CN115786486A - 一种基于mlpa-ngs方法用于检测线粒体dna变异的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于MLPA‑NGS方法用于检测线粒体DNA变异的试剂盒及其应用,具体地用于检测人线粒体DNA各区段拷贝数变异(CNV)及多个突变位点(SNV),所述试剂盒包括针对于人线粒体DNA的CNV探针组合物和与疾病相关的SNV探针组合物,还包括引物组合物,所述引物组合物为用于扩增连接后的探针的带有index序列的通用引物。上述试剂盒将各探针配制成探针工作液,然后取待测样本DNA,通过加热解链、与探针孵育、探针连接、通用引物对连接产物的扩增、高通量测序,得到测序数据,采用自制的程序进行数据分析,得到人线粒体DNA各疾病相关SNV和各区段CNV的测序情况,上述检测方法操作简单,成本低廉、可信度高,是进行人线粒体DNA SNV和CNV检测的良好工具。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其涉及一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的试剂盒及其应用。
背景技术
线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器,是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体DNA(mtDNA)是线粒体中的遗传物质,呈双链环状。一个线粒体中可有一个或数个mtDNA分子。人类正常mtDNA全长16569bp,包含37个基因,其中13个编码氧化磷酸化呼吸链复合体多肽的基因,2个核糖体RNA,22个转运RNA。
由于缺乏像核基因组DNA所具有的多种损伤修复机制等原因,mtDNA的突变率要高于核基因组DNA。在细胞***时,母细胞里的线粒体含有的突变mtDNA,在随机分离进入子细胞后,突变mtDNA在子细胞的线粒体中所占的比例可能发生改变。mtDNA为母系遗传,后代细胞中所含mtDNA,一般来自母亲。
mtDNA的突变可在体细胞中积累。已发现有多种人类遗传性疾病与mtDNA的突变有关。例如:(1)位于mtDNA 12S rRNA的基因MTRNR1的m.1555A>G和m.1494C>T突变可导致氨基糖甙类抗生素耳聋;(2)m.8344A>G、m.3243A>G等可导致Leigh综合征;(3)mtDNA突变是Leber遗传性视神经病(LHON)发病的分子基础。已报道有10个与LHON相关的原发突变,其中,m.11778G>A、m.3460G>A和基因m.14484T>C,这3种点突变占95%以上。
mtDNA缺失引起的三种典型表型为Kearns-Sayre综合征(KSS),Pearson综合征和进行性眼外肌麻痹(PEO),以及很罕见的Leigh综合征。但临床中线粒体缺失疾病患者经常表现为临床表型不完整或者相互之间有重叠,而不能被归类为任何一种典型综合征,使此类患者的临床诊断及治疗具有很大的挑战性。因此,开发线粒体缺失和单碱基变异诊断方法具有重要的临床意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少一个问题,本发明开发了一种基于MLPA-NGS原理进检测人线粒体DNA(mtDNA)上疾病相关多个重要突变和缺失的试剂盒,提供线粒体疾病的检测服务;具体地,上述试剂盒用于人mtDNA的拷贝数变异(CNV)和疾病相关重要变异位点(SNV)的检测。MLPA-NGS方法是一种将MLPA技术的原理与NGS技术原理相结合的方法,其建库过程遵循MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification)技术的原理,其测序过程遵循二代测序技术(NGS,Next-generation sequencing technology)的原理,可实现基因上SNV和CNV的准确分析,是一种高通量的MLPA方法。基于该MLPA-NGS方法,可多重地进行SNV和CNV的检测,从而开发出适用于人mtDNA的CNV和SNV的检测试剂盒。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一个方面是提供一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的组合物,其包括针对于人线粒体DNA的CNV探针组合物和与疾病相关的SNV探针组合物,所述CNV探针组合物包括分别设计于线粒体DNA的多个区域上的探针对,所述SNV探针组合物包括分别用于检测多个位点变异情况的探针组;其中,所述位点变异选自m.1555A>G、m.1494C>T、m.8344A>G、m.3243A>G、m.11778G>A、m.3460G>A、m.14484T>C中的至少一个,各所述探针对和探针组均分别包括左侧探针和右侧探针;其中,所述组合物还包括引物组合物,所述引物组合物为用于扩增连接后的探针的带有index序列的1对通用引物;所述左侧探针的5’端和所述右侧探针的3’端分别包含一段通用序列,其作为所述通用引物扩增时的结合序列。具体地,所述CNV探针组合物包括分别设计于线粒体DNA的27个区域上的探针对(每一CNV探针对包括两条探针),所述SNV探针组合物包含7个探针组(每一SNV探针组包括三条探针),位点变异为m.1555A>G、m.1494C>T、m.8344A>G、m.3243A>G、m.11778G>A、m.3460G>A和m.14484T>C。上述通用引物中的index序列用于区分不同的样本。
