CN108624504A - 一种从石油污染物分离固氮菌的方法 - Google Patents

一种从石油污染物分离固氮菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从石油污染物分离固氮菌的方法，属于微生物分离培养技术领域。本发明方法包括以下步骤：(1)采集石油污染物，加水悬浮，悬浮液进行梯度稀释；(2)制备无氮固体培养基，在培养基融化状态分别加入不同稀释度的悬浮液，混匀后静置培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染物中的固氮菌。本发明能够弥补常规方法只能获得好氧条件下可以固氮的菌，容易在筛选中遗漏微好氧或厌氧条件固氮的菌，满足了固氮菌对氧需求的多样性，从而提高了石油污染物中分离固氮菌的准确率和分离效率，应用前景广阔。

Description

一种从石油污染物分离固氮菌的方法
技术领域
本发明涉及微生物分离培养技术领域，特别是涉及一种从石油污染土壤或石油污染水体中分离固氮菌的方法。
背景技术
生物固氮是指固氮微生物将大气中的氮气转化为可被生物体利用的氮源过程，可分为共生固氮、联合固氮和自生固氮。共生固氮一般是微生物与其他生物紧密生活在一起，并形成特殊的共生结构进行固氮作用；联合固氮是指有些自生固氮菌可以定植于植物的根际或体内，与宿主之间存在着互利关系，并有一定的特异性；自生固氮菌通常在自然环境或培养基中独立生活就能够固定分子态氮，并将其还原为氨。
固氮菌广泛的分布在自然界中，而针对油污土壤微生物的分析表明，固氮菌的数量与土壤一定浓度石油污染存在正相关。随着土壤石油污染浓度的升高，存在固氮酶活性的高表达和固氮菌的富集，推测原因是由于污染土壤中石油的含量较高，在降解石油微生物作用下，增加了土壤中碳源的含量，在氮源含量相对降低的条件下，引起固氮菌的富集。固氮菌的存在可以增强原油污染生物治理的能力，一些菌株即便是浓度较低也可以增加石油降解能力。Ikechukwu等人将固氮菌(Azotobacter vinelandii)和降解石油的假单胞菌(Pseudomonas sp)混合接种于污染土壤中，石油烃降解率从23.2–44.45％提高到66.83-69.6％。从石油污染土壤中分离固氮菌，将为石油污染土壤的生物治理提供重要的菌株资源。然而石油中各成分的存在影响并抑制了包括固氮菌在内的大多数微生物的生长，因此从石油污染土壤中分离固氮菌并不容易分离得到。
常见的固氮菌分离方法主要使用Ashby无氮培养基，通过将待分离样品梯度稀释后，表面涂布于无氮培养基中，在30℃培养3-5天后，观察并筛选纯化菌株。后续通过固氮酶结构基因nifH的扩增和序列分析，结合固氮酶活性分析对其是否是固氮菌进行确定。然而自生固氮菌类型繁多，包括好氧、厌氧、微好氧、兼性厌氧和光合细菌等，由于固氮酶对氧高度敏感，很多固氮菌只能在厌氧或微好氧条件下才能固氮，容易在常规分离方法中被错过。因此常规的无氮培养基表面涂布的方法只能获得一些存在防氧保护机制的好氧固氮菌，其它种类的固氮菌由于固氮酶对氧的需求不同，无法在好氧条件下固定氮素，因而丧失了在无氮培养基中生长的能力，从而在筛选中被遗漏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从石油污染物中分离固氮菌的方法以克服现有技术的不足。
本发明首先提供一种改进了的无氮固体培养基，其1L的配方为：葡萄糖20-50g；K2HPO4 0.5-1.0g；MgSO4·7H2O 0.1-0.2g；三价铁柠檬酸盐【Fe(Ⅲ)-citrate】0.02-0.05g；NaMoO4·2H2O0.001-0.76g；琼脂粉8-15g；加水至1L；pH 7.0。
优选地，本发明的提供的无氮固体培养基，其1L的配方为：葡萄糖25-40g；K2HPO40.8-1.0g；MgSO4·7H2O 0.15-0.2g；三价铁柠檬酸盐0.03-0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001-0.05g；琼脂粉8-12g；加水至1L；pH 7.0。
更优选地，本发明的提供的无氮固体培养基，其1L的配方为：葡萄糖30g；K2HPO41.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g；加水至1L；pH 7.0。
