CN115820508A - 一株地衣芽孢杆菌及其在制备低分子量γ-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents
一株地衣芽孢杆菌及其在制备低分子量γ-聚谷氨酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌及其在制备低分子量γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明提供地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA‑BL19，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221810。该地衣芽孢杆菌菌株能够高效生产γ‑聚谷氨酸，且其生产的γ‑聚谷氨酸为低分子量γ‑聚谷氨酸。该菌株生产的低分子量γ‑聚谷氨酸除可用于化妆品、食品等领域外，还可用于作为微生物的冻干保护剂，能够有效保护冻干过程中的细菌和真菌，减少冻干过程对微生物的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株地衣芽孢杆菌及其在制备低分子量γ-聚谷氨酸中的应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种生物高分子载体材料，最早由Ivanovics等人在炭疽芽孢杆菌的夹膜中发现，是芽孢杆菌属微生物(如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)在生命活动过程中产生的次级代谢产物，可通过微生物发酵法制备。
γ-PGA的分子量(Mw)主要在10-10000kDa。不同分子量的γ-PGA具有不同的功能和应用领域，例如：低分子量的γ-PGA(Mw<400kDa)能够改善食物口感、涂抹到皮肤上能够保持皮肤湿润、光滑，可用于食品、化妆品领域，还可用于药物载体，将药物靶向递送到癌细胞并释放其包封的活性成分以抑制肿瘤的生长；高分子量γ-PGA(Mw>1 000kDa)具有更高的黏度，可以作为絮凝剂吸附水中的重金属，作为增稠剂用于生物材料的制备等。目前，低分子量γ-PGA在食品领域、化妆品、医药载体方面的应用和需要更为广泛。
不同的γ-PGA生产菌株的特性不同，菌株的γ-PGA产量和相对分子质量也就有所差异。γ-PGA生产菌可分为两大类：芽孢杆菌属和其他菌种，常用的生产γ-PGA的微生物是芽孢杆菌属微生物，除此之外还有异源表达γ-PGA合成基因的大肠杆菌。芽孢杆菌属微生物中，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌常被作为γ-PGA的生产菌株。
目前，制备低分子量γ-PGA主要是通过胞内调控和体外调节两种途径。胞内调控主要是通过发酵条件的改变，例如：添加山梨醇、无机盐进行胁迫以及通过基因改造手段对生产菌株进行改造；但是，目前的基因改造手段主要是针对γ-PGA的产量，对于分子量的研究较少且不成熟，例如：Pgds和GTT虽然能够使分子量降低，但可能会影响γ-PGA的产量。体外调节主要是通过发酵时候添加γ-PGA降解酶控制γ-PGA的分子量大小，或者采用超声法、酸热降解法促进γ-PGA的降解，存在水解分子量大小难以控制的弊端。
现有技术公开的产γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株主要包括：地衣芽孢杆菌ATCC9945A发酵得到γ-PGA的相对分子质量在500kDa-800kDa之间，γ-PGA产量为5-17g/L；另一株Bacillus lichniformis菌株发酵5天，γ-PGA的相对分子质量为300kDa，产量为8.5g/L；Bacillus licheniormis WX-02合成的γ-PGA分子量为100-1200kDa。目前仍缺乏高产低分子量的γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株地衣芽孢杆菌，该菌株能够高产低分子量γ-PGA。
本发明以土壤中筛选得到的产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为出发菌株，进行离子束注入诱变筛选，得到了一株高产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌菌株，该菌株能够高效转化前体谷氨酸为γ-聚谷氨酸，并且该菌株生产的γ-PGA为低分子量产品，分子量小于265kDa，在微生物的冻干保护中具有优异的效果，可作为微生物的冻干保护剂。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19，该菌株已于2022年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221810，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19具有高产γ-聚谷氨酸的特性，其发酵生产的γ-聚谷氨酸的分子量集中在265kDa以下，属于低分子量γ-聚谷氨酸，在食品、化妆品、药物载体等领域具有广泛用途，且在微生物冻干保护方面的效果优异。
第二方面，本发明提供一种发酵物，其由以上所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PGA-BL19经发酵培养制备得到。
所述发酵物包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19或包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19及其发酵上清液。
