MS b/y ion found≥2)에 대하여 해석을 행하였다. 검출된 모든 펩티드의 MS 강도와 번역 후 수식을 포함하는 펩티드의 MS 강도의 비율로부터 번역 후 수식의 비율을 산출하였다.
피험 항체 G8의 정제 후 4℃에서 보존한 샘플과 37℃에서 2주간 보존한 샘플에 관한 펩티드 맵핑에 의해, 중쇄의 프레임워크 영역의 84번째의 아스파라긴 잔기와 85번째의 세린 잔기 사이에서 절단된 펩티드가 동정되었다. 정제 후 4℃에서 보존한 샘플에 있어서, 절단된 펩티드의 비율은 해당 아미노산을 포함하는 펩티드 중 4.6%도 있고, 해당 부위가 잠재적으로 절단될 가능성이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 피험 항체 내가 다른 아스파라긴 잔기-세린 잔기 사이에서는 절단은 확인되고 있지 않으며, 84번째의 아스파라긴 잔기와 85번째의 세린 잔기 사이에 특이적이었다.
아스파라긴 잔기와 세린 잔기 사이에서 절단되는 것으로부터 84번째의 아스파라긴 잔기를 세린 잔기로 치환한 인간화 항PAD4 항체 G8ss를 작성하였다. 피험 항체 G8ss의 정제 후 4℃에서 보존한 샘플과 40℃에서 2주간 보존한 샘플에 대하여 펩티드 맵핑을 행하였다. 그 결과, 어느 쪽의 보존 조건에 있어서도 84번째의 세린 잔기와 85번째의 세린 잔기 사이에서 절단된 펩티드는 검출되지 않았다. 이상으로부터, 인간화 항PAD4 항체에 있어서는, 84번째가 세린 잔기 쪽이 보다 화학적 안정성이 높다고 생각된다.
피험 항체 G8과 G8ss의 인간 PAD4 단백질에 대한 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여 HBS-EP+ 중에서의 해리 상수(KD)를 측정함으로써 결정하였다. Biotin Capture Kit(GE Healthcare)를 이용하여 비오틴 표지한 인간 PAD4 단백질을 센서 칩에 고정화하였다. HBS-EP+를 이용하여 상기 PAD4 단백질을 0.25μg/mL로 조제하고, 리간드 용액으로 하였다. 리간드 용액을 플로우 셀에 유속 10μL/min로 30초간 첨가하고, 그 후의 60초간 HBS-EP+를 첨가하였다. 리간드 용액을 첨가하지 않은 플로우 셀을 레퍼런스 셀(reference cell)로 하였다. HBS-EP+를 이용하여 피험 항체를 몇백pM에서 몇nM으로 조제하고, 애널라이트(analyte) 용액으로 하였다. 또한, 러닝 완충액을 블랭크 용액으로 하였다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 single-cycle법을 이용하여 유속 30μL/min로 180초간 첨가하고, 해리 시간은 1200초간으로 하였다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 첨가했을 때의 리간드를 첨가한 플로우 셀의 센서그램으로부터 레퍼런스 셀의 센서그램을 빼고, 또한 애널라이트 용액을 첨가한 센서그램으로부터 블랭크 용액을 첨가한 센서그램을 뺀 것을 유속 30μL/min로 이용하였다. Biacore T200 Evaluation software(GE Healthcare)를 사용하고, 1:1 결합 모델을 이용하여 결합 파라미터를 산출하였다. 피험 항체 G8은 인간 PAD4 단백질에 결합 속도 상수 kon=7.70×106(1/Ms), 해리 속도 상수 koff=1.65×10-3(1/s), 해리 상수 KD=214pM의 결합 친화성으로 결합하였다. 피험 항체 G8ss는 인간 PAD4 단백질에 결합 속도 상수 kon=6.37×106(1/Ms), 해리 속도 상수 koff=1.76×10-3(1/s), 해리 상수 KD=276 pM의 결합 친화성으로 결합하였다. 이상으로부터, 인간화 항PAD4 항체에 있어서는, 84번째를 세린 잔기로 치환해도 인간 PAD4로의 결합 친화성은 변함없는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2> 상보성 결정 영역을 개량하기 위한 아미노산 치환 부위의 결정
인간화 항PAD4 항체 G8의 인간 PAD4로의 친화성 및 기능성 향상을 목적으로 하고, Fab(분자형이 Fab인 것을 의미함, 이하 동일하게 표기함) 파지 디스플레이에 의한 상보성 결정 영역의 개량을 행하였다. 상보성 결정 영역의 개량은 2단계로 실시하고, 제1 단계에서 인간 PAD4로의 친화성 향상을 노릴 수 있는 1아미노산 치환을 결정하고, 제2 단계에서 이들 1아미노산 치환의 복수의 조합을 결정하였다(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 2012 Vol. 428(3), p395). 