CN110982753A

CN110982753A - 凝结芽孢杆菌mes847、菌剂、鸡饲料、制备方法及应用

Info

Publication number: CN110982753A
Application number: CN201911381799.2A
Authority: CN
Inventors: 刘刚; 孙海远; 顾欣燕; 刘金龙; 肖培英
Original assignee: Tianjin Development Zone Kunhe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Development Zone Kunhe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110982753B

Abstract

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌MES847、菌剂、鸡饲料、的制备方法及应用，涉及微生物技术领域，本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847，于2018年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16358。该凝结芽孢杆菌MES847具有较广的抗菌谱，可用于制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品，同时能够提高机体细胞免疫和体液免疫水平的作用，刺激动物免疫器官的发育，提高动物的抗病能力。

Description

凝结芽孢杆菌MES847、菌剂、鸡饲料、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种凝结芽孢杆菌MES847、菌剂、鸡饲料、的制备方法及应用。

背景技术

近年来，肉(蛋)鸡出现拉饲料便，水便的现象增多，临床症状表现为：在粪便中残留胃能消化的饲料小颗粒，粪便含水量大；肉鸡生长速度下降，蛋鸡产蛋率下降，饲料转化率降低。在不继发其他疾病的情况下，通常家禽的死亡率并不高。这种拉稀过料症状，病因复杂，解剖检查又常无明显的特征病变，难以确定病因，给临床防治带来了一定难度。

目前对于拉稀过料的形成原因可以归纳为三个方面：

(1)传染性因素

细菌性肠炎，由致病性大肠杆菌引起，临床表现多样，如***下方羽毛潮湿、污秽、黏连，肠粘膜出血、充血，而拉稀是细菌性肠炎的征兆。

其他如沙门氏菌感染、法氏囊病、肾型传支、传染性生长矮小综合症、禽霍乱等也会引起拉稀过料。

(2)饲料因素

饲料发霉后大都会产生霉菌，在玉米及其副产品、花生粕、菜籽粕等原料中极易检出霉菌毒素。霉菌与霉菌毒素的存在，即使没有达到使禽类严重中毒的水平，但常会引起腹泻，而且用抗菌素药物治疗无效果。

饲料中存在抗营养因子，如大豆中的胰蛋白酶抑制因子、小麦中的木聚糖等抗营养因子含量过高，会造成肉(蛋)鸡拉稀。

在治疗疾病时，同时服用几种抗生素，服用时间长易造成肉(蛋)鸡肠道中微生物失衡，有害微生物大量繁殖，造成鸡群采食量明显下降，拉稀、增重速度下降。

此外饲料中食盐含量过高、饲料的阴阳离子严重不平衡及饲料蛋白过高也会造成(肉)蛋鸡拉稀。

(3)其他因素

除了传染性因素及饲料因素外，其他如球虫病、应激因素等也会造成(肉)蛋鸡拉稀。

对疾病的发生机理分析后不难看出，活菌在肠道内的繁殖对传染性因素和饲料原因都可以起到防治作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种凝结芽孢杆菌MES847，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌MES847，所述凝结芽孢杆菌MES847于2018年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.16358。

本发明还提供了上述的凝结芽孢杆菌MES847在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用。

本发明还提供了上述的凝结芽孢杆菌MES847在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

进一步地，所述产品为药物、保健品或饲料添加剂。

本发明还提供了一种菌剂，包括上述的凝结芽孢杆菌MES847；

优选地，所述菌剂中的有效活菌数≥10.0×10⁸个/g。

本发明还提供了上述的菌剂在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用。

本发明还提供了上述的菌剂在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

本发明还提供了上述的菌剂的制备方法，所述制备方法包括将凝结芽孢杆菌MES847依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养、发酵和喷干，得到所述菌剂。

另外，本发明还提供了一种鸡饲料，所述鸡饲料包括基础鸡饲料和上述的凝结芽孢杆菌MES847的菌剂。

进一步地，每吨基础鸡饲料添加1-2kg菌剂。

本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847，具有较广的抗菌谱，同时，还具有提高机体细胞免疫和体液免疫水平的作用，能够刺激动物免疫器官的发育，提高动物的抗病能力。该凝结芽孢杆菌MES847可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等活性物质，促进营养物质的消化吸收。此外，其产生的维生素、短链脂肪酸、氨基酸、有机酸、促生长因子等，可供动物机体提供营养，还可以促进小肠的蠕动，改善肠道消化功能，为动物的生长发育提供有利条件。

进一步地，本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到95％以上，更加适合饲料加工的要求。

本发明提供的菌剂，包括本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847。将本发明的菌剂用于预防和/或治疗鸡腹泻，防治效果显著，防治效果达80％以上，并且具有无药害、无残留、不抑制生长以及用量少的特点，为用药方案多样化和生态环境的保护提供了可能，便于推广使用。同时，本发明提供的菌剂不仅可以饲料厂大规模添加使用，也便于养殖户自己拌饵。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

本发明的菌种保藏日期为2018年8月30日，保藏编号为：CGMCC No.16358。分类命名为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101。

