CN115814016A

CN115814016A - 一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用

Info

Publication number: CN115814016A
Application number: CN202211591880.5A
Authority: CN
Inventors: 杨婷婷; 徐启民; 李军训; 马正阳; 宋洪宁
Original assignee: Shandong Taishan Shengliyuan Group Co ltd
Current assignee: Shandong Taishan Shengliyuan Group Co ltd
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-12-09
Also published as: CN115814016B

Abstract

一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用，将凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉混合，制成凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，该凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物对减轻由大肠杆菌引起的腹泻具有显著作用，可以应用在与大肠杆菌相关的疾病或制药方面，还可以应用在制备增加动物采食量、体重、肠道内有益菌含量，增强动物免疫力和动物消化能力的药物等方面，应用范围广，应用价值高。

Description

一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体为一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用。

背景技术

大肠杆菌是儿童腹泻和旅行者腹泻的主要原因之一。大肠杆菌会产生不耐热肠毒素和耐热肠毒素，改变肠道紧密连接的完整性，引发炎症、肠道功能障碍等问题，同时破坏细胞外离子通道、溶质通道和水通道，最终导致腹泻。通常使用抗生素来防治大肠杆菌引起的腹泻，但其也可能会产生恶心、呕吐、腹痛等副作用。

凝结芽孢杆菌是目前国际市场上研究和应用的新一代益生菌，它除了具有普通乳酸菌的营养保健作用外，其产芽孢的特性使其还拥有极高的抗逆性，可保障该菌能通过消化道的复杂环境，最终在肠道定植，进而增加益生菌的数量，改善肠道菌群结构，对缓解细菌性腹泻具有显著作用。大蒜皮中含有大量优质膳食纤维，能促进动物肠道中的益生菌增殖。且大蒜皮中还含有一定量的大蒜素，具有抗炎杀菌，增强体内胰岛素分泌而降低血糖等作用。但大蒜皮常作为加工副产物常被抛弃，造成了资源巨大浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用。

一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，含有凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉。

如上所述的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，所述凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉按照质量比(1-5)﹕(15-20)混合。

如上所述的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，所述大蒜皮喷干粉的制备方法包括：浓缩大蒜皮水提滤液，待其固形物含量大于30％时，进喷雾干燥器，进风温度110-140℃，出风温度70-100℃，得大蒜皮喷雾干燥粉，粉碎所述大蒜皮喷雾干燥粉后，过100目以上筛子，制成所述大蒜皮喷干粉。

其中，所述大蒜皮水提滤液的制备方法包括：将大蒜皮置于其8-12倍质量的水中浸泡40-60min，煎煮，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第一滤液和滤渣；用所述滤渣6-10倍质量的水煎煮所述滤渣，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第二滤液；混合所述第一滤液与第二滤液，制成所述大蒜皮水提滤液。

如上所述的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，所述凝结芽孢杆菌喷干粉的制备方法包括：离心含有凝结芽孢杆菌的菌液得菌泥，然后进喷雾干燥器，进风温度110-140℃，出风温度70-100℃，得到凝结芽孢杆菌喷雾干燥粉，粉碎过筛所述凝结芽孢杆菌喷雾干燥粉，制成所述凝结芽孢杆菌喷干粉。

其中，所述凝结芽孢杆菌喷干粉中的凝结芽孢杆菌活菌数为2-4×10¹²cfu/g。

其中，所述含有凝结芽孢杆菌的菌液的制备方法包括：将含有凝结芽孢杆菌的液体种子液接种于液体发酵培养基中，接种体积为所述液体发酵培养基体积的3-8％，温度37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，发酵22-48h，当芽孢率大于90％时，停止发酵，制成所述含有凝结芽孢杆菌的菌液。

其中，所述液体发酵培养基中含有以下质量浓度的物质：1-2％乳糖、1-2％麸皮、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％酵母粉、0.1-0.2％硫酸氢二钾和0.01-0.1％硫酸锰。

其中，所述含有凝结芽孢杆菌的液体种子液的制备方法包括：将凝结芽孢杆菌放入液体种子培养基中，37-45℃、120-200r/min培养10-20h，然后进行扩培，扩培条件为37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，时间为16-20h，制成所述含有凝结芽孢杆菌的液体种子液；

其中，所述液体种子培养基中含有以下质量浓度的物质：6-10％葡萄糖、5-8％乳糖、6-10％蛋白胨、6-10％酵母粉、1-3％碳酸钙、0.2-0.5％硫酸镁、0.01-0.1％硫酸锰和2-4％硫酸氢二钾。

本发明还提供了一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的应用，所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

