CN108553446B - 一种双敏感双载药的纳米粒载体及纳米粒制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双敏感双载药的纳米粒载体及纳米粒制剂，其中，所述纳米粒载体的合成步骤如下：在缩合剂等的存在下，以聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)和GFLGF多肽(Gly‑Phe‑Leu‑Gly‑Phe)为原料合成PLGA‑GFLGF；以合成的PLGA‑GFLGF和聚乙烯亚胺(PEI)为原料，在同样的条件下合成PLGA‑GFLGF‑PEI；再加入碱性催化剂及电荷翻转分子2,3‑二甲基马来酸酐(DA)，通过酰化反应合成PLGA‑GFLGF‑PEI‑DA纳米粒载体；纳米粒的制备方法包括如下：将药物多西紫杉醇(docetaxel,DTX)和GDC0941(GDC)及载体材料PLGA‑GFLGF‑PEI‑DA溶于有机溶剂中，在超声条件下，滴入聚乙烯醇(PVA)溶液中，再将初乳真空旋蒸除去有机试剂，形成均一的纳米粒溶液。与现有技术相比，本发明制备的双敏感双载药纳米粒制剂，具有良好的载药量、包封率和稳定性，且能实现肿瘤主动靶向。

Description

一种双敏感双载药的纳米粒载体及纳米粒制剂
技术领域
本发明属于纳米制剂技术领域，涉及一种双敏感双载药的纳米粒载体及纳米粒制剂。
背景技术
目前，肿瘤转移是肿瘤治疗中最为棘手的攻坚目标之一，肿瘤转移发生机率极高并且致死率也令人吃惊，临床方面，60％以上的恶性肿瘤患者在发现时已经发生转移，另文献报道超过90％的癌症死亡患者均死于肿瘤转移(Marx V.Tracking metastasis andtricking cancer[J].Nature,2013,494(7435):133-6)。
传统的抗肿瘤转移的策略大多为杀伤治疗，即采取传统的化疗药物直接杀伤原发肿瘤细胞及转移性细胞，取得了一定的抗癌效果。多西紫杉醇(docetaxel,DTX)，是一种天然二萜类化合物，亲脂性强，水中溶解度很小，其可通过促进微观聚合和抑制微管蛋白解聚来阻断纺锤体的***，进而抑制细胞的有丝***，抑制细胞的增殖。DTX是在肿瘤转移中常用的化疗药物，但作为肿瘤转移化疗药的有效率 (response rate，RR)仅为18％-24％，令人欣慰的是，当DTX和其它化疗药物、 siRNA或信号通路抑制剂等联合应用，RR得到大大提升。为提高制剂治愈肿瘤转移的几率，设计加入一种通路抑制剂，联合用于抗肿瘤转移的治疗。 GDC0941(GDC)，又名Pictilisib，是PI3K通路抑制剂，能够有效抑制下游Akt磷酸化，抑制细胞转移。
化疗药物本身具有高效的抗肿瘤增殖的作用，但本身具有的一项缺陷却限制其应用，即抗癌药物具有很大的盲目杀伤性，在杀死肿瘤细胞的同时也无选择性地对正常细胞造成损伤，引起严重的毒副作用。
传统的纳米载体，对肿瘤细胞膜的穿透力不够，造成肿瘤细胞内药物浓度低而无法达到有效的治疗效果。近年来，刺激响应性纳米载体得到极大的发展，刺激响应性纳米载体可在外界信号的刺激下会产生物理或化学的变化，如分子链结构、表面结构、溶胀、溶解性以及解离等行为。这些刺激信号主要包括一些化学信号，如 pH、离子强度、化学物质等，还有一些物理信号，包括温度、磁场、电场与超声等。随着刺激响应性纳米载体的发展，新型刺激响应性纳米制剂在肿瘤细胞内外特定生物刺激条件下响应性的释放药物，提高抗癌药物在肿瘤组织的蓄积，从而能够有效地提高抗癌药物的治疗效果，因此，在抑制肿瘤转移的治疗方面具有巨大的潜在应用价值。提高胞内药物浓度，即将药物递送至肿瘤细胞内，需要克服三个屏障：细胞外(血液循环)避免清除、通过受体结合或静电作用力增加细胞摄取、内涵体中释放药物并逃逸至细胞质。因此，良好的载体应具有以下功能：能够避免体内清除，增加细胞摄取能力和内涵体逃逸。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好的生物相容性，1997年已被FDA 批准用于药物辅料。PLGA在体内可降解，且降解产物是乳酸和羟基乙酸，对人体不会产生毒副作用(乳糖不耐受症者除外)，此外，PLGA还具有良好的成膜和成囊性能，因此，将其作为纳米载体，并对其进行修饰，在纳米递药***中应用广泛。
肿瘤环境中特定的酶，如蛋白酶、糖苷酶、磷脂酶表达水平提高，因此，可以利用肿瘤组织和正常组织的区别，设计和构建针对酶环境响应的纳米递药***。目前针对酶环境响应的纳米递药***主要针对的是细胞外环境中的酶，如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogenactivator，uPA)，弗林(Furin)蛋白酶。另外针对细胞内酶环境响应的纳米递药***也有研究，纳米粒通过内吞方式进入细胞时，首先与内涵体结合，对溶酶体酶响应的纳米载体在内涵体或溶酶体中被剪切，因此，针对溶酶体酶敏感的纳米载体也取得了良好的效果。化疗药物发挥作用需经过细胞膜、内涵体、溶酶体等过程到达细胞浆特定位置，才能发挥作用，杀死肿瘤细胞，因此，对溶酶体酶响应的纳米粒由于作用位点的延后将更有利于药物在细胞内蓄积。
