CN115820778A - 工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，属于多肽生产技术领域。该方法包括以下步骤：简单蒸煮去内脏和沙嘴的海参，121℃、0.1MPa处理10‑15min，粉碎，碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解150‑180min、风味蛋白酶酶解30‑60min，灭活、过滤、离心、压滤，过截留分子量为10‑20ku的超滤膜，透过液用3nm活性炭纤维膜脱色，截留液121℃、0.1MPa处理10‑20min、压滤，混合截留液和透过液，三段浓缩后干燥形成干粉。本发明的有益之处在于：先用超滤膜将多肽和多糖分开，然后对两者单独进行处理，再混合，最终获得了富含海参多糖的海参多肽，其活性较高、更适合工业化生产。

Description

工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法
技术领域
本发明涉及一种工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，属于多肽生产技术领域。
背景技术
海参多糖是海参体壁的重要活性成分之一，其含量占干参总有机物的4%-10%。海参多糖包括海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯。其中，海参硫酸软骨素是带岩藻糖支链的酸性粘多糖，主要由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-岩藻糖以糖苷键连接而成，是一种分支杂多糖；海参岩藻聚糖硫酸酯是由L-岩藻糖以糖苷键连接而成，是一种直链多糖。海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的化学结构特殊，为海参所特有，二者的硫酸酯化程度都高达30%以上。
由于海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的分子量都特别大（海参硫酸软骨素相对分子质量为40-50ku，海参岩藻聚糖硫酸酯相对分子质量为80-100ku），并且在蛋白质酶解过程中以及在高温高压、中性pH条件下海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的糖苷键均不能被破坏（黏度高），此外，海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯还都含硫酸基（带负电荷），所以在海参多肽的纯化、脱腥脱色等工艺流程中，海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯基本都被去除，市面上的海参多肽产品其海参多糖的含量基本都低于0.5%，海参多糖浪费严重。
中国专利CN101191139A公开了一种海参多肽、多糖的综合提取工艺，采用该综合提取工艺虽然可以制备出高纯度的海参多肽和高纯度完整的海参多糖，但是该综合提取工艺并不适宜工业化生产，更适宜实验室小规模制备高纯度的海参多肽和高纯度完整的海参多糖用于学术研究，具体的：
（1）该综合提取工艺通过两次酶解、醇沉的方法分离海参多肽和海参多糖，上清液主要为游离的氨基酸（平均分子量为128u）、二肽和三肽，平均分子量小于350u（每形成一个肽键将除去一分子水，水的相对分子量为18），产品的活性较低，所以该综合提取工艺不适宜工业化生产；
（2）该综合提取工艺虽然进行了两次酶解，但是只有游离氨基酸、二肽和三肽才能溶于60%的乙醇溶液，产品得率仅为68.2%，产品得率较低，所以该综合提取工艺不适宜工业化生产；
（3）该综合提取工艺需要进行两次醇沉，乙醇的耗费量较大，所以该综合提取工艺不适宜工业化生产；
（4）该综合提取工艺在海参粗多糖的精制过程中需要加入乙酸钾，通过盐析得到较高纯度的海参多糖，由于引入了外来物质乙酸钾，后期需要去残留等，所以该综合提取工艺不适宜工业化生产；
（5）该综合提取工艺需要对海参多糖溶液进行长达48h的透析处理，由于工业化生产不是在无菌环境下进行的，透析时间过长料液很容易变质，所以该综合提取工艺不适宜工业化生产。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，包括以下步骤：
（1）将干海参泡发，然后剖开，去除内脏和沙嘴，用纯水洗净；
（2）将洗净的海参放入蒸煮锅中，加水，对海参进行简单蒸煮，然后将海参捞出，弃汤液；
（3）将经过简单蒸煮的海参放入高压釜中，加水，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10-15min；
