CN115804847B - 一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用，涉及载药载体技术领域。本发明基于SPARC高表达的调节性T细胞来源的外泌体对心脏功能的保护作用，以及梗死区域内pH、H₂O₂和MMP9的水平，合成了共轭肽、pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球以及搭载外泌体的生物载体。首先，通过酰腙键在酸性条件下断裂从而释放外泌体和水凝胶原料。随后，利用H₂O₂将Co²⁺氧化为Co³⁺，形成凝胶并固定释放的外泌体。最后，在MMP9的水解下，凝胶逐渐降解，释放出外泌体，从而对心肌发挥持续和长期的保护作用，以改善心功能。

Description

一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物 载体及应用

技术领域

本发明涉及载药载体技术领域，具体而言，涉及一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用。

背景技术

在急性心肌梗死(AMI)中,调节性T细胞(Tregs)可以抑制分化的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Th17细胞的效应活性，以及自然杀伤细胞和B细胞的功能，还可通过调节单核/巨噬细胞分化来影响损伤的愈合过程[1]。浸润至心肌的Tregs高表达SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)，其可提高心肌梗死瘢痕中的胶原含量和成熟度，以防止心肌梗死后心脏破裂并提高存活率[2]。因此，Sparc^highTreg在急性心肌梗死后的组织修复中发挥重要的保护作用。虽然，Tregs可在心肌梗死发生后浸润至梗死区域，但在第7天才达到峰值，这表明提前促使Sparc^highTreg在梗死区域的峰值可能有助于梗死区域的修复，降低梗死面积，但是直接体外扩增细胞受到遗传物质和细胞存活的不稳定性而造成功能限制甚至丧失[3]。

细胞来源的外泌体具有与细胞类似的功能，其可促进血管生成，减少细胞凋亡，抑制纤维化，调节免疫反应等[4]。研究证实，包括树突状细胞经坏死的心肌细胞刺激后分泌的外泌体可通过激活Tregs减少心脏炎症，从而改善心肌梗死后的心功能和左心室重构[5]。

然而，外泌体靶向及原位驻留在心肌组织的数量限制了其治疗急性心肌梗死的效果。现目前基因工程已被广泛用于提高外泌体的靶向性和稳定性[6]。同时，许多研究已证实水凝胶是固定外泌体的良好基质[7]。然而，目前诸多水凝胶包裹外泌体的研究均通过原位注射，这会给心肌组织带来二次损伤。因此，急需开发一种与急性心肌梗死后局部微环境相容的水凝胶-外泌体***来靶向梗死部位。这种既可原位交联形成凝胶固定外泌体，又可缓慢释放外泌体的水凝胶可能为心肌梗死的治疗提供潜在方案。

通过对急性心肌梗死后局部微环境变化的分析表明，在无菌性炎症反应被激活后，第一阶段，损伤的心肌释放损伤相关分子成分并结合Toll样受体，启动趋化因子的产生，如CXCL1,CXCL2和CXCL5等，其配体为CXCR2，诱导CXCR2高表达的中性粒细胞和Ly6C^high单核细胞的募集，释放大量促炎因子。同时，由于细胞的不断死亡并破裂，同时伴随着乳酸的不断积累，从而导致梗死区pH值的持续下降(pH<6.8)[8]，形成酸性微环境[9,10]。第二阶段，趋化至梗死区域的炎性细胞发挥促炎作用，促使活性氧簇的大量产生，包括H₂O₂、超氧化物和羟基自由基等，进一步损伤受损心肌[10]。第三阶段，Ly6C^low单核细胞和M2型巨噬细胞在富集IL-10、TGF-β和VEGF的环境下发挥抗炎作用，同时释放基质金属蛋白酶9(MMP9)[11]。第四阶段，成纤维细胞被激活并迁移至梗死区域，在趋化因子和生长因子的作用下被转换为肌成纤维细胞，逐渐累积的MMP9的酶解反应被激活，降解细胞外基质，并促进肌成纤维细胞的增殖，促进瘢痕组织的形成[12]。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pH/过氧化氢/MMP9时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体及应用以解决上述技术问题。

本发明利用急性心肌梗死后的炎症反应过程，通过酸性微环境(pH<6.8)使得水凝胶原料释放(微球破裂、外泌体释放)，随之利用心肌梗死后H₂O₂高浓度环境原位形成水凝胶固定外泌体，接着利用含量不断增加的MMP9降解水凝胶，释放外泌体，从而发挥修复心血管组织的功能。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种共轭肽，其包括多肽修饰的4A-PEG和金属钴离子，多肽包括组氨酸和用于MMP9酶水解的肽段，用于MMP9酶水解的肽段具有如下SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，金属钴离子与组氨酸以配位键结合；金属钴离子能被H₂O₂氧化从而促使共轭肽呈凝胶状。

SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为：GGALGLPG。

先前研究表明，在通过肽化学合成组氨酸修饰的4A-PEG水溶液中，组氨酸中的氨基和Co²⁺可形成配位键。在H₂O₂的作用下，Co²⁺被氧化为Co³⁺，同时4A-PEG水溶液从液体变为凝胶样[14]。炎症反应第二阶段产生的H₂O₂和第四阶段分泌的MMP9不断在梗死区域累积[10-12]，MMP9可以特异性识别和水解肽段“GALGLP”[15]。利用急性心肌梗死后不同阶段局部微环境的变化，为确保产品具有在H₂O₂作用下形成凝胶并在MMP9的作用下水解的特性，发明人使用多肽(包括组氨酸和MMP9识别和水解的肽段，即GGALGLPGH)来修饰4A-PEG，结合基于金属-配体相互作用的Co²⁺，最终形成4A-PEG共轭肽(4APPC)。4APPC的合成结构如图7A所示。

此外，经过验证，上述共轭肽具有良好的流动性，一旦被H₂O₂触发，材料表现出良好的韧性和强度，这将有助于其适应心脏的跳动特性并实现长期驻留。而一旦材料再次被MMP9触发，韧性和韧性特征消失，流动性增加，从而确保装载试剂的释放。上述共轭肽是基于H₂O₂响应设计的，且Co²⁺配位连接的4A-PEG可在梗死区域原位形成水凝胶，固定外泌体。共轭肽中设置用于MMP9酶水解的肽段，便于后续在MMP9酶的作用下使得形成的水凝胶逐渐降解并缓慢释放外泌体。

本发明还提供了一种pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，其包括：以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的微球，且微球内装载有上述的共轭肽。

上述微球为两性聚合物组成，可在水中自组装并形成微球。聚合物的疏水部分形成了包裹试剂的核心，而亲水部分形成了微球结构的外壳[16]。酰腙键具有pH值敏感性，可在pH值<6.8时发生断裂[17]。根据梗死区域局部酸性微环境，可将亲脂性化合物DSPE和亲水性化合物PEG通过酰腙键(Hyd)连接，形成DSPE-Hyd-PEG(DHP)。经过发明人验证，上述微球呈均匀的球形结构，在中性溶液中保持稳定，在酸性溶液中解聚。微球(DHPM)装载4APPC形成DHPM_(4APPC),其承载能力为32.34±7.43wt％。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述微球在pH小于6.8的环境下酰腙键断裂。在梗死区域pH<6.8的环境下破裂，以释放内部装载物。

本发明提供了一种搭载外泌体的生物载体，其包括上述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，时序性响应微球的外周通过酰腙键连接CD63适配体，CD63适配体与外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合(第一种方式)。

作为一种实施方式，调节性T细胞对于心梗具有积极的效果，此外，在其他实施方式中，也可根据需要选择其他来源的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合CD63适配体。所有来源的外泌体膜的表面均高表达CD63。

在一种可选的实施方式中，上述外泌体来源于干细胞或调解性T细胞。

在一种可选的实施方式中，上述外泌体来源于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞或内皮祖细胞。

CD63作为外泌体最重要的标记物，其在外泌体表面大量表达[13]。适配体是通过体外筛选获得的短寡核苷酸序列或短多肽，可与具有高亲和力和强特异性的相应配体结合[18,19]。为了修饰Sparc高表达的Tregs来源的外泌体，发明人选择CD63适配体作为连接体。通过指数富集的配体***进化技术[20]筛选出CD63适配体，再合成得分最高的前10个适配体序列，并验证每个序列对CD63蛋白的亲和力(S表)。本研究中选取了亲和力最高的序列(图11A)。通过结合力实验的结果表明，所选适配体与CD63具有很强的结合力(Kd＝4.54±0.27nM)(图11B)，图11B为CD63适配体和CD63蛋白随浓度增加的亲和力曲线。

设置pH敏感的酰腙键，以便于在酸性条件下外泌体的释放。

在一种可选的实施方式中，CD63适配体与来源于SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合(第二种方式)。

在一种可选的实施方式中，CD63适配体与来源于CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合(第三种方式)。利用炎症反应第一阶段中趋化因子的作用，使得CXCR2高表达的外泌体可在趋化因子的作用下靶向梗死区域。

发明人发现，第一种、第二种和第三种方式均可以抑制缺血再灌注损伤，恢复心脏功能，并防止纤维化，而第三种方式具有更佳的效果。即CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体具有更好地抑制缺血再灌注损伤，恢复心脏功能，并防止纤维化的效果，可改善急性心肌梗死后的心功能不全。

发明人发现，单纯Tregs来源的外泌体，对心肌梗死就具有一定的保护作用，而Sparc高表达的Tregs来源的外泌体，对心肌梗死具有很强的保护作用。虽然反复原位注射Sparc^highTreg可以改善心功能，但由于心肌的二次损伤，存活率降低。此外，将外泌体靶向递送并驻留梗死区域同样是一项难题。而发明人利用了急性心肌梗死后梗死区中CXCL1/2/5等趋化因子富集，通过基因编辑方法获得CXCR2高表达的免疫细胞的趋化特性。结果表明，从CXCR2高表达的Sparc^highTreg中提取的外泌体可以快速、准确地靶向梗死区域。发明人还开发了一种在急性心肌梗死后的梗死区域既可原位交联形成凝胶固定外泌体，又可以在局部微环境的作用下缓慢释放外泌体的***。