纳米载体表面的电荷性质，在一定程度上决定了纳米载体在体内的去向。正电荷可以增强纳米载体与带负电荷细胞膜的相互作用，促进细胞对药物的摄取，但由于血液中带负电蛋白的存在，表面带正电荷的纳米载体也存在凝血、溶血和快速清除的问题。相反，负电荷可以增强纳米载体的血液相容性，延长***循环的时间，但也会降低纳米载体与细胞膜相互作用，不利于细胞对药物的摄取。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种双敏感双载药的纳米粒载体及纳米粒制剂，本发明制备的包载DTX和GDC的电荷翻转双敏感纳米制剂的粒径为135.6±2.8nm，制备方法简便、有效，具有良好的包封率、载药量和稳定性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的目的之一在于提出了一种双敏感双载药的纳米粒载体，其为由原料PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)依次与GFLGF多肽(Gly-Phe-Leu-Gly-Phe)、PEI (聚乙烯亚胺)、以及电荷翻转分子DA(2,3-二甲基马来酸酐)反应合成的 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体。
本发明中采用的PLGA是一种具有良好的生物相容性的载体材料，无毒、可生物降解且易被修饰，作用是与PEI一同构成主链，装载药物。
GFLGF是溶酶体酶响应的短肽，作用是连接PLGA与PEI。在溶酶体中它能被组织蛋白酶Cath B剪切，致使PEI和PLGA断开，纳米粒因此发生部分破碎或全部解体。
PEI是具有质子缓冲能力的载体材料，作用是与PLGA一同构成主链，能使纳米载体带正电荷，从而增强纳米载体与带负电荷细胞膜的相互作用，促进肿瘤细胞对药物的摄取，在肿瘤细胞中蓄积；在溶酶体内则能使溶酶体膜因正电破裂，使药物从膜内逃逸至细胞浆中，发挥药效。
DA带负电，作用是翻转PEI所带的电荷，使纳米粒在体循环(pH＝7.4)中保持负电位，避免纳米载体在血循环中被快速清除。在肿瘤微环境中(pH＝6.8)DA 从纳米粒表面脱去，实现电荷翻转。
本发明的目的之二在于提出了上述一种双敏感双载药的纳米粒载体的制备方法，其具体包括以下步骤：
(1)：在酰化活化剂存在的条件下，以PLGA和GFLGF多肽为原料合成PLGA- GFLGF；
(2)：在酰化活化剂和缩合剂存在的条件下，以PLGA-GFLGF与PEI为原料合成PLGA-GFLGF-PEI；
(3)：最后，往PLGA-GFLGF-PEI中加入碱性物质和电荷翻转分子DA，酰化反应合成PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米粒载体。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述PLGA的重均分子量为2000～35000 Da，所述PEI的重均分子量为200～5000Da。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的酰化活化剂为4-二甲氨基吡啶或 1-羟基苯并三氮唑中的一种或两种。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的缩合剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的碱性物质为三乙胺或吡啶中的一种或两种。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(1)中，酰化活化剂、缩合剂、PLGA 和GFLGF多肽的质量比为(1-20):(1-20):(1-200):(1-20)。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(2)中，酰化活化剂、缩合剂、 PLGA-GFLGF与PEI的质量比为(1-200)：(1-100)：(1-300)：(1-200)。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(3)中，PLGA-GFLGF-PEI、电荷翻转分子DA和碱性物质的加入量比为(100-500)mg：(100-500)mg：1ml。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(2)的合成条件为：在氮气保护环境下，室温超声搅拌反应72h左右。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(3)的合成条件为：在氮气保护环境下，室温下搅拌反应48h左右。
PLGA与GFLGF、GFLGF与PEI、PEI与DA分别通过酰化反应形成酰胺键。 PLGA-GFLGF-PEI-DA单体以聚合物胶束的形式形成纳米载体。