进一步地,所述CNV探针组包含用于结合模板DNA的如SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.54所示序列;所述SNV探针组包含用于结合模板DNA的如SEQ ID NO.55~SEQ ID NO.75所示序列,其中所述SNV探针组中左侧探针由分别针对野生型和突变型碱基的两条探针组成。每一所述SNV位点包含两种基因型:野生型和突变型,在测试完成后可给出突变型在所检测的SNV中的比例。
进一步地,上述各探针对中,右侧探针的5’端添加磷酸基团,以用于探针的连接。
进一步地,所述通用引物的序列如SEQ ID NO.76~SEQ ID NO.77所示,所述左侧探针的5’端的通用序列如SEQ ID NO.78所示,右侧探针的3’端的通用序列如SEQ ID NO.79所示。具体地,参与反应的探针整体序列为:左侧探针:5’-通用序列-结合模板DNA序列-3’,右侧探针:5’-结合模板DNA序列-通用序列-3’。
可理解的是,上述CNV探针和SNV探针的选择及设计中,基于同样的MLPA-NGS方法,如果更换CNV或SNV位点在线粒体上设计新的探针,不应视为对本发明所记载的探针的本质改变。
本发明的第二个方面是提供一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的试剂盒,其包含如本发明的第一个方面中任一所述的用于检测线粒体DNA变异的组合物。
具体地,采用所述组合物制备的试剂盒可用于检测以下疾病中的至少一种;氨基糖甙类抗生素耳聋、Leigh综合征、Leber遗传性视神经病、Kearns-Sayre综合征、Pearson综合征、进行性眼外肌麻痹。
进一步地,在上述试剂盒中,所述CNV探针组合物和SNV探针组合物混合获得探针工作液,所述探针工作液中每条探针浓度为0.2~20fmol/μL。具体地,所有的SNV和CNV探针取适量混合,配制为每条探针浓度为0.2-20fmol/μL的混合液,依测试结果优化浓度,确定最优的探针工作液。具体地,所述探针工作液的最优浓度为2fmol/μL。
进一步地,在上述试剂盒中,所述引物组合物中,每一通用引物的配制浓度为2~200pMol。具体地,优选5~40pMol,更优选20pMol的浓度,每一引物各自配制而不加混合,只在扩增不同样本的探针连接产物时,上下游引物进行不同的组合,以获得带有不同index、可区分样本的产物。
进一步地,所述试剂盒还包括MLPA缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、PCR缓冲液、dNTP、PCR酶中的至少一种。
进一步地,所述试剂盒中各组分的用量包括:50-250ng DNA样品5μL,MLPA缓冲液1.5μL,探针工作液1.5μL;连接酶缓冲液6μL,连接酶1μL;PCR缓冲液5μL,dNTP4μL,PCR酶0.25μL,上下游通用引物各1μL。
可理解的是,在上述试剂盒中,对所用试剂及其浓度、用量等可进行适当的改变,其均不视为对上述试剂盒的本质改变。
进一步地,在上述试剂盒中,每一CNV探针对和每一SNV探针组均各自具有1~4段用于该SNV或CNV检测的特征性序列,具体地为2段特征性序列;各所述探针对或探针组分别包括左侧探针和右侧探针,所述特征性序列分别为从左侧探针非通用引物结合区域的左部、左侧探针与右侧探针连接位置左右各截取的具有预定长度的碱基序列;其中,所述特征性序列的序列长度为10-30个碱基,具体地序列长度为12-24个碱基,所述特征性序列相互之间至少间隔一个碱基(例如间隔2~20个,具体为间隔3个、4个、5个……19个、20个碱基等)。在一具体实施方案中,每对探针的特异序列包含二段,第一段为从左侧探针与模板结合区域的左部取12个碱基,第二段为左侧探针与右侧探针连接位置左右分别取6个和12个碱基(对于CNV,即总长为18个碱基)或者各取12个碱基(对于SNV,即总长为24个碱基)。
