CN114381515A - 一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种检测人类异常血红蛋白基因突变的试剂盒。本申请检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒包括检测8种异常α‑珠蛋白基因点突变的试剂A，和检测6种异常β‑珠蛋白基因点突变的试剂B；试剂A包括一组α珠蛋白特异性引物对和八条α珠蛋白突变位点特异性探针；试剂B包括两组β珠蛋白特异性引物对和五条β珠蛋白突变位点特异性探针。本申请检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒，能同时检测14种异常血红蛋白基因突变，检测位点更全面、效率更高、准确性高和重复性好。
Description
技术领域
本申请涉及人类异常血红蛋白基因检测技术领域，特别是涉及一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒。
背景技术
异常血红蛋白发病机理是由于珠蛋白的一级结构发生改变，从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性血红蛋白病。正常血红蛋白内部氨基酸是非极性氨基酸，组成了亚基之间相互接触、血红素与珠蛋白链接触、珠蛋白链螺旋段间接触的位点；如果氨基酸的异常发生在分子内部，对血红蛋白的空间构像和功能的影响较大，临床表现明显。某些异常血红蛋白可以引起地中海贫血表型，其共同病理学机制是肽链结构改变或基因突变使受累珠蛋白链的表达量下降。但如果这种氨基酸的异常改变发生在血红蛋白分子外部，则对血红蛋白的影响较小，常没有明显的临床表现。目前所发现的异常血红蛋白中，绝大多数属于血红蛋白分子外部氨基酸发生替代，该类替代既不影响血红蛋白分子的稳定性，也不影响血红蛋白分子的功能，携带此类突变基因的患者通常没有明显的临床表现。
血红蛋白病给相关家庭和社会造成了严重的生理、心理和经济负担。血红蛋白病可分为地中海贫血(简称地贫)和异常血红蛋白两类。大多数异常血红蛋白并不引起临床表型，但仍有少数异常血红蛋白如Hb S、Hb E等可以单独存在或复合地中海贫血，引起明显的临床表现；并且，无症状的血红蛋白病也可能随着年龄增长而导致症状加重。
在全球已发现1300多种异常血红蛋白变异体，至少有44种可引起非缺失型α-地中海贫血。常见的主要有Hb Westmead、Hb CS、Hb QS和Hb E，这4种异常血红蛋白都是可引起α-或β-地中海贫血的Hb变异体。其他常见的异常血红蛋白还有Hb New York、Hb Q-Thailand和Hb J-Bangkok等；其中，Hb Q-Thailand是发生于α1基因且与-α4.2缺失连锁的一种变异。Hb Q-Thailand复合α0-地中海贫血杂合子可导致Hb H病，Hb New York和Hb J-Bangkok等异常血红蛋白一般不引起明显表型。另外，还有其他少见的异常血红蛋白，位于α珠蛋白基因簇及β珠蛋白基因簇上。血红蛋白病的主要类型为α和β地中海贫血，高发区的发病率可以达到4.4％-15.2％。现有研究对地贫基因的携带情况研究较多，但对异常血红蛋白的研究相对较少。目前境内已发现的80多种异常血红蛋白中，大多临床症状轻微甚至无临床症状；但是，当合并地贫时可能会表现出中到重度贫血；而目前缺少有效的治疗手段，患者只能依赖长期输血进行治疗，给家庭和社会都造成了沉重的负担。
临床上常用高效液相色谱和毛细管电泳方法，根据电泳时所出现的异常带位置对异常血红蛋白进行分组。但由于同一电泳区带内可包含多种血红蛋白，电泳技术不能区分其具体的类型，仍需要通过珠蛋白基因序列分析来鉴定。尤其是，大部分的异常血红蛋白并不影响其功能，或对功能的影响很小，只有一小部分的异常血红蛋白会导致相应的功能异常，因此，对电泳分析所出现的异常血红蛋白进行准确分型，以判断其具体性质，具有重要的现实意义。因此，对异常血红蛋白的基因分型，有助于增强和提高对异常血红蛋白的认识和重视，解决现实问题，对遗传咨询和临床处置也具有重要的参考价值。
目前，市场上检测异常血红蛋白基因的试剂盒较少；现有的试剂盒也只能够检测较少类型的部分异常血红蛋白基因，例如检测三种α珠蛋白基因Hb Westmead(WS)、HbConstantSpring(CS)和Hb QuongSze(QS)，或者检测β珠蛋白基因Hb E(CD26)。随着异常血红蛋白基因的深入研究和发展，以及血红蛋白电泳检测普及所发现的越来越多的异常血红蛋白条带，现有的检测方法和产品已经无法满足使用需求。
另外，针对α与β珠蛋白基因点突变的检测也有相关的研究报道，例如扩增阻碍突变***PCR(ARMS-PCR)、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)、PCR-反向点杂交(PCR-Reverse Dot Blot，PCR-RDB)法、DNA测序等。其中，扩增阻碍突变***PCR(ARMS-PCR)，是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)，可减少假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。PCR-反向点杂交(PCR-Reverse Dot Blot，PCR-RDB)法，这一方法具有灵敏度高、特异性好和通量高等优点，可同时检测WS、QS和CS三种突变类型，目前已广泛应用于α-地贫基因检测，但其人工操作繁琐，先进行PCR扩增α2珠蛋白基因，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，检测时间较长，降低了工作效率。同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。DNA测序技术，是先PCR扩增，再对PCR产物进行纯化、测序文库构建、上机测序，并对测序结果进行数据分析等；同样存在操作繁琐、耗时长、携带污染等问题。
总的来说，现有的针对异常血红蛋白基因点突变检测的方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，不能满足当前大规模人群筛查和临床常规检测的需要；并且，目前市场上也还没有一款可以更全面检测异常血红蛋白的试剂盒。因此，亟需研发一种能够满足大规模人群筛查和临床常规检测需要的多种常见异常血红蛋白基因分型技术方案。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒，其包括检测8种异常α-珠蛋白基因点突变的试剂A，和检测6种异常β-珠蛋白基因点突变的试剂B；其中，试剂A包括一组α珠蛋白特异性引物对和八条α珠蛋白突变位点特异性探针；一组α珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，八条α珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.3至Seq ID No.10所示序列；试剂B包括两组β珠蛋白特异性引物对和五条β珠蛋白突变位点特异性探针；两组β珠蛋白特异性引物对中，其中一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq IDNo.12所示序列；另一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；五条β珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.15至Seq ID No.19所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGGCACTCTTCTGGTCCCCACAG-3’；