本发明的目的之三在于提出了一种双敏感双载药的纳米粒制剂，由上述的 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体和负载的DTX、GDC组成，其中， PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体中的PLGA部分作为疏水段并包载DTX和GDC， GFLGF-PEI部分为亲水段，并通过外部DA部分的连接，实现电荷翻转功能。
PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体包载DTX与GDC，将之递送至靶点(肿瘤溶酶体)，并释放至细胞浆内。DTX通过促进微管聚合和抑制微管蛋白解聚来阻断纺锤体的***，进而抑制细胞的有丝***，抑制细胞的增殖。GDC是PI3K抑制剂，能够有效抑制下游Akt磷酸化，抑制肿瘤细胞转移。将DTX与GDC联合应用，既能发挥DTX的抗癌作用，又能阻断PI3K/Akt信号通路，增强抗肿瘤转移作用。
本发明的目的之四在于提出了一种双敏感双载药的纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
(一)、在超声条件下，取DTX、GDC-0941和PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体溶于二氯甲烷中，再加入丙酮和三乙胺，作为有机相；
(二)、将有机相在超声条件下滴加到PVA溶液中，超声结束后得到初乳溶液；
(三)、将初乳溶液转移到水浴环境中，蒸发除去有机溶剂，得到均一纳米粒溶液，即为目的产物的溶液。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(一)中，DTX与 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:(1-270)。
在本发明的一种优选的实施方式中，GDC-0941与PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:(1-320)。
在本发明的一种优选的实施方式中，二氯甲烷、丙酮和三乙胺的体积比为 (500-8000)：(500-6000)：1。
在本发明的一种优选的实施方式中，DTX与有机相的添加比为(0.1-10)mg： 1mL。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(二)中，超声功率为20-240W，超声时间为1min-30min，温度为-10～10℃。
在本发明的一种优选的实施方式中，PVA溶液中，PVA分子量范围为13KDa 以下，溶液的pH值为5-7.4，PVA溶液的重量体积百分比浓度为0.6～2％。
在本发明的一种优选的实施方式中，有机相与PVA溶液的加入量之比为1： (1-50)。
在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(三)中，水浴温度为15℃-80℃。
本发明中制备过程中，有机相中的三乙胺的作用主要是调节pH，提高纳米粒的稳定性。若不加三乙胺，在蒸发除去溶剂时会出现大量的沉淀， PLGA-GFLGF-PEI-DA无法很好地形成纳米溶液。PVA溶液是有助于纳米粒分散的水相。超声条件、较低的反应温度有助于初乳的形成。温度过高或过低都会导致产率下降。
本发明合成PLGA-GFLGF-PEI-DA载体，制备电荷翻转的双敏感双载药纳米粒，提高药物疗效的同时降低副作用的发生。纳米制剂作为抗肿瘤的载体，可以通过渗透增强和滞留(enhanced permeability and retention effect，EPR)效应从血管到达肿瘤部位，为抑制肿瘤转移提供了一种新的策略。纳米制剂具有提高难溶性药物的溶解度、靶向释放、可控释放、降低药物的体内清除率等特点。
本发明通过设计并合成四嵌段聚合物PLGA-GFLGF-PEI-DA，以此克服细胞外 (血液循环)避免清除、通过受体结合或静电作用力增加细胞摄取、内涵体中释放药物并逃逸至细胞质三层制剂递送障碍，实现制剂的肿瘤细胞靶向。
本发明还利用电荷翻转技术，构建了电荷翻转纳米递药***，其在血循环过程保持惰性，在实体瘤中通过EPR效应到达肿瘤微环境，进而被肿瘤微环境的低pH 活化，纳米载体表面转变为正电荷，带正电荷的纳米粒与细胞膜(表面带负电荷) 的作用力增强，提高细胞摄取，从而提高药物疗效。电荷翻转的构建具有两个优势：既可以利用纳米粒表面的负电荷避免其在血循环中被清除，又可以利用翻转后的正电荷与细胞膜的相互作用力增加，从而增加细胞对纳米粒的摄取能力。
内涵体逃逸有利于药物或载体进入胞浆中发挥作用。PEI具有内涵体逃逸功能，这可能与其“质子海绵效应”有关。PEI结构中所含有的三种胺，在生理条件下，可以形成很强的缓冲能力对以适应细胞内外pH的变化，其在pH 7.0时质子化率为 20％，pH 5.0时质子化率可达45％。因此，PEI在细胞生理pH 5.0～7.4范围内具有逐步质子化的能力，即“质子海绵效应”。该效应可以使内涵体在渗透压的作用下膨胀，导致内涵体膜破裂，使药物进入胞浆。