具体地,使用上述试剂盒对受检者进行MLPA-NGS检测后,为了分析各个SNV或CNV的等位基因型在fastQ文件中的reads数,需先设计相应探针的如上所述的特征性序列。在一具体实施方案中,每一SNV探针组分别包含两组特征性序列,每组特征性序列针对SNV的两个等位基因,每组特征性序列包含两段,长度分别为12和24个碱基;两个等位基因的两小组探针特征性序列,仅在第二段特异序列有一个碱基的差异。上述构成了全部检测位点的特征性序列,如将包含简并碱基的一个SNV的探针视为两组探针,则任意一组特征性序列,与相应的探针是一一对应的。每一CNV探针对仅有包括两段的一组特征性序列,长度分别为12和18个碱基。
可理解的是,在进行特征性序列设计时,可对序列的数量、长度、位置等进行适当调整,在保证对扩增产物分析的前提下,其应不视为对本发明所记载的特征性序列的本质改变。
基于上述探针序列、引物序列等源自Illumina二代测序的接头序列,扩增本身也是Illumina上机前的建库过程。可理解的是,也可进行调整采用其他合适的高通量测序平台;例如Roche/454测序平台、ABI SOLiD测序平台、Ion Torrent测序平台、CG测序平台等。
上述试剂盒涉及的序列信息如下表所示:
表1–探针、引物及特征性序列信息表
本发明的第三个方面是提供如本发明的第二个方面中任一所述的试剂盒的使用方法,其包括步骤:DNA样品变性;SNV探针组合物和CNV探针组合物与DNA样品进行探针杂交;采用连接酶和连接酶缓冲液进行杂交探针的连接;将探针连接产物与引物组合物进行PCR扩增;将PCR扩增产物测序,获得测序结果。
进一步地,上述试剂盒的使用方法具体包括步骤:
步骤S1、DNA变性和探针杂交:将DNA样品进行变性操作;将MLPA缓冲液与探针工作液充分混合,进行杂交反应,反应程序为:95℃2min,65℃至55℃,每降一度孵育1小时,然后在54℃保持3-10小时,获得杂交产物;
步骤S2、配制含有连接酶缓冲液的连接酶主液,将连接酶加入所述连接酶主液并混匀,54℃加热1分钟,于54℃恒温下加入所述杂交产物中混匀,继续孵育25分钟,于98℃加热5分钟,并冷却至20℃暂停,实现杂交探针的连接,获得连接产物;
步骤S3、将所述连接产物与PCR反应液进行PCR扩增反应,所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dNTP、带有index的上下游通用引物、Taq酶,反应条件为:95℃30s,60℃30s,72℃60s,35个循环;72℃孵育20min,最后15℃孵育,获得PCR扩增产物;
步骤S4、从每个所述PCR扩增产物中各取适量样本,混合均匀,送NGS测序仪上测序,获得测序结果(具体为fastQ文件)。
在一具体实施方案中,上述试剂盒的使用方法可为:(1)第一天进行DNA变性和探针杂交,其方法是:将5微升DNA样品(50-250ng)加到PCR管中,98℃变性5分钟,冷却至25℃取出;将MLPA缓冲液(来自MRC-Holland公司)1.5μL与探针工作液1.5μL混合,加入样品管,充分混合;(2)继续热循环程序:95℃2min,65℃至55℃,每降一度孵育1小时,然后在54℃保持3-10小时;(3)第二天,配制连接酶-65主液:每个反应各含25μL dH2O+3μL连接酶缓冲液B+3μL连接酶缓冲液A,然后加入1μL连接酶-65酶,移液器轻轻吹打混合均匀;缓冲液A、B及连接酶-65均来自MRC-Holland公司;将混合物置PCR仪(54℃)加热1分钟,然后于54℃恒温下加入正在孵育的PCR管,混匀,继续孵育25分钟;(4)将上述反应于98℃加热5分钟,并冷却至20℃暂停,取出PCR管;(5)在进行PCR扩增时,所用PCR酶为来自Takara的HS Taq酶;50μLPCR反应液中包括以下成分:5μL反应缓冲液,4μL dNTP,带有index的上下游通用引物(20pMol)各1μL,连接产物10μL,酶0.25μL,加水补充到50μL;反应条件为:95℃30s,60℃30s,72℃60s,35个循环;72℃孵育20min,最后15℃孵育;(6)从每个PCR扩增产物中各取适量样本,混合均匀,冷冻保存,送Illumina公司生产的NGS测序仪上测序,获得测序的fastQ文件。
可理解的是,在上述使用方法中,对所用试剂、温度、孵育时间、测序仪器等可进行适当的调整,在不影响检测分析的前提下,应均不视为对上述试剂盒使用方法的本质改变。
进一步地,在上述使用方法中,每一探针对和每一探针组均具有用于线粒体检测的特征性序列,相关特征性序列的设计及其序列信息详见前述的本发明的第一个方面。
进一步地,在上述使用方法中,还包括根据所述测序结果进行结果分析的步骤,进行以下分析中的至少一种:分析探针reads数、确定SNV比例、判断线粒体DNA的CNV情况。
进一步地,在上述使用方法中,当用于分析探针reads数和确定SNV比例时,其包括步骤:以每对探针的1~4段(具体为2段)特征性序列的组合为待查找文本,统计含有每个待查文本的reads的数量(以fastQ文件中的每个reads为查找对象,以python中正则表达式的findall为查找函数);其中,对于每个SNV,如果两种等位基因的reads数的和小于100,视为质量不合格,不予分析;通过质控的SNV,每个样本以检测位点突变型reads除以位点SNV的总reads,得到该样本SNV的分型值,所述分型值的取值范围是[0,1]。