모클론(parent clone) G8의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 이용하여 Fab 파지 디스플레이 벡터를 구축하였다. 이것을 주형으로 한 site-directed mutagenesis PCR 및 overlap extension PCR에 의한 다단층의 PCR 반응에 의해, 항체의 6개의 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 구성하는 모든 아미노산 잔기를 1개씩 전체 20종류의 천연 아미노산으로 치환한, 포괄적 1아미노산 치환 이변체 라이브러리를 구축하였다. Fab 파지 디스플레이법(Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 2012 Vol. 428(3), p395)에 의해, 재조합 인간 PAD4 단백질(비오틴 표지 PAD4)을 베이트로서 포괄적 1아미노산 치환 이변체 라이브러리의 농축을 몇 라운드 반복하였다. 농축 전(구축 직후)의 라이브러리 및 농축 후의 라이브러리에 포함되는 각 클론의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 염기서열을 차세대 시퀀서(Ion GeneStudio S5 System)를 이용하여 해석하였다. 먼저, 농축 전후의 각 라이브러리로부터 몇백만 리드의 서열 데이터를 취득하여, 상보성 결정 영역에서의 모든 1아미노산 치환 이변체의 존재 빈도를 산출하였다. 다음으로, 농축 전의 라이브러리와 농축 후의 라이브러리에서의 모든 1아미노산 치환 이변체의 존재 빈도의 변화 배율(농축비)를 산출하고, 라이브러리 농축에 의한 농축비의 크기를 지표로 하여, 인간 PAD4 단백질에 대한 친화성을 향상시키기 위해 유용하다고 생각되는 1아미노산 치환을 결정하였다. 이 때, 항체의 물성에 영향을 부여할 가능성이 있는 1아미노산 치환체(라이신과 아르기닌)의 데이터는 제외하였다. 마지막으로 이들 1아미노산 치환의 총수와 아미노산 서열상에서의 분포 상태를 고려하고, 제2 단계에서 구축하는 커스텀 라이브러리에서 아미노산 치환을 도입하는 위치를 결정하였다.
모클론 G8에서는, LCDR2(서열표의 서열번호 5)의 2번째의 아스파라긴, LCDR3(서열표의 서열번호 25)의 4번째의 아스파라긴산, HCDR2(서열표의 서열번호 24)의 11번째의 티로신, 12번째의 글리신, 13번째의 알라닌, 14번째의 알라닌, 15번째의 발린, 17번째의 글리신, HCDR3(서열표의 서열번호 11)의 1번째의 알라닌에 아미노산 치환을 도입하는 것을 결정하였다.
<실시예 3> 상보성 결정 영역을 개량한 인간화 항PAD4 항체의 창제
먼저, 친화성 향상을 목적으로 한 상기의 유용 아미노산 치환을 복수 조합하는 것에 의해 본격적인 상보성 결정 영역 개량용 커스텀 라이브러리를 설계하였다. 다음으로, LCDR3과 HCDR2에 stop 코돈을 삽입한 모클론 G8 Fab 파지 디스플레이의 벡터를 구축하고, Fab 파지 디스플레이 벡터를 주형으로 한 쿠켈법에 의한 부위특이적 이변 도입법(Fellouseet al., J. Mol. Biol.2007 Vol.373, p924)을 실시함으로써, 상보성 결정 영역을 상기의 설계에 기초하여 랜덤화한 상보성 결정 영역 개량용 커스텀 라이브러리를 구축하였다. 인간 PAD4 단백질(His tag PAD4, GST-biotin-PAD4)을 베이트로 하여, Fab 파지 디스플레이에 의한 라이브러리 농축을 몇 라운드 반복하였다. PAD4는 칼슘 이온의 유무로 구조가 변화할 가능성이 있으므로, 염화칼슘 존재 하, 및 비존재 하에서의 셀렉션을 행하고, 농축 검토를 실시하였다.
베이트로서 사용한 재조합 단백질은 하기와 같이 조제하였다. 인간 PAD4(잔기 1부터 잔기 663)는 N말단 측에 GST 태그-Avi 태그를 부가한 것을 pGEX-6P-1에 삽입함으로써 발현 벡터를 구축하고, 재조합 단백질을 조제하였다. 발현 벡터를 보유하는 대장균 BL21(DE3)pLysS주를 LB 배지 5mL에서 전(前)배양 후, 전배양액 1 mL를 LB 배지 50mL에 식균(植菌)하고, 37℃에서 대수증식기(OD600=1.0)까지 배양한 후, 100μm의 IPTG에 의해, 18℃/200rpm으로 약 18시간 발현 배양하였다. 회수한 균체를 세정 후, 초음파 파쇄하여 용균하고 상청을 회수하였다. 상청으로 시판되고 있는 비오틴 리가아제(Avidity, BirA)를 4℃에서 약 18시간 반응시키고, 원심분리에 의해 상청을 회수하였다. 상청 중에 포함되는 GST 태그-Avi 태그-인간 PAD4는 GS4B 수지(GE Healthcare)를 사용하여 정제하고, PreScission Protease(GE Healthcare)를 사용하여 GST 태그를 절단하고, Avi 태그-PAD4를 회수하였다.