与现有技术相比，本发明制备的包载DTX和GDC的电荷翻转双敏感纳米制剂的粒径为135.6±2.8nm，制备方法简便、有效，具有良好的包封率、载药量和稳定性。与无电荷翻转的PPP/NPs相比，增加DA电荷翻转设计的PPP-DA/NPs 在体内外表现出良好的性能。因而电荷翻转双敏感双载药纳米粒载体 PLGA-GFLGF-PEI-DA和纳米粒制剂是理想的药物载体。
附图说明
图1为本发明各原料以及产物的近红外光谱图；
图2为本发明合成的PPP-DA/NPs的TEM图；
图3为PPP-DA/NPs的构造及体内示意图；
图4为未载药的PLGA/NPs、PPP/NPs和PPP-DA/NPs的Zeta电位翻转图；
图5为PPP-DA/NPs Cath B酶敏感体外释放曲线图；
图6为不同pH条件下PPP-DA/NPs的细胞摄取实验图；
图7为PPP-DA/NPs的体内抗肿瘤实验效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，各原料组分的具体来源如下：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，Mw＝15kD，济南岱罡生物工程有限公司；
GFLGF短肽(peptide)则购自于吉尔生化(上海)有限公司；
N，N'-二异丙基碳酰亚胺(DIC)，购自于阿拉丁试剂(上海)有限公司，可采用批号Lot.l1528045的试剂；
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，购自于阿拉丁试剂(上海)有限公司，可采用 No.#F1504032型号试剂；
4-二甲氨基吡啶(DMAP)，购自于阿拉丁试剂(上海)有限公司，可采用 No.#F1517023型号试剂；
聚乙烯亚胺(PEI)，Mw 1.8kD左右，购自于阿拉丁试剂(上海)有限公司，可采用No.D1513014型号试剂；
三乙胺(Et3N)，购自于上海凌峰化学试剂有限公司，可采用No.20160225 型号试剂；
2，3-二甲基马来酸酐(DA)，购自于阿法埃莎(天津)化学有限公司，可采用No.#10136503型号试剂；
1-羟基苯并***(HOBT)，购自于阿拉丁试剂(上海)有限公司，可采用 No.#l12180555型号试剂；
聚乙烯醇(PVA)，Mw＝13000-23000，购自于美国Aldrich公司，可采用 Lot#MKBS5267V型号试剂。
实施例1 PLGA-GFLGF的合成
将PLGA 100mg和DIC 10mg溶于20mL DMSO中，并置于100mL圆底烧瓶，抽真空作为反应液A；另外称GFLGF 10mg和DMAP 5mg溶于5mL二氯甲烷中，超声溶解作为反应液B，并将反应液B加入反应液A中。继续反应24h，反应结束后，离心并收集沉淀，冷冻干燥得PLGA-GFLGF产物。
利用近红外(IR)光谱图对产物进行表征，结构如图1所示，PLGA-peptide IR 谱图中既含有PLGA的酯键特征峰vc＝c 1759cm-1、vc-o-c 1278cm-1，又可见GFLGF中的酰胺Ⅱ带1538cm-1,可见PLGA-GFLGF合成成功。
实施例2 PLGA-GFLGF-PEI的合成
准确称取PLGA-GFLGF 200mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)50mg、PEI 100mg、 DIC50mg、DMAP 50mg置于100mL三颈瓶中，抽真空，在氮气保护的环境中，注入二氯甲烷10mL，超声并搅拌使其溶解，室温条件下，继续反应72h。反应结束后，将反应液转移进透析袋(Mw＝3500Da)中，透析4d，将透析袋中液体冷冻干燥，得白色产物PLGA-GFLGF-PEI(PPP)。
利用近红外(IR)光谱图对产物进行表征，结构如图1所示，PPP的IR图谱中，由于氨基的原因，3418cm-1的峰变宽，且向低频移动；酰胺键的伸缩振动vc＝o 从1757cm-1向低频移动至1645cm-1，提示PEI的接枝成功。
实施例3 PLGA-GFLGF-PEI-DA的合成
准确称取PLGA-GFLGF-PEI 300mg、DA 250mg、三乙胺1mL置于50mL圆底烧瓶中，抽真空，在氮气保护下，注入20mL DMSO，搅拌使其溶解，在室温条件下，继续反应48h。反应结束后，收集生成的黏性产物，并清洗3次后，真空过夜干燥，得最终产物PLGA-GFLGF-PEI-DA(PPP-DA)。
利用近红外(IR)光谱图对产物进行表征，结构如图1所示，PPP中-NH2-中 N-H伸缩振动vN-H峰3300cm-1在PPP-DA峰中消失，提示氨基和DA已反应，另外DA中的-CH3的堆成弯曲振动峰1434cm-1和1382cm-1，该峰在PPP-DA显著增强，也可证明DA与PPP合成成功。
本实施例中三乙胺也可以用吡啶、或三乙胺与吡啶的混合物替代。
实施例4 PPP-DA/NPs的制备
本制剂采用改良的乳化溶剂挥发法制备。