更进一步地,当用于确定SNV比例时,SNV的计算方式是:某样本的SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值,如果为正值,且与标准差的比值大于2,则在95.45%的置信区间,该样本的SNV存在变异,变异比例是SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值;如果为正值,且与标准差的比值大于3,则在99.73%的置信区间,该样本的SNV存在变异,变异比例是SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值。
进一步地,在上述使用方法中,当用于判断线粒体DNA是否存在CNV时,需将待测样本的每个CNV的reads与已知阴性样本的对应CNV的reads相比,计算比值之间是否存在大于一定范围的变化,上述变化在相邻的CNV位点之间是否有共性关系,以此判断线粒体DNA上是否存在CNV。
更进一步地,当用于判断线粒体DNA是否存在CNV时,将待测样本的每个CNV的reads与已知阴性样本的对应CNV的reads相比,得到待测样本的比值,将任意两个或多个在位置上相邻的比值与该样本的全部比值之间进行t检验(双尾,异方差),检验水准:α=0.01,小于该值视为差异显著,判断为存在CNV。另外,在判断单个位点是否存在CNV,则将该处CNV的比值与平均值相减的绝对值与标准差相比,如大于3个标准差,则视为存在CNV。但由于探针受SNV的影响比较大,在判断单个位点的CNV时,应排除SNV的干扰。
可理解的是,本发明并不局限于基于MLPA-NGS原理设计的线粒体当前检测的CNV和SNV。基于MLPA-NGS原理设计的用于线粒体上其它CNV和SNV,如遵循了同样的方法,其不视为对上述分析方法的本质改变。
本发明的第四个方面提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的组合物、或如本发明的第二个方面中任一所述的试剂盒的应用,其采用所述试剂盒测试待检测者线粒体DNA样本,进行MLPA-NGS检测。
进一步地,在上述应用中,通过MLPA-NGS检测获得下述结果中的至少一种:探针reads数、SNV分型、CNV情况。
进一步地,在上述应用中,DNA样本的制备包括:采集外周血,使用血液DNA提取试剂盒制备DNA样本。可理解的是,也可采用其他形式的样本。具体地,提取全血样本或其它材质中的基因组DNA(gDNA)。
可理解的是,上述结果的分析可为非诊断目的,用于获得相关分析的中间结果。
与现有技术相比,本发明采用上述技术方案具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于线粒体DNA的CNV检测和疾病相关的多个SNV检测的基于MLPA-NGS原理的试剂盒及其分析方法。上述试剂盒是由探针工作液、MLPA缓冲液、耐高温连接液、通用引物、PCR反应液等组成,其操作过程与MLPA技术类似。对于测序后获得的fastQ文件,可进行自动分析。分析内容包括:SNV分型、CNV检测。上述试剂盒通过二代测序的方法检测,检测信息量大,对SNV和CNV检测的灵敏度高,试剂成本低,操作简便,对操作人员技能要求低,便于大规模推广。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明一实施例中MLPA-NGS方法用于SNV检测的探针特点的示意图;
图2是本发明一实施例中以10号样品为对照、以9号样品为例进行的CNV分析的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料,均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准,则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明,否则所有的份数为重量份,所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明,本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限定。
下述实施例中,基于MLPA-NGS方法进行人线粒体DNA的拷贝数变异(CNV)和疾病相关重要变异位点(SNV)的检测的设计思路简述如下:首先提取全血样本或其它材质中的基因组DNA(gDNA),由于mtDNA与基因组DNA没有本质区别,因此会被一同提取出来,对提取的gDNA进行MLPA-NGS操作,包括解链、模板与探针的孵育、探针连接、连接探针的扩增,然后对扩增产物进行高通量测序,使用自行编写的程序对测序结果进行突变位点和CNV的分析,以给出检测位点的变异情况。