염화칼슘 존재 하, 및 비존재 하의 조건 하에서 4∼6라운드 농축한 Fab 라이브러리에 포함되는 각 클론을 클로닝하고, 각 조건으로부터 랜덤하게 선택한 384클론의 서열을, 시퀀서를 이용하여 동정하였다. 384클론의 Fab를 모두 전장 항체(인간 IgG1/인간 λ)로 변환한 발현용 DNA 단편화하고, 유전자 도입 시약 ExpiFectamine 293 Transfection Kits(LifeTechnologies)를 사용하여, 상기 DNA를 Expi293(LifeTechnologies)에 도입하였다. 유전자 도입 후 5일간 배양한 후에 배양 상청을 취득하였다. Protein A 수지(GE Healthcare, PreDictor MabSelect SuRe LX)를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청으로부터 피험 항체(IgG)(분자형이 IgG인 것을 의미함, 이하 동일하게 표기함)을 정제하였다. 정제 후의 피험 항체 용액은 투석 디바이스(Merck, D-Tube96 Dialyzer)를 이용하여 PBS pH 7.4로 용액 치환하였다.
피험 항체에 대하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 항원 결합 확인을 행하였다. SPR 실험에는 표면 플라즈몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여 러닝 완충액 HBS-EP+(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%(V/V) Surfactant P20, pH 7.4) 중에서의 피험 항체의 항원 결합을 확인하였다. Biotin Capture Kit(GE Healthcare)를 이용하여 비오틴 표지한 인간 PAD4 단백질을 센서 칩에 고정화하였다. HBS-EP+를 이용하여 상기 PAD4 단백질을 4μg/mL로 조제하고, 리간드 용액으로 하였다. 리간드 용액을 플로우 셀에 유속 10μL/min로 30초간 첨가하고, 그 후의 60초간 HBS-EP+를 첨가하였다. 리간드 용액을 첨가하지 않은 플로우 셀을 레퍼런스 셀로 하였다. HBS-EP+를 이용하여 피험 항체를 10nM으로 조제하고, 애널라이트 용액으로 하였다. 또한, 러닝 완충액을 블랭크 용액으로 하였다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 유속 30μL/min로 120초간 첨가하고, 결합상의 센서그램을 얻었다. 다음으로, 러닝 완충액을 180초간 첨가함으로써 해리상(解離相)의 센서그램을 얻었다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 첨가했을 때의 리간드를 첨가한 플로우 셀의 센서그램으로부터 레퍼런스 셀의 센서그램을 빼고, 또한 애널라이트 용액을 첨가한 센서그램으로부터 블랭크 용액을 첨가한 센서그램을 뺀 것을 해석에 이용하였다. Biacore T200 Evaluation software v3.1(GE Healthcare)를 이용하여, 결합 시그널 및 비특이 흡착을 확인하였다.
상보성 결정 영역을 개량한 클론 중에서 인간 PAD4 단백질에 대한 친화성이 G8과 비교하여 향상되고, 센서 칩으로의 비특이 흡착이 적은 클론, 및 G8을 실시예 4 이후의 고차 평가로 진행시키는 5클론(G8, Lib2(4R)-1-47, Lib1(6R)-1-39, Lib1(6R)-2-37, Lib2(5R)-2-25)로서 결정하였다. 5클론의 CDR 서열을 표 1에 나타낸다. 5클론의 인간 PAD4에 대한 결합 친화성을 표 2에 나타낸다.
피험 항체(G8, Lib2(4R)-1-47, Lib1(6R)-1-39, Lib1(6R)-2-37, Lib2(5R)-2-25)의 인간 PAD4 효소 저해 활성을 평가하였다. 피험 항체의 최종농도가 600, 200, 66.67, 22.22, 7.41, 2.47, 0.82, 0.27, 0.09nM으로 되도록, 인간 PAD4(최종농도 10nM)와 1mM DTT, 150mM NaCl을 포함하는 50mM HEPES 완충액(pH 7.6)을 혼합하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 교반하면서 BAEE(벤조일아르기닌에틸에테르)를 부가하고, CaCl2를 더 부가하여 잘 교반하였다(BAEE의 최종농도는 10mM, 칼슘 이온의 최종농도는 10mM). 이 용액을 37℃에서 3시간 인큐베이션한 후, 시트룰린화된 BAEE의 시트룰린 잔기를 2,3-부탄디온모노옥심과 티오세미카바지드를 포함하는 혼합액을 사용하여 비색정량하였다.
피험 항체(G8, Lib2(4R)-1-47, Lib1(6R)-1-39, Lib1(6R)-2-37, Lib2(5R)-2-25)는 인간 PAD4의 효소 활성을 저해하고, IC50은 각각 21.6, 9.6, 8.7, 13.4, 8.3 nM이었다.