准确称取DTX 15mg、GDC 15mg、PPP-DA 20mg溶于5mL二氯甲烷中，并添加1μL三乙胺与1ml丙酮，超声溶解，作为有机相。在超声(20W，3min)条件下，将有机相加入2％PVA溶液(50ml)中。超声结束后，将乳液转移至圆底烧瓶中，80℃条件下真空旋转蒸发除去有机溶剂，得均一纳米粒(即PPP-DA/NPs) 溶液。
采用TEM观察PPP-DA/NPs外观，检测结果如图2所示，可见均一圆整呈球状的纳米粒。马尔文粒径仪测定Zeta为－(27.1±0.8)mV，粒径135.6±2.8nm。
本实施例中，PVA溶液的重量体积百分比浓度还可以替换为0.6％、1.2％等在0.6％-2％之间的数值。
实施例5体外释放
吸取上述实施例4制得的2mL PPP-DA/NPs溶液，封存于透析袋中 (MWCO＝3500)，并将其浸入pH 5.0柠檬酸磷酸盐缓冲液中，其中实验组释放介质中加入Cath B(2.5UI/mL)酶，空白组中不含此酶，置于摇床中37℃，100rpm 振摇24h，在既定时间点取样，HPLC法测定累积释放含量。
Cath B酶敏感体外释放结果如图5所示，与空白组相比，实验组中PPP-DA/NPs 在含酶的释放介质中孵育后，24h累积药物释放率明显提高，说明此制剂具有一定的Cath B酶响应性。
实施例6体内抗肿瘤
取五周龄裸鼠25只，将培养的细胞消化收集后，在裸鼠的右腋部接种(1×107个/只)4T1细胞悬液，待荷瘤鼠肿瘤体积达到100mm3时，可开始给药。将荷瘤裸鼠随机分成5组，分别为生理盐水组(Saline)、DTX游离组、DTX+GDC物理混合组、PPP/NPs组和PPP-DA/NPs组。每组尾静脉注射给药，三天给药一次，共给药4次，治疗结束后，再正常饲养一周。治疗结束后，处死裸鼠并剥离肿瘤组织，体外拍照。
体内抗肿瘤效果如图7所示，治疗器结束后，从图中肿瘤外观图可知，生理盐水组肿瘤体积最大，PPP-DA/NPs制剂组肿瘤体积最小，较有效的抑制肿瘤的增殖，说明PPP-DA/NPs具有良好的抑瘤效果。
实施例7
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中DTX与 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:1，GDC-0941与 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:1。
实施例8
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中DTX与 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:270，GDC-0941与 PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的质量比为1:320。
实施例9
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中二氯甲烷、丙酮和三乙胺的体积比为500：500：1。
实施例9-1
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中二氯甲烷、丙酮和三乙胺的体积比为8000：6000：1。
实施例10
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中超声功率为240W，超声时间为1min。
实施例11
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中超声功率为120W，超声时间为15min。
实施例12
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中水浴温度为15℃。
实施例13
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中水浴温度为50℃。
实施例14
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中还进一步限定了PVA溶液中，PVA分子量范围为13KDa以下，溶液的pH值为5-7.4。
实施例15
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中二氯甲烷、丙酮和三乙胺的加入量分别改为0.75ml、0.75ml和0.1μL。
实施例16
与实施例4相比，绝大部分都相同，除了本实施例中DTX、GDC、PPP-DA 的加入量分别替换为0.2mg、0.2mg和0.25mg。
实施例17
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了本实施例中酰化活化剂、缩合剂、 PLGA和GFLGF多肽的质量比为1:1:1:1。
实施例18
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了本实施例中酰化活化剂、缩合剂、 PLGA和GFLGF多肽的质量比为20:20:200:20。
实施例19