在设计SNV探针时,其检测SNV的模式如图1所示,SNV设计原理是:对于野生型和突变型等位基因分别为A和G的某SNV,探针上设计的简并碱基分别与模板上对应的T和C杂交时,可成功连接;如模板上不匹配,则不能成功连接或连接的比例较低,以此原理检测SNV。
实施例1-试剂盒的设计及使用
本实施例设计一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的试剂盒,并说明该检测试剂盒的操作方法,上述设计具体包括:
(1)血液样本的gDNA提取;
血液样本提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型,货号DP318),其标准流程是:使用前在缓冲液GD和漂洗液PW中按说明书加入无水乙醇,并于瓶子上张贴已加乙醇的标签。
1)将1.5毫升外周血加到5毫升红细胞裂解液中,4度放置10分钟。期间颠倒混匀几次。1200RPM离心10分钟,去上清。注意观察管子底部白细胞数量。
2)加入20微升蛋白酶K溶液,混匀。
3)加200微升缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10分钟,其间颠倒混匀数次,溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮,请延长裂解时间至溶液清亮为止)。
4)加200微升无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中),12000RPM(13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000RPM(13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700微升漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000RPM(13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500微升漂洗液PW,12000RPM(13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中,12000RPM(13,400xg)离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加100微升洗脱缓冲液TB,室温放置2~5分钟,12000RPM(13,400xg)离心2分钟,将溶液收集到离心管中。
11)丢弃吸附柱。将离心管标记清楚,
测量DNA浓度,-80度保持DNA样本。
(2)mtDNA突变检测探针工作液的配制
遵循MLPA-NGS技术的原理,为每个待测的位点和区段各设计一对或一组探针。每对探针或每组探针包括左侧探针(L表示)和右侧探针(R表示),两条探针结合到模板上,无缝相邻。探针设计完成,在合成时于右侧探针5’端添加磷酸基团。
由于D-loop区域存在大量变异,故不在此区域设计CNV探针。所设计的CNV探针组合物中与模板结合的探针对序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.54所示。所述探针序列中,左侧探针(L探针)的5’端有一段通用序列:5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ IDNO.78),右侧探针(R探针)的3’端有一段通用序列:5'-TCCAACCCTTAGGGAACCCCGATC-3'(SEQID NO.79),以便进行扩增。
所设计的SNV探针组合物中与模板结合的探针组序列如SEQ ID NO.55~SEQ IDNO.75所示。每一SNV探针组包括三条探针,其左侧探针由分别针对野生型和突变型碱基的两条探针组成。所述探针序列中,左侧探针(L探针)的5’端有一段通用序列:5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO.78),右侧探针(R探针)的3’端有一段通用序列:5'-TCCAACCCTTAGGGAACCCCGATC-3'(SEQ ID NO.79),以便进行扩增。
每一CNV探针和SNV探针合成后,加蒸馏水溶解混合,配制为每条探针浓度为0.2-20fmol/uL的混合液,依测试结果优化浓度(最优浓度为2fmol/uL),作为探针工作液。
(3)设计探针的分析序列(特征性序列)