（4）将高温高压处理后的海参用斩拌机粉碎；
（5）将粉碎好的海参倒入到酶解罐中，将高温高压处理步骤剩余的蒸煮汤液也泵入到酶解罐中，再加入纯水，然后将酶解罐内的料液的pH值调节至7-9、温度升至50-55℃，之后依次加入干海参重量0.2%的碱性蛋白酶和干海参重量0.2%的中性蛋白酶，酶解150-180min，最后加入干海参重量0.1%的风味蛋白酶，酶解30-60min，酶解过程持续搅拌；
（6）将酶解后的料液加热至85-90℃，保持10min；
（7）将灭活后的料液降温至50-55℃，然后用200-250目的滤网过滤，之后将滤液倒入卧式螺旋沉降离心机内进行离心，最后将离心液泵回至酶解罐中；
（8）将酶解罐中的料液导入到板框压滤机内进行压滤；
（9）将压滤后的料液过截留分子量为10-20ku的卷式超滤膜，分别收集透过液和截留液；
（10）将透过液的温度升至35℃，然后导入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中进行脱腥脱色，活性炭纤维的微孔孔径为3nm，收集滤液；
（11）将截留液泵入到高压釜中，用醋酸将截留液的pH值调节至5，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10-20min，待截留液冷却至50-60℃时，用氢氧化钠溶液将截留液的pH值调节至6.5-7，然后导入到板框压滤机内进行压滤，收集滤液；
（12）将经过高温高压处理和板框压滤处理的截留液与经过脱腥脱色处理的透过液混合，然后将混合液用卷式纳滤膜依次进行一级纳滤、二级纳滤和三级纳滤；
（13）将经过三段浓缩后得到的浓缩液进行瞬时喷雾干燥，形成干粉，即得到海参多肽。
优选的，在步骤（1）中，干海参的泡发方法为：将干海参于4-10℃水中泡发48h，其间换水2次。
优选的，在步骤（2）中，按照料液比1：4-5加水；当水加热至80-90℃时将海参捞出。
优选的，在步骤（3）中，按照料液比1：2-3加水。
优选的，在步骤（5）中，加入纯水后，最终固液比为1：4-5。
优选的，在步骤（7）中，离心速度为4800r/min，生产能力为0.8m3/h。
优选的，在步骤（8）中，板框压滤机内装有AG-3000#硅藻土。
优选的，在步骤（11）中，板框压滤机内装有SD 307#制糖专用硅藻土。
优选的，在步骤（13）中，瞬时喷雾干燥的方法为：将浓缩液升温至90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为150-160℃。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明先用超滤膜将小分子海参多肽和大分子海参多糖（海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯）分离开，然后再对两者单独进行处理，最后再混合，最终获得了富含海参多糖（海参多糖的含量达到6.02-6.07%）的海参多肽，避免了海参多糖浪费；
（2）本发明通过在pH=5、121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理海参多糖10-20min，使得海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的部分糖苷键断裂，经过适度降解的海参多糖分子量减小、水溶性变好、黏度降低；
（3）本发明的方法海参多肽得率可以达到85%，海参多肽中总氮含量（以干基计）为14.8-14.9%，蛋白质含量（以干基计）为92.5-93.1%，海参多肽中相对分子质量小于1000u的小分子肽占比为76.42-78.30%，海参多肽平均相对分子质量为742u-798u（分子量标品回归直线方程：Y=-0.24742X+7.23795，R2=0.9917），分子量适中，活性较高；
（4）本发明的方法不需要耗费大量乙醇，不会引入外来物质，也不需要长时间透析，更适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1制备得到的海参多肽的分子量分布图；
图2是本发明实施例2制备得到的海参多肽的分子量分布图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
1、预处理
将干海参于4℃水中泡发48h，其间换水2次。然后剖开海参，去除内脏和沙嘴，用纯水清洗干净。
2、去除海参皂苷
海参皂苷是海参的次生代谢产物，海参受到天敌攻击时，居维氏器官便从体腔伸出并释放具有鱼毒性和溶血性的物质作为防御工具，其中就含有皂苷，与此同时，海参体壁表面也会分泌出毒素，毒素的主要成分就是皂苷。