Seq ID No.2：5’-CCACTCAGACTTTATTCAAAGAC-3’；
Seq ID No.3：5’-CCGACCTTACGCCAGGCGGCC-3’；
Seq ID No.4：5’-GCCTCACCTCTCCAGGGCCTC-3’；
Seq ID No.5：5’-AAGGACAGGAACATCCTGC-3’；
Seq ID No.6：5’-GGCATGCCNNNNNNNNNCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.7：5’-TTGGGCATNNNNNNNNNGTCCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.8：5’-CACCCGAAGCTTGTGCGC-3’；
Seq ID No.9：5’-GGAGGCGTGCACCGCAGGG-3’；
Seq ID No.10：5’-GGAGGTCAGCACGGCGCTCACA-3’；
Seq ID No.11：5’-GGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGG-3’；
Seq ID No.12：5’-AGGGTCCCATAGACTCACCCT-3’；
Seq ID No.13：5’-GGCCCTTTTGCTAATCATGTT-3’；
Seq ID No.14：5’-AAGGCCCTTCATAATATCCCC-3’；
Seq ID No.15：5’-AACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3’；
Seq ID No.16：5’-CTGTTATGGACAACCCNNNNNNNNNGTGAAG-3’；
Seq ID No.17：5’-CTGTTATNNNNNNNNNACCCTAAGGTGA-3’；
Seq ID No.18：5’-ACGTGGATCCTCAGAACTTCA-3’；
Seq ID No.19：5’-TGGGCCAG CTCACAGACC-3’；
其中，Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.16和Seq ID No.17所示序列的探针为拱桥探针，这四个探针中的“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列，使得这四个探针与靶标结合后呈拱桥形状；八条α珠蛋白突变位点特异性探针和五条β珠蛋白突变位点特异性探针的5’端都标记有相同或不同的荧光基团，3’端都标记有相同或不同的荧光淬灭基团。
需要说明的是，本申请的试剂盒主要由检测8种异常α-珠蛋白基因点突变的α珠蛋白特异性引物对和八条α珠蛋白突变位点特异性探针，以及检测6种异常β-珠蛋白基因点突变的β珠蛋白特异性引物对和五条β珠蛋白突变位点特异性探针组成。本申请的一种实现方式中，结合本申请的试剂盒和荧光探针熔解曲线技术，能够一次性的对CD15、CD30、CD34、CD74、CD75、CD90、CD121和CD134八种α-异常血红蛋白基因点突变，以及CD22-1、CD22-2、CD56、CD59、CD101和CD113六种β-异常血红蛋白基因点突变进行快速检测，即可以同时检测14种异常血红蛋白基因突变，与同类产品相比，本申请的试剂盒检测位点更全面、效率更高、自动化程度高，极大的提高了检测效率。本申请的试剂盒不仅能够更全面的检测异常血红蛋白，而且能够满足大规模人群筛查和临床常规基因检测的使用需求。
还需要说明的是，本申请检测的14种异常血红蛋白基因突变中，其中部分位点间隔较近，为了更好的区分两个距离较近的突变位点，本申请对部分位点设计了拱桥探针，例如Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.16和Seq ID No.17所示序列的探针。拱桥探针的主要原理是在探针中间连接一段与靶序列不匹配的序列，当探针与靶序列结合时，其不匹配的部分可以形成一个囊状结构，即呈拱桥形状；该囊状结构将两个临近的突变位点中的其中一个囊括其中；这样在通过靶基因熔解峰Tm检测另一个未被囊括的突变位点时，可以有效的避免临近突变位点的干扰，实现对距离较近的突变位点的准确判读。拱桥探针中连接的与靶序列不匹配的序列的具体碱基个数根据相邻两个突变位点的距离来定，一般该不匹配序列的长度在5-15bp左右。可以理解，如果不匹配序列的长度小于5bp，说明两个相邻的突变位点位置太过接近，已经难以通过拱桥探针的设计区分；如果不匹配序列的长度大于15bp，说明两个相邻突变位点的间隔已经比较大，可以直接针对两个突变位点设计常规的检测探针，而无需采用拱桥探针。并且，拱桥探针中不匹配序列的长度太长也会影响拱桥探针与靶标序列的正常结合。
本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括检测内参基因β-actin的内参特异性引物对和内参特异性探针，内参特异性引物对的上游引物为Seq ID No.20所示序列，下游引物为Seq ID No.21所示序列，内参特异性探针为Seq ID No.22所示序列；
Seq ID No.20：5’-GCTCCATCCTGGCCTCGC-3’；
Seq ID No.21：5’-CGTCCACCGCAAATGCTTCT-3’；
Seq ID No.22：5’-CGTCAACACCCCAGCCA-3’。
需要说明的是，Seq ID No.20和21所示序列的内参特异性引物对只是本申请的一种具体实现方式中采用的内参基因β-actin的特异性扩增引物对，不排除还可以采用其他的内参基因β-actin特异性引物对，甚至还可以采用其他内参基因及其检测引物。当然，本申请的一种实现方式中，具体是将内参基因引物对加入到检测8种α-异常血红蛋白基因点突变的试剂A中，和/或加入到检测6种β-异常血红蛋白基因点突变的试剂B中，进行多重PCR扩增，因此内参基因及其特异性引物对的选择还需要考虑对多重PCR扩增的影响。
本申请的一种实现方式中，Seq ID No.3所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.4所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.5所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.6所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.7所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.8所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.9所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.10所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.15所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.16所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.17所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.18所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.19所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.22所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1。