相邻探针完成连接、扩增和测序后,获得测序结果。测序结果以fastQ文件的方式存在,文件包含了每个被测片段的序列及相关信息,这些序列即为reads。为了分析所设计探针扩增后的reads数,使用探针的特征性序列在fastQ文件中搜索。fastQ文件中,凡是包含了这些特异序列的reads,即归类为该探针并计数。每对探针的特异序列包含二段,第一段为从左侧探针与模板结合区域的左部取12个碱基,第二段为左侧探针与右侧探针连接位置左右分别取6个和12个碱基(对于CNV,即总长为18个碱基)或者各取12个碱基(对于SNV,即总长为24个碱基)。两段序列相互之间至少间隔一个碱基。相关的特征性序列信息见表1的特征性序列信息部分。
(4)试剂盒的实验操作流程;
文库制备步骤如下:
第一天进行DNA变性和探针杂交,其方法是:将5微升DNA样品(50-250ng)加到PCR管中,98℃变性5分钟,冷却至25℃取出。将MLPA缓冲液(来自MRC-Holland公司)1.5μL与上述自制探针工作液1.5μL混合,加入样品管,充分混合。继续热循环程序:95℃2min,65℃至55℃,每降一度孵育1小时,然后在54℃保持3-10小时。第二天,配制连接酶-65主液:每个反应各含25μL dH2O+3μL连接酶缓冲液B+3μL连接酶缓冲液A,然后加入1μL连接酶-65酶,移液器轻轻吹打混合均匀。缓冲液A、B及连接酶-65均来自MRC-Holland公司。将混合物置PCR仪(54℃)加热1分钟,然后于54℃恒温下加入正在孵育的PCR管,混匀,继续孵育25分钟。将上述反应于98℃加热5分钟,并冷却至20℃暂停。取出PCR管。
在进行PCR扩增时,所用PCR酶为来自Takara的HS Taq酶(货号:R007Q)。50uL PCR反应液中包括以下成分:5uL反应缓冲液,4uL dNTP,上下游引物(20pMol)各1uL,连接产物10uL,酶0.25uL,加水补充到50uL。上游引物的序列和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77所示,两条引物中的poly(N)为index序列,以区分样本。反应条件为:95℃30s,60℃30s,72℃60s,35个循环;72℃孵育20min,最后15℃孵育。从每个PCR扩增产物中各取适量样本,混合均匀,冷冻保存,送南京诺禾致源生物科技有限公司进行测序,使用Qubit2.0对文库浓度进行初步定量,使用Agilent 2100检测文库DNA片段的完整性及***片段大小,使用Illumina高通量测序仪(如HiSeq2500/HiSeq4000/HiSeqX/MiSeq)进行双端150bp测序,获得测序的fastQ文件。
实施例2–试剂盒测序结果的分析
本实施例对实施例1中获得的fastQ文件进行相应的结果分析;测序公司发送过来的测序结果一般为压缩文件,解压后正向测序文件>0.1G。在进行分析时,以解压缩的正向测序文件为分析文件,其分析步骤具体包括:
以每对探针的两段特征性序列的组合为待查找的文本,以fastQ文件中的每个reads为查找对象,以python中正则表达式的findall为查找函数,统计含有每个待查文本的reads的数量。
对于每个SNV,如果两种等位基因的reads数的和小于100,视为质量不合格,不予分析;通过质控的SNV,每个样本以突变型reads除以该样本SNV的总reads,得到该样本SNV的分型值,分型值的取值范围是[0,1]。取阴性样品,求得的每个SNV的平均值加减标准差,即该SNV的阴性时的正常范围。数据结果显示,在阴性样本中,该分型值的平均值一般小于0.05。
SNV的计算方式是:某样本的SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值,如果为正值,且与标准差的比值大于2,则在95.45%的置信区间,该样本的SNV存在变异,变异比例是SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值;如果为正值,且与标准差的比值大于3,则在99.73%的置信区间,该样本的SNV存在变异,变异比例是SNV的分型值减去阴性样本的平均分型值。
在进行线粒体的CNV判断时,为了确定一个位点或在位置上连续的位点之间是否存在CNV,可将待测样本与阴性样本的对应位点CNV一一计算比值,对于比值之间是否存在大于一定范围的变化,上述变化在位置连续的位点之间是否有共性关系,具体方法是:将待测样本的每个CNV的reads与已知阴性样本的对应CNV的reads相比,得到待测样本的比值。将任意两个或多个在位置上相邻的比值与该样本的全部比值之间进行t检验(双尾,异方差),检验水准:α=0.01,小于该值视为差异显著,判断为存在CNV。如判断单个位点是否存在CNV,则将该处CNV的比值与平均值相减的绝对值与标准差相比,如大于3个标准差,则视为存在CNV。但由于探针受SNV的影响比较大,在判断单个位点的CNV时,应十分谨慎,应排除SNV的干扰。
实施例3–试剂盒的分析方法的验证