上述无氮固体培养基中，由于增加了碳源，为固氮菌的生长提供了能量，便于更好地培养并分离固氮菌。现有技术中无氮固体培养基中碳源较少，通常添加葡萄糖为10g左右，申请人在固氮酶活性测定过程中发现每升培养基中，葡萄糖达到30-50g时，固氮菌的以氮气为唯一氮源的生长能力最高，超过80g时，则对固氮菌的生长有抑制作用，因此利用此碳源浓度分离固氮菌，将更有利于菌株在无氮培养基中生长的能力，从而提高检出率。同时，分离用的无氮培养基中优化凝固剂琼脂粉的用量为1％，培养基仍可以形成固体状态，不流动，有利于菌体的分散和固定，同时后续菌株筛选中，由于培养基比较软，有利于不同层次中单菌落的挑取。
本发明提供了所述的无氮固体培养基在从石油污染土壤分离固氮菌的应用。
进一步地，本发明提供了一种从石油污染物中分离固氮菌的方法，包括以下步骤：(1)采集石油污染物，加水悬浮，悬浮液进行梯度稀释；(2)制备本发明所述的无氮固体培养基，在培养基融化状态分别加入不同稀释度的悬浮液，混匀后静置培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染物中的固氮菌。所述石油污染物为石油污染土壤或石油污染水体。
本发明的从石油污染物中分离固氮菌的方法中，步骤(2)中培养基融化状态是指50-55℃下培养基的融合状态。
步骤(2)中静置培养的条件为25-35℃培养2-4天。
优选地，步骤(2)中静置培养的条件为30℃培养2-4天。
本发明还提供了利用上述方法分离得到的固氮菌的纯化方法，挑取无氮固体培养基中生长的菌落，采用GCMY培养基纯化，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10-30g；K2HPO4 0.5-1.0g；MgSO4·7H2O 0.1-0.2g；FeSO4·7H2O 0.02-0.05g；CaCl2·2H2O0.05-0.1g，NaMoO4·2H2O 0.001-0.76g；酵母粉0.5-1g；水解酪蛋白0.5-1g；麦芽汁0.5-1g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。
优选地，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O0.2g；FeSO4·7H2O 0.05g；CaCl2·2H2O 0.1g；NaMoO4·2H2O 0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。
本发明还提供了一种分离厌氧固氮菌的方法，采用上述方法分离得到固氮菌，挑取无氮固体培养基内生长的菌落，采用厌氧管滚管法进行纯化，得到厌氧固氮菌。
本发明提供了上述方法在提高石油污染土壤或石油污染水体中固氮菌分离效率的应用。
本发明的有益效果在于：本发明弥补常规方法只能获得好氧条件下可以固氮的菌，容易在筛选中遗漏兼性厌氧或厌氧菌的不足，采用改良后的无氮培养基筛选固氮菌，以混菌接种法代替常规方法中的表面涂布，分离用的无氮培养基中优化凝固剂琼脂粉的用量为1％，培养基仍可以形成固体状态，不流动，有利于菌体的分散和固定，同时后续菌株筛选中，由于培养基比较软，有利于不同层次中单菌落的挑取。本发明的培养基对在无氧或微好氧条件下进行固氮作用的微生物筛选提供了必要条件，满足了固氮菌对氧需求的多样性，极大提高了固氮微生物分离的多样性和固氮菌的检出率，不仅能够从难以分离到固氮菌的石油污染土壤或水体中分离到固氮菌，并且所分离的固氮菌包括好氧、厌氧、微好氧、兼性厌氧等固氮菌，对于好氧或厌氧谱的固氮菌都能够分离得到，提高了石油污染土壤或水体中分离固氮菌的准确率和分离效率，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为固氮菌在无氮培养基中添加不同浓度葡萄糖的生长情况
图2为青岛市黄岛区中石化黄潍输油管***原油泄漏污染土壤分离固氮菌16SrRNA基因序列***发育树。
图3为辽宁新民石油(蜡质稠油)污染土壤分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图4为辽宁盘锦石油污染土壤样品1分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图5为辽宁盘锦石油污染土壤样品2分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图6为辽宁盘锦石油污染土壤样品3分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图7为辽宁盘锦石油污染土壤样品4分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图8为辽宁盘锦石油污染土壤样品5分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