具体地，参照图16所示，发明人成功利用MMP9特异性水解并识别的多肽修饰4A-PEG，在溶液中加入Co²⁺后，并不影响化合物功能，并在H₂O₂的作用下形成凝胶样。同时，利用酰腙键连接DSPE和PEG形成DHPM，选择CD63的适配体对DHPM进行修饰，DHPM结合并包裹凝胶材料，同时与Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi锚定形成复合结构。该***在CXCR2的作用下成功地靶向了梗死区域，并实现了微球在酸性条件下的破裂，利用梗死区域的高H₂O₂含量，促使凝胶原材料中的Co²⁺从二价态转变为三价态，从而形成了捕获外泌体的凝胶。然后，利用后期MMP9的逐渐增加，凝胶逐渐降解，促使外泌体逐渐释放，达到通过靶向递送和固定外泌体作为一种非侵入性治疗来对急性心肌梗死发挥保护作用。本发明为急性心肌梗死的治疗提供了一种新的选择。

在一种可选的实施方式中，CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞是经过基因编辑手段使得SPARC高表达的调节性T细胞实现CXCR2高表达。

发明人发现Sparc^highTreg来源的外泌体可为急性心肌梗死的治疗提供了一种新的方案。通过基因工程编辑使外泌体膜表面大量表达CXCR2，促进外泌体快速靶向达到梗死区，

在一种可选的实施方式中，适配体的序列如SEQ ID NO：1所示：UUAGCAGUGUACGAGAAGUCGUUACAAGUUA。

在一种可选的实施方式中，适配体还修饰有修饰物或标记有可被检测的标记物。

在一种可选的实施方式中，修饰物为生物素。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

本发明提供了一种pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球的制备方法，其包括如下步骤：

将共轭肽和以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇形成的微球混合于溶剂中，然后离心，真空干燥。

在一种可选的实施方式中，共轭肽在溶剂中的浓度与微球在溶剂中的浓度比为2.3-2.7mg/ml:4.8-5.2mg/ml。

在一种可选的实施方式中，溶剂为二氯甲烷，共轭肽与微球混合时加入水直至添加的水的体积占总混合液体积的30％；在一种可选的实施方式中，以0.5-0.6ml/h的速度加入水；

在一种可选的实施方式中，待水添加至总混合液体积的30％后，以2-2.5mL/h的速度加入占总混合液体积50％的水。

本发明提供了一种搭载外泌体的生物载体的制备方法，特征在于，制备方法包括如下步骤：

将时序性响应微球与CD63适配体按照0.23-0.27mM：0.008-0.012mM的摩尔比进行混合反应，获得通过酰腙键连接有CD63适配体的时序性响应微球，然后将来源于调节性T细胞的外泌体与连接CD63适配体的时序性响应微球进行混合。例如时序性响应微球与CD63适配体按照0.257mM：0.01mM的摩尔比进行混合反应。

在一种可选的实施方式中，CD63适配体进行混合反应前，还包括在CD63适配体上修饰乙炔基。使用叠氮基苯乙酮对其进行修饰便于后续与微球反应。

在一种可选的实施方式中，外泌体与连接CD63适配体的时序性响应微球的混合质量比为0.5-1.5:1-3。在上述混合条件下，为更优的结合比率。例如混合质量比为1:2。

在一种可选的实施方式中，混合是在37℃±0.5℃下进行孵育3h。

共轭肽、pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球或搭载外泌体的生物载体在制备心肌梗死修复药物中的应用。

在上述应用中，pH触发生物载体的外泌体的释放，活性氧(H₂O₂)引发金属钴离子的氧化从而形成凝胶以固定释放的外泌体，然后基于MMP9酶的水解触发凝胶的降解，缓慢释放外泌体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述心肌梗死选自急性心肌梗死、亚急性心肌梗死、心肌梗死再灌注或室壁瘤。

本发明提供了一种治疗心肌梗死的药物，其包括上述的共轭肽、上述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球或上述的搭载外泌体的生物载体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述治疗心肌梗死的药物还包括药学上可接受的添加剂或辅料；

在一种可选的实施方式中，药物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。

在一种可选的实施方式中，上述药物还包括联用药物/疗法，联用药物/疗法为所公开的药物化合物与如下药物/疗法中的至少一种的组合：

化疗药物，放射疗法，光敏剂，光热剂，免疫疗法，雄激素受体拮抗剂及功能调节剂，***受体拮抗剂及功能调节剂，糖激素受体拮抗剂及功能调节剂，盐激素受体拮抗剂及功能调节剂，FXR激动剂、拮抗剂及功能调节剂，GPR30激动剂、拮抗剂及功能调节剂，TGR激动剂、拮抗剂及功能调节剂，GLP受体激动剂、拮抗剂及功能调节剂，FGF受体激动剂、拮抗剂及功能调节剂、甲状腺素受体激动剂、拮抗剂及功能调节剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、二肽基肽酶-4抑制剂和TGF受体激动剂、拮抗剂及功能调节剂。

需要说明的是，上述联用药物可以与本发明中的化合物作用机制相同，也可以是作用机制不同。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于SPARC高表达的调节性T细胞来源的外泌体对心脏功能的保护作用，以及梗死区域内pH、H₂O₂和MMP9的水平，合成了共轭肽、pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球以及搭载外泌体的生物载体。

首先，共轭肽具有良好的流动性，一旦被H₂O₂触发，材料表现出良好的韧性和强度，这将有助于其适应心脏的跳动特性并实现长期驻留。而一旦材料再次被MMP9触发，韧性和韧性特征消失，流动性增加，从而确保装载试剂的释放。上述共轭肽是基于H₂O₂响应设计的，且Co²⁺配位连接的4A-PEG可在梗死区域原位形成水凝胶，固定外泌体。共轭肽中设置用于MMP9酶水解的肽段，便于后续在MMP9酶的作用下使得形成的水凝胶逐渐降解并缓慢释放外泌体。

其次，经过发明人验证，上述pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球呈均匀的球形结构，在中性溶液中保持稳定，在酸性溶液中解聚。例如在梗死区域的环境下破裂，以释放内部装载物。

再次，搭载外泌体的生物载体，可以通过pH响应，酰腙键断裂从而释放外泌体和水凝胶原料。随后，利用H₂O₂将Co²⁺氧化为Co³⁺，形成凝胶并固定释放的外泌体。最后，在MMP9的水解下，凝胶逐渐降解，释放出外泌体，从而对心肌发挥持续和长期的保护作用，以改善心功能。

此外，还提供了时序性响应微球和搭载外泌体的生物载体的制备方法，该制备方法简单易行，易于生产应用。

本发明提供的共轭肽、上述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球或上述的搭载外泌体的生物载体可以用于制备治疗心肌梗死的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中验证Sparc^highTreg来源的外泌体的功能的结果图((A)使用SD大鼠(雌性，180-230g)根据描述的手术方法建立急性心肌梗死模型，缺血45分钟并再灌注4周，再灌注开通后通过局部原位注射的方式，分别给以纯化的Tregs^Sp_lo_Exos(0.1mL；包含0.1×10⁸/mL外泌体)或Tregs^Sp_hi_Exos(0.1mL；包含0.1×10⁸/mL外泌体)，每天注射一次，持续7天，然后改为每2天注射一次，持续7天，再持续观察2周，PBS组只注射1次；Tregs^Sp_lo_Exos代表Sparc^lowTreg来源的外泌体，Tregs^Sp_hi_Exos代表Sparc^highTreg来源的外泌体。(B)再灌注24小时后，取出心脏并进行伊文思蓝-TTC染色；每组，n＝5。(C，D)根据(B)的结果测量AAR、IF和LV的面积，并计算和统计分析IF/AAR和AAR/LV的结果；每组，n＝5，单因素方差分析；IF：梗死面积，AAR：危险区，LV：左心室。再灌注4周后，使用超声心动图检测心功能，(E)通过脉冲多普勒和M型超声检测，获得超声心动图的统计结果，(F)E/A：舒张期早期及晚期经室流速比值；(G)LVEF：左室射血分数；(H)LVFS：左室缩短率；(I)HR：心率；每组，n＝5；单因素方差分析。(J，K)超声心动图检查后，立即摘取心脏并切割成5μm的切片，进行(K)masson染色，测量纤维化面积并进行(J)统计分析；每组，n＝5；单向方差分析。(L)在整个过程中，对大鼠的死亡进行监测和统计分析，获得Kaplan-Meier生存曲线；每组，n＝20；log-rank(Mantel–Cox)。*P<0.05)；

图2为4APPC和DHPM表征结果图；

图3为DHPM(4APPC)_Exo表征结果图；

图4为实验例5中验证DHPM(4APPC)_Exo改善急性心肌梗死患者的心功能不全的实验结果图；

图5分离Sparc^highTregs并对其来源的外泌体表征图((A)建立急性心肌梗死模型，3天后摘取心脏，利用CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺Sparc⁺Tregs作为分离方案。将分离出的CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺Sparc⁺Tregs及CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺Sparc-Tregs进行培养以获得外泌体,将CXCR2过表达质粒转录入CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺Sparc⁺Tregs并获得其来源的外泌体。(B)通过TEM分析检测外泌体形态；(C)纳米颗粒追踪分析(NTA)检测粒径分布；(D)测量外泌体的zeta电位；(E)western blot检测外泌体标志物CD63和CD9的表达情况，通过检测CXCR2以确认基因编辑的效率；Tregs^Sp_lo_Exos：Sparc低表达Tregs来源的外泌体，Tregs^Sp_hi_Exos：Sparc高表达Tregs来源的外泌体，Tregs^Sp_hi_Exos^CR2_hi：CXCR2高表达的Sparc高表达Tregs来源的外泌体)；