凝结芽孢杆菌是一种兼性厌氧型革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界。凝结芽孢杆菌菌体呈长杆状，两端钝圆，无鞭毛，芽孢端生；菌落形态为不透明白色，呈圆形，表面突出，在15～40℃条件生长较好，生长的最适pH值为6.6～7.0。因其发酵后可产生大量乳酸，所以又属于肠道乳酸菌。凝结芽孢杆菌除了具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡，提高机体消化功能和健康水平的功能外，还具有耐高温，耐酸、耐胆盐等优点，能有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能，具有易保藏、复活率高等特点，在饲料行业有很好的应用前景。

本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847是2018年5月我公司研发人员从河北省保定市的土壤中分离的。

基于本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847的特性，本发明还提供了上述的凝结芽孢杆菌MES847在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用，以及在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847具有较广的抗菌谱，同时，还具有提高机体细胞免疫和体液免疫水平的作用，能够刺激动物免疫器官的发育，提高动物的抗病能力。该凝结芽孢杆菌MES847可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等活性物质，促进营养物质的消化吸收。此外，其产生的维生素、短链脂肪酸、氨基酸、有机酸、促生长因子等，可供动物机体提供营养，还可以促进小肠的蠕动，改善肠道消化功能，为动物的生长发育提供有利条件。

在一些优选的实施方式中，所述产品为口服产品，进一步可以为药物、保健品或饲料添加剂。

本发明提供的凝结芽孢杆菌MES847有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到95％以上，便于口服，更加适合药物、保健品或饲料加工的要求。

根据本发明的一方面，本发明还提供了一种菌剂，包括上述的凝结芽孢杆菌MES847。

该菌剂可以将凝结芽孢杆菌MES847作为主要活性成分；也可将凝结芽孢杆菌MES847作为辅助的活性成分与其他微生物或者功效成分配合使用。由于该菌剂包含上述凝结芽孢杆菌MES847，因此具有凝结芽孢杆菌MES847的所有有益效果。将本发明的菌剂用于预防和/或治疗鸡腹泻，防治效果显著，防治效果达80％以上，并且具有无药害、无残留、不抑制生长以及用量少的特点，为用药方案多样化和生态环境的保护提供了可能，便于推广使用。同时，本发明提供的菌剂不仅可以饲料厂大规模添加使用，也便于养殖户自己拌饵。

优选地，所述菌剂中的有效活菌数≥10.0×10⁸个/g。

根据本发明的另一方面，还提供了上述的菌剂在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用，以及在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

利用菌剂中的活性成分凝结芽孢杆菌MES847的较广的抗菌谱，能够对鸡腹泻致病菌起到有效的拮抗作用，包含其的菌剂能够对鸡腹泻起到良好的预防和/或治疗作用。

本发明提供的上述菌剂的制备方法，工艺简单，操作方便，适合大规模扩增培养。

具体地，上述菌剂的制备方法包括如下步骤：

①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：MRS培养基(牛肉蛋白粉10g、鱼肉汁10g、酵母浸出汁粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80 0.1ml、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g、蒸溜水1000ml、调节pH值6.2-6.6)。培养条件为：转速200-230r/min，温度32-37℃，培养30-36h。

②一级种子培养：500ml茄子瓶中装有100ml一级种子培养基，116℃-121℃湿热灭菌20-35min，取10ml凝结芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h；一级种子培养所用培养基的原料及用量为：牛肉蛋白粉1％、鱼肉汁1％、酵母浸出汁粉0.5％、葡萄糖2％、醋酸钠0.5％、柠檬酸二铵0.2％、吐温800.01％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.028％、培养基pH为6.2-6.6；

③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃-122℃湿热灭菌20-40min，将100-300ml一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养10-15h；二级种子培养所用培养基的原料及用量为:蛋白胨1％、酵母浸膏0.25％、葡萄糖1.0％、蔗糖1.0％、K₂HPO₄ 0.4％、MnSO₄·H₂O 0.02％和MgSO₄·7H₂O 0.05％，pH值6.8±0.2；

④发酵：在5m³或30m³扩大发酵罐中装有或4000L或20m³凝结芽孢杆菌活菌发酵培养基，15℃-122℃湿热灭菌20-40min，将150L或200L二级种子接种于凝结芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养36-48h；发酵所用培养基的原料及用量为:蛋白胨1％、酵母浸膏0.25％、葡萄糖1.0％、蔗糖1.0％、K₂HPO₄ 0.4％、MnSO₄·H₂O 0.02％和MgSO₄·7H₂O 0.05％，pH值6.8±0.2；

⑤至凝结芽孢杆菌数量达到发酵水平时，结束发酵；

⑥将上述发酵液经喷干形成粉剂：

⑦凝结芽孢杆菌产品有效活菌数不少于10.0×10⁸个/g。

⑧尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。

此外，本发明还提供了一种鸡饲料，包括基础鸡饲料和上述的凝结芽孢杆菌MES847菌剂。

由于该鸡饲料包含上述凝结芽孢杆菌MES847，因此具有凝结芽孢杆菌MES847的所有有益效果。将本发明的鸡饲料用与预防和/或治疗鸡腹泻，防治效果显著，防治效果达80％以上，并且无公害、无污染、成本低、宜于推广使用，便于养殖户自己拌饵。