[표 1]
[표 2]
5클론, G8, Lib2(4R)-1-47, Lib1(6R)-1-39, Lib1(6R)-2-37, 및 Lib2(5R)-2-25에 대하여, 84번째의 아스파라긴을 세린으로 치환하고, 각각 G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 및 4-2-25로 하였다. 피험 항체(G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25)의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 CMV 프로모터의 하류에 삽입하는 것에 의해, lgG를 발현하는 포유세포용 발현 벡터를 구축하였다. 각 클론의 경쇄의 DNA 서열은 각각, 서열표의 서열번호 27, 17, 19, 21 및 23을 코딩하는 DNA 서열을 사용하고, 중쇄의 DNA 서열은 각각, 서열표의 서열번호 11 및 12를 코딩하는 DNA 서열을 사용하였다. 유전자 도입 시약 ExpiFectamine CHO Transfection Kit(LifeTechnologies)를 사용하여, 상기 발현 벡터를 ExpiCHO(LifeTechnologies)에 도입하였다. 유전자 도입 후 14일간 배양한 후에 배양 상청을 취득하였다. AKTA pure 25M(GE Healthcare)을 사용하고, Protein A 수지(JSR Life Sciences, Amsphere A3 column)을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상청으로부터 IgG를 정제하였다. Protein A 수지에 결합한 IgG를 6 Column Volume의 100mM 탄산나트륨 완충액(pH 11.0)에 의해 세정하고, 다음으로 6 Column Volume의 PBS(pH 7.2) (3×)에 의해 세정하였다. 그리고, pH 3.5의 Gly-HCl 완충액에서 용출하고, 신속하게 중화함으로써 pH를 중성 부근으로 하였다. 정제 순도를 높이는 목적으로, Protein A컬럼 정제 후의 IgG를 CHT(ceramic hydroxyapatite Type I 수지)(Bio-rad)로 정제하였다. CHT에 결합한 IgG를 NaCl 농도의 그래디언트로 용출하고, 목적의 프랙션을 회수 후, 투석법을 이용하여 PBS(pH 7.4)로 용액 치환하였다. 피험 항체(G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25)의 정제 후 4℃에서 보존한 샘플에 대하여 펩티드 맵핑을 행하였다. 그 결과, 84번째의 세린 잔기와 85번째의 세린 잔기 사이에서 절단된 펩티드는 검출되지 않았다.
<실시예 4> 인간 PAD4 단백질에 대한 결합 친화성
피험 항체(G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25)의 인간 PAD4 단백질에 대한 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여 HBS-EP+ 중에서의 해리 상수(KD)를 측정함으로써 결정하였다. Biotin Capture Kit(GE Healthcare)을 이용하여 비오틴 표지한 인간 PAD4 단백질을 센서 칩에 고정화하였다. HBS-EP+를 이용하여 상기 PAD4 단백질을 0.5μg/mL로 조제하고, 리간드 용액으로 하였다. 리간드 용액을 플로우 셀에 유속 10μL/min로 30초간 첨가하고, 그 후의 60초간 HBS-EP+를 첨가하였다. 리간드 용액을 첨가하지 않은 플로우 셀을 레퍼런스 셀로 하였다. HBS-EP+를 이용하여 피험 항체를 몇백pM에서 몇nM으로 조제하고, 애널라이트 용액으로 하였다. 또한, 러닝 완충액을 블랭크 용액으로 하였다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 single-cycle법을 이용하여 유속 30μL/min로 180초간 첨가하고, 해리 시간은 1200초간으로 하였다. 블랭크 용액 혹은 애널라이트 용액을 첨가했을 때의 리간드를 첨가한 플로우 셀의 센서그램으로부터 레퍼런스 셀의 센서그램을 빼고, 또한 애널라이트 용액을 첨가한 센서그램으로부터 블랭크 용액을 첨가한 센서그램을 뺀 것을 해석에 이용하였다. Biacore T200 Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여, 1:1 결합 모델을 이용하여 결합 파라미터를 산출하였다. 산출한 결합 파라미터를 표 3에 나타냈다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 피험 항체 G8ss는 인간 PAD4 단백질에 결합 속도 상수 kon=6.15×106(1/Ms), 해리 속도 상수 koff=1.22×10-3(1/s), 해리 상수 KD=199pM의 결합 친화성으로 결합하였다. 상보성 결정 영역을 개량한 항체 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25의 인간 PAD4 단백질에 대한 해리 상수는, 각각 31, 48, 73, 20pM이었다.
[표 3]
<실시예 5> 항체의 보존 안정성의 평가
항체의 보존 안정성의 지표의 하나로서 항원 결합 활성의 유지가 포함된다. 항체에 의해 보존 안정성은 크게 상이한 것은 공지되어 있으며, 예를 들면, DiCara et al., mAbs, 2018 Vol. 10(7), p1073에 교시되어 있는 것에서는, 4℃ 혹은 40℃에서 보존한 항체의 항원 결합능을 비교하고 있지만, 40℃에서 보존한 항체의 상대 항원 결합 활성은 4℃에서 보존한 항체의 상대 항원 결합 활성의 30% 이하부터 100%에 걸친다.