图6为使用SD大鼠(雌性，180-230g)建立急性心肌梗死模型，一旦缺血区域的血供恢复，分别给予以下不同的方案((A)PBS(0.2ml，n＝3)、Tregs^Sp_hi_Exos(0.2mL，1×10⁸/mL，n＝3)、FITC(0.2mL，100μM，n＝3)、Tregs^Sp_hi_Exos(FITC)(0.2mL，Sparc^lowTregs来源的外泌体(0.2×10⁸)加入FITC(0.02μmol)，n＝3)和Tregs^Sp_hi_Exos^CR2_hi(FITC)(0.2mL，CXCR2高表达的Sparc^highTreg来源的外泌体(0.2×10⁸)加入FITC(0.02μmol))于缺血区血供恢复后经尾静脉注射，2小时后取出心、肝、脾、肺和肾，进行光学生物发光成像分析。(B)对于注射Tregs^Sp_hi_Exos(FITC)和Tregs^Sp_hi_Exos^CR2_hi(FITC)组，在光学生物发光成像分析后，将心脏切除并切割成20μm切片，通过全景组织切片高分辨率荧光扫描成像***观察荧光强度。当缺血区域恢复血液供应，通过尾静脉注射Tregs^Sp_hi_Exos^CR2_hi(FITC)(0.2mL，CXCR2高表达的Sparc^highTreg来源的外泌体(0.2×10⁸)加入FITC(0.02μmol)，在(C)30分钟(n＝3)、2小时(n＝3)、5小时(n＝3)和10小时(n＝3)后，摘取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，进行光学生物发光成像分析，并分析荧光强度。急性心肌梗死模型建立后不同天，通过尾静脉注射Tregs^Sp_hi_Exos^CR2_hi(FITC)(0.2mL，CXCR2高表达的Sparc^highTreg来源的外泌体(0.2×10⁸)加入FITC(0.02μmol))，注射后2小时，(E)提取主要器官进行光学生物发光成像分析，(F)并分析荧光分布，(G，H)并将心脏摘除并切成20μm的切片，观察和分析梗死区和远端的荧光强度)；

图7为4APPC的合成路线图和4APP的H¹核磁共振谱图(4APP：四臂聚乙二醇与MMP9酶共轭肽偶联，4APPC:基于金属-配体相互作用的Co²⁺修饰的4APP)；

图8为Co²⁺被H₂O₂氧化为Co³⁺的示意图以及MMP9酶水解的特异性肽段示意图；

图9为中间产物B的合成路线图；

图10为DSPE-Hyd-PEG的合成路线路；

图11为CD63适配体的折叠结构图和亲和力检测结果图；

图12为DHPM_Apt^CD63的合成路线图；

图13为DHPM_Apt^CD63的验证结果图；

图14(A)根据图4A的结果，测量AAR和LV的面积，计算AAR/LV并进行统计分析，每组，n＝5；单因素方差分析；AAR：危险区，LV：左心室；(B)注射后4周，通过超声心动图检测并分析HR；HR：心率；每组，n＝5；单因素方差分析；

图15为DHPM(4APPC)_Exo在大鼠中的毒性评估结果图；

图16为搭载外泌体的生物载体的结构示意图以及pH/H₂O₂/MMP9时序性响应原理图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

材料如下：

Boc-H(Trt)GPLGLAGG-OH肽购自ChinaPeptidesCo.LTD(Shanghai,China)；四臂聚乙二醇胺(#A163118,MW2000Da)，1-羟基苯并***(HOBT；#H106176，≥97.0％)，N、N-二甲基甲酰胺(DMF；#D112009,≥99.9％),N、N′-二异丙基碳二亚胺(DIC；#D106162,98％),N、N-二异丙基乙胺(DIPEA；#D109321,99％),三氟乙酸(TFA；#T103295,>99.5％),三异丙基硅烷(#T107280,98％),二氯化钴(#C106772,99.7％),N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-乙磺酸(HEPES；#H109408,≥99.5％),氢氧化钠(#S291911,60％(w/v)),NH₂-PEG-COOH(#A163238,MW600Da),4-乙酰苯甲酸(#A151401,>98.0％),二氯甲烷(#D116153,≥99.9％),N、N′-二环己基碳二亚胺(DCC；#D106074,99％),4-二甲氨基吡啶(DMAP；#D109207,99％),三乙胺(#T103284,≥99.5％),碳氮叔丁酯(#B106949,98％),1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE；#D130471,>97％),丁二酸酐(#S104823,99％),乙腈(#A104439,≥99.9％),四(乙腈)六氟磷酸铜(#T115570,97％),对叠氮乙酰丙酮(#P344177),四氢呋喃中的四丁基氟化铵溶液(TBAF-THF；#T106821,1.0MinTHF),5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU；#E131265,≥98％),Cy5.5(#C266425),异硫氰酸荧光素(#F272903,≥95％),过氧化氢(#H112517,30wt％inH₂O)购自Aladdin。三氯化亚甲基(#288306,≥99％),丙酮(#48358),醋酸三乙胺缓冲液(TEAA；#90358,1.0M),生物素(#B4501,≥99％)够自SigmaAldric。4-氨基-DL-苯丙氨酸(#235606)购自J&KScientific。

实施例1

本实施例提供了一种共轭肽及其制备方法。

参考如下文献记载的方法：

LiPP,XiaYG,HaoJC,WangX.TransientHealabilityofMetallosupramolecularPolymerNetworksMediatedbyKineticControlofCompetin gChemicalReactions.Macromolecules.2020,53(8):2856-2863

将4-ArmPEGAmine(5.0g,2.0mmolNH₂end-group),Boc-H(Trt)GPLGLAGG-OH(2.0g,4.0mmol)和HOBTHOBT(0.54g,4.0mmol)溶解在DMF溶液(15mL)中，然后添加DIPEA(1.07mL，6.0mmol)和DIC(0.62mL，4.0mmol)，混合物在室温下反应24小时。用冷***将粗品沉淀洗涤3次，所得白色粉末沉淀物真空干燥，后进一步溶解在由TFA(95mL)、三异丙基硅烷(2.5mL)和水(2.5mL)组成的裂解溶液中，并持续搅拌3小时以去除保护基。减压，除去溶剂，将产物进一步以适量溶解于DMF中，用冷***(3×)纯化产物，所得产物为4APP。为了进一步合成4APPC，将GOX(0.4mg/mL；#G8030，≥300U/mg，Solarbio)，4APP(100mg/mL，10mM)和CoCl2(13.3mM)混合在HEPES缓冲液(pH7.0)中，用NaOH将溶液pH调节至7.0，在室温下反应2小时后，获得Co²⁺交联水凝胶，将产物离心(×1500g)30分钟，然后真空干燥，最终产物为4APPC。4APPC通过核磁共振光谱仪(BrukerAvance400 spectrometer at 400MHz)进行¹H光谱检测得到确认。

4APPC的合成结构如图7A所示。通过质子核磁共振波谱证实4APP的成功合成(图7B)。

实施例2

本实施例提供了一种pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球(DHPM(4APPC))及其制备方法。

DSPE-Hyd-PEG microsphere(DHPM)和DHPM(4APPC)制备如下：

合成DSPE-Hyd-PEG：

将4-乙酰苯甲酸(0.5mM)溶解在二氯甲烷溶液(2mL)中，然后加入DCC(1.0mM)和DMAP(1.0mM)，室温反应6小时；加入NH2-PEG-COOH(0.25mM)，同时加入三乙胺(80μL)。将混合物在室温下持续轻微振动缩回6小时，过滤并蒸发反应溶液，将残余物溶解在适量的超纯水中并在室温下透析(1000Da；#YA1035，Solarbio；500Da，#YA1069，Solarbio)48小时，冷冻干燥，得到产物A。将产物A(0.5mM)和氨基甲酸叔丁酯(0.25mM)混合，氨基氨基甲酸叔丁酯的氨基和产品A的羧基进行缩合反应，重复产物A的合成步骤，最终得到产品B。

将DSPE(0.2mM)溶解在三氯化亚甲基(2mL)中，将琥珀酸酐(0.2mM)溶解在DMSO(0.5mL)中，然后逐滴加入DSPE溶液中，混合物避光反应24小时。反应结束后，加入丙酮(45mL)，在-20℃下进一步反应过夜，离心(15000rpm)15分钟，去除上清液，收集的固体为产物C。产物C(0.5mM)，DCC(1.0mM)和DMAP(1.0mM)在二氯甲烷溶液(2mL)中混合，室温反应6小时；向反应混合物中加入氨基甲酸叔丁酯(0.5mM)和三乙胺(80μL)，在室温下继续搅拌6小时，最后蒸干反应溶剂，用硅胶柱进行色谱纯化(洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝10:1)，即得产品D。进一步将产物D(0.5mM)溶解于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(2mL)，室温搅拌反应2小时，停止反应，蒸去反应溶剂，用硅胶柱进行色谱纯化(洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得到产物E。

将产物B(0.3mM)和产物E(0.3mM)在二氯甲烷(2mL)中混合，加入TFA(100μL)，室温搅拌反应8小时，停止反应并蒸发反应溶剂，将残渣溶于适量超纯水中，室温透析(1000Da；#YA1035，Solarbio)48小时，冻干最终得到DSPE-Hyd-PEG，核磁共振光谱仪(400MHz的BrukerAvance400)用于¹H光谱检测。

将DSPE-Hyd-PEG(100mg)和4APPC(50mg)溶解在二氯甲烷(10mL)中并持续低速搅拌，同时缓慢加入H₂O(4.3mL)，通过注射泵以0.5mL/小时的速度加入，直至水浓度为30％v/v，继续搅拌60小时，然后以2mL/小时的速度持续缓慢加入H₂O(5.7mL)，搅拌12小时。最后，将混合物离心(1500rpm)8分钟，用PBS洗涤3次，真空干燥样品，得到DHPM(4APPC)。如果不添加4APPC，执行相同的程序，则最终产品为DHPM。DHPM(4APPC)形成后，通过紫外-可见分光光度计检测上清液，根据比尔定律计算4APPC的装载率。装载率(wt％)＝(4APPC总重量-剩余4APPC重量)/(DHPM重量)×100％。