图9为辽宁盘锦石油污染土壤样品6分离固氮菌16S rRNA基因序列***发育树。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明所使用的培养基为：
(1)无氮固体培养基(无氮土壤改良)：
葡萄糖30g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；Fe(Ⅲ)-citrate 0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g；加水至1L；pH 7.0(2)GMCY培养基：
葡萄糖10g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；FeSO4·7H2O 0.05g；CaCl2·2H2O0.1g；NaMoO4·2H2O 0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g。
实施例中SQ-204型气相色谱测定条件：载体：N2，放大器量程：10-11A/mV，柱温：70℃，检测器温度：150℃。
实施例1固氮菌在无氮培养基中添加不同浓度葡萄糖的生长情况
(1)菌体的培养：选择确定具有固氮能力的菌株Klebsiella sp PJ35做为实验材料，用LB培养基将菌株培养至对数期后，调整初始密度为OD600＝0.2；
(2)生长能力的检测：将培养好的固氮菌，接种到含有不同的葡萄糖浓度的无氮培养基中，葡萄糖浓度分别为:10g/L，30g/L，50g/L，80g/L。每隔两小时测一次菌体OD600值。结果见图1。
表明在30g/L和50g/L葡萄糖浓度下，固氮菌在无氮培养基中的生长能力最优，超过80g/L葡萄糖浓度后，会对其生长有抑制，而10g/L葡萄糖浓度在超过24hr后，生长能力有下降。因此在本发明中改进无氮培养基中葡萄糖浓度为30g/L，促进固氮菌在无氮培养基中的生长能力，从而提高分离菌株的检出。
实施例2青岛市黄岛区中石化黄潍输油管***原油泄漏污染土壤固氮菌的分离
(1)样品采集：采集青岛黄潍输油管***原油污染土壤进行固氮菌的筛选
(2)固氮菌的分离：称取2.5g土样加入10ml无菌水悬浮，漩涡振荡器震荡10min，促进分散，静止2-5分钟，吸取悬浮液，稀释至10-3，将无氮固体培养基融化后55℃保温，每个稀释度取1ml加入到25ml无氮固体培养基中，充分混匀后，立刻制备平板，每个稀释度3个重复。30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了石油污染土壤中的固氮菌，挑取单菌落至GMCY培养基纯化后，-80℃保存。
(3)固氮菌***发育地位分析：将纯化后，挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清做为PCR模板。PCR扩增的反应体系(50μL)：
PCR反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃90s，共30个循环；72℃延伸10min。
将PCR扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，回收后，通过16S rDNA-RFLP酶切分型，选择不同的酶切分型，重新扩增16S rDNA送华大基因测序，利用MEGA5软件分析，使用Maximum Likelihood(ML)方法，基于Tamura-Nei模型，使用最大相似然法计算菌株的***发育地位。
(4)固氮菌固氮特性的定性分析：将纯化后的菌株在LB液体培养基中培养至对数期后，按照1％接种量转接到25ml LB液体培养基中，培养至对数期后，5000rmp离心收集菌体，用无氮培养基洗涤菌体1-2次后，重新悬浮，调整OD600＝1.0，吸取菌液715μl注入到含有10ml半固体培养基的厌氧管中，充分混匀，30℃培养箱培养2天后，充入10％体积乙炔气体(即1.4ml)，不同时间点取100μl气体于气谱(SQ-204型气相色谱，FID检测器，2米填充柱，内装GDX502)测定气体中乙烯含量(由于个别菌株乙烯生成量较少，作为定性实验，以乙烯峰的有无和乙烯峰面积数值做为初筛数据)。