需要说明的是，本申请的一种实现方式中，检测8种α-异常血红蛋白基因点突变的试剂A是在一个PCR反应管中进行反应，检测6种β-异常血红蛋白基因点突变的试剂B是在另一个PCR反应管中进行反应；因此，原则上，同一PCR反应管内各探针标记的荧光基团需要不一样才能彼此区分，以上限定的具体荧光基团只是本申请的一种实现方式中具体采用的荧光基团，不排除还可以采用其他荧光基团，例如TET、JOE、CY3等，具体根据所使用的实时荧光PCR扩增仪进行选择。荧光淬灭基团也可以根据需求进行选择，在此不作具体限定。
还需要说明的是，在同一管反应中，如果两个靶标的熔解曲线峰值差距较大，这两个靶标的检测探针也可以采用相同的荧光基团；这样可以减少所需的荧光检测通道，对仪器的要求更低。此时，对于同一个荧光检测通道，可以获得两个或多个熔解曲线峰值。例如八条α珠蛋白突变位点特异性探针中，Seq ID No.3和Seq ID No.4的探针都是标记荧光基团CY5，在CY5荧光信号的检测通道中可以获得这两个靶标的熔解曲线峰值。
本申请的另一面公开了本申请的试剂盒在制备异常血红蛋白基因突变检测或血红蛋白病诊断的试剂中的应用。
可以理解，本申请的试剂盒本身就是针对8种α-异常血红蛋白基因点突变和6种β-异常血红蛋白基因点突变设计的特异性检测引物和探针，因此，可以用于制备异常血红蛋白基因突变检测的试剂，进而用于对血红蛋白病进行诊断。以上引物和探针，可以根据需求独立包装，例如以引物、探针的干粉形态作为产品，使用时再稀释，根据需求自行配制反应体系；也可以按照本申请的一种实现方式中给出的优选方案，将检测8种α-异常血红蛋白基因点突变的试剂A中的引物和探针组合在一起，形成一组反应体系，将检测6种β-异常血红蛋白基因点突变的试剂B中的引物和探针组合在一起，形成另一组反应体系，使用时，直接将反应体系分装到PCR管中，加入待测DNA和DNA聚合酶即可。
本申请的再一面公开了另一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒，其包括反应液I和反应液II；反应液I包括一组α珠蛋白特异性引物对、八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一组内参特异性引物对、一条内参特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；一组α珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，八条α珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.3至Seq ID No.10所示序列，一组内参特异性引物对的上游引物为Seq ID No.20所示序列，下游引物为Seq ID No.21所示序列，一条内参特异性探针为Seq ID No.22所示序列；反应液II包括两组β珠蛋白特异性引物对、五条β珠蛋白突变位点特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；两组β珠蛋白特异性引物对中，其中一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq IDNo.12所示序列；另一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；五条β珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.15至Seq ID No.19所示序列；其中，Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.16和Seq ID No.17所示序列的探针中的“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列；八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一条内参特异性探针和五条β珠蛋白突变位点特异性探针的5’端标记有相同或不同的荧光基团，3’端标记有相同或不同荧光淬灭基团。
需要说明的是，本申请检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒，实际上就将本申请检测异常血红蛋白基因突变的试剂，按照预先优化的反应体系，组装成反应液I和反应液II。其中，反应液I就是检测8种α-异常血红蛋白基因点突变的反应体系，反应液II即检测6种β-异常血红蛋白基因点突变的反应体系。因此，反应液I和反应液II中引物、探针的具体限定以及探针的荧光基团和荧光淬灭基团都可以参考本申请的试剂。
本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括反应液III，该反应液III为DNA聚合酶。
可以理解，DNA聚合酶可以根据需求选择性的加入本申请的试剂盒中，以方便使用；当然，DNA聚合物也可以自行购买现有产品，在此不作具体限定。
本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒包括试剂A阳性质控品和试剂B阳性质控品；所述试剂A阳性质控品为含有所述一组α珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的阳性质粒，且该阳性质粒中分别含有已知含量的基因型为CD15纯合的片段和已知含量的基因型为野生型的片段；试剂B阳性质控品为含有所述两组β珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的阳性质粒，且分别含有已知含量的基因型为CD113纯合的片段和已知含量的基因型为野生型的片段。
需要说明的是，本申请试剂A阳性质控品中使用的CD15纯合基因型还可以替换为8种α-异常血红蛋白基因点突变中的其它突变的纯合基因型，例如CD30纯合基因型、CD34纯合基因型、CD74纯合基因型、CD75纯合基因型、CD90纯合基因型、CD121纯合基因型或CD134纯合基因型，又或者这8种纯合基因型的任意组合。同样的，试剂B阳性质控品中使用的CD113纯合基因型也可以替换为6种β-异常血红蛋白基因点突变中的其它突变的纯化基因型，例如CD22-1纯合基因型、CD22-2纯合基因型、CD56纯合基因型、CD59纯合基因型或CD101纯合基因型，又或者这6种纯合基因型的任意组合。
本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括试剂A阴性质控品和试剂B阴性质控品，所述试剂A阴性质控品为含有所述一组α珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒；试剂B阴性质控品为含有所述两组β珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒。