实施例3

本实施例提供了时序性响应微球的外周通过酰腙键连接CD63适配体的方法(DHPM_Apt^CD63制备)。

筛选出的CD63适配体(参照SEQ ID NO：1所示)经乙炔基修饰(Aptamer^CD63-CCH)，通过基于固相合成的标准RNA合成程序合成，即末端脱氧尿苷被EdU取代，核苷酸链从固体载体上切断，将可控孔径玻璃(CPG)载体(2mg)用氮气吹干，加入乙腈(0.5mL)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(20mM)，然后加入对叠氮基苯乙酮(1μM)，在室温持续振荡16小时，后于室温离心(3000rpm)10分钟并弃上清液，残留固相用1mL乙腈洗涤3次。然后加入乙醇和浓氨水(1:3)的混合物(2mL)，在55℃下反应18小时，室温离心(10000rpm)10分钟，收集上清液，排出氨水/乙醇混合液后，得到白色胶体固体，进一步溶解于TBAF-THF溶液(200μL)中，在室温下连续振荡20小时，加入Tris-HCl缓冲液(pH7.4；0.5mL)，室温下振荡15分钟，将溶液放入离心干燥机中提取体积至原体积的1/2，除去THF。将溶液用氯仿(0.5mL)萃取两次，加入TEAA缓冲液(1mL)，将混合溶液倒入固相萃取柱中，按照标准RNA脱盐程序除去溶液中多余的盐分，得到产物F经MALDI-TOF测定证实，理论分子量[M+Na+]＝10092，MALDI-TOF检测分子量为10094.317。

与前面步骤类似，将DHPM(0.5mM)溶解在二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(2mL)，室温下搅拌反应2小时，停止反应并蒸去反应溶剂，用超纯水洗涤残留物3次，室温下离心(1500rpm)5分钟，真空干燥即得产品G。

此外，如前所述，基于4-氨基-DL-苯丙氨酸的催化作用，产品F和产品G之间可以形成酰腙键。简而言之，将产品F(0.257mM)和产品G(0.01mM)溶解在超纯水(2mL)中，并将4-氨基-DL-苯丙氨酸(0.001mM)加入溶液中，并加入NaOH溶液(0.6M)将pH调节至7.4，在室温下轻微搅拌反应24小时，然后在室温下离心(3000rpm)10分钟，用超纯水(2mL)洗涤3次，真空干燥后即得DHPM_Apt^CD63。

实施例4

本实施例提供了搭载外泌体的生物载体的制备方法，其包括将实施例3制备的DHPM_Apt^CD63与外泌体混合孵育制备DHPM(4APPC)_Exo。

分离细胞

根据以往报道的方法分离心脏中浸润的细胞(XiaN,LuY,GuM,LiN,LiuM,JiaoJ,ZhuZ,LiJ,LiD,TangT,LvB,NieS,ZhangM,LiaoM,LiaoY,YangX,ChengX.AUniquePopulationofRegulatoryTCellsinHeartPotentiatesCardiacProtectionFromMyocardialInfarction.Circulation.2020Nov17；142(20):1956-1973.)。简而言之，建立急性心肌梗死模型，3天后，取心脏组织，切碎，组织块在HEPES缓冲液中用胶原酶II(1mg/mL)(#17101015,Gibco^TM)消化，37℃轻轻旋转1.5h，细胞悬液用细胞过滤器(40μm)(#CL图831750,CorningFalcon^TM)过滤，PM400(#F4375,Sigma-Aldrich)密度离心法纯化心脏单个核细胞。使用CD4MicroBeads(#130-090-319,MiltenyiBiotec)收集心脏单个核细胞，使用抗CD45(#ab10558,Abcam)，抗CD4(#ab6413,Abcam)，抗Foxp3(ab215206,Abcam)和抗Sparc(#ab290647,Abcam)对分离的细胞进行染色，最后，使用流式细胞仪FACSAria instrument(BDBioscience,USA)对CD45⁺CD4⁺Foxp3⁺Sparc⁺Tregs进行分选，并用FlowJo软件进行分析。

细胞培养和慢病毒转染

将分选的Tregs使用含CD3ε抗体(5μg/mL；#100340，Biolegend)及抗CD28抗体(2.5μg/mL；#102116，Biolegend)的RPMI-1640完全培养基(10％FBS)中于37℃和5％CO2中培养。培养24小时后，转染CXCR2高表达的Crispr-cas9慢病毒包装的质粒(GenePharma；sgRNA：GCATAGTCTGAGAGATTCTTGCT)并培养48小时。

外泌体纯化及表征

通过连续离心的方法纯化外泌体。简而言之，收集细胞上清液并在4℃下离心(300×g)10分钟,保留上清液并在4℃下再离心(10000×g)30分钟，然后再次收集上清液，继续4℃离心(140000×g)90min，去除上清液，重新悬浮并用适当体积的PBS洗涤，在4℃下离心(140000×g)90分钟收集沉淀，在-80℃下冷冻备用。使用Pierce^TMRapid Gold BCA ProteinAssay(#A53226,ThermoScientific^TM)检测总蛋白浓度。使用NTA纳米粒度分析仪NanosightLM10(Malvern Instruments)检测粒度分布和颗粒浓度。此外，使用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形态，将外泌体悬浮液置于碳网格上并用乙酸铀酰(2％)染色，在80-kV下通过H-7000FATEM观察形态。通过蛋白质印迹法检测外泌体标志物CD9和CD63。

将上述CXCR2高表达的Sparc^highTregs来源的外泌体与实施例3制备的DHPM_Apt^CD63在37℃下混合3小时，然后将混合物在室温下离心(1500rpm)10分钟后获得DHPM_Exo，并用超纯洗涤3次水。通过TEM分析观察DHPM_Exo的形态。通过荧光观察进一步证实DHPM_Apt^CD63与外泌体的结合，外泌体负载荧光分子FITC，DHPM负载Cy5.5，最终形成DHPM(Cy5.5)_Exo(FITC)，通过荧光显微镜观察DHPM(Cy5.5)_Exo(FITC)的荧光分布。通过western blot检测DHPM_Apt^CD63与外泌体的最佳结合量比，以总外泌体为对照，用RIPA裂解液(#P0013B，Beyotime)裂解DHPM_Exo中结合的外泌体，然后进行SDS-PAGE电泳，通过检测CD63来检测结合率。通过western blot检测DHPM_Exo或DHPM(4APPC)_Exo(在DHPM_Apt^CD63形成过程中，DHPM装载4APPC形成DHPM(4APPC)_Apt^CD63)对pH<6.8、H₂O₂或MMP9酶(#P01795，Solarbio)的反应，释放的外泌体通过CD63检测验证并用NTA定量。

实验例1

本实例检测实施例4纯化获得的Sparc^highTreg来源的外泌体，并验证其功能。

实验方法如下：

(1)构建急性心肌梗死模型。

根据以往报道的方法建立急性心肌梗死模型(ChengP,HanH,ChenF,ChengL,MaC,HuangH,ChenC,LiH,CaiH,HuangH,LiG,TaoJ.AmeliorationofacutemyocardialinfarctioninjurythroughtargetedferritinnanocagesloadedwithanALKBH5inhibitor.ActaBiomater.2022Mar1；140:481-491.)。简而言之,使用SPF级SD大鼠(雌性，180-230g)建模,所有动物相关程序均获得动物保护与使用委员会批准。SD大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，气管插管，连接小动物呼吸机维持小鼠呼吸，心电图(ECG)监测评估心肌缺血情况。在左侧第四肋间区域进行开胸手术，暴露心脏，然后用无菌6-0线结扎左前降支冠状动脉，在LCA起点远端2-3毫米处打活结。当心电图出现T波倒置和ST段抬高即提示心肌缺血，缺血45min后松开结子，进行再灌注。同时，采用不同的治疗策略，在不同的时间点进行不同的检测。假手术组除结扎冠状动脉外，其余同实验方法一样。

(2)透射电子显微镜(TEM)

将样品置于碳网格上，并用乙酸铀酰(2％)染色，通过H-7000FATEM观察并获得样品的形态，通过与显微镜相连的数码相机获得图像，并对样品的形态进行成像。

(3)粒径分布和zeta电位检测

如前所述，采用动态光散射法，以超纯水为分散剂，通过纳米颗粒尺寸和zeta电位分析仪(ZetasizerNanoZ)检测外泌体的zeta电位。采用动态光散射法，以乙醇为分散剂，通过纳米颗粒尺寸和zeta电位分析仪(ZetasizerNanoZ)检测微球的粒径分布和zeta电位。

(4)Western blot

用RIPA裂解缓冲液(#P0013B，Beyotime)在冰上裂解外泌体或其他样品30分钟，然后在4℃下离心(10000×g)15分钟，使用上清液进行蛋白质印迹分析。用10％-15％的SDS-PAGE凝胶分离纯化的蛋白质，并转移到PVDF膜上，在37℃的脱脂牛奶溶液(5％)中室温孵育1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜，具体抗体如下：抗CXCR2(#ab65968，Abcam)、抗CD63(#PA5-92370，Invitrogen)、抗CD9(#PA5-85955，Invitrogen)和抗β-actin(#ab8226，Abcam)。然后用PBST洗涤膜3次(每次10分钟)，用二抗抗鼠IgG(#ab6789，Abcam)或抗兔IgG(#ab6721，Abcam)在37℃下孵育2小时，再用PBST洗涤膜3次(每次10分钟)，用BeyoECLMoon(#P0018FS，Beyotime)进行化学发光，通过FluorChemE数据***(ProteinSimple,CA,USA)获得条带。

上述试验结果表明，Sparc^highTreg在急性心肌梗死后的组织修复中起着重要的保护作用[2]。为检测Sparc^highTreg来源的外泌体对急性心肌梗死的影响，将Tregs通过流式细胞分选仪分离为Sparc^high及Sparc^low(图5A)并通过超速离心收集不同细胞来源的外泌体[13]。透射电镜显示纯化的外泌体保持良好的完整性(图5B)，通过纳米颗粒跟踪分析及动态光散射检测，Sparc^high及Sparc^low来源的外泌体在粒径分布及zeta电位上没有显著差异(图5C和图5D)。Western blott检测外泌体的特异性标志物CD9及CD63，从而进一步证实外泌体成功分离于Sparc^highTregs及Sparc^lowTregs(图5E)。