研究发现，海参皂苷具有多种生理活性，但是过量的海参皂苷对黏膜有强烈的刺激性。另外，海参皂苷还具有强烈的吸湿性，易吸潮，不易保存。因此，在制备海参多肽产品时，需要将大部分海参皂苷去除掉。
由于海参皂苷的水溶液经强烈振摇会产生持久性的泡沫，且加热也不会消失，如果不提前去除海参皂苷，那么在后续的酶解过程中（需要不断搅拌）就会产生大量的持久性的泡沫，这是非常不利于工业化生产的。因此，在酶解之前就要将料液中大部分的海参皂苷提前去除掉。
本发明将去除海参皂苷的步骤安排在了预处理之后，去除海参皂苷的方法具体如下：
将清洗干净的海参放入蒸煮锅中，按照料液比1：4加水，然后对海参进行简单蒸煮，当水加热至80℃时，将海参捞出，弃汤液。
海参皂苷可溶于水，尤其易溶于热水，因此，简单蒸煮海参时，海参皂苷会溶于汤液中，弃汤液可以去除大量的皂苷，同时还能去除涩、辣等不良风味。
海参体壁中的蛋白质约70%为胶原蛋白，海参胶原蛋白是由三条α多肽链形成的类Ⅰ型胶原蛋白，类Ⅰ型胶原蛋白富含丙氨酸和糖结合型羟赖氨酸，α多肽链的端肽形成胶原蛋白的球状结构区，三条α多肽链借助范德华力、氢键及共价键交联聚合成三股螺旋结构（直径小于50nm），成为难溶性胶原蛋白，因此，简单蒸煮海参时，胶原蛋白的损失甚微。
海参多糖分子通过糖肽键与蛋白多糖的核心蛋白相连，此外海参多糖分子还与蛋白链间通过非共价键（氢键等次级键）形成具有螺旋、折叠、盘绕、卷由空间构象的大分子聚集体，因此，简单蒸煮海参时，海参多糖的损失也甚微。
3、高温高压处理
海参经过上一步的简单蒸煮后，体积缩小，且更具弹性，这是非常不利于接下来的粉碎和酶解的。高温高压处理可以很好的解决此问题。
故本发明在简单蒸煮海参后，又对其进行了高温高压处理，高温高压处理的方法具体如下：
将经过简单蒸煮的海参放入高压釜中，按照料液比1：2加水，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10min。
经过高温高压处理后的海参体积变大，弹性变小。
4、粉碎
将高温高压处理后的海参用斩拌机粉碎。
5、酶解
将粉碎好的海参倒入到酶解罐中，将高温高压处理步骤剩余的蒸煮汤液也泵入到酶解罐中，再加入纯水，最终固液比为1：4，然后将酶解罐内的料液的pH值调节至7、温度升至50℃，之后依次加入干海参重量0.2%的碱性蛋白酶（安琪AP-200A系列）和干海参重量0.2%的中性蛋白酶，酶解150min，最后加入干海参重量0.1%的风味蛋白酶，酶解30min，酶解过程持续搅拌。
6、灭活
将酶解后的料液加热至85℃，保持10min。
7、离心
将灭活后的料液降温至50℃，然后用200目的滤网过滤，之后将滤液倒入到卧式螺旋沉降离心机内，离心速度为4800r/min，离心生产能力为0.8m3/h，最后将离心液泵回至酶解罐中。
8、板框压滤
将酶解罐中的料液（离心液）导入到装有AG-3000#硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内进行压滤。
AG-3000#硅藻土具有中粗的微孔结构，不仅能使海参多肽料液获得较好的流速比，而且能滤除海参多肽料液中的微细的悬浮物。
9、膜过滤
将压滤后的料液过截留分子量为10ku的卷式超滤膜，分别收集透过液和截留液。
海参硫酸软骨素的相对分子质量为40-50ku，海参岩藻聚糖硫酸酯的相对分子质量为80-100ku，小分子肽的相对分子质量<5ku。因此，透过液基本以小分子肽为主，截留液基本以大分子海参多糖（海参硫酸软骨素、海参岩藻聚糖硫酸酯）为主。
10、处理透过液（脱腥脱色）
将透过液的温度升至35℃，然后导入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜（活性炭纤维的微孔孔径为3nm）脱色装置中进行脱腥脱色，收集滤液。
11、处理截留液
将截留液泵入到高压釜中，用醋酸将截留液的pH值调节至5，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10min。待截留液冷却至50℃时，用质量浓度为5%的氢氧化钠溶液将截留液的pH值调节至6.5，然后导入到装有SD 307#制糖专用硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内进行压滤，收集滤液。
截留液在进行高温高压处理时，只有在pH值<7时，其中的海参多糖的糖苷键才能被破坏、被降解。另外，海参多糖在100-121℃范围内加热时，pH值越低、温度越高、加热时间越长，分子量降低越明显。但是硫酸根含量是决定海参多糖活性极为重要的指标，随着pH值的降低、加热时间的增加，硫酸根损失增大。综合考虑到酸对设备的腐蚀、硫酸根的损失以及节能等因素，本发明最终确定将截留液的pH值调节至5，并在121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理截留液10-20min。经过适度降解的海参多糖，分子量减小，水溶性变好，黏度降低。