可以理解，阳性质控品和阴性质控品主要是为了对反应体系进行质控，确保反应的正常进行以及结果判断的准确性和有效性；原则上，在实际的使用过程中，可以采用已知浓度和基因型的人工合成核酸或PCR扩增片段作为阳性对照或阴性对照，达到质控的目的；质粒主要是为了便于长期保存。因此，阳性质控品和阴性质控品也可以根据需求选择性的加入本申请的试剂盒中。
本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括空白对照，该空白对照为灭菌去离子水。
可以理解，灭菌去离子水空白对照也可以根据需求选择性的加入试剂盒中，也可以使用实验室常规使用的灭菌去离子水作为空白对照，在此不作具体限定。
本申请的有益效果在于：
本申请检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒，能够同时检测14种异常血红蛋白基因突变，检测位点更全面，效率更高，自动化程度高，提高了临床样本的检测效率；利用拱桥探针设计区分两个距离较近的点突变位点，区分度高，准确性高和重复性好。在本申请的一种使用方式中，结合PCR熔解曲线技术，直接通过不同通道出现的熔解峰及对应的Tm值进行突变位点判读，更直观；且可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，减少了样本污染的概率。本申请的试剂及试剂盒既能够更全面的检测异常血红蛋白，又能够满足大规模人群筛查和临床常规分子诊断的使用需求。
附图说明
图1是本申请实施例中拱桥探针的原理示意图；
图2是本申请实施例中A管试剂对CD74杂合与CD75杂合突变样本的检测结果；
图3是本申请实施例中A管试剂对CD34杂合与CD121杂合突变样本的检测结果；
图4是本申请实施例中A管试剂对CD90杂合与CD134杂合突变样本的检测结果；
图5是本申请实施例中A管试剂对CD15杂合与CD30杂合突变样本的检测结果；
图6是本申请实施例中B管试剂对CD22-1杂合与CD22-2杂合突变样本的检测结果；
图7是本申请实施例中B管试剂对CD56杂合与CD59杂合突变样本的检测结果；
图8是本申请实施例中B管试剂对CD101杂合突变样本的检测结果；
图9是本申请实施例中B管试剂对CD113杂合突变样本的检测结果。
具体实施方式
现有的异常血红蛋白基因突变检测技术存在操作要求条件高、方法繁琐、耗时长、难以实现自动化等不足，尚不能满足临床诊断简便快速的要求。并且，目前市场上还没有一款可以全面检测异常血红蛋白的产品。现有荧光探针熔解曲线技术方案中对于临近的单碱基突变位点的检测区分度较差，不同位点突变造成的熔点值(Tm值)变化的差异较小，造成结果判读时容易出现错判或无法区分临近的不同位点的突变情况。更重要的是，目前并没有关于异常血红蛋白基因突变熔解曲线技术的检索技术研究或报道。
因此，本申请采用荧光探针熔解曲线技术研发了一种快速、稳定的用于异常血红蛋白基因检测的试剂及试剂盒，实现通过一次试验即可同时检测8种α-珠蛋白基因点突变与6种β-珠蛋白基因点突变。同时本申请使用了拱桥探针，可防止SNP或者其他检测位点干扰靶基因熔解峰Tm值，实现对距离较近的突变位点的准确判读。
具体的，本申请的试剂包括检测8种α-异常血红蛋白基因点突变的试剂A，和检测6种β-异常血红蛋白基因点突变的试剂B；其中，试剂A包括一组α珠蛋白特异性引物对和八条α珠蛋白突变位点特异性探针；一组α珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，八条α珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq IDNo.3至Seq ID No.10所示序列；一组检测内参基因β-actin的内参特异性引物对和一条检测内参基因β-actin的内参特异性探针，一组特异性内参引物对的上游引物为Seq IDNo.20所示序列，下游引物为Seq ID No.21所示序列，一条特异性内参探针为Seq ID No.22所示序列；试剂B包括两组β珠蛋白特异性引物对和五条β珠蛋白突变位点特异性探针；两组β珠蛋白特异性引物对中，其中一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；另一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为SeqID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；五条β珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.15至Seq ID No.19所示序列；其中，探针中的“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列；八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一条内参特异性探针和五条β珠蛋白突变位点特异性探针的5’端都标记有相同或不同的荧光基团，3’端都标记有相同或不同的荧光淬灭基团。
本申请拱桥探针的主要原理是在探针中间连接一段与靶序列不匹配的碱基，当探针与靶序列结合时，其不匹配的部分可以形成一个囊状结构；囊状结构可以将靶标邻近的突变位点囊括进来，不与靶序列发生杂交，不会影响靶标的检测；拱桥探针的碱基个数根据两个突变位点距离来定，一般在5-15bp左右。具体原理如图1所示。
本申请熔解曲线技术的原理是：本申请中检测α-异常血红蛋白与β-异常血红蛋白的探针包括杂交探针及拱桥探针。熔解曲线技术的原理是利用特定的探针在PCR扩增完成后，与靶序列杂交形成的熔解曲线及熔点值(Tm)进行分析，检测探针覆盖区域是否存在碱基突变以及具体的突变类型。具体包括PCR扩增和熔解曲线分析，先是使用不对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔解曲线分析过程探针可与靶序列杂交，具体是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针***设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔解曲线分析。
本申请的试剂及试剂盒可同时检测8种α-异常血红蛋白基因点突变与6种β-异常血红蛋白基因点突变，结合荧光PCR-熔解曲线法，具有检测位点全面、操作简单、检测快速等优点；弥补了传统检测方法的不足，不仅增加了异常血红蛋白基因检测类型，而且简化了操作步骤，缩短检测异常血红蛋白基因的时间，为开展高效有力的遗传病检测提供较好的平台，能够更好的满足大规模人群筛查和临床常规分子诊断的使用需求。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
一、材料及方法
1.检测材料
本例对80例全血样本进行试验和检测；其中，60份为阳性样本，20份为阴性样本。
本例的全血样本采集和保存方法如下：
(1)所有样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA。
(2)样本采集：抽取静脉血1～5mL入含有抗凝剂的管中，标记样本信息。
(3)血样保存：抗凝全血室温放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一月，-30～-15℃保存不超过两年，-85～-75℃长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