发明人通过构建Sprague-Dawley(SD)大鼠急性心肌梗死模型，以确定Sparc^high及Sparc^low来源的外泌体对心功能的影响。第一周每天于SD大鼠的心肌原位注射外泌体2次，第二周每天原位注射1次(图1A)。首次注射24小时后，摘取心脏并切片，用伊文思蓝染色，然后浸入氯化三苯基四氮唑中。结果表明，原位注射Tregs来源的外泌体能有效抑制缺血再灌注损伤，而Sparc^highTreg来源的外泌体的作用更为明显(图1B-1D)。四周后，发明人通过超声心动图检测了心功能情况，结果表明Sparc^highTreg来源的外泌体可有效地促进心功能的恢复，包括E/A比值、左心室缩短率和左心室射血分数(图1E–1I)。此外，通过Masson染色进一步检测心肌纤维化程度，表明Sparc^highTreg来源的外泌体有效抑制了纤维化瘢痕的形成(图1J及1K)。上述结果表明，Sparc^high及Sparc^low来源的外泌体均可改善急性心肌梗死后的心功能。但原位注射同时也导致存活率持续下降，最终接近30％(图1L)。

实验例2

本实验例证实了实施例2-4制备的时序性响应微球、搭载外泌体的生物载体具有外泌体递送功能，并固定于梗死区域，验证了实施例1制备的共轭肽具有良好的流动性，一旦被H₂O₂触发，材料表现出良好的韧性和强度，这将有助于其适应心脏的跳动特性并实现长期驻留。而一旦材料再次被MMP9触发，韧性和弹性特征消失，流动性增加，从而确保装载试剂的释放。

在急性心肌梗死早期，大量CXCR2高表达的免疫细胞在趋化因子的作用下聚集在梗死区[9]。为确保外泌体能够靶向梗死区域，发明人使用CRISPR/Cas9***对Sparc^highTreg进行基因编辑，以增加外泌体膜表面的CXCR2表达。并且这与未经编辑的细胞中获得的外泌体的特征没有明显差异(图5B-5E)。发明人将异硫氰酸荧光素(FITC)装载到外泌体中，并将其注射到急性心肌梗死后SD大鼠的静脉中。经生物发光成像显示，CXCR2高表达的Sparc^highTreg来源的外泌体可迅速靶向心脏(图6A)，并主要集中在梗死区(图6B)。研究发现，单次注射外泌体时，梗死区的外泌体数量在大约2.5小时后达到峰值，然后逐渐减少(图6C和图6D)。如连续7天注射外泌体，聚集在梗死区域的外泌体的数量将随着时间的推移逐渐减少(图6E-图6H)。结果表明，CXCR2可有效地将外泌体引导至梗死区，但外泌体在梗死区驻留时间不长，靶向能力随时间延长而降低。这可能是由于血流冲刷和CXCR2配体随时间逐渐减少，导致外泌体不会长时间留在梗死区。

为了解决这个问题，发明人设计了一种水凝胶-微球-外泌体复合***，即DHPmicrospheres(DHPM)(4APPC)_Exo(参照实施例4提供的搭载外泌体的生物载体)。先前研究表明，在组氨酸修饰的4A-PEG水溶液中，组氨酸中的氨基和Co²⁺可形成配位键。在H₂O₂的作用下，Co²⁺氧化为Co³⁺，同时4A-PEG水溶液从液体变为凝胶样[14]。炎症反应第二阶段产生的H₂O₂和第四阶段形成的MMP9不断在梗死区域累积[10-12]，MMP9可以特异性识别和水解肽段“GALGLP”[15]。利用急性心肌梗死后不同阶段局部微环境的变化，为确保产品具有在H₂O₂作用下形成凝胶并在MMP9的作用下水解的特性，发明人使用多肽(包括组氨酸和MMP9识别和水解的肽段，即GGALGLPGH)来修饰4A-PEG，结合基于金属-配体相互作用的Co²⁺，最终形成4A-PEG共轭肽(4APPC)。4APPC的合成结构如图7A所示，并通过质子核磁共振波谱证实4APPC的成功合成(图7B)。

发明人将H₂O₂加入4APPC水溶液中，以测定4APPC对H₂O₂和MMP9的反应。将4APPC(40mM)溶解在水中，加入H₂O₂(1.0wt％)触发水凝胶的形成，并检测了共轭肽的流变特性，加入MMP9(0.05μg/mL)后触发其降解。

使用HAAKE^TMMARS 40Rheometer(Thermo Scientific^TM)测试流变性能，配备平行板几何形状(25mm diameter,0.3mm gap)；固定应变(应力)频率试验：5％应变，0.628～100rad/s，37℃，pH7.0；屈服应力试验：振荡模式，37℃，pH7.0；模量测试：振荡模式，6.28rad/s，37℃，0-1小时检测，pH7.0。4APPC溶液(40mM)中添加H₂O₂(1wt％)形成凝胶，添加足够的MMP9使凝胶降解。在凝胶形成时间测试中，将H₂O₂加入4APPC溶液后，测试并记录G`和G``。

图2中(A)不同触发条件下的物理形态。(B)频率扫描测量。(C)动态时间扫描测量。(D)振动模式下的屈服应力试验。

结果表明，通过H₂O₂的氧化作用(图8A)液体变为凝胶样(图2A)。然而,一旦添加入MMP9，固体再次变成液体(图2A)，显然这是通过多肽链水解造成的(图8B)。发明人使用频率扫描测试评估其机械性能，结果表明，H₂O₂触发的4APPC具有良好的弹性性能(G`>G``)。然后，一旦MMP9再次触发，弹性性能消失(图2B)。同时，发明人使用流变仪检测了H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>触发凝胶化的时间。当H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>加入4APPC后，在341秒时观察到储能模量(G`)和损耗模量(G``)之间的交叉点，这表明H₂O₂触发的4APPC可以形成凝胶。此外，通过应力应变测试结果表明，H₂O₂触发的4APPC具有良好的韧性和强度。然而，MMP9的加入降低了拉伸强度和伸长率，同时材料的韧性和强度则消失了(图2D)。综上结果表明，4APPC具有良好的流动性，一旦被H₂O₂触发，材料表现出良好的韧性和强度，这将有助于其适应心脏的跳动特性并实现长期驻留。而一旦材料再次被MMP9触发，韧性和韧性特征消失，流动性增加，从而确保装载试剂的释放。

如下实验证实了DHPM在中性溶液中保持稳定，在酸性溶液中解聚。

两性共聚物可在水中自组装并形成微球。聚合物的疏水部分形成了包裹试剂的核心，而亲水部分形成了微球结构的外壳[16]。酰腙键具有pH值敏感性，可在pH值<6.8时发生断裂[17]。根据梗死区域局部酸性微环境，可将亲脂性化合物DSPE和亲水性化合物PEG通过酰腙键(Hyd)连接，形成DSPE-Hyd-PEG(DHP)，DHP可自组装形成微球DHPM。DHP的合成结构如图9A和图11A所示。

通过质子核磁共振波谱证实了中间反应试剂和DHP的成功合成(中间产物B如图9B和DSPE-Hyd-PEG的H¹核磁共振谱如图11B)。

将DHPM溶解在pH值为7.2或pH值<6.8的溶液中(约6.6，本发明中的所有溶液)，并通过TEM、纳米颗粒尺寸和zeta电位分析仪检测其(E)形态(标尺，500nm)，(F)粒度分布和(G)zeta电位。

通过透射电子显微镜显示，每个DHPM都是一个均匀的球形结构(图2E)。粒度分布和zeta电位的动态光散射检测也证实DHPM均匀分布(图2F和2G)。将DHPM添加到不同pH值的溶液中以测试其稳定性。结果表明，DHPM在中性溶液中保持稳定，在酸性溶液中解聚(图2E-2G)。此外，用DHPM装载4APPC形成DHPM_(4APPC),其装载能力为32.34±7.43wt％。DHPM_(4APPC)也可在酸性溶液(pH<6.8)中迅速解聚(图2H)。

实验例3

本实验例验证了上述实施例中DHPM_Apt^CD63的成功合成。

CD63作为外泌体最重要的标记物，其在外泌体表面大量表达[13]。适配体是通过体外筛选获得的短寡核苷酸序列或短多肽，其与相应的配体结合具有高亲和力和强特异性[18,19]。为了修饰Sparc高表达的Tregs来源的外泌体，发明人选择CD63适配体作为连接体。通过指数富集的配体***[20]筛选出CD63适配体，再合成得分最高的前10个适体序列，并评估每个序列与CD63蛋白的亲和力(表S)。本研究中选取了亲和力最高的序列(图11A)。通过结合力实验的结果表明，所选适配体与CD63具有很强的结合力(Kd＝4.54±0.27nM)(图11B)。将CD63适配体经乙炔基修饰(图12A)，然后与DHPM结合形成DHPM_Apt^CD63，其含有pH敏感的酰腙键(图12B)。DHPM_Apt^CD63结构如图12B和图12C所示。

为验证DHPM_Apt^CD63合成成功，通过生物素修饰CD63适配体，DHPM负载荧光分子Cy5.5形成DHPM(Cy5.5)_Apt^CD63-Biotin，然后将不同组成的微球与Dynabeads^TMM-450Streptavidin(每1mL溶液加入5uL；#2850000005，Thermo Fisher Scientific)，在室温下轻微振荡培养1小时，在室温下离心(1000rpm)10分钟，观察颜色变化并拍照。另一种策略是通过Cy5.5修饰CD63适配体形成DHPM_Apt^CD63-Cy5.5，通过流式细胞仪检测DHPM_Apt^CD63-Cy5.5的荧光强度。这两种策略均证实了DHPM_Apt^CD63的成功合成。