本实施例采用某些样本对实施例2中的分析方法进行验证,具体为采用通过捕获测序的已知临床信息的样本进行测试,如下:样本1存在m.1555A>G;样本2m.1494C>T;样本3m.8344A>G;样本4m.3243A>G;样本5m.11778G>A;样本6m.3460G>A;样本7m.14484T>C;样本8m:7503-15621区域缺失;样本9阴性;样本10阴性。所有样本来自医院保存的样本库,是由来医院就诊的患者所签署了知情同意书的。知情同意书事先得到了医院伦理委员会的批准。
上述样本的分析结果如下:
(1)基本统计:10例样品(mtDNA-1~10)的mtDNA进行建库测序,进行基本统计,从结果上看,目标区域的有效reads占比大于80%,有效数据大于80MB,平均深度大于5000x,结果符合检测需求。
测序全部reads | 可分析reads | 可分析比例 | |
样本1 | 511037 | 413940 | 81% |
样本2 | 470899 | 390846 | 83% |
样本3 | 449700 | 368754 | 82% |
样本4 | 436772 | 375624 | 86% |
样本5 | 596945 | 501434 | 84% |
样本6 | 525360 | 462317 | 88% |
样本7 | 565072 | 485962 | 86% |
样本8 | 469486 | 389674 | 83% |
样本9 | 536725 | 456217 | 85% |
样本10 | 543920 | 446015 | 82% |
分析之后发现,每个样本的CNV测序深度>5000×;可通过index归属至具体检测位点的index比例>80%。
(2)SNV、CNV分析与样品报告比较;
采用现有技术中的捕获+NGS分析方法进行对比(送上海金域医学检验所检测结果),10例样品的MLPA-NGS分析结果及其同捕获结果对比情况如下表所示。
由上表可知,2例阴性样品检测结果SNV与CNV仍为阴性,结果一致;7例点突变样品检测结果与捕获方法一致,突变比例虽然有变化,但误差在许可范围内;1例缺失样本的CNV分析的两种算法结果不一致,捕获+NGS结果为7503-15621区域缺失,MLPA-NGS结果显示缺失,缺失位置为7617-15071,这是由于MLPA-NGS所设计的CNV探针位置是不连续的,仅能展示探针所在位置的变异情况。因此,认定上述两种方法结果基本一致,可信程度较高。
以10号样品为对照,进行各个样本的线粒体DNA分析。以其中一个样本,9号样品为例,其CNV分析结果如图2所示。每个位点的CNV变异范围在30%以内,符合质控要求。
由上述实施例可知,本发明所开发的用于检测人线粒体DNA(mtDNA)各区段拷贝数变异(CNV)及多个突变位点(SNV)的试剂盒,可采用自制的程序进行数据分析,得到人mtDNA各疾病相关SNV和各区段CNV的测序情况。与已有的线粒体突变与拷贝数的方法(如:邢金良,莫钦钦,郭姗姗:一种基于NGS同时检测mtDNA拷贝数和突变的方法(申请号:201910576636.3))相比,本发明涉及的方法可以检测线粒体DNA中区段的缺失或增加,而不仅仅是线粒体DNA相对于基因组DNA的拷贝数变化。基于捕获法或者扩增法,都会导致目标片段之间拷贝数相对于模板的的巨大变动,导致对CNV检测的失真。而MLPA是公认的CNV检测的金标准,基于MLPA发展起来的MLPA-NGS技术,继承了MLPA对CNV的检测能力,在精度上要高于现有的其它NGS建库方法。在突变检测方面,与已有的捕获法或PCR扩增法(例如:潘石,玄伟,李璐璐,王其成,林彬,钱海峰,孙之彬,宋金宇:一种用于人类线粒体全基因组检测的引物、方法和试剂盒(申请号201911286581.9))相比,本发明所述的方法检测目标明确、在同样的测序量条件下可得到更精确的数据。而仅检测确定位点,不检测目标之外的位点,不被意外突变的致病性所困扰,则有利于进行医疗器械注册证的申报工作。总之,其检测方法操作简单,成本低廉、可信度高,是进行人mtDNA SNV和CNV检测的良好工具。
以上所述仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的组合物,其特征在于,所述组合物包括针对于人线粒体DNA的CNV探针组合物和与疾病相关的SNV探针组合物,所述CNV探针组合物包括分别设计于线粒体DNA的多个区域上的探针对,所述SNV探针组合物包括分别用于检测多个位点变异情况的探针组;其中,所述位点变异选自m.1555A>G、m.1494C>T、m.8344A>G、m.3243A>G、m.11778G>A、m.3460G>A、m.14484T>C中的至少一个,各所述探针对和探针组均分别包括左侧探针和右侧探针;其中,所述组合物还包括引物组合物,所述引物组合物为用于扩增连接后的探针的带有index序列的1对通用引物;所述左侧探针的5’端和所述右侧探针的3’端分别包含一段通用序列,其作为所述通用引物扩增时的结合序列。