第三方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂含有以上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19。
上述菌剂中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19优选以活菌形式存在。
对于菌剂的剂型，本发明没有特殊限制，可以为微生物制剂领域常见的剂型，例如：固体菌剂或液体菌剂，其中，固体菌剂可为冻干粉。
上述菌剂除含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19以外，还可包含微生物制剂领域允许的辅料或载体。
第四方面，本发明提供以上所述的菌剂的制备方法，所述方法包括将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19经培养获得菌液的步骤。
优选地，所述培养为在35-37℃条件下进行。
上述获得的菌液可直接或加入微生物制剂领域允许的辅料或载体制备为液体菌剂，也可收集菌液中的菌体与冻干保护剂等微生物制剂领域允许的辅料或载体混合后，经真空冷冻干燥制备为冻干菌粉。
第五方面，本发明提供以上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19或所述菌剂在制备γ-聚谷氨酸中的应用。
优选地，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤300kDa。
进一步优选地，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤270kDa。
进一步优选地，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤265kDa。
第六方面，本发明提供以上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19或所述菌剂在制备微生物冻干保护剂中的应用。
以上所述的微生物冻干保护剂中除含有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PGA-BL19发酵产生的γ-聚谷氨酸外，还可包含其它一种或多种具有微生物冻干保护功能的物质。
第七方面，本发明提供一种制备γ-聚谷氨酸的方法，所述方法包括：对以上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19进行培养得到培养液，收集培养液中的γ-聚谷氨酸。
上述培养的温度优选为35-37℃。pH优选为6.8-7.4。转速优选为100-280rpm。
上述培养优选在盐胁迫条件下进行。
上述培养所使用的培养基优选包括如下组分：葡萄糖或蔗糖或甘油130-150g/L、蛋白胨或酵母粉或硝酸钾30-40g/L、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾1.5-2.5g/L、谷氨酸钠50-80g/L，一水柠檬酸3-5g/L、硫酸镁或氯化钙或硫酸锰0.4-0.6g/L，氯化钠8-12g/L，pH 6.5-7.2。
上述收集培养液中的γ-聚谷氨酸可通过将培养液去除菌体后，上清液中加入乙醇进行沉淀，离心收集沉淀物，透析脱盐后获得γ-PGA。其中，乙醇的添加量优选为上清液的1-5倍。
第八方面，本发明提供一种γ-聚谷氨酸，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤270kDa，其中，分子量为265kDa-35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为86-97％，分子量大于等于18kDa且小于35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为1.5-2.5％，余量为分子量≤10kDa的γ-聚谷氨酸。
优选地，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤265kDa，其中，分子量为265kDa-35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为94-97％，分子量大于等于18kDa且小于35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为1.5-2.0％，余量为分子量≤10kDa的γ-聚谷氨酸。
优选地，以上所述的γ-聚谷氨酸由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19经发酵产生。
进一步优选地，以上所述的γ-聚谷氨酸采用以上所述的制备γ-聚谷氨酸的方法制备得到。
第九方面，本发明提供一种微生物冻干保护剂，所述冻干保护剂包含以上所述的γ-聚谷氨酸。
以上所述的微生物冻干保护剂除包含上述γ-聚谷氨酸外，还可包含其它一种或多种具有微生物冻干保护功能的物质。
本发明的有益效果在于：本发明提供的地衣芽孢杆菌能够高效生产γ-聚谷氨酸，且其生产的γ-聚谷氨酸为低分子量γ-聚谷氨酸。
本发明提供的地衣芽孢杆菌生产的低分子量γ-聚谷氨酸除可用于化妆品、食品等领域外，还可用于作为微生物的冻干保护剂。经实验验证，该低分子量γ-聚谷氨酸对于冻干过程的植物乳杆菌等细菌具有较好的保护作用，可应用于益生菌冻干粉制备工艺，对于高山被孢霉菌等真菌的冻干具有十分优异的保护作用，可用于菌种保藏和菌剂制备工艺。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1高产低分子量γ-PGA地衣芽孢杆菌的获得