最终结构如图13A所示。结果可知，将生物素与CD63适配体结合实验，确定了CD63适配体成功修饰到DHPM表面。发明人使用DHPM装载Cy5.5，并与能够特异性结合生物素的链霉亲和素磁珠一起孵育，然后离心，液体荧光分层现象证实CD63适配体成功修饰在DHPM表面(图13B)。同时Cy5.5通过直接与CD63适配体结合连接到DHPM(图13C)，通过流式细胞分析仪进一步证实CD63适配体成功连接到DHPM(图13D)。

表S

实验例4

本实验例通过设计实验表明DHPM(4APPC)_Exo有效地靶向梗死区域。

为了检测靶向到达心脏和梗死区域的能力,发明人进行了光学生物发光成像和荧光显微镜观察。简单地说，一旦建立了急性心肌梗死模型并给予不同的治疗方案，在不同的时间后，通过麻醉处死动物，并通过Xenogen活体成像***(IVIS，CaliperLifeSciences，USA)对摘取的心脏、肺、肝脏、肾脏和脾脏进行光学生物发光成像分析。同时，将的心脏冷冻并切割成20μm的切片，通过全景组织切片高分辨率荧光扫描成像***(THUNDER ImagerTissue,Leica)观察切片，并对荧光强度进行统计分析。

将DHPM(4APPC)_Apt^CD63与Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi(已转入CXCR2过表达的质粒的Sparc高表达的Tregs来源的外泌体)培养，得到复合结构DHPM(4APPC)_Exo。通过透射电子显微镜得到DHPM(4APPC)_Exo的结构(图3A)。可见囊泡状结构明显地附着在DHPM(4APPC)_Apt^CD63，从而证实了DHPM(4APPC)_Exo的成功合成。此外，在培养前将DHPM_Apt^CD63装载Cy5.5并将Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi装载FITC。使用荧光共聚焦显微镜进一步证实了DHPM_Exo的成功合成(图3B)。

为了确定最佳结合比率，将Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi和DHPM(4APPC)_Apt^CD63以不同比率共同培养。通过CD63的Western blot分析确定最佳结合比例为1:2(图3C)。

将DHPM(4APPC)_Exo溶解在超纯水中，通过添加HCl将pH调节至<6.8，离心(1500rpm)5分钟，通过Western blot检测上清液中CD63的表达检测释放的外泌体的量。研究发现，当pH值<6.8时，DHPM(4APPC)_Exo的CD63表达明显降低，这表明由于酰腙键的断裂，DHPM(4APPC)_Exo释放出外泌体(图3D)。

图3E在pH<6.8或7.2的溶液中培养后，通过NTA测量DHPM(4APPC)_Exo释放的外泌体量。如图3E所示，在pH值为7.2时释放出少量外泌体，在pH值<6.8时释放出大量外泌体。

为了验证H₂O₂和MMP9触发的外泌体的释放，在添加MMP9之前，将DHPM(4APPC)_Exo与pH<6.8及含有H₂O₂的溶液培养。具体地，在(pH<6.8+1.0wt％H₂O₂)或((pH<6.8+1.0wt％H₂O₂)+0.05μg/mL MMP9)中培养5分钟后，通过图3(F)western blot和图3(G)NTA检测对释放的外泌体进行定量，收集上清液进行外泌体检测。通过Western blot检测上清液中CD63的表达，发现在pH<6.8时释放外泌体，其随后被H₂O₂的触发而固定，然后再次被MMP9的触发而释放。外泌体的定量检测同样证实了这一现象(图3E和3G)。

为了进一步验证DHPM(4APPC)_Exo在急性心肌梗死后靶向和驻留梗死区的能力，将负载FITC的Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi与DHPM(4APPC)结合形成DHPM(4APPC)_Exo(FITC)，然后将其注射到SD大鼠的尾静脉中。

本实验例均使用SD大鼠(雌性，180-230g)根据前述的方法建立急性心肌梗死模型，一旦缺血区的血供恢复，通过尾静脉注射DHPM(FITC)(0.2mL，0.14×10⁸/mL；包含0.02μmol FITC)或DHPM(FITC)_Exo(0.2mL，0.2×10⁸/mL；包含0.1×10⁸/mL外泌体和0.02μmolFITC)，2小时后，提取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行光学生物发光成像分析(每组n＝3)，将心脏摘除并切成20μm的切片，用于荧光分布观察。FITC通过外泌体负载形成DHPM(4APPC)_Exo(FITC)，一旦急性心肌梗死模型缺血区血供恢复，通过尾静脉注射DHPM(4APPC)_Exo(FITC)(0.2mL，0.2×10⁸/mL；包含2.4mM 4APPC，0.1×10⁸/mL外泌体和0.02μmol FITC)，注射后3(n＝3)、5(n＝3)和7天(n＝3)，提取主要器官进行光学生物发光成像测定并分析荧光分布，将心脏切成20μm切片，观察和分析梗死区和远端的荧光强度。

光学生物发光成像和心肌切片荧光成像表明DHPM(4APPC)_Exo有效地靶向梗死区域(图3H和3I)并驻留7天以上(图3J-3M)。

实验例5

本实验例通过设计实验表明DHPM(4APPC)_Exo可改善急性心肌梗死后的心功能不全。

实验方法如下：

伊文思蓝-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色

在建立急性心肌梗死模型并给予不同治疗方案后，于24小时后重新结扎左前降支，通过右颈静脉注射埃文氏蓝染料溶液(1％，0.3ml)对危险区域(AAR)进行染色。一旦心脏变蓝，迅速切下心脏并用生理盐水洗涤3次，然后在-20℃冷冻1小时，切成1mm厚的切片，用TTC溶液(1％)在37℃孵育15分钟，***(10％)固定过夜，随后使用数码相机拍照。红色区域表示AAR，白色区域表示梗死，计算IF/AAR和AAR/LV的值。

超声心动图

MyLabSat(Esaote)配备相控阵探头(SP3630)用于超声心动图检查。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，置于加热板上恒温37℃。采用医用超声耦合剂保证耦合和超声传输。采用M型和脉冲波多普勒超声心动图检测舒张期和收缩期的后壁直径、室间隔直径、左室长度和左室直径；同时检测心率、左室舒张早期充盈峰(E峰)和舒张晚期充盈峰(A峰)。获取超声图像，计算不同指标的各种值。

Masson染色

根据制造商的说明，使用masson的三色染色试剂盒(#G1340，Solarbio)进行masson染色，由AperioCS2仪器(徕卡生物***有限公司)观察和获取图像，由ImageJ软件测量梗死面积，梗死率计算为梗死面积/左室面积×100％。

生存监测

每天监测手术后大鼠的死亡率，评估心脏周围和胸腔内的血栓，以及梗死心室壁的穿孔，这均表明心脏破裂。

为了确定DHPM(4APPC)_Exo对急性心肌梗死后心功能的影响，分别在再灌注期间通过静脉注射DHPM(4APPC)_Exo、DHPM(4APPC)和外泌体(Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi)。进行伊文斯蓝-TTC染色(图4A、4B和图14A)、超声心动图(图4C–4F和图14B)和Masson染色(图4G和4H)。

使用SD大鼠(雌性，180-230g)根据上述手术程序建立急性心肌梗死模型，一旦缺血区域的血液供应恢复，通过尾静脉注射PBS(0.2mL)，DHPM(4APPC)(0.2mL，0.2×10⁸/mL；包含2.4mM 4APPC)，Exos(0.2mL，包含0.1×10⁸/mL外泌体)或DHPM(4APPC)_Exo(0.2mL，0.2×10⁸/mL；包含2.4mM 4APPC，0.1×10⁸/mL外泌体)。

图4中，A为注射后24小时，摘取心脏并进行伊文斯蓝-TTC染色结果图；每组，n＝5。(B)为测量AAR和IF面积，计算IF/AAR结果并进行统计分析；每组，n＝5；单因素方差分析；IF：梗死面积，AAR：危险区域。注射后4周，进行超声心动图检查，(C)获得脉冲波多普勒和M型图像，获得超声心动图的统计结果，(D)E/A：舒张期早期及晚期经室流速比值，(E)LVEF：左室射血分数，(F)LVFS：左室短缩分数；每组，n＝5；单向方差分析。(G，H)超声心动图检查后立即将心脏摘除并切成5μm切片，(G)进行Masson染色，测量纤维化区域，(H)进行统计学分析；每组，n＝5；单因素方差分析。(I)在整个过程中，对大鼠的死亡进行监测和统计分析，获得Kaplan-Meier生存曲线；每组，n＝20；log-rank(Mantel–Cox)。*P<0.05。

结果表明，外泌体和DHPM(4APPC)_Exo可抑制缺血再灌注损伤，恢复心脏功能，并防止纤维化。值得注意的是，DHPM(4APPC)_Exo的效果更为佳。同时，注射DHPM(4APPC)_Exo可将存活率提高至95％左右，显著高于原位多次外泌体注射(图4I和1L)。

接下来，进行血液化学分析，以评估DHPM(4APPC)的全身毒性。对于急性心肌梗死模型，空白组作为对照,SD大鼠分别同图4剂量给予PBS,DHPM(4APPC),Exo或者DHPM(4APPC)_Exo,4周后，采集大鼠血液，室温离心(1500rpm)10分钟，由临床实验室检测血清CK、AST,ALT,BUN和Crea。

所有数据均以平均值±标准差表示。统计分析采用T检验，样本间差异采用非参数Mann-Whitney秩和检验。单因素方差分析和Bonferroni事后测试也用于具体的实验分析。采用Kaplan-Meier法分析动物存活率的差异。采用P<0.05的阈值用于确定统计学意义。

血清肌酸激酶(图15A，CK)、天冬氨酸转氨酶(图15B，AST)、血尿素氮(图15C，BUN)、丙氨酸转氨酶(图15D，ALT)和肌酐(图15E，Crea)水平表明DHPM(4APPC)几乎没有毒性或副作用。综上表明，DHPM(4APPC)_Exo是治疗急性心肌梗死的安全选择。