피험 항체(G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25)의 보존 안정성을 평가하기 위하여, 피험 항체를 약 10mg/mL의 농도로 시트르산 완충액(50mM 시트르산, 150mM NaCl, pH 6.3)에 용해하여, 4℃ 혹은 40℃에서 4주간 보존하였다. 보존 후의 항원 결합능의 유무를 조사하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 장치 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용한 항원 결합 활성 측정을 행하였다. 동결보존한 피험 항체, 4℃혹은 40℃에서 4주간 보존한 피험 항체를 러닝 완충액 HBS-EP+를 이용하여 10μg/mL로 조제하였다. Series S Sensorchip Protein A(GE Healthcare)를 이용하여 플로우 셀(2)에 피험 항체 용액을 유속 10μL/min로 60초간 첨가하고, 센서 칩에 고정화하였다. 플로우 셀(1)은 레퍼런스 셀로 하였다. 플로우 셀(2)의 피험 항체 첨가 종료후의 55초 후의 결합량을 플로우 셀(1)의 결합량으로부터 빼고, 항체 결합량으로 하였다. 다음으로, 인간 PAD4(Cayman Chemical company, Cat. 10500)를 HBS-EP+를 이용하여 50nM으로 조제하고, 애널라이트 용액으로 하였다. 애널라이트 용액을 유속 30μL/min로 120초간 첨가하여 결합상의 센서그램을 얻었다. 플로우 셀(2)의 애널라이트 용액 첨가 종료의 5초 전의 결합량을 플로우 셀(1)의 결합량으로부터 빼하고, 항원 결합량으로 하였다. 계속해서 러닝 완충액을 180초간 첨가함으로써 해리상의 센서그램을 얻었다. 측정은 25℃에서 진행되었다. 항체 결합량 및 항원 결합량은 데이터 해석 프로그램(GE Healthcare, Biacore T200 Evaluation Software v3.1)을 이용하여 산출하고, 각 조건에서의 항원 결합량을 항체 결합량으로 나눗셈하고 상대 항원 결합량으로 하였다. 동결보존한 피험 항체의 상대 항원 결합량과 4℃에서 보존한 피험 항체의 상대 항원 결합량은 변함없었다. 4℃·4주간 보존한 각종 피험 항체의 상대 항원 결합량과 40℃·4주간 보존한 피험 항체의 상대 항원 결합량을 비교하고, 항원 결합 활성으로 하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, G8ss에서는 40℃·4주간 보존 후의 항원 결합 활성은 82.2%였다. 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25에서는, 40℃·4주간 보존 후에 있어서, 90% 이상의 항원 결합 활성을 보유하고 있었다. 예를 들면, Pisupati et al., mAbs, 2017 Vol. 9(7), p1197에 교시되어 있는 바와 같이, 항체 의약품 레미케이드(등록상표)에서는 40℃에서 1개월 보관해도 항원 결합 활성은 80% 이상 유지된다. 또한, 항체의 생물 활성의 안정성으로서는, 항체 제제 조제 시에서의 항체의 생물 활성과 비교하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 생물 활성을 유지하는 것이 바람직하다(예를 들면, 국제공개 공보WO2003/018056을 참조). 이상으로부터, 피험 항체 G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25에 대하여, 양호한 보존 안정성이 관찰되었다.
[표 4]
<실시예 6> in vitro에서의 인간 PAD4의 효소 저해 활성의 평가
피험 항체(G8ss, 3-2-37, 3-1-39, 4-2-25, 2-1-47)의 인간 PAD4 효소 저해 활성을 평가하였다. 피험 항체의 최종농도가 600, 200, 66.67, 22.22, 7.41, 2.47, 0.82, 0.27, 0.09nM으로 되도록, 인간 PAD4(최종농도 10nM)와 1mM EDTA, 1mM DTT, 150mM NaCl을 포함하는 50mM HEPES 완충액(pH 7.4)을 혼합하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 교반하면서 BAEE(벤조일아르기닌에틸에테르)를 부가하고, CaCl2을 더 부가하여 잘 교반하였다(BAEE의 최종농도는 10mM, 칼슘 이온의 최종농도는 10mM). 이 용액을 37℃에서 3시간 인큐베이션한 후, 시트룰린화된 BAEE의 시트룰린 잔기를 2,3-부탄디온모노옥심과 티오세미카바지드를 포함하는 혼합액을 이용하여 비색정량하였다.
피험 항체(G8ss, 3-2-37, 3-1-39, 4-2-25, 2-1-47)은 인간 PAD4의 효소 활성을 저해하고, IC50은 각각 20.3, 15.3, 8.8, 7.6, 12.2nM이었다.
<실시예 7> CAIA 모델
항콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델 마우스를 이용하여, 피험 항체 G8ss, 2-1-47, 3-1-39, 3-2-37, 4-2-25의 약효 평가를 행하였다. CAIA 모델 마우스는, 관절 류머티즘(RA) 및 관절염의 모델 마우스다. CAIA 모델 마우스의 제작 방법은 마우스 관절염 야기용 항체 칵테일(Chondrex Inc., Cat.53040)의 프로토콜에 따랐다. 실험 조건의 개요를 도 1에 나타낸다. 0일째에, 9주령의 암컷 Balb/c 마우스(6마우스/군)의 미정맥에, 항콜라겐 항체 혼합액(1.5mg)을 정맥내 투여하였다. 3일째에, 25μg LPS(염증을 유발하는 물질)을 복막내 투여하였다. 3일째의 LPS 투여 4시간전에 피험 항체, 또는 대조 항체(인간 IgG1)을 정맥내 투여(15mg/kg)하였다. 3-10일에, 관절염 스코어를 이하의 (i)∼(iii)에 따라서 평가하였다.