(4)血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。
2.核酸提取
本例使用亚能公司的“核酸提取试剂”(粤深械备20150099号，粤深械备20200318号)提取80例全血样的基因组DNA。具体操作参考试剂盒使用说明。
对提取的80例全血样的基因组DNA进行DNA浓度和纯度的检测，具体采用核酸定量仪或紫外分光光度计，结果显示，本试验的80例全血样的浓度都在20-100ng/μL之间，纯度A260/280在1.6～2.2之间，能够满足后续检测需求。
3.引物、探针的设计及筛选
本例从GenBank数据库中获取人类珠蛋白基因序列，根据不同的缺失或突变类型，用Primer Premier 5和Oligo6.0设计相应的引物与探针序列。引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，均由上海英骏生物技术有限公司合成。本例具体的，针对CD15、CD30、CD34、CD74、CD75、CD90、CD121和CD134八种α-异常血红蛋白基因点突变，以及CD22-1、CD22-2、CD56、CD59、CD101和CD113六种β-异常血红蛋白基因点突变，设计特异性检测引物和探针，具体引物、探针序列和检测的突变位点如表1所示。
表1引物探针序列即检测突变位点
表1中，“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列，本例具体采用的是9个碱基可重复选自A,T,C,G四种碱基的随机序列。
8种α-异常血红蛋白基因点突变和6种β-异常血红蛋白基因点突变的详细信息如表2所示。
表2突变位点信息
4.阳性质控品和阴性质控品质粒构建
质粒通过人工合成碱基构建，具体由苏州金唯智生物技术有限公司完成。
选取α珠蛋白特异性引物对扩增靶标序列的基因型为CD15的纯合突变阳性质粒和基因型为野生型的质粒混合制备成试剂A的阳性质控品。
选取β珠蛋白特异性引物对扩增靶标序列的基因型为CD113的纯合突变阳性质粒和基因型为野生型的质粒混合制备成试剂B的阳性质控品。
选取α珠蛋白特异性引物对扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒作为试剂A的阴性质控品。
选取β珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒作为试剂B的阴性质控品。
5.PCR扩增及熔解曲线分析
本例将8种α-异常血红蛋白基因点突变的引物和探针，以及内参基因β-actin的内参特异性引物和探针加入到同一反应管中进行多靶标检测，标记为A管试剂；将6种β-异常血红蛋白基因点突变的引物和探针加入到同一反应管中进行多靶标检测，标记为B管试剂。两管试剂的PCR反应液体系如表3所示。
表3 PCR反应体系
按照表3配制的PCR反应体系，将配制好的A管试剂分装到一个96孔板中，每孔的量为20μL；将B管试剂分装到另一个96孔板中，每孔的量为20μL。将提取的80例全血样的基因组DNA，每个样本DNA对应一个孔，取5μL的DNA加入分装A管试剂的96孔板中；同样的，80例全血样的基因组DNA，每个样本DNA对应一个孔，取5μL的DNA加入分装B管试剂的96孔板中。即分别采用A管试剂和B管试剂对80例全血样的基因组DNA进行检测。每管试剂每个96孔板设置至少一个阳性质控品、一个阴性质控品、一个水空白对照。
将两个96孔板置于实时荧光PCR扩增仪Bio-Rad CFX96上进行反应和熔解曲线分析，反应条件为：95℃预变性5min；然后进入50个循环：95℃30sec、62℃20s、72℃30s；循环结束后，95℃变性5min；40℃复性10min；在40℃-90℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。
6.灵敏度试验
采用以上反应体系对8种α-点突变(CD15、CD30、CD34、CD74、CD75、CD90、CD121和CD134)与6种β-点突变(CD22-1、CD22-2、CD56、CD59、CD101和CD113)检测位点进行灵敏度分析。采用含有各基因型的基因组DNA样本进行稀释，稀释后的基因组DNA浓度为100ng/μL、50ng/μL、30ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL。采用“5.PCR扩增及熔解曲线分析”中的反应体系对7个稀释样本进行检测和熔解曲线分析。
7.特异性试验
分别对以下样本按照“2.核酸提取”的方法进行核酸提取：(1)临床正常计量枸橼酸钠、EDTA的全血样本，(2)服用去铁胺的病人的血液样本，(3)溶血样本，(4)脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L的血液样本，(5)3例G-6-PD血液样本，(6)1例缺铁性贫血样本，(7)1例感染弓形虫的全血样本，(8)1例乙肝病毒DNA血液样本。采用“5.PCR扩增及熔解曲线分析”中的反应体系对以上样本提取的核酸进行检测和熔解曲线分析。
二、检测结果
1.80例全血样本检测结果
本例对80例样本的检测结果显示，20份阴性样本只有内参基因β-actin的检测信号，没有其他信号；60份阳性样本的基因型与预期相符，准确率为100％。说明本例的引物和探针能够准确有效的对八种α-异常血红蛋白基因点突变和六种β-异常血红蛋白基因点突变进行检测。
2.阳性质控品和阴性质控品质粒构建结果
A管试剂阳性质控品的检测结果为CD15杂合，阴性质控的检测结果为野生型；B管试剂阳性质控品的检测结果为CD113杂合，阴性质控品的检测结果为野生型；与预期相符。
3.灵敏度试验结果
灵敏度试验结果显示，本实施例对各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为1ng/μL。
4.特异性试验结果
特异性检测结果显示，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA的全血样本提取的基因组DNA检测结果与不添加枸橼酸钠、EDTA的全血样本提取的基因组DNA检测结果相符。说明临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本例检测的干扰物质。
服用去铁胺的病人的血液样本提取基因组DNA进行检测的结果显示，去铁胺不是本例检测的干扰物质。
溶血样本的基因组DNA检测结果显示，溶血样本，即使是完全溶血也不会干扰本例的检测结果。
脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，的血液样本基因组DNA检测结果显示，甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度对本例检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本例的检测结果均无干扰，不是本例检测的干扰物质。
另外，对6例样本特异性检测中，前5例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即6例均无交叉反应；说明本例的引物和探针仅对设计的8种α-异常血红蛋白基因点突变与6种β-异常血红蛋白基因点突变进行特异性检测，不会受其他突变位点干扰。
实施例二
本例基于实施例一设计的引物和探针，结合PCR熔解曲线技术，构建了用于异常血红蛋白基因检测的试剂盒。具体如下：
【产品名称】
通用名称：异常血红蛋白基因检测试剂盒(荧光PCR-熔解曲线法)