(a1)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备减轻动物腹泻药物中的应用；

(a2)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备提升动物采食量药物中的应用；

(a3)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备增加动物体重药物中的应用；

(a4)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备平衡动物体内炎症因子药物中的应用；

(a5)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备提高动物肠道内有益菌含量药物中的应用；

(a6)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备增强动物免疫力药物中的应用；

(a7)一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物在制备提升动物消化能力药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，由凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉混合制成，将凝结芽孢杆菌进行发酵和喷雾干燥，可获得具有更高芽孢率的凝结芽孢杆菌喷干粉，然后抽滤和喷雾干燥大蒜皮，并于凝结芽孢杆菌喷干粉混合，所得的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物对缓解由大肠杆菌引起的腹泻具有显著作用。

(2)本发明提供的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，可应用在制备减轻动物腹泻的药物中，也可以应用在制备增加动物采食量、体重、肠道内有益菌含量，增强动物免疫力和动物消化能力的药物中，还可以应用在与大肠杆菌相关的疾病或制药方面，应用范围广，应用价值高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，它的制备方法包括如下操作：

将装有凝结芽孢杆菌的长期冰箱保藏的斜面试管，转接至新鲜斜面培养基中，37-45℃，静置培养48-72h。

将以下质量浓度的物质，具体为：6-10％葡萄糖、5-8％乳糖、6-10％蛋白胨、6-10％酵母粉、1-3％碳酸钙、0.2-0.5％硫酸镁、0.01-0.1％硫酸锰和2-4％硫酸氢二钾混合，pH调节至7.0-7.5，制成液体种子培养基。

从斜面培养基试管上挑取凝结芽孢杆菌转接到液体种子培养基中，37-45℃、120-200r/min、培养10-20h，再转接至100L液体发酵罐中进行扩培，37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，发酵16-20h，制成含有凝结芽孢杆菌的液体种子液。

将以下质量浓度的物质，具体为：1-2％乳糖、1-2％麸皮、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％酵母粉、0.1-0.2％硫酸氢二钾和0.01-0.1％硫酸锰混合，pH调节至7.0-7.5，制成液体发酵培养基。

将液体种子液接种于液体发酵培养基中，接种体积为所述液体发酵培养基体积的3-8％，其中凝结芽孢杆菌37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，发酵22-48h，当芽孢率大于90％，停止发酵，制成含有凝结芽孢杆菌的菌液。

将含有凝结芽孢杆菌的菌液离心，得菌泥，用20％的脱脂奶粉吸附，然后进喷雾干燥器，进风温度110-140℃，出风温度70-100℃，得喷雾干燥粉，粉碎过筛，得凝结芽孢杆菌喷干粉，将凝结芽孢杆菌喷干粉进行细胞计数，凝结芽孢杆菌活菌数为2-4×10¹²cfu/g。

称取完全干燥的白皮蒜的大蒜皮10-15g，并置于其8-12倍质量的水中浸泡40-60min，煎煮，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第一滤液和滤渣；然后用所述滤渣6-10倍质量的水煎煮滤渣，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第二滤液；混合第一滤液与第二滤液，制成大蒜皮水提滤液。

浓缩大蒜皮水提滤液，待其固形物含量大于30％，进喷雾干燥器，进风温度控制110-140℃，出风温度70-100℃，，得大蒜皮喷雾干燥粉，粉碎大蒜皮喷雾干燥粉后过100目以上筛子，制成大蒜皮喷干粉。

将凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉按照质量比为(1-5)﹕(15-20)的比例混合，制成凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物。

实施例1

在实施例1当中，包括了上述一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的制备方法的内容，为节省篇幅，本实施例不再详述上述方法的操作，仅展示在上述方法的基础上的限定内容：

在制成凝结芽孢杆菌喷干粉的操作中，所得的凝结芽孢杆菌喷干粉中凝结芽孢杆菌活菌数为2×10¹²cfu/g。

在制成大蒜皮水提滤液的操作中，完全干燥大蒜皮的使用量为10g。

在制成凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的操作中，凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉的质量比1：15。

实施例2

在实施例2当中，包括了上述一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的制备方法的内容，为节省篇幅，本实施例不再详述上述方法的操作，仅展示在上述方法的基础上的限定内容：

在制成凝结芽孢杆菌喷干粉的操作中，所得的凝结芽孢杆菌喷干粉中凝结芽孢杆菌活菌数为3×10¹²cfu/g。

在制成大蒜皮水提滤液的操作中，完全干燥大蒜皮的使用量为12.5g。

在制成凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的操作中，凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉的质量比为1：20。

实施例3

在实施例3当中，包括了上述一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的制备方法的内容，为节省篇幅，本实施例不再详述上述方法的操作，仅展示在上述方法的基础上的限定内容：