(i) 평가 부위를 사지의 각 손가락, 손발의 등, 관절로 하였다. (ii) 관절염 스코어는 표 5에 따라서 붙였다. (iii) 관절염 스코어는 사지의 각 손가락, 손발의 등, 관절의 합계값의 평균으로 나타낸다(최대값은 16/마우스). 관절염 스코어의 평가 결과를 도 1에 나타내었다. 이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 피험 항체는 높은 RA 치료 효과를 가지고 있었다.
[표 5]
<실시예 8> CIA 모델
콜라겐 유도 관절염(CIA) 모델 마우스를 이용하여, 피험 항체 3-2-37의 약효 평가를 행하였다. CIA 모델 마우스는, 5-7주령의 암컷(DBA)/1마우스에 소 타입 II 콜라겐과 프로인드 아쥬반트를 첫날, 및 첫회 면역으로부터 21일 후의 2회에 걸쳐 면역함으로써 제작하였다. 첫회 면역으로부터 29일 후, 관절염을 발증한 마우스에 피험 항체를 0.3mg/kg, 1mg/kg, 또는 3mg/kg의 용량으로 미정맥 내에 투여하였다(각군 9마리). 첫회 면역으로부터 36일 후, 및 43일 후에도 3-2-37을 같은 양 투여하였다. 관절염 스코어를 이하의 (i)∼(iii)에 따라서 평가하였다. (i) 평가 부위를 사지의 각 손가락, 손발의 등, 관절로 하였다. (ii) 관절염 스코어는 표 6에 따라서 붙였다. (iii) 관절염 스코어는 사지의 각 손가락, 손발의 등, 관절의 합계값의 평균으로 나타내었다(최대값은 16/마우스). 관절염 스코어의 평가 결과를 도 2에 나타낸다. 이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 3-2-37은 이번 설정한 어느 용량이라도 시험 후반에서 대조 항체 투여군에 대하여 관절염 스코어 평균을 유의하게 저하시켰다(Shirley-Williams의 다중 비교 검정, *p<0.025, **p<0.005).
[표 6]
<실시예 9> cGvHD 모델
만성 이식편대숙주병(cGvHD) 모델 마우스를 이용하여, 피험 항체 3-2-37의 약효 평가를 행하였다. cGvHD 모델 마우스는, 8주령의 암컷 B6D2F1 마우스에 8-9주령의 암컷 DBA/2마우스의 비장세포를 이입함으로써 제작하였다. 이 마우스는 SLE 환자에서 생기는 루푸스 신염과 같은 신장 장애를 초래한다. 비장세포 이입의 전날, 2주일 후, 4주일 후, 및 6주일 후에 피험 항체를 3mg/kg, 또는 30mg/kg의 용량으로 복강내에 투여하였다(각 군 13마리). 비장세포 이입의 2주일 후에서 8주일 후까지, 주 1회의 빈도로 마우스의 하복부를 압박하여 채뇨하고, 요중의 단백 농도와 크레아티닌 농도를 측정하였다. 비장세포 이입의 8주일 후의 요단백 농도를 표 7에 따라서 스코어를 붙였다. 요단백 스코어의 평가 결과를 도 3에 나타낸다. 이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 피험 항체 3-2-37의 30mg/kg 투여군과 대조 항체 투여군에 대하여 요단백 스코어의 유의한 감소가 인지되었다(Shirley-Williams의 다중비교 검정, *p<0.025). 또한, 요중의 단백/크레아티닌 비가 3 미만(Pro/Cre<3)을 미발증 개체로 정의하고, 피험 항체 3-2-37의 30mg/kg 투여군과 대조 항체 투여군의 미발증율을 경시적으로 그래프화한 결과를 도 4에 나타낸다. 피험 항체 투여군의 미발증 기간의 중앙값은 7주일이었던 것에 대하여 대조 항체 투여군의 미발증 기간의 중앙값은 4주일이며, 피험 항체 투여군에서 유의한 미발증 기간의 연장이 인지되었다(LogRank 검정, p<0.05).