12、混合
将经过高温高压处理和板框压滤处理的截留液与经过脱腥脱色处理的透过液混合，然后将混合液用卷式纳滤膜依次进行一级纳滤、二级纳滤和三级纳滤。
混合液经过三段浓缩后，浓度逐级提高，同时灰分也被去除。
13、干燥
将经过三段浓缩后得到的浓缩液升温至90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为150℃，形成干粉，即得到海参多肽，得率为85%。
将得到的海参多肽倒入到水中，制成质量浓度为2%的样品溶液，该样品溶液澄清透明。
经检测，样品中海参多糖的含量为6.07%，总氮含量（以干基计）为14.8%，蛋白质含量（以干基计）为92.5%。
另外，经检测，样品的分子量分布如图1所示，具体数据见下表1：
表1 样品的分子量分布表
分子量大小 占比
<180u 13.49%
180-500u 37.89%
500-1000u 25.04%
1000-2000u 14.56%
2000-5000u 8.08%
>5000u 0.93%
由上表可知，本发明制备得到的海参多肽中分子量<1000u的占比为76.42%。
另外，依据分子量标品回归直线方程：Y=-0.24742X+7.23795，R2=0.9917，经计算，本发明制备得到的海参多肽其平均相对分子质量为798u，分子量适中，活性较高。
实施例2
1、预处理
将干海参于10℃水中泡发48h，其间换水2次。然后剖开海参，去除内脏和沙嘴，用纯水清洗干净。
2、去除海参皂苷
将清洗干净的海参放入蒸煮锅中，按照料液比1：5加水，然后对海参进行简单蒸煮，当水加热至90℃时，将海参捞出，弃汤液。
3、高温高压处理
将经过简单蒸煮的海参放入高压釜中，按照料液比1：3加水，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理15min。
4、粉碎
将高温高压处理后的海参用斩拌机粉碎。
5、酶解
将粉碎好的海参倒入到酶解罐中，将高温高压处理步骤剩余的蒸煮汤液也泵入到酶解罐中，再加入纯水，最终固液比为1：5，然后将酶解罐内的料液的pH值调节至8、温度升至55℃，之后依次加入干海参重量0.2%的碱性蛋白酶（安琪AP-200A系列）和干海参重量0.2%的中性蛋白酶，酶解180min，最后加入干海参重量0.1%的风味蛋白酶，酶解60min，酶解过程持续搅拌。
6、灭活
将酶解后的料液加热至90℃，保持10min。
7、离心
将灭活后的料液降温至55℃，然后用250目的滤网过滤，之后将滤液倒入到卧式螺旋沉降离心机内，离心速度为4800r/min，离心生产能力为0.8m3/h，最后将离心液泵回至酶解罐中。
8、板框压滤
将酶解罐中的料液（离心液）导入到装有AG-3000#硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内进行压滤。
9、膜过滤
将压滤后的料液过截留分子量为20ku的卷式超滤膜，分别收集透过液和截留液。
10、处理透过液（脱腥脱色）
将透过液的温度升至35℃，然后导入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜（活性炭纤维的微孔孔径为3nm）脱色装置中进行脱腥脱色，收集滤液。
11、处理截留液
将截留液泵入到高压釜中，用醋酸将截留液的pH值调节至5，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理20min。待截留液冷却至60℃时，用质量浓度为5%的氢氧化钠溶液将截留液的pH值调节至7，然后导入到装有SD 307#制糖专用硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内进行压滤，收集滤液。
12、混合
将经过高温高压处理和板框压滤处理的截留液与经过脱腥脱色处理的透过液混合，然后将混合液用卷式纳滤膜依次进行一级纳滤、二级纳滤和三级纳滤。
13、干燥
将经过三段浓缩后得到的浓缩液升温至90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为150℃，形成干粉，即得到海参多肽，得率为85%。
将得到的海参多肽倒入到水中，制成质量浓度为2%的样品溶液，该样品溶液澄清透明。
经检测，样品中海参多糖的含量为6.02%，总氮含量（以干基计）为14.9%，蛋白质含量（以干基计）为93.1%。
另外，经检测，样品的分子量分布如图2所示，具体数据见下表2：
表2 样品的分子量分布表
分子量大小 占比