将地衣芽孢杆菌菌悬液涂布于无菌平皿，在超净台中以无菌空气风干备用，在中国科学院离子束生物工程学重点实验室氮离子注入装置上进行菌株的等离子诱变。N+离子源注入能量15keV，注入剂量10×1014ion/cm2，以5s脉冲式注入，间隔20s，合计注入15s，靶室真空度约10-3Pa。将涂布平皿放于注入机靶台上进行离子束注入。诱变结束后以2mL无菌水洗脱，梯度稀释后，涂布于含有初筛培养基的平板上，37℃培养16h。挑选菌落黏稠的菌落，经过二级种子活化，以1％的接种量接种到复筛发酵培养基保存。将初筛得到的菌株接种于含种子培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，每株菌设置3个平行，37℃、250r/min培养12h。种子液按4％转接到含发酵培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，37℃、150r/min培养48h。
在发酵后测定γ-PGA的产量和γ-PGA分子量，筛选高产低分子量γ-PGA的菌株。
γ-PGA的产量和γ-PGA分子量的测定方法如下：
γ-PGA产量测定：按照QB/T 5189-2017中的方法测定；
γ-PGA分子量测定：γ-PGA分子量使用水相凝胶渗透色谱(gel permeationchromatography,GPC)进行测定，采用三柱串联，所用柱型号分别为：WatersUltrahydrogel TM 2000(7.8mm×300mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8mm×300mm)和Waters Utrahydrogel TM120(7.8mm×300mm)。检测方式：以去离子水作为流动相，流速为0.6mL/min，柱温为65℃，示差折光检测器(RI)进行检测。以不同分子质量的葡聚糖为标准样品，建立分子质量与保留时间之间的标准方程，计算样品γ-PGA的分子量。
经不断筛选，获得一株高产γ-PGA，且生产的γ-PGA的分子量较低的地衣芽孢杆菌菌株，将该菌株命名为PGA-BL19。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19已于2022年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M20221810，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
实施例2菌株发酵培养和低分子量γ-PGA的制备(1)
对地衣芽孢杆菌PGA-BL19进行发酵培养生产低分子量γ-PGA，具体方法如下：
1、种子培养
菌种活化：将地衣芽孢杆菌PGA-BL19接种在斜面培养基上，于37℃、湿度60％培养16-18h，制备成熟的斜面种子。
所述斜面培养基组成为：蔗糖60g/L，蛋白胨60g/L，谷氨酸钠80g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙1g/L，琼脂15g/L，pH为6.5，115℃灭菌20min。
种子培养基制备及种子活化培养：
一级种子液制备：用灭菌的0.85％生理盐水1-2mL，将斜面的菌落洗脱下来，按0.1％-0.2％接种量接种到装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rmp培养14h至对数生长期。
二级种子液制备：将制备得到的一级种子液按0.3％接种量接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rmp培养12h，到对数生长期。
一级和二级种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L、谷氨酸钠10g/L，pH为7.5，115℃灭菌20min。
2、发酵培养
配制发酵培养基：葡萄糖140g/L、酵母粉35g/L、磷酸氢二钾2g/L、谷氨酸钠60g/L，一水柠檬酸4g/L、氯化钙0.5g/L，氯化钠10g/L，pH6.8。
发酵培养基的装液量为200mL/1L的挡板摇瓶，将步骤1中二级种子液按10％接种量接种到发酵培养基中，37℃恒温摇床培养48h，0-12h转速为120rmp；12-24h转速为200rmp；24-48h转速为250rmp。培养48h，发酵完毕，检测发酵液γ-聚谷氨酸的产量达到45.8g/L，其中分子量在265kDa≥Mw≥35kDa的γ-聚谷氨酸含量占比96.5％，在35kDa＞Mw≥18kDa之间的γ-聚谷氨酸含量占比1.7％，剩余为分子量≤10kDa的γ-聚谷氨酸。
3、发酵液中γ-PGA的提取
将发酵液离心除去菌体后，上清液中加入发酵液体积2倍的乙醇，沉淀后离心收集沉淀物，透析脱盐后获得γ-PGA。
实施例3菌株发酵培养和低分子量γ-PGA的制备(2)
对地衣芽孢杆菌PGA-BL19进行发酵培养生产低分子量γ-PGA，发酵培养的方法与实施例2的区别仅在于：采用装液量为1/2的7L发酵罐进行发酵培养，37℃恒温摇床培养48h，0-12h转速为150rmp；12-24h转速为220rmp；24-48h转速为250rmp。培养48h，发酵完毕，检测发酵液γ-聚谷氨酸的产量达到48.8g/L，其中分子量在265kDa≥Mw≥35kDa的γ-聚谷氨酸含量占比94.6％，在35kDa＞Mw≥18kDa之间的γ-聚谷氨酸含量占比1.9％，剩余为分子量≤10kDa的γ-聚谷氨酸。
实施例4低分子量γ-PGA用于微生物的冻干保护
将实施例2制备的γ-PGA用于植物乳杆菌和高山被孢霉菌的冻干保护，具体方法和结果如下：
1、植物乳杆菌的冻干保护