[표 7]
<서열표의 설명>
서열번호 1: 항PAD4 항체의 HCDR1의 아미노산 서열
서열번호 2: 항PAD4 항체의 HCDR2의 아미노산 서열(혼합 서열)
서열번호 3: 항PAD4 항체의 HCDR3의 아미노산 서열(혼합 서열)
서열번호 4: 항PAD4 항체의 LCDR1의 아미노산 서열
서열번호 5: 항PAD4 항체의 LCDR2의 아미노산 서열
서열번호 6: 항PAD4 항체의 LCDR3의 아미노산 서열(혼합 서열)
서열번호 7: 항PAD4 항체 Lib2(4R)-1-47, 2-1-47의 HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 8: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-1-39, 3-1-39의 HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 9: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-2-37, 3-2-37의 HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 10: 항PAD4 항체 Lib2(5R)-2-25, 4-2-25의 HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 11: 항PAD4 항체 G8, G8ss, Lib2(4R)-1-47, 2-1-47, Lib1(6R)-1-39, 3-1-39, Lib2(5R)-2-25, 4-2-25의 HCDR3의 아미노산 서열
서열번호 12: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-2-37, 3-2-37의 HCDR3의 아미노산 서열
서열번호 13: 항PAD4 항체 Lib2(4R)-1-47, 2-1-47, Lib1(6R)-1-39, 3-1-39의 LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 14: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-2-37, 3-2-37의 LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 15: 항PAD4 항체 Lib2(5R)-2-25, 4-2-25의 LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 16: 항PAD4 항체 2-1-47의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 17: 항PAD4 항체 Lib2(4R)-1-47, 2-1-47의 경쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 18: 항PAD4 항체 3-1-39의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 19: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-1-39, 3-1-39의 경쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 20: 항PAD4 항체 3-2-37의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 21: 항PAD4 항체 Lib1(6R)-2-37, 3-2-37의 경쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 22: 항PAD4 항체 4-2-25의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 23: 항PAD4 항체 Lib2(5R)-2-25, 4-2-25의 경쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 24: 항PAD4 항체 G8, G8ss의 HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 25: 항PAD4 항체 G8, G8ss의 LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 26: 항PAD4 항체 G8의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 27: 항PAD4 항체 G8, G8ss의 경쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 28: 항PAD4 항체 G8ss의 중쇄 전장의 아미노산 서열
서열번호 29: PAD4의 아미노산 서열
서열번호 30: 항PAD4 항체 G8의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 31: 항PAD4 항체 G8, G8ss의 경쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 32: 항PAD4 항체 2-1-47의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 33: 항PAD4 항체 2-1-47의 경쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 34: 항PAD4 항체 3-1-39의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 35: 항PAD4 항체 3-1-39의 경쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 36: 항PAD4 항체 3-2-37의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 37: 항PAD4 항체 3-2-37의 경쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 38: 항PAD4 항체 4-2-25의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 39: 항PAD4 항체 4-2-25의 경쇄 전장을 코딩하는 염기서열
서열번호 40: 항PAD4 항체 G8ss의 중쇄 전장을 코딩하는 염기서열
본 발명은, RA 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료에 유용하고, 의약품 산업에 있어서 높은 이용 가치를 가진다.
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Pharma Foods International Co., Ltd. <120> Novel anti PAD4 antibody <130> P212096 <150> JP2021-024642 <151> 2021-02-18 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR <400> 1 Thr Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR <220> <221> misc_difference <222> (11)..(11) <223> Tyr, Thr or Ile <220> <221> misc_difference <222> (12)..(12) <223> Gly, Ser or Pro <220> <221> misc_difference <222> (13)..(13) <223> Thr, Val Tyr or Pro <220> <221> misc_difference <222> (14)..(14) <223> Pro or Asn <220> <221> misc_difference <222> (15)..(15) <223> Tyr, Ala, Gln or Leu <220> <221> misc_difference <222> (17)..(17) <223> Gly, Thr or Ser <400> 2 Ala Ile Arg Asn Asp Gly Ser Trp Thr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR <220> <221> misc_difference <222> (1)..(1) <223> Ala 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tcaaggcggg agtggagacc 480 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 540 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 600 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tag 633 <210> 34 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 34 gaagtacagc tgcttgagag tggcggaggg ttggtccaac ctggtgggtc cttacgactg 60 agctgtgcag catctggctt caccttcagc acctatgcga tgggatgggt tcgtcaggct 120 cccggtaaag gcctggagtt tgtggctgcc atacgcaatg atgggtcttg gactgggact 180 agtgtgaatg ctaaaacgcg gtttacgatc tcaagggaca actccaagaa taccctctat 240 ctccagatgt cttctctaag agccgaagac acagccgtgt actactgcgc caagtacact 300 gggtcaagtg gaggctcgat tggcgcatgg ggtcagggaa cactggtcac agtgtccagc 360 gcctctacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaact gctgggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa tga 1353 <210> 35 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 35 tcgtatgagc tgacacaacc tccctcagtg tccgtaagtc caggacagac tgcgagaatc 60 acctgctctg gaggcaatcg caactactac tatgggtggt atcagcagaa acccggacaa 120 gctcctgtga ccgtcatcta tgccaacgac aaacggccat caggcattcc ggagaggttc 180 agcggtagca attccgggtc taccaccact ctcacgataa gtggggttca ggctgaagat 240 gaagccgact actactgtgg cacagcaacc acaggcaagt acgtgtttgg tggaggcact 300 aagctgacag tccttggtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc 360 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 420 ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 480 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 540 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 600 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tag 633 <210> 36 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 36 gaagtacagc tgcttgagag tggcggaggg ttggtccaac ctggtgggtc cttacgactg 60 agctgtgcag catctggctt caccttcagc acctatgcga tgggatgggt tcgtcaggct 120 cccggtaaag gcctggagtt tgtggctgcc atacgcaatg atgggtcttg gactgggata 180 ggttataatc agaaatctcg gtttacgatc tcaagggaca actccaagaa taccctctat 240 ctccagatgt cttctctaag agccgaagac acagccgtgt actactgcgg taagtacact 300 gggtcaagtg gaggctcgat tggcgcatgg ggtcagggaa cactggtcac agtgtccagc 360 gcctctacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaact gctgggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa tga 1353 <210> 37 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 37 tcgtatgagc tgacacaacc tccctcagtg tccgtaagtc caggacagac tgcgagaatc 60 acctgctctg gaggcaatcg caactactac tatgggtggt atcagcagaa acccggacaa 120 gctcctgtga ccgtcatcta tgccaacgac aaacggccat caggcattcc ggagaggttc 180 agcggtagca attccgggtc taccaccact ctcacgataa gtggggttca ggctgaagat 240 gaagccgact actactgtgg cacagcactc acaggcaagt acgtgtttgg tggaggcact 300 aagctgacag tccttggtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc 360 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 420 ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 480 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 