英文名称：Abnormal Hemoglobin Genotyping Kit(Fluorescence PCR-MeltingCurve Analysis)
【包装规格】24人份/盒、48人份/盒
【用途】
本试剂盒用于在临床样本中，检测与异常血红蛋白相关的8种α-珠蛋白基因点突变与6种β-珠蛋白基因点突变，8种α珠蛋白基因点突变包括CD15、CD30、CD34、CD74、CD75、CD90、CD121、CD134。6种β-珠蛋白基因点突变包括CD22-1、CD22-2、CD56、CD59、CD101、CD113。
【检验原理】
本试剂盒是基于荧光PCR扩增和熔解曲线分析。
设计特异的PCR引物，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的缺失基因型。
其检测过程是使用不对称PCR进行扩增，富集单链靶序列，使熔解曲线分析过程探针可以与靶序列杂交，具体实施方式是在需要检测的区域设计相应的探针，并在设计好的探针***设计一条上游引物和一条下游引物，用该上游引物和下游引物扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔解曲线分析。
根据熔点值的大小及不同通道出现的熔解峰形状对模板的基因型作出判断。
【主要组成成份】
1.试剂盒主要成份
其中，反应液I包括一组α珠蛋白特异性引物对、八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一组内参特异性引物对、一条内参特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；各组分用量参考实施例一表3的“A管试剂”。反应液II包括两组β珠蛋白特异性引物对、五条β珠蛋白突变位点特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；各组分用量参考实施例一表3的“B管试剂”。
2.本检测需要用到的其他主要试剂
全血基因组DNA提取试剂：亚能生物技术(深圳)有限公司的“核酸提取试剂”(粤深械备20150099号，粤深械备20200318号)。
【储存条件及有效期】
储存条件：试剂盒置于-30～-15℃保存，避免反复冻融。
有效期：6个月。
【适用仪器】
本试剂盒适用于具有熔解曲线分析功能的实时荧光PCR扩增仪，如Bio-RadCFX96、Rotor-Gene LC480、SLAN96P/S。
【样本要求】
1.本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA。
2.样本采集：抽取静脉血1～5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。
3.血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2～8℃保存不超过一个月，-30～-15℃保存不超过两年，-85～-75℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
4.血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。
【检验方法】
全血DNA的提取：
推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的“核酸提取试剂”(粤深械备20150099号，粤深械备20200318号)提取人基因组DNA。
PCR前模板DNA浓度和纯度的测定可采用核酸定量仪或紫外分光光度计。本试剂盒要求待检基因组DNA的浓度为1-100ng/μL，纯度(A260/280)为1.6～2.2。
PCR扩增
从试剂盒中取出所有组分置于室温融化并振荡混匀，5000rpm离心5～10秒。先设置好同批实验的实验组别，取出八联管或96孔PCR板，标记好实验组、对照组。各管反应液需求量＝待检样本数N+1个阳性质控+1个阴性质控+1个空白对照，反应液可直接分装成20μL/份使用，而后向PCR反应液中加入已提取的待测样品DNA 5μL，反应总体系为25μL。
PCR按以下条件进行扩增：95℃预变性5min；然后进入50个循环：95℃30sec、62℃20s、72℃30s；循环结束后，95℃变性5min；40℃复性10min；40℃-90℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。
3.结果判读
【参考值】
各基因在4个通道的熔解峰的Tm值范围如下：
【检验结果的解释】
A管各突变样本典型检测结果如图2至图5所示，B管各突变样本典型检测结果如图6至图9所示。其中，图2为FAM荧光通道检测到的CD74杂合与CD75杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图3为HEX荧光通道检测到的CD34杂合与CD121杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图4为ROX荧光通道检测到的CD90杂合与CD134杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图5为CY5荧光通道检测到的CD15杂合与CD30杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图6为FAM荧光通道检测到的CD22-1杂合与CD22-2杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图7为HEX荧光通道检测到的CD56杂合与CD59杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图8为ROX荧光通道检测到的CD101杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型；图9为CY5荧光通道检测到的CD113杂合的熔解曲线，W表示野生型，M表示突变型。图2至图9的结果与前述“【参考值】”表格中的数值一致。
需要说明的是，以上表格的熔解峰Tm值、图2至图9，都是以试剂A阳性质控品、试剂A阴性质控品、试剂B阳性质控品和试剂B阴性质控品为检测对象，获得的典型的参考值和结果图。以上数值可以直接用于对待测样本进行结果判读。
【产品性能指标】
1.测定准确性
用60份临床阳性样本和20份临床阴性样本，结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。
2.分析灵敏度
使用本发明试剂盒对8种α-点突变与6种β-点突变检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为1ng/μL。
3.分析特异性
通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质。
用本产品检测6例本产品检测范围外的临床样本，包括3例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前5例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即6例均无交叉反应。
4.重复性
不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术（深圳）有限公司
<120> 一种检测异常血红蛋白基因突变的试剂盒
<130> 21I32520