植物乳杆菌种子培养基、活化培养基采用MRS培养基，植物乳杆菌在MRS固体培养基生长48h，在液体培养基生长16h到对数期，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，用2.5％的实施例2制备的γ-聚谷氨酸进行重悬，-80℃冷冻过夜，冻干成粉末。密封放置-20℃至两天，采用梯度稀释，进行平板计数，计算菌株冻干后存活率N％＝N1/N0*100；其中，N1：冻干粉末计数活菌数；N0：冻干前计数活菌数。
2、高山被孢霉菌的冻干保护
高山被孢霉种子培养基、活化培养基采用PDA培养基，高山被孢霉在PDA斜面培养基上培养4天，在液体培养基中培养3天到成熟期，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，用2.5％的实施例2制备的γ-聚谷氨酸进行重悬，-80℃冷冻过夜，冻干成粉末。密封放置-20℃至两天，采用梯度稀释，进行平板计数，计算菌株冻干后存活率N％＝lgN1/lgN0*100％，其中N1：冻干粉末计数活菌数；N0：冻干前计数活菌数。
实验结果如表1所示。
表1不同分子量γ-PGA对植物乳杆菌和高山被孢霉菌冻干保护作用
冷冻干燥是将菌体悬浮液冷冻到冰点以下，从而转变为固体结晶态，然后在低温低压(真空)下使固体升华而脱水的干燥方法。一般干燥处理过程会破坏微生物的细胞膜，导致细胞的大量死亡，因此需要添加保护剂，提高菌液密度的均一性，减少活菌在冻干过程中因机械效应和溶质效应导致的死亡。在冻干前加入的冻干保护剂是影响冻干菌粉活力的至关重要的决定性因素，它既会影响到储存期细胞的活性以及稳定性，也会影响到复水时的细胞存活率。
γ-聚谷氨酸除广泛应用于化妆品、食品、药品领域外，已有文献公开γ-聚谷氨酸可以应用于益生菌的冻干保护，例如CN112899204B公开了含有γ-聚谷氨酸的益生菌冻干外壳复合保护剂；文献“高分子聚合物γ-PGA对长双歧杆菌的冻干保护作用”公开了γ-PGA与乳清粉复配能够起到较好的冻干保护效果。这些研究均涉及γ-聚谷氨酸与其他物质复配作为微生物的冻干保护剂。文献“Relationship between the Antifreeze Activitiesand the Chemical Structures of Oligo-and Poly(glutamic acid)s”中经理化实验验证后，发现20KDa的γ-PGA的抗冻性最好，确实对于细菌而言，本发明制得的γ-PGA与超低分子量的γ-PGA对微生物的冻干保护效果优势不明显，但是相比细菌，真菌由于细胞体积大，缺少细胞壁保护形态，在冷冻干燥预冻过程中更容易受到冰晶的机械损伤。因此，真菌在冻干工艺过程中更容易失活，细胞死亡率更高，对冻干保护剂的性能要求更高。本发明的地衣芽孢杆菌PGA-BL19能够产生分子量范围及分布合适的γ-聚谷氨酸产品，该产品能够提升γ-聚谷氨酸对菌体在冻干过程中的保护作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221810。
2.一种菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)PGA-BL19。
3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19经培养获得菌液的步骤。
4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19或权利要求2所述的菌剂在制备γ-聚谷氨酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤300kDa。
6.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19或权利要求2所述的菌剂在制备微生物冻干保护剂中的应用。
7.一种制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：对权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19进行培养得到培养液，收集培养液中的γ-聚谷氨酸。
8.一种γ-聚谷氨酸，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸的分子量≤270kDa，其中，分子量为265kDa-35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为86-97％，分子量大于等于18kDa且小于35kDa的γ-聚谷氨酸的质量百分含量为1.5-2.5％，余量为分子量≤10kDa的γ-聚谷氨酸。
9.根据权利要求8所述的γ-聚谷氨酸，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸由权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)PGA-BL19经发酵产生。
10.一种微生物冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包含权利要求8或9所述的γ-聚谷氨酸。
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|---|---|---|---|---|
| CN117089496A (zh) * | 2023-08-22 | 2023-11-21 | 轩凯生物科技(山东)有限公司 | 一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用 |
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