需要说明的是，对基础鸡饲料的种类不做限定，凡是本领域常规可用的鸡饲料均可用于制备本发明提供的鸡饲料。

在一些优选的实施方式中，每吨基础鸡饲料包括1-2kg菌剂，例如可以包括1kg、1.2kg、1.5kg、1.8kg或2kg菌剂。

根据想要达到的治疗或者预防效果，可选择添加不同剂量的菌剂。例如，在预防性应用中，可以选择相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量，在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，可根据实际需求在合理范围内进行调整。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1菌株的分离筛选

该株凝结芽孢杆菌MES 847是2018年5月我公司研发人员从河北省保定市的土壤中分离的。当时共分离3株乳酸菌，经过平板划线，在32℃培养36小时，制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落，做切片，经结晶紫染色，镜检，生理生化试验最终确定其中一株为凝结芽孢杆菌，将其命名为MES 847。

实施例2凝结芽孢杆菌MES 847菌剂的制备

该方法包括：摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养、发酵、喷干等。具体地：

④发酵：在5m³或30m³扩发酵罐中装有或4000L或20m³凝结芽孢杆菌活菌发酵培养基，15℃-122℃湿热灭菌20-40min，将150L或200L二级种子接种于凝结芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养36-48h；发酵所用培养基的原料及用量为:蛋白胨1％、酵母浸膏0.25％、葡萄糖1.0％、蔗糖1.0％、K₂HPO₄ 0.4％、MnSO₄·H₂O0.02％和MgSO₄·7H₂O 0.05％，pH值6.8±0.2；

⑤至凝结芽孢杆菌数量达到发酵水平时，结束发酵；

⑥将上述发酵液经喷干制成粉剂：

⑦凝结芽孢杆菌菌剂产品有效活菌数不少于10.0×10⁸个/g。

实施例3凝结芽孢杆菌的治疗效果试验

(1)试验时间和地点：

2019年6月8日在试验在天津市静海区双塘镇杨学士村的两个肉鸡养殖大棚里进行。

(2)试验大棚条件：

养殖大棚为均为东西向简易大棚，南面和北面为厚塑料覆盖，内有龙骨支架，东西两侧有出入口的土坯墙。大棚东西向约60米；南北跨度为9.5米，中间高约2米，南面和北面均较低约1.5米，养殖模式为网养，养殖品种为肉鸡。试验开始前，2个大棚养殖的肉鸡不同程度发生了“拉稀”的情况。

(3)试验方法：

1#为对照大棚，发生拉稀症状较轻，2#为试验大棚，症状较重；试验开始在2#大棚的肉鸡拌服实施例2制成的凝结芽孢杆菌菌剂，用量为每100kg饲料使用200g菌剂，即每吨饲料使用2kg菌剂。连续7天为一疗程，连续使用两个疗程；1#大棚肉鸡不拌服任何产品。

2#大棚经过7天(至6月15日)，肉鸡拉稀的症状减轻，然后继续拌服一个疗程至6月22日“拉稀”现象已完全消失，肉鸡摄食正常。而2#大棚拉稀症状加重，数量增多，食欲下降。

实施例4凝结芽孢杆菌制剂预防效果试验

(1)试验时间和地点：2019年7月6日开始在试验在天津市静海区双塘镇杨学士村的三个肉鸡养殖大棚里进行，3个大棚均为养殖10天的鸡雏。

(2)试验大棚条件：

3个大棚为均为肉鸡养殖大棚分别标识为3#、4#、5#。三个鸡棚放苗，投料，加水等情况保持一致。试验开始前三个大棚正常摄食，无“拉稀”现象。

(3)试验方法：

随机选取3#大棚作为试验大棚，4#和5#大棚为对照大棚。在试验大棚，不间断的拌服由实施例2制成的凝结芽孢杆菌制剂，使用剂量为每100kg饲料使用100-200g菌剂。即每吨饲料使用菌剂1kg-2kg。对照大棚肉鸡直接投喂未拌服凝结芽孢杆菌制剂的饲料。

在7月20日和23日，对照组大棚先后发生了“拉稀”症状；而试验大棚一直到卖鸡也没有出现“拉稀”症状。对照组大棚饲料利用率明显低于实验组。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌MES847，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌MES847于2018年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16358。

2.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌MES847在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用。

3.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌MES847在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述产品为药物、保健品或饲料添加剂。

5.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌MES847；

优选地，所述菌剂中的有效活菌数≥10.0×10⁸个/g。

6.如权利要求5所述的菌剂在制备预防和/或治疗鸡腹泻的产品中的应用。

7.如权利要求5所述的菌剂在制备促进鸡消化功能的产品中的应用。

8.权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将凝结芽孢杆菌MES847依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养、发酵和喷干，得到所述菌剂。

9.一种鸡饲料，其特征在于，所述鸡饲料包括基础鸡饲料和权利要求1所述的凝结芽孢杆菌MES847或权利要求5所述的菌剂。

10.根据权利要求9所述的鸡饲料，其特征在于，每吨基础鸡饲料添加1-2kg菌剂。