540 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 600 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tag 633 <210> 38 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 38 gaagtacagc tgcttgagag tggcggaggg ttggtccaac ctggtgggtc cttacgactg 60 agctgtgcag catctggctt caccttcagc acctatgcga tgggatgggt tcgtcaggct 120 cccggtaaag gcctggagtt tgtggctgcc atacgcaatg atgggtcttg gactgggtat 180 cctcctcctc ttaaaggtcg gtttacgatc tcaagggaca actccaagaa taccctctat 240 ctccagatgt cttctctaag agccgaagac acagccgtgt actactgcgc caagtacact 300 gggtcaagtg gaggctcgat tggcgcatgg ggtcagggaa cactggtcac agtgtccagc 360 gcctctacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaact gctgggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa tga 1353 <210> 39 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 39 tcgtatgagc tgacacaacc tccctcagtg tccgtaagtc caggacagac tgcgagaatc 60 acctgctctg gaggcaatcg caactactac tatgggtggt atcagcagaa acccggacaa 120 gctcctgtga ccgtcatcta tgccaacgac aaacggccat caggcattcc ggagaggttc 180 agcggtagca attccgggtc taccaccact ctcacgataa gtggggttca ggctgaagat 240 gaagccgact actactgtgg cacagcatac acaggcaagt acgtgtttgg tggaggcact 300 aagctgacag tccttggtca gcccaaggct gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc 360 tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 420 ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 480 accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 540 cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 600 gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tag 633 <210> 40 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 40 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctatgcca tgggctgggt gcgccaggcc 120 cctggaaagg gcctggaatt tgtggccgcc atccggaacg atggcagctg gacaggatat 180 ggcgccgctg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga gcagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc caagtacacc 300 ggcagcagcg gcggctctat tggagcttgg ggacagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gcctctacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaact gctgggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa tga 1353

Claims (28)

  1. HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 7∼10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13∼15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    b-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    c-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
    d-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
    으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    b-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    c-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
    d-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
    으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  5. a-3) 중쇄(重鎖) 가변 영역이 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄(輕鎖) 가변 영역이 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    b-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    c-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
    d-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
    으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    a-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 16의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 17의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    b-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 18의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 19의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    c-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 20의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 21의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
    d-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 22의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 23의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
    으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    a-5) 중쇄가 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    b-5) 중쇄가 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편,
    c-5) 중쇄가 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 및
    d-5) 중쇄가 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편
    으로부터 선택되는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    PAD4에 대한 KD값이, 100pM 이하인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
    상기 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 40℃에서 1개월간 보존했을 때, 상기 보존 전의 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편이 가지는 PAD4 결합량에 비하여, 90% 이상의 결합량을 가지는 것인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  11. e-1) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2가 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3이 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
    중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  12. 제11항에 있어서,
    e-2) HCDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR2가 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지고, HCDR3이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR1이 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR2가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, LCDR3이 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서,
    중쇄의 84번째의 아미노산에 상당하는 아미노산이 세린인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  13. e-3) 중쇄 가변 영역이 서열번호 28의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열을 포함하는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    e-4) 중쇄 가변 영역이 서열번호 28의 아미노산 번호 1∼120의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 번호 1∼105의 아미노산 서열로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    e-5) 중쇄가 서열번호 28로 이루어지고, 경쇄가 서열번호 27로 이루어지는, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편으로서, 생성 시에 생기는 절단이 총생성량의 3% 미만인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 중화 항체인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 서열번호 29로 표시되는 PAD4의 결합 항체인, 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 핵산 분자.
  20. 제19항에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.
  21. 제20항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는, 형질전환체.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는, 의약 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방제 또는 치료제인, 의약 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    단백질에서의 시트룰린화의 억제제인, 의약 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포에서의 네토시스(NETosis)의 억제제인, 의약 조성물.
  26. 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병을 예방 또는 치료하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물의 사용.
  27. 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방제 또는 치료제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물의 사용.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 항PAD4 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 유효량 투여하는 것에 의한, 관절 류머티즘 또는 관절염, 전신성 홍반루푸스, 루푸스 신염, 또는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료 방법.
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