综上，急性心肌梗死引发炎症反应，导致形成富含胶原蛋白的疤痕，取代坏死组织以防止心脏破裂[21]。急性心肌梗死后，T细胞参与炎症和组织修复，Tregs介导器官特异性再生[22]。更重要的是，急性心肌梗死后，Sparc^highTreg浸润至心肌可以增加胶原含量，防止心脏破裂，提高存活率[23]。因此，Sparc^highTreg通过终止促炎期并启动抗炎或修复期可以潜在地促进AMI后心血管组织的修复。然而，细胞扩增不可能在短时间内实现。此外，必须进一步验证扩增细胞与靶组织微环境之间的相互作用，以避免潜在的免疫排斥风险。细胞衍生遗传物质的不稳定性或功能丧失以及细胞存活率有限也带来了额外的挑战[24]。因此，迫切需要避免细胞治疗的缺陷的一类新的治疗方案。

外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，具有磷脂双分子层，直径为50-150nm[25]，外泌体携带和传递关键的信号分子，形成一个新的细胞间信息传递***，影响细胞的生理状态，并与各种疾病的发生和发展密切相关[26]。外泌体可以携带多种重要的生物分子，包括脂质、蛋白质、信使RNA(mRNA)、microRNA(miRNA)和其他非编码RNA。[27]。研究表明，外泌体中的microRNAs在心血管疾病中起着关键的调节作用[28]，来自免疫细胞的外泌体可以促进各种心血管疾病的免疫反应和炎症，不同的免疫细胞有不同的作用[29]。但目前尚无研究报道Tregs所分泌的外泌体在心血管中的作用。

为了探讨特殊群的Tregs在心肌梗死中的作用，SD大鼠上研究了Sparc^highTreg来源的外泌体在急性心肌梗死中的作用。结果表明，单纯Tregs来源的外泌体，对心肌梗死就具有一定的保护作用，而Sparc高表达的Tregs来源的外泌体，对心肌梗死具有很强的保护作用。虽然反复原位注射Sparc^highTreg可以改善心功能，但由于心肌的二次损伤，存活率降低。此外，将外泌体靶向递送并驻留梗死区域同样是一项难题。因此，需要一种非侵入性治疗方案。

科研人员通过其表面多种修饰设计特殊所需的配体，已证明可引导其靶向相应的组织甚至细胞[30]。目前已有的修饰方法主要分为基因工程，共价修饰和非共价修饰[31]。目前，基因工程及共价结合是外泌体最主要的修饰方法，而基因工程编辑又因其可编辑性强，损伤低以及稳定性高等优势，被应用得最为广泛。在本研究中，利用了急性心肌梗死后梗死区CXCL相关趋化因子高表达，通过基因编辑方法获得CXCR2高表达的免疫细胞，其具有良好的趋化特性。结果表明，从CXCR2高表达的Sparc^highTreg中提取的外泌体可以快速、准确地靶向梗死区域。

水凝胶已被用于改善梗死区外泌体的驻留问题。水凝胶是物理或化学交联的三维亲水聚合物网络，可以在不经历溶解过程的情况下吸附大量目标试剂。在再生医学中，水凝胶可以作为支架、屏障、药物输送***和细胞封装基质[32]。研究表明，与不含水凝胶相比，结合有水凝胶的细胞或生物活性分子可在更长的时间内保持其结构和功能[33]。因此，急需开发一种在急性心肌梗死后的梗死区域既可原位交联形成凝胶固定外泌体，又可以在局部微环境的作用下缓慢释放外泌体的***。目前已有许多急性心肌梗死的治疗方案利用4臂-聚乙二醇(4Arm-PEG)耦联组氨酸(4A-PEG-His)，并用金属钴离子(Co²⁺)与组氨酸中的氨基和氮根的形成配位键，在H₂O₂的作用下，Co²⁺从2价状态变为3价，即Co³⁺，同时4A-PEG-His也从液体变为凝胶样。同时，MMP9作为一类酶解蛋白，其可特异性识别并水解特殊的肽段，即“GALGLP”[34,35]。另一方面，心肌梗死发生后，由于细胞的不断死亡并破裂，同时伴随着乳酸的不断积累，这一系列导致梗死区域的pH值不断下降(pH<6.8)，使局部处于酸化环境[36]。酰腙键作为动态共价键的一种，比分子间的弱相互作用(氢键等)要强，酰腙键在特定pH条件下(pH<6.8)具有可逆性质，从而导致酰腙键可在pH<6.8的环境下断裂[37]。基于酰腙键的这一特殊性质，已有大量研究利用酰腙键连接相关化合物，使其可在pH<6.8的酸性环境断裂，从而分离化合物[38]。

目前的研究主要集中在急性心肌梗死后梗死区的微环境(pH<6.8)、梗死早期的高H₂O₂含量以及后期微环境MMP9表达的逐渐增加。在本设计中，成功利用MMP9特异性水解并识别的多肽修饰4A-PEG，在溶液中加入Co²⁺后，并不影响化合物功能，并在H₂O₂的作用下形成凝胶样。同时，利用酰腙键连接DSPE和PEG形成DHPM，选择CD63的适配体对DHPM进行修饰，DHPM结合并包裹凝胶材料，同时与Tregs^Sp_hi_Exos^CXCR2_hi锚定形成复合结构。该***在CXCR2的作用下成功地靶向了梗死区域，并实现了微球在酸性条件下的破裂，利用梗死区域的高H₂O₂含量，促使凝胶原材料中的Co²⁺从二价态转变为三价态，从而形成固定外泌体的凝胶。然后，利用后期MMP9的逐渐增加，水凝胶被破坏，促使外泌体逐渐释放。达到通过靶向递送和固定以及缓慢释放外泌体作为一种非侵入性治疗来对急性心肌梗死发挥保护作用。本结果为急性心肌梗死的治疗提供了一种新的选择。

引用文献如下：

1.KawaiK,UchiyamaM,HesterJ,WoodK,IssaF.RegulatoryTcellsfortolerance.HumImmunol.2018May；79(5):294-303.

2.XiaN,LuY,GuM,LiN,LiuM,JiaoJ,ZhuZ,LiJ,LiD,TangT,LvB,NieS,ZhangM,LiaoM,LiaoY,YangX,ChengX.AUniquePopulationofRegulatoryTCellsinHeartPotentiatesCardiacProtectionFromMyocardialInfarction.Circulation.2020Nov17；142(20):1956-1973.

3.QaduraM,TerenziDC,VermaS,Al-OmranM,HessDA.ConciseReview:CellTherapyforCriticalLimbIschemia:AnIntegratedReviewofPreclinicalandClinicalStudies.StemCells.2018Feb；36(2):161-171.

4.WangJ,ZhaoC,XiaoJ.ExosomesinCardiovascularDiseasesandTreatment:ExperimentalandClinicalAspects.JCardiovascTranslRes.2019Feb；12(1):1-2.

5.WuR,GaoW,YaoK,GeJ.RolesofExosomesDerivedFromImmuneCellsinCardiovascularDiseases.FrontImmunol.2019Mar29；10:648.

6.KimMS,HaneyMJ,ZhaoY,YuanD,DeygenI,KlyachkoNL,KabanovAV,BatrakovaEV.Engineeringmacrophage-derivedexosomesfortargetedpaclitaxeldeliverytopulmonarymetastases:invitroandinvivoevaluations.Nanomedicine.2018Jan；14(1):195-204.

7.YangJ,ChenZ,PanD,LiH,ShenJ.UmbilicalCord-DerivedMesenchymalStemCell-DerivedExosomesCombinedPluronicF127HydrogelPromoteChronicDiabeticWoundHealingandCompleteSkinRegeneration.IntJNanomedicine.2020Aug11；15:5911-5926.

8.GarbernJC,MinamiE,StaytonPS,MurryCE.DeliveryofbasicfibroblastgrowthfactorwithapH-responsive,injectablehydrogeltoimproveangiogenesisininfarctedmyocardium.Biomaterials.2011Mar；32(9):2407-16.

9.UthmanL,NederlofR,EerbeekO,BaartscheerA,SchumacherC,BuchholtzN,HollmannMW,CoronelR,WeberNC,ZuurbierCJ.DelayedischaemiccontractureonsetbyempagliflozinassociateswithNHE1inhibitionandisdependentoninsulininisolatedmousehearts.CardiovascRes.2019Aug1；115(10):1533-1545.

10.WagnerMJ,KhanM,MohsinS.HealingtheBrokenHeart；TheImmunomodulatoryEffectsofStemCellTherapy.FrontImmunol.2020Apr9；11:639.

11.SaparovA,OgayV,NurgozhinT,ChenWCW,MansurovN,IssabekovaA,ZhakupovaJ.Roleoftheimmunesystemincardiactissuedamageandrepairfollowingmyocardialinfarction.InflammRes.2017Sep；66(9):739-751.

12.FrangogiannisNG.Cardiacfibrosis:Cellbiologicalmechanisms,molecularpathwaysandtherapeuticopportunities.MolAspectsMed.2019Feb；65:70-99.

13.WuX,ShowiheenSAA,SunAR,CrawfordR,XiaoY,MaoX,PrasadamI.ExosomesExtractionandIdentification.MethodsMolBiol.2019；2054:81-91.

14.PanpanLi,YuguoXia,JingchengHao,andXuWang.TransientHealabilityofMetallosupramolecularPolymerNetworksMediatedbyKineticControlofCompetingChemicalReactions.Macromolecules202053(8),2856-2863

15.LindseyML.Assigningmatrixmetalloproteinaserolesinischaemiccardiacremodelling.NatRevCardiol.2018；15:471-479.

16.KaurJ,MishraV,SinghSK,GulatiM,KapoorB,ChellappanDK,GuptaG,DurejaH,AnandK,DuaK,KhatikGL,GowthamarajanK.Harnessingamphiphilicpolymericmicellesfordiagnosticandtherapeuticapplications:Breakthroughsandbottlenecks.JControlRelease.2021Jun10；334:64-95.