在制成凝结芽孢杆菌喷干粉的操作中，所得的凝结芽孢杆菌喷干粉中凝结芽孢杆菌活菌数为4×10¹²cfu/g。

在制成大蒜皮水提滤液的操作中，完全干燥大蒜皮的使用量为15g。

在制成凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的操作中，凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉的质量比为5：15。

为验证本发明提供的方法制备的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的使用效果更好，还提供了对比例1-5，用于对比验证本发明提供的方法可行且效果好。

对比例1：

与实施例3的区别在于，不将含有凝结芽孢杆菌的液体种子液接种到液体发酵培养基中进行发酵。

对比例2：

与实施例3的区别在于，将凝结芽孢杆菌替换为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，活菌数均为2×10¹²cfu/g，混合质量比为1:1。

对比例3：

与实施例3的区别在于，不对完全干燥的大蒜皮进行煎煮和抽滤，仅对其进行喷雾干燥处理。

对比例4：

与实施例3的区别在于，不对大蒜皮水提滤液进行喷雾干燥处理。

对比例5：

与实施例3的区别在于，将大蒜皮替换为大蒜秸秆。

为验证本发明提供的方法制得的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的效果，本发明的发明人对实施例1-3和对比例1-5所提供方法制得的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物进行了动物实验，具体操作如下：

首先将斜面保藏的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养10h，浓度稀释至1×10⁸cfu/ml，制备大肠杆菌功菌液。

选用20-22g的雄性昆明小鼠120只，随机分为10个实验组，即空白组、模型组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组和对比例5组，每组12只小鼠。空白组中每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5ml，模型组、实施例1-3组和对比例1-5组中的每只小鼠均腹腔注射大肠杆菌菌悬液0.5ml，当小鼠身体出现稀便，采食量减少，眼睑分泌物增多，精神萎靡等状况，判定小鼠已感染大肠杆菌。

按照每只小鼠0.05g/kg的量对实验组小鼠给药。受试物以超纯水配制，空白组和模型组用生理盐水灌胃，每组每只小鼠0.5ml。实施例1-3组和对比例1-5组分别用各自提供的方法制备的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物(以下简称组合物)灌胃给药，连续给药7d，每天记录小鼠的体重及采食量。待第七天给药1h后，将所有小组的小鼠眼球取血，剖杀后取盲肠粪便，小肠和内脏。

分别于实验开始的第1，3，5，7天，记录小鼠给药前的腹泻率(腹泻小鼠数/小鼠总数)，实验结果参见表1。结果显示，空白组小鼠不腹泻，模型组小鼠腹泻无改善，实施例1-3组和对比例1-5组中的小鼠，随着治疗的进行，腹泻率逐渐降低，到第7天，实施例2组中的小鼠腹泻发生率为0。

表1：各组小鼠腹泻率情况汇总表

实验还采集了七天以来各组小鼠采食量及重量的数据，并计算各组小鼠平均日采食量及平均日增重情况，实验结果参见表2。结果显示，模型组中的小鼠平均日采食量及平均日增重情况最差，经给药治疗后，实施例1-3组和对比例1-5组中的小鼠平均日采食量及平均日增重情况均出现好转，其中实施例2组中小鼠平均日采食量及平均日增重情况最好，甚至超过了空白组，说明实施例2提供的制备方法获得的组合物的治疗效果最好，且有助于增加小鼠的采食量和体重。

表2：各组小鼠平均日采食量及平均日增重情况汇总表

实验还采集了剖杀后各组小鼠血液，检测血液中免疫因子含量，当小鼠感染大肠杆菌时，体内会有炎症反应的发生，血液中一些免疫因子的含量会增加，例如白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)；一些免疫因子的含量也会减少，例如白介素2(IL-2)和白介素10(IL-10)；当小鼠恢复健康后，体内免疫因子含量也随之恢复到正常水平。实验中选取检测IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的含量进行小鼠患病情况比对，实验结果参见表3。结果显示，经给药治疗后，实施例1-3组和对比例1-5组中小鼠体内免疫因子含量逐渐恢复向空白组靠近，其中实施例2组小鼠体内免疫因子含量最接近空白组，说明实施例2提供的制备方法获得的组合物的治疗效果最好，有助于平衡小鼠体内的免疫因子。

表3：各组小鼠IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α水平汇总表

实验还采集了各组小鼠粪便中的平均大肠杆菌和乳酸菌计数，粪便中大肠杆菌数和乳酸菌数能分别反应出肠道中的感染菌和有益菌的具体情况，实验结果参见表4。实验结果显示，经给药治疗后，实施例1-3组和对比例1-5组中小鼠粪便中大肠杆菌计数降低，乳酸菌计数增加，均向空白组靠近，其中实施例2组中肠道菌群的回复与空白组最接近，且乳酸菌计数超过空白组，说明实施例2提供的制备方法获得的组合物的治疗效果最好，且能够提升小鼠肠道内有益菌中乳酸菌含量。