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述CNV探针组合物包含用于结合模板DNA的如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.54所示序列;所述SNV探针组合物包含用于结合模板DNA的如SEQ ID NO.55~SEQ ID NO.75所示序列,其中各所述SNV探针组中左侧探针由分别针对野生型和突变型碱基的两条探针组成。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述通用引物的序列如SEQ ID NO.76~SEQ ID NO.77所示,所述左侧探针的5’端的通用序列如SEQ ID NO.78所示,右侧探针的3’端的通用序列如SEQ ID NO.79所示。
4.一种基于MLPA-NGS方法用于检测线粒体DNA变异的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含如权利要求1~3中任一项所述的用于检测线粒体DNA变异的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述CNV探针组合物和SNV探针组合物混合获得探针工作液,所述探针工作液中每条探针浓度为0.2~20fmol/μL;和/或,所述引物组合物中,每一通用引物的配制浓度为2~200pMol;和/或,所述试剂盒还包括MLPA缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、PCR缓冲液、dNTP、PCR酶中的至少一种。
6.一种如权利要求4~5中的任一项所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括步骤:
步骤S1、DNA变性和探针杂交:将DNA样品进行变性操作;将MLPA缓冲液与探针工作液充分混合,进行杂交反应,反应程序为:95℃2min,65℃至55℃,每降一度孵育1小时,然后在54℃保持3-10小时,获得杂交产物;
步骤S2、配制含有连接酶缓冲液的连接酶主液,将连接酶加入所述连接酶主液并混匀,54℃加热1分钟,于54℃恒温下加入所述杂交产物中混匀,继续孵育25分钟,于98℃加热5分钟,并冷却至20℃暂停,实现杂交探针的连接,获得连接产物;
步骤S3、将所述连接产物与PCR反应液进行PCR扩增反应,所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液、dNTP、带有index的上下游通用引物、Taq酶,反应条件为:95℃30s,60℃30s,72℃60s,35个循环;72℃孵育20min,最后15℃孵育,获得PCR扩增产物;
步骤S4、从每个所述PCR扩增产物中各取适量样本,混合均匀,送NGS测序仪上测序,获得测序结果。
7.根据权利要求6所述的使用方法,其特征在于,每一CNV探针对和每一SNV探针组均各自具有1~4段用于位点识别的特征性序列;各所述探针对或探针组分别包括左侧探针和右侧探针,所述特征性序列分别为从左侧探针非通用引物结合区域的左部、左侧探针与右侧探针连接位置左右部各截取具有预定长度的碱基序列;其中,所述特征性序列的序列长度为10-30个碱基,所述特征性序列相互之间至少间隔一个碱基,每组特征性序列唯一对应于一对探针。
8.根据权利要求6所述的使用方法,其特征在于,还包括根据所述测序结果进行结果分析的步骤,进行以下分析中的至少一种:分析探针reads数、确定SNV比例、判断线粒体DNA的CNV情况。
9.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,当用于分析探针reads数和确定SNV比例时,其包括步骤:以每对探针的1~4段特征性序列的组合为待查找文本,统计含有每个待查文本的reads的数量;其中,对于每个SNV,如果两种等位基因的reads数的和小于100,视为质量不合格,不予分析;通过质控的SNV,每个样本以检测位点突变型reads除以位点SNV的总reads,得到该样本SNV的分型值,所述分型值的取值范围是[0,1];
和/或,当用于判断线粒体DNA是否存在CNV时,需将待测样本的每个CNV的reads与已知阴性样本的对应CNV的reads相比,使用统计学方法计算比值之间是否存在大于一定范围的变化,上述变化在连续的位点之间是否有有统计学意义的共减少或共增加的共性关系,以此判断线粒体DNA上是否存在CNV。
10.一种如权利要求1~3中的任一项所述的组合物、或如权利要求4~5中的任一项所述的试剂盒的应用,其特征在于,采用所述试剂盒测试待检测者线粒体DNA样本,进行MLPA-NGS检测,获得下述结果中的至少一种:探针reads数、SNV分型、CNV情况。
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