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (10)
1.一种检测人类异常血红蛋白基因突变的试剂盒，其特征在于：包括检测8种异常α-珠蛋白基因点突变的试剂A，和检测6种异常β-珠蛋白基因点突变的试剂B；
所述试剂A包括一组α珠蛋白特异性引物对和八条α珠蛋白突变位点特异性探针；所述一组α珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述八条α珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.3至Seq ID No.10所示序列；
所述试剂B包括两组β珠蛋白特异性引物对和五条β珠蛋白突变位点特异性探针；所述两组β珠蛋白特异性引物对中，其中一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；另一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；所述五条β珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.15至Seq ID No.19所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGGCACTCTTCTGGTCCCCACAG-3’；
Seq ID No.2：5’-CCACTCAGACTTTATTCAAAGAC-3’；
Seq ID No.3：5’-CCGACCTTACGCCAGGCGGCC-3’；
Seq ID No.4：5’-GCCTCACCTCTCCAGGGCCTC-3’；
Seq ID No.5：5’-AAGGACAGGAACATCCTGC-3’；
Seq ID No.6：5’-GGCATGCCNNNNNNNNNCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.7：5’-TTGGGCATNNNNNNNNNGTCCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.8：5’-CACCCGAAGCTTGTGCGC-3’；
Seq ID No.9：5’-GGAGGCGTGCACCGCAGGG-3’；
Seq ID No.10：5’-GGAGGTCAGCACGGCGCTCACA-3’；
Seq ID No.11：5’-GGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGG-3’；
Seq ID No.12：5’-AGGGTCCCATAGACTCACCCT-3’；
Seq ID No.13：5’-GGCCCTTTTGCTAATCATGTT-3’；
Seq ID No.14：5’-AAGGCCCTTCATAATATCCCC-3’；
Seq ID No.15：5’-AACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3’；
Seq ID No.16：5’-CTGTTATGGACAACCCNNNNNNNNNGTGAAG-3’；
Seq ID No.17：5’-CTGTTATNNNNNNNNNACCCTAAGGTGA-3’；
Seq ID No.18：5’-ACGTGGATCCTCAGAACTTCA-3’；
Seq ID No.19：5’-TGGGCCAGCTCACAGACC-3’；
其中，Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.16和Seq ID No.17所示序列的探针为拱桥探针，这四个探针中的“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列，使得这四个探针与靶标结合后呈拱桥形状；八条α珠蛋白突变位点特异性探针和五条β珠蛋白突变位点特异性探针的5’端都标记有相同或不同的荧光基团，3’端都标记有相同或不同的荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括检测内参基因β-actin的内参特异性引物对和内参特异性探针，所述内参特异性引物对的上游引物为Seq ID No.20所示序列，下游引物为Seq ID No.21所示序列，内参特异性探针为Seq ID No.22所示序列；
Seq ID No.20：5’-GCTCCATCCTGGCCTCGC-3’；
Seq ID No.21：5’-CGTCCACCGCAAATGCTTCT-3’；
Seq ID No.22：5’-CGTCAACACCCCAGCCA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：Seq ID No.3所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.4所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.5所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.6所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.7所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.8所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.9所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.10所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.15所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.16所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.17所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.18所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.19所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.22所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒在制备异常血红蛋白基因突变检测的试剂中的应用。
5.一种检测人类异常血红蛋白基因突变的试剂盒，其特征在于：包括反应液I和反应液II；
所述反应液I包括一组α珠蛋白特异性引物对、八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一组内参特异性引物对、一条内参特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；
所述一组α珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为SeqID No.2所示序列，所述八条α珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.3至Seq IDNo.10所示序列，一组内参特异性引物对的上游引物为Seq ID No.20所示序列，下游引物为Seq ID No.21所示序列，一条内参特异性探针为Seq ID No.22所示序列；