与实施例2相比，绝大部分都相同，除了本实施例中酰化活化剂、缩合剂、 PLGA-GFLGF与PEI的质量比为1：1：1：1。
实施例20
与实施例2相比，绝大部分都相同，除了本实施例中酰化活化剂、缩合剂、 PLGA-GFLGF与PEI的质量比为200：100：300：200。
实施例21
与实施例3有所不同的是，本实施例中，PLGA-GFLGF-PEI和DA的质量分别改为称取100mg。
实施例22
与实施例3有所不同的是，本实施例中，PLGA-GFLGF-PEI和DA的质量分别改为称取500mg。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种双敏感双载药的纳米粒制剂，其特征在于，由PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体和负载的DTX、GDC-0941组成，其中，PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体中的PLGA部分作为疏水段并包载DTX和GDC-0941，GFLGF-PEI部分为亲水段，并通过外部DA部分的连接，实现电荷翻转功能；
PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体、DTX、GDC-0941的质量比为20:15:15；
所述PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体为由原料PLGA依次与GFLGF多肽、PEI、以及电荷翻转分子DA反应合成的PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体；
PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体的制备过程包括以下步骤：
(1)：在酰化活化剂和缩合剂存在的条件下，以PLGA和GFLGF多肽为原料合成PLGA-GFLGF；
(2)：在酰化活化剂和缩合剂存在的条件下，以PLGA-GFLGF与PEI为原料合成PLGA-GFLGF-PEI；
(3)：最后，往PLGA-GFLGF-PEI中加入碱性物质和DA，酰化反应合成PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米粒载体；
所用PLGA的分子量为Mw＝15kD，PEI的分子量为Mw 1.8kD。
2.根据权利要求1所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂，其特征在于，所述的酰化活化剂为4-二甲氨基吡啶或1-羟基苯并三氮唑中的一种或两种；
所述的缩合剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺；
所述的碱性物质为三乙胺或吡啶中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂，其特征在于，步骤(1)中，酰化活化剂、缩合剂、PLGA和GFLGF多肽的质量比为(1-20):(1-20):(1-200):(1-20)；
步骤(2)中，酰化活化剂、缩合剂、PLGA-GFLGF与PEI的质量比为(1-200)：(1-100)：(1-300)：(1-200)；
步骤(3)中，PLGA-GFLGF-PEI、DA和碱性物质的加入量比为(100-500)mg：(100-500)mg：1ml。
4.如权利要求1所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、在超声条件下，取DTX、GDC-0941和PLGA-GFLGF-PEI-DA纳米载体溶于二氯甲烷中，再加入丙酮和三乙胺，作为有机相；
(二)、将有机相在超声条件下滴加到PVA溶液中，超声结束后得到初乳溶液；
(三)、将初乳溶液转移到水浴环境中，蒸发除去有机溶剂，得到均一纳米粒溶液，即为目的产物的溶液。
5.根据权利要求4所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(一)中，
二氯甲烷、丙酮和三乙胺的体积比为(500-8000)：(500-6000)：1；
DTX与有机相的添加比为(0.1-10)mg：1mL。
6.根据权利要求4所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(二)中，超声功率为20-240W，超声时间为1min-30min，温度为-10～10℃；
PVA溶液中，PVA分子量范围为13KDa以下，溶液的pH值为5-7.4，PVA溶液的重量体积百分比浓度为0.6～2％；
有机相与PVA溶液的加入量之比为1：(1-50)。
7.根据权利要求4所述的一种双敏感双载药的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(三)中，水浴温度为15℃-80℃。
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