<180u 13.92%
180-500u 39.67%
500-1000u 24.71%
1000-2000u 14.25%
2000-5000u 6.71%
>5000u 0.74%
由上表可知，本发明制备得到的海参多肽中分子量<1000u的占比为78.30%。
另外，依据分子量标品回归直线方程：Y=-0.24742X+7.23795，R2=0.9917，经计算，本发明制备得到的海参多肽其平均相对分子质量为742u，分子量适中，活性较高。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引伸出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干海参泡发，然后剖开，去除内脏和沙嘴，用纯水洗净；
（2）将洗净的海参放入蒸煮锅中，加水，对海参进行简单蒸煮，然后将海参捞出，弃汤液；
（3）将经过简单蒸煮的海参放入高压釜中，加水，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10-15min；
（4）将高温高压处理后的海参用斩拌机粉碎；
（5）将粉碎好的海参倒入到酶解罐中，将高温高压处理步骤剩余的蒸煮汤液也泵入到酶解罐中，再加入纯水，然后将酶解罐内的料液的pH值调节至7-9、温度升至50-55℃，之后依次加入干海参重量0.2%的碱性蛋白酶和干海参重量0.2%的中性蛋白酶，酶解150-180min，最后加入干海参重量0.1%的风味蛋白酶，酶解30-60min，酶解过程持续搅拌；
（6）将酶解后的料液加热至85-90℃，保持10min；
（7）将灭活后的料液降温至50-55℃，然后用200-250目的滤网过滤，之后将滤液倒入卧式螺旋沉降离心机内进行离心，最后将离心液泵回至酶解罐中；
（8）将酶解罐中的料液导入到板框压滤机内进行压滤；
（9）将压滤后的料液过截留分子量为10-20ku的卷式超滤膜，分别收集透过液和截留液；
（10）将透过液的温度升至35℃，然后导入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中进行脱腥脱色，活性炭纤维的微孔孔径为3nm，收集滤液；
（11）将截留液泵入到高压釜中，用醋酸将截留液的pH值调节至5，然后于121℃、0.1MPa条件下恒温恒压处理10-20min，待截留液冷却至50-60℃时，用氢氧化钠溶液将截留液的pH值调节至6.5-7，然后导入到板框压滤机内进行压滤，收集滤液；
（12）将经过高温高压处理和板框压滤处理的截留液与经过脱腥脱色处理的透过液混合，然后将混合液用卷式纳滤膜依次进行一级纳滤、二级纳滤和三级纳滤；
（13）将经过三段浓缩后得到的浓缩液进行瞬时喷雾干燥，形成干粉，即得到海参多肽。
2.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（1）中，干海参的泡发方法为：将干海参于4-10℃水中泡发48h，其间换水2次。
3.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（2）中，按照料液比1：4-5加水。
4.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（2）中，当水加热至80-90℃时将海参捞出。
5.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（3）中，按照料液比1：2-3加水。
6.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（5）中，加入纯水后，最终固液比为1：4-5。
7.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（7）中，离心速度为4800r/min，离心生产能力为0.8m3/h。
8.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（8）中，板框压滤机内装有AG-3000#硅藻土。
9.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（11）中，板框压滤机内装有SD 307#制糖专用硅藻土。
10.根据权利要求1所述的工业化生产富含海参多糖的海参多肽的方法，其特征在于，在步骤（13）中，瞬时喷雾干燥的方法为：将浓缩液升温至90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为150-160℃。
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