17.Blanco-GómezA,Fernández-BlancoV,RodríguezJ,PeinadorC,GarcíaMD.ThinkingOutsidethe"BlueBox":InducedFitwithinaUniqueSelf-AssembledPolycationicCyclophane.JAmChemSoc.2019Mar6；141(9):3959-3964.

18.ZhouG,LatchoumaninO,HebbardL,DuanW,LiddleC,GeorgeJ,QiaoL.Aptamersastargetingligandsandtherapeuticmoleculesforovercomingdrugresistanceincancers.AdvDrugDelivRev.2018Sep；134:107-121.

19.RahimizadehK,AlShamailehH,FratiniM,ChakravarthyM,StephenM,ShigdarS,VeeduRN.DevelopmentofCell-SpecificAptamers:RecentAdvancesandInsightintotheSelectionProcedures.Molecules.2017Nov27；22(12):2070.

20.CanouraJ,YuH,AlkhamisO,RoncancioD,FarhanaR,XiaoY.AcceleratingPost-SELEXAptamerEngineeringUsingExonucleaseDigestion.JAmChemSoc.2021Jan20；143(2):805-816.

21.WestmanPC,LipinskiMJ,LugerD,WaksmanR,BonowRO,WuE,EpsteinSE.InflammationasaDriverofAdverseLeftVentricularRemodelingAfterAcuteMyocardialInfarction.JAmCollCardiol.2016May3；67(17):2050-60.

22.EpelmanS,LiuPP,MannDL.Roleofinnateandadaptiveimmunemechanismsincardiacinjuryandrepair.NatRevImmunol.2015Feb；15(2):117-29.

23.XiaN,LuY,GuM,LiN,LiuM,JiaoJ,ZhuZ,LiJ,LiD,TangT,LvB,NieS,ZhangM,LiaoM,LiaoY,YangX,ChengX.AUniquePopulationofRegulatoryTCellsinHeartPotentiatesCardiacProtectionFromMyocardialInfarction.Circulation.2020Nov17；142(20):1956-1973.

24.QaduraM,TerenziDC,VermaS,Al-OmranM,HessDA.ConciseReview:CellTherapyforCriticalLimbIschemia:AnIntegratedReviewofPreclinicalandClinicalStudies.StemCells.2018Feb；36(2):161-171.

25.KalluriR,LeBleuVS.Thebiology,function,andbiomedicalapplicationsofexosomes.Science.2020Feb7；367(6478):eaau6977.

26.ZhangY,LiuY,LiuH,TangWH.Exosomes:biogenesis,biologicfunctionandclinicalpotential.CellBiosci.2019Feb15；9:19.

27.LatifkarA,HurYH,SanchezJC,CerioneRA,AntonyakMA.Newinsightsintoextracellularvesiclebiogenesisandfunction.JCellSci.2019Jul1；132(13):jcs222406.

28.HouZ,QinX,HuY,ZhangX,LiG,WuJ,LiJ,ShaJ,ChenJ,XiaJ,WangL,GaoF.LongtermExercise-DerivedExosomalmiR-342-5p:ANovelExerkineforCardioprotection.CircRes.2019Apr26；124(9):1386-1400.

29.WuR,GaoW,YaoK,GeJ.RolesofExosomesDerivedFromImmuneCellsinCardiovascularDiseases.FrontImmunol.2019Mar29；10:648.

30.KimMS,HaneyMJ,ZhaoY,YuanD,DeygenI,KlyachkoNL,KabanovAV,BatrakovaEV.Engineeringmacrophage-derivedexosomesfortargetedpaclitaxeldeliverytopulmonarymetastases:invitroandinvivoevaluations.Nanomedicine.2018Jan；14(1):195-204.

31.SalunkheS,Dheeraj,BasakM,ChitkaraD,MittalA.Surfacefunctionalizationofexosomesfortarget-specificdeliveryandinvivoimaging&tracking:Strategiesandsignificance.JControlRelease.2020Oct10；326:599-614.

32.WangC,WangM,XuT,ZhangX,LinC,GaoW,XuH,LeiB,MaoC.EngineeringBioactiveSelf-HealingAntibacterialExosomesHydrogelforPromotingChronicDiabeticWoundHealingandCompleteSkinRegeneration.Theranostics.2019Jan1；9(1):65-76.

33.YangJ,ChenZ,PanD,LiH,ShenJ.UmbilicalCord-DerivedMesenchymalStemCell-DerivedExosomesCombinedPluronicF127HydrogelPromoteChronicDiabeticWoundHealingandCompleteSkinRegeneration.IntJNanomedicine.2020Aug11；15:5911-5926.

34.PanpanLi,YuguoXia,JingchengHao,andXuWang.TransientHealabilityofMetallosupramolecularPolymerNetworksMediatedbyKineticControlofCompetingChemicalReactions.Macromolecules202053(8),2856-2863

35.LindseyML.Assigningmatrixmetalloproteinaserolesinischaemiccardiacremodelling.NatRevCardiol.2018；15:471-479.

36.UthmanL,NederlofR,EerbeekO,BaartscheerA,SchumacherC,BuchholtzN,HollmannMW,CoronelR,WeberNC,ZuurbierCJ.DelayedischaemiccontractureonsetbyempagliflozinassociateswithNHE1inhibitionandisdependentoninsulininisolatedmousehearts.CardiovascRes.2019Aug1；115(10):1533-1545.

37.ChenX,GuoL,MaQ,ChenW,FanW,ZhangJ.Design,Synthesis,andBiologicalEvaluationofNovelN-AcylhydrazoneBondLinkedHeterobivalentbeta-CarbolinesasPotentialAnticancerAgents.Molecules.2019Aug14；24(16):2950.

38.LiuY,LiuY,WangQ,HanY,ChenH,TanY.DoublyDynamicHydrogelFormedbyCombiningBoronateEsterandAcylhydrazoneBonds.Polymers(Basel).2020Feb21；12(2):487.

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种共轭肽，其特征在于，其包括多肽修饰的4A-PEG和金属钴离子，所述多肽包括组氨酸和用于MMP9酶水解的肽段，所述用于MMP9酶水解的肽段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述金属钴离子与组氨酸以配位键结合；所述金属钴离子能基于H₂O₂响应使得所述共轭肽呈凝胶状；

所述多肽修饰的4A-PEG的结构式如下：

2.一种pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，其特征在于，其包括：以酰腙键连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇DSPE-Hyd-PEG形成的微球，且所述微球内装载有权利要求1所述的共轭肽；DSPE-Hyd-PEG的结构式如下：

。

3.根据权利要求2所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，其特征在于，所述微球在pH小于6.8的环境下酰腙键断裂。

4.根据权利要求3所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，其特征在于，所述微球装载所述共轭肽的承载量为32.34±7.43wt%。

5.一种搭载外泌体的生物载体，其特征在于，其包括权利要求2-4任一项所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球，所述时序性响应微球的外周通过酰腙键连接CD63适配体，所述CD63适配体与来源于CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞的外泌体通过外泌体表面的CD63标记物特异性结合；

所述适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求5所述的搭载外泌体的生物载体，其特征在于，所述CXCR2高表达和SPARC高表达的调节性T细胞是经过基因编辑手段使得SPARC高表达的调节性T细胞实现CXCR2高表达，最终获得CXCR2高表达的外泌体。

7.根据权利要求5所述的搭载外泌体的生物载体，其特征在于，所述适配体还修饰有修饰物或标记有可被检测的标记物；所述修饰物为生物素；所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

8.一种如权利要求2-4任一项所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

将共轭肽和DSPE-Hyd-PEG形成的微球混合于溶剂中，然后离心，真空干燥。

9.根据如权利要求8所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球的制备方法，其特征在于，所述共轭肽在所述溶剂中的浓度与所述微球在所述溶剂中的浓度比为2.3-2.7 mg/ml:4.8-5.2 mg/ml。

10.根据如权利要求9所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷，所述共轭肽与所述微球混合时加入水直至添加的水的体积占总混合液体积的30%，以0.5-0.6mL/h的速度加入水。

11.根据如权利要求10所述的pH/H₂O₂/MMP9时序性响应微球的制备方法，其特征在于，待水添加至总混合液体积的30%后，以2-2.5mL/h的速度加入占总混合液体积50%的水。

12.一种如权利要求5-7任一项所述的搭载外泌体的生物载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

将时序性响应微球与CD63适配体按照0.23-0.27 mM ：0.008-0.012 mM的摩尔比进行混合反应，获得通过酰腙键连接有CD63适配体的时序性响应微球，然后将来源于调节性T细胞的外泌体与连接CD63适配体的时序性响应微球进行混合；

所述CD63适配体进行混合反应前，还包括在CD63适配体上修饰乙炔基，并通过点化学与对叠氮基苯乙酮连接。

13.根据权利要求12所述的搭载外泌体的生物载体的制备方法，其特征在于，所述外泌体与连接CD63适配体的时序性响应微球的混合质量比为0.5-1.5:1-3。

14.根据权利要求13所述的搭载外泌体的生物载体的制备方法，其特征在于，所述混合是在37℃±0.5℃下进行孵育3 h。

15.如权利要求5-7任一项所述的搭载外泌体的生物载体在制备心肌梗死修复药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述心肌梗死选自急性心肌梗死、亚急性心肌梗死或室壁瘤。

17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用中，pH触发所述生物载体的外泌体的释放，活性氧H₂O₂引发金属钴离子的氧化从而形成凝胶以固定释放的外泌体，然后基于MMP9酶的水解触发所述凝胶的降解，缓慢释放外泌体。

18.一种治疗心肌梗死的药物，其特征在于，其包括如权利要求5-7任一项所述的搭载外泌体的生物载体。

19.根据权利要求18所述的药物，其特征在于，所述治疗心肌梗死的药物还包括药学上可接受的辅料。

20.根据权利要求19所述的药物，其特征在于，所述药物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂和喷雾。