本实施例中，固氮菌数量达到103/g土样，通过菌落形态的区分，选取并纯化了22个菌落，16S rDNA-RFLP酶切分型，获得8个不同的酶切分型，测序结果表明分属于5个属8个不同的种。
实施例3新民高凝油污染土壤固氮菌的分离
(1)样品采集：从油田采集石油污染土壤。
(2)固氮菌的分离：称取2.5g土样加入10ml无菌水悬浮，漩涡振荡器震荡10min，促进分散，静止2-5分钟，吸取悬浮液，稀释至10-3，将无氮固体培养基融化后55℃保温，每个稀释度取1ml加入到25ml无氮固体培养基中，充分混匀后，立刻制备平板，每个稀释度3个重复。30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了石油污染土壤中的固氮菌，挑取单菌落至GMCY培养基纯化后，-80℃保存。
(3)固氮菌***发育地位分析：将纯化后，挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清做为PCR模板，PCR扩增的反应体系(50μL)：
PCR反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃90s，共30个循环；72℃延伸10min。
将PCR扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，通过16S rDNA-RFLP酶切分型，选择不同的酶切分型，重新扩增16S rDNA回收后，送华大基因测序，利用MEGA5软件分析，使用Maximum Likelihood(ML)方法，基于Tamura-Nei模型，使用最大相似然法计算菌株的***发育地位，结果见图2。
(4)固氮菌固氮特性的定性分析：将纯化后的菌株在LB液体培养基中培养至对数期后，按照1％接种量转接到25ml LB液体培养基中，培养至对数期后，5000rmp离心收集菌体，用无氮培养基洗涤菌体1-2次后，重新悬浮，调整OD600＝1.0，吸取菌液715μl注入到含有10ml半固体培养基的厌氧管中，充分混匀，30℃培养箱培养2天后，充入10％体积乙炔气体(即1.4ml)，不同时间点取100μl气体于气谱(SQ-204型气相色谱，FID检测器，2米填充柱，内装GDX502)测定气体中乙烯含量(由于各别菌株乙烯生成量较少，作为定性实验，以乙烯峰的有无和乙烯峰面积数值做为初筛数据)。
本实施例中，固氮菌数量达到103/g土样，通过菌落形态的区分，选取并纯化了12个菌落，16S rDNA-RFLP酶切分型，获得7个不同的酶切分型，测序结果表明分属于3个属7个不同的种。
实施例4辽宁盘锦油田污染土壤固氮菌的分离
(1)样品采集：从油田采集6份石油污染土壤，根据采集地不同对样品进行标记；
(2)固氮菌的分离：称取2.5g土样加入10ml无菌水悬浮，漩涡振荡器震荡10min，促进分散，静止2-5分钟，吸取悬浮液，稀释至10-3，将无氮固体培养基融化后55℃保温，每个稀释度取1ml加入到25ml无氮固体培养基中，充分混匀后，立刻制备平板，每个稀释度3个重复。30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了石油污染土壤中的固氮菌，挑取单菌落至GMCY培养基纯化后，-80℃保存。
(3)固氮菌***发育地位分析：挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清做为PCR模板。PCR反应体系和反应条件参见实施例1和2。
将PCR扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，通过16S rDNA-RFLP酶切分型，选择不同的酶切分型，重新扩增16S rDNA后，送华大基因测序，利用MEGA5软件分析，使用Maximum Likelihood(ML)方法，基于Tamura-Nei模型，使用最大相似然法计算菌株的***发育地位，结果见图3-8。
(4)固氮菌固氮特性的定性分析：将纯化后的菌株在LB液体培养基中培养至对数期后，按照1％接种量转接到25ml LB液体培养基中，培养至对数期后，5000rmp离心收集菌体，用无氮培养基洗涤菌体1-2次后，重新悬浮，调整OD600＝1.0，吸取菌液715μl注入到含有10ml半固体培养基的厌氧管中，充分混匀，30℃培养箱培养2天后，充入10％体积乙炔气体(即1.4ml)，不同时间点取100μl气体于气谱(SQ-204型气相色谱，FID检测器，2米填充柱，内装GDX502)测定气体中乙烯含量(由于各别菌株乙烯生成量较少，作为定性实验，以乙烯峰的有无和乙烯峰面积数值做为初筛数据)。