表4：各组小鼠粪便大肠杆菌与乳酸菌计数汇总表

实验还采集了剖杀后各组小鼠的免疫器官指数，当脏器病理性萎缩或水肿时，脏器系数大小发生改变从而反映出器官功能的强弱，致病性大肠杆菌可诱导小鼠肝脏和脾脏肿大，胸腺萎缩，实验结果参见表5。结果显示，实施例1-3组和对比例1-5组均能使小鼠的内脏指数有所恢复，且实施例2组中小鼠的肝脏和脾脏指数降低并接近空白组，胸腺指数增加甚至超过了空白组，说明实施例2提供的制备方法制得的组合物能显著降低大肠杆菌对小鼠免疫器官的伤害，并能提升小鼠的免疫力。

表5：各组小鼠免疫器官指数汇总表

实验还采集了剖杀后各组小鼠的空肠绒毛形态，肠绒毛高度与隐窝深度比值下降，表明肠道的消化吸收能力减弱，将会影响小肠免疫功能的正常发挥，实验结果参见表6。结果显示模型组小鼠绒毛高度与隐窝深度的比值最低，实施例2组的绒毛高度与隐窝深度的比值最接近空白组，说明实施例2提供的制备方法制得的组合物能显著提高患病小鼠肠道的消化吸收能力，增强患病小鼠的小肠免疫功能。

表6：各组小鼠空肠绒毛形态汇总表

由上述动物实验结果可知，本发明提供的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，由凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉混合制成，将凝结芽孢杆菌进行发酵和喷雾干燥，可获得具有更高芽孢率的凝结芽孢杆菌喷干粉，然后抽滤和喷雾干燥大蒜皮，并于凝结芽孢杆菌喷干粉混合，制得的凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物对缓解由大肠杆菌引起的腹泻具有显著作用；且制备方法的操作步骤简单，对生产设备要求不高，操作所需原材料成本不高，可大力推广使用。另外，本发明提供的一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的应用，可应用在制备减轻小鼠腹泻的药物中，也可应用在制备增加动物采食量、体重、肠道有益菌含量，增强动物免疫力和动物消化能力的药物中，还可应用在与大肠杆菌相关的疾病或制药方面，应用范围广，应用价值高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物，其特征在于，含有凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌喷干粉和大蒜皮喷干粉按照质量比(1-5)﹕(15-20)混合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述大蒜皮喷干粉的制备方法包括：

浓缩大蒜皮水提滤液，待其固形物含量大于30％时，进喷雾干燥器，进风温度110-140℃，出风温度70-100℃，得大蒜皮喷雾干燥粉，粉碎所述大蒜皮喷雾干燥粉后，过100目以上筛子，制成所述大蒜皮喷干粉。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述大蒜皮水提滤液的制备方法包括：

将大蒜皮置于其8-12倍质量的水中浸泡40-60min，煎煮，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第一滤液和滤渣；

用所述滤渣6-10倍质量的水煎煮所述滤渣，水开后继续煎煮30-50min，过滤得到第二滤液；

混合所述第一滤液与第二滤液，制成所述大蒜皮水提滤液。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌喷干粉的制备方法包括：

离心含有凝结芽孢杆菌的菌液得菌泥，然后进喷雾干燥器，进风温度110-140℃，出风温度70-100℃，得到凝结芽孢杆菌喷雾干燥粉，粉碎过筛所述凝结芽孢杆菌喷雾干燥粉，制成所述凝结芽孢杆菌喷干粉。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌喷干粉中的凝结芽孢杆菌活菌数为2-4×10¹²cfu/g。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述含有凝结芽孢杆菌的菌液的制备方法包括：

将含有凝结芽孢杆菌的液体种子液接种于液体发酵培养基中，接种体积为所述液体发酵培养基体积的3-8％，温度37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，发酵22-48h，当芽孢率大于90％时，停止发酵，制成所述含有凝结芽孢杆菌的菌液。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述液体发酵培养基中含有以下质量浓度的物质：1-2％乳糖、1-2％麸皮、0.5-1％蛋白胨、0.1-0.5％酵母粉、0.1-0.2％硫酸氢二钾和0.01-0.1％硫酸锰。

9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述含有凝结芽孢杆菌的液体种子液的制备方法包括：

将凝结芽孢杆菌放入液体种子培养基中，37-45℃、120-200r/min培养10-20h，然后进行扩培，扩培条件为37-45℃、120-200r/min、通气比为1:0.2-1:1，时间为16-20h，制成所述含有凝结芽孢杆菌的液体种子液；

10.一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物的应用，其特征在于，所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：