所述反应液II包括两组β珠蛋白特异性引物对、五条β珠蛋白突变位点特异性探针、dNTPs和PCR反应缓冲液；
所述两组β珠蛋白特异性引物对中，其中一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为SeqID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；另一组β珠蛋白特异性引物对的上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；所述五条β珠蛋白突变位点特异性探针依序为Seq ID No.15至Seq ID No.19所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGGCACTCTTCTGGTCCCCACAG-3’；
Seq ID No.2：5’-CCACTCAGACTTTATTCAAAGAC-3’；
Seq ID No.3：5’-CCGACCTTACGCCAGGCGGCC-3’；
Seq ID No.4：5’-GCCTCACCTCTCCAGGGCCTC-3’；
Seq ID No.5：5’-AAGGACAGGAACATCCTGC-3’；
Seq ID No.6：5’-GGCATGCCNNNNNNNNNCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.7：5’-TTGGGCATNNNNNNNNNGTCCACGTGCGC-3’；
Seq ID No.8：5’-CACCCGAAGCTTGTGCGC-3’；
Seq ID No.9：5’-GGAGGCGTGCACCGCAGGG-3’；
Seq ID No.10：5’-GGAGGTCAGCACGGCGCTCACA-3’；
Seq ID No.11：5’-GGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGG-3’；
Seq ID No.12：5’-AGGGTCCCATAGACTCACCCT-3’；
Seq ID No.13：5’-GGCCCTTTTGCTAATCATGTT-3’；
Seq ID No.14：5’-AAGGCCCTTCATAATATCCCC-3’；
Seq ID No.15：5’-AACGTGGATGAAGTTGGTGGT-3’；
Seq ID No.16：5’-CTGTTATGGACAACCCNNNNNNNNNGTGAAG-3’；
Seq ID No.17：5’-CTGTTATNNNNNNNNNACCCTAAGGTGA-3’；
Seq ID No.18：5’-ACGTGGATCCTCAGAACTTCA-3’；
Seq ID No.19：5’-TGGGCCAGCTCACAGACC-3’；
Seq ID No.20：5’-GCTCCATCCTGGCCTCGC-3’；
Seq ID No.21：5’-CGTCCACCGCAAATGCTTCT-3’；
Seq ID No.22：5’-CGTCAACACCCCAGCCA-3’。
其中，Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.16和Seq ID No.17所示序列的探针为拱桥探针，这四个探针中的“NNNNNNNNN”表示与靶序列不匹配的长度为5-15bp的序列，使得这四个探针与靶标结合后呈拱桥形状；八条α珠蛋白突变位点特异性探针、一条内参特异性探针和五条β珠蛋白突变位点特异性探针的5’端都标记有相同或不同的荧光基团，3’端都标记有相同或不同的荧光淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：Seq ID No.3所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.4所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.5所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.6所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.7所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.8所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.9所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.10所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.15所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.16所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.17所示序列的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1；Seq ID No.18所示序列的探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BQ2；Seq ID No.19所示序列的探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BQ3；Seq ID No.22所示序列的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BQ1。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括反应液III，所述反应液III为DNA聚合酶。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括试剂A阳性质控品和试剂B阳性质控品；所述试剂A阳性质控品为含有所述一组α珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的阳性质粒，且该阳性质粒中分别含有已知含量的基因型为CD15纯合的片段和已知含量的基因型为野生型的片段；试剂B阳性质控品为含有所述两组β珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的阳性质粒，且该阳性质粒中分别含有已知含量的基因型为CD113纯合的片段和已知含量的基因型为野生型的片段。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括试剂A阴性质控品和试剂B阴性质控品，所述试剂A阴性质控品为含有所述一组α珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒；试剂B阴性质控品为含有所述两组β珠蛋白特异性引物对的扩增靶标序列的基因型为野生型的质粒。
10.根据权利要求5-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括空白对照，所述空白对照为灭菌去离子水。
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