本实施例中，固氮菌数量达到103/g土样，通过菌落形态的区分，选取并纯化了126个菌落，16S rDNA-RFLP酶切分型和测序结果表明，盘锦石油污染土样1纯化了29个菌落，分属于9个属16个不同的种；土样2纯化了23个菌落，分属于4个属8个不同的种；胜土样3纯化了11个菌落，分属于3个属3个不同的种；土样4纯化了16个菌落，分属于10个属15个不同的种；土样5纯化了28个菌落，分属于7个属12个不同的种；土样6纯化了19个菌落，分属于5个属6个不同的种。
实施例5新疆油藏水固氮菌的分离
(1)样品采集：从油井采集油藏水；
(2)固氮菌的分离：吸取1ml水样加入10ml无菌水稀释，稀释至10-3，将无氮固体培养基融化后55℃保温，每个稀释度取1ml加入到25ml无氮培养基中，充分混匀后，立刻制备平板，每个稀释度3个重复。30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了油藏水中的固氮菌，挑取单菌落至GMCY培养基纯化后，-80℃保存。
本实施例同时使用K.oxytoca无氮固体培养基作为对照组，表面涂布和混菌法进行菌株分离，利用K.oxytoca培养基纯化菌株。
K.oxytoca培养基：葡萄糖50g；NaCl 2g；MgSO4·7H2O 0.2g；Fe(Ⅲ)-citrate36mg；NaMoO4·2H2O 7.6mg；NH4Ac 1.54g(20mM)；Na2HPO4·12H2O 9.84g；KH2PO4 1.7g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。
注：不加NH4Ac便是K·oxytoca无氮固体培养基。
(3)固氮菌***发育地位分析：将纯化后的菌株，挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清作为PCR模板。PCR反应体系和反应条件参见实施例1和2。
将PCR扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，回收后，送华大基因测序。
本发明实施例2-5分别从4个地区9个样品中共分离获得83株固氮菌，分属于Paenibacillus类芽孢杆菌属、Rhizobium根瘤菌属、Pseudomonas假单胞菌属、Bacillus芽孢杆菌属、Azotobacter自生固氮菌属、Achromobacter无色杆菌属、Microbacterium微杆菌属、Sphingobium鞘氨醇菌属sphingomonas鞘氨醇单胞菌属、caulobacter柄细菌属、Azospirillum固氮螺菌属、Arthrobacter节杆菌属、Pandoraea潘多拉属、Cellulomonas纤维素单胞菌属、Acidovorax嗜酸菌属、Streptomyces链霉菌属、Devosia戴沃斯氏菌属、Klebsiella克雷伯氏杆菌属、Flavobacterium产黄菌属、Massilia马西利亚属、Pseudoxanthomonas假黄单胞菌属、Citricoccus柠檬酸菌属、Salinicola盐生菌属、Paracoccus副球菌属、Aurantimonas橙单胞菌属、Defluviimonas解毒单胞菌属26个不同的属，即包括了好氧的固氮菌属，也包括了微好氧的固氮螺菌属和兼性厌氧的克雷伯氏杆菌，本发明中由于后续纯化是在好氧条件下利用丰富培养基进行纯化，因此，没有分离获得完全厌氧的固氮菌，若步骤2)采用厌氧管滚管法进行纯化，则可分离到厌氧的固氮菌。
同时，本发明实施例5中，使用新疆地区油井油藏水，同一样品采用不同分离培养基和分离方法，结果发现，使用本发明提供的无氮固体培养基和混菌法，共获得6个属8个不同种的菌株(表1)，细菌数量是103/ml水样，而使用其他无氮培养基和表面涂布方法，细菌数量为102/ml水样，且只获得了一种菌Salinicola acroporae。由此可见，本发明中对于最大限度的获得石油污染环境中的固氮菌具有简便易行，增加固氮菌多样性的优势。
表1新疆地区油藏水固氮菌分离结果(无氮培养基，混菌法)
菌株名 菌株种属 16S rDNA同源性
1--1 Citricoccus nitrophenolicus 99.44％
1--3 Salinicola halophilus 98.20％
1--4 Pseudomonas balearica 99.24％
2--2 Salinicola salarius 99.31％
3 Paracoccus saliphilus 96.90％
4--1 Paracoccus saliphilus 97.26％
4--2 Paracoccus saliphilus 97.06％
4--3 Paracoccus siganidrum 97.35％
5--1 Aurantimonas endophytica 98.91％
XJ4 Defluviimonas alba 97.18％
本发明对实施例2-5分离的83株固氮菌，选择不同种属的40株做为代表，分析其固氮酶活性(有的菌虽然分离地不同，但属于同一种，所以这样的菌株就只选择了一个做为代表，比如D12和C27虽然分离地不同，但都与Paenibacillus typhae xj7同源性最高，所以就选了D12做为代表分析固氮酶活)，采用半固体混菌法，结果见表2。
表2石油污染土壤分离固氮菌的种属同源性和固氮酶活性测定(定性实验)
由结果可知，分离获得的菌株大多数具有乙炔还原能力，为后续筛选高效固氮菌株奠定了基础。
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种无氮固体培养基，其特征在于，其1L的配方为：葡萄糖20-50g；K2HPO4 0.5-1.0g；MgSO4·7H2O 0.1-0.2g；三价铁柠檬酸盐0.02-0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001-0.76g；琼脂粉8-15g；加水至1L；pH 7.0。
2.如权利要求1所述的无氮固体培养基，其特征在于，其1L的配方为：葡萄糖25-40g；K2HPO4 0.8-1.0g；MgSO4·7H2O 0.15-0.2g；三价铁柠檬酸盐0.03-0.05g；NaMoO4·2H2O0.001-0.05g；琼脂粉8-12g；加水至1L。
3.如权利要求1所述的无氮固体培养基，其特征在于，其1L的配方为：葡萄糖30g；K2HPO41.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉10g；加水至1L。
4.权利要求1-3任一所述的无氮固体培养基在从石油污染土壤或石油污染水体中分离固氮菌的应用。
5.一种从石油污染物中分离固氮菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集石油污染物，加水悬浮，悬浮液进行梯度稀释；(2)制备权利要求1-3任一所述的无氮固体培养基，在培养基融化状态分别加入不同稀释度的悬浮液，混匀后静置培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染物中的固氮菌；所述石油污染物为石油污染土壤或石油污染水体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中培养基融化状态是指50-55℃下培养基的融合状态；步骤(2)中静置培养的条件为25-35℃培养2-4天。
7.权利要求5-6任一所述的方法分离得到的固氮菌的纯化方法，其特征在于，挑取无氮固体培养基中生长的菌落，采用GCMY培养基纯化，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10-30g；K2HPO4 0.5-1.0g；MgSO4·7H2O 0.1-0.2g；FeSO4·7H2O 0.02-0.05g；CaCl2·2H2O0.05-0.1g；NaMoO4·2H2O 0.001-0.76g；酵母粉0.5-1g；水解酪蛋白0.5-1g；麦芽汁0.5-1g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；FeSO4·7H2O 0.05g；CaCl2·2H2O 0.1g；NaMoO4·2H2O0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。
9.一种分离厌氧固氮菌的方法，其特征在于，采用权利要求5-6任一所述的方法分离得到固氮菌，挑取无氮固体培养基内生长的菌落，采用厌氧管滚管法进行纯化，得到厌氧固氮菌。
10.权利要求5-6或9任一所述的方法在提高石油污染土壤或石油污染水体中固氮菌分离效率的应用。
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