CN111424091B - 一组鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的标志物及其应用 - Google Patents

一组鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于鉴别诊断和/或预测甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的甲基化标志物；进一步本发明提供所述甲基化标志物在制备甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的鉴别诊断工具中的应用。本发明利用128甲状腺滤泡性病变的石蜡组织标本，发现70个甲状腺滤泡性肿瘤相关甲基化标志物，在判断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性判断时敏感性及特异性非常高(特异性100％，敏感性为92.3％，准确度为96.2％，AUC值为0.994)；同时该70个标志物可以预测交界性甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性，指导临床大夫做出正确地诊治策略，避免过度诊疗。

Description

一组鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一组鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的标志物及其应用。
背景技术
甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌恶性肿瘤，占95％以上的病例。甲状腺癌主要包括四种病理类型(分别为甲状腺***状癌，甲状腺滤泡癌，髓样癌和甲状腺间变性癌)。甲状腺滤泡癌(FTC)约占所有TC的15％，属于甲状腺癌的少见类型。FTC通常见于年龄较大的患者，并且比甲状腺***状癌(PTC)更具侵袭性。FTC的病理诊断取决于典型的包膜和/或血管浸润，同时肿瘤细胞缺乏***状癌细胞核的特点。
甲状腺腺瘤(FTA)是最常见的良性甲状腺滤泡性病变，是指一类具有滤泡分化、包膜完整、无包膜和脉管浸润的良性肿瘤。FTA和FTC无法从细胞学的角度进行鉴别，鉴别二者需要从手术切除的石蜡标本中寻找有无包膜和/或血管浸润。恶性潜能未定的甲状腺肿瘤(TT-UMP)，是一组有包膜的交界性甲状腺滤泡性病变，出现了不确定的或者可疑的包膜和/或血管浸润，且无法达到诊断恶性的标准；TT-UMP包括恶性潜能未定的滤泡性肿瘤(FT-UMP)及甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤(WT-UMP)。
由于FTA、FTC及TT-UMP的治疗策略不同，所以正确的病理诊断非常重要，但是日常病理诊断工作中，单纯通过形态学准确地区分三者，有时非常困难，难以做出精准的诊断。而且目前对于TT-UMP的良恶性仍然缺乏认识，若能有效地判断出该组疾病的良恶性，可以更好地指导临床大夫做出诊疗策略。
很多研究试图通过免疫组化、基因突变或者甲基化的方法寻找鉴别三者的指标。但目前已有指标主要是针对甲状腺***状癌，针对其他滤泡性肿瘤的生物学指标非常有限，且缺乏应用大样本量的实验研究。此外，现有良恶性判断指标的敏感性及特异性不高；而且已有指标无法预测交界性肿瘤的良恶性。
因此，本领域迫切需要寻找可辅助甲状腺滤泡性病变病理诊断的甲基化标志物，同时可用于预测交界性病变的良恶性。
发明内容
本发明目的在于提供一组与甲状腺滤泡性肿瘤良恶性相关的甲基化标志物及其在制备鉴别诊断及预测甲状腺肿瘤良恶性的工具中的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
本发明通过亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)对128例(包括46例FTA,36例TT-UMP及46例FTC)甲状腺滤泡性肿瘤的石蜡标本进行甲基化检测。首先，发明人在训练集(由33例FTA及33例FTC组成)中找出70个甲状腺滤泡性肿瘤相关甲基化标志物，之后通过该70个指标构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型，并在测试集(13例FTA及13例FTC组成)中对基于70个标志物构建的恶性甲状腺癌潜能的评估模型进行验证。进一步，发明人利用基于70个标志物构建的评估模型，用于预测交界性甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性。
首先，本发明提供了一组用于鉴别诊断和/或预测甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的甲基化标志物，所述甲基化标志物包括以下基因组区域甲基化的组合，所述基因组区域为TBX15基因间区、LHX4内含子、MYOG外显子、MYOG 3'UTR、HMX3启动子、KRT85基因间区、GPC5启动子、FOXA1基因间区、FOXA1外显子区、SIX6启动子、GSE1基因间区、WNK4启动子、HOXB3启动子、GATA6-AS1启动子、CBLN2启动子、POU3F3启动子、KIAA2012内含子、LRRTM1启动子、FAM95A基因间区、SIM2内含子、PITX2内含子、CRIPAK基因间区、RBM47启动子、TMEM174基因间区、FRMD1基因间区、MYL10基因间区、MIR153-2内含子、LINC00689启动子、HOXA5启动子、MYO1G 3'UTR、FIGNL1外显子、SOX17基因间区、AJM1启动子、MYOG外显子、GPC5启动子、SIX6启动子、GATA6-AS1启动子、HOXA5启动子、MIR3675外显子、KAZALD1启动子、NEURL1启动子、LINC00173基因间区、AQP5启动子、KRT86内含子、FRY启动子、KCTD12启动子、LINC00239基因间区、ZC3H18外显子、RFNG启动子、TNPO2启动子、LYL1启动子、EPHX3启动子、ADAMTS10启动子、LINC01270基因间区、OGFRP1基因间区、LINC00887基因间区、LINC00884启动子、DDAH2启动子、SNX10基因间区、KAZALD1启动子、MRPL23-AS1基因间区、MYEF2启动子、RORA启动子、NUDT16L1外显子、LINC01530基因间区、PROC基因间区、PRMT2基因间区、LGALS1启动子、SNX10基因间区。
在其中一些实施例中，所述甲基化标志物包括70个甲基化单倍型区域(methylation haplotype block,MHB)，所述70个甲基化单倍型区域为表2所示。
在其中一些实施例中，所述甲状腺滤泡性肿瘤包括甲状腺腺瘤、甲状腺滤泡癌和恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤。
本发明的第二方面提供了所述的甲基化标志物在制备甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的鉴别诊断工具中的应用。
在其中一些实施例中，所述甲基化标志物通过构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型在制备甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的鉴别诊断工具中的应用。
本发明的第三方面提供了所述的甲基化标志物在制备恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤恶性潜能的评估工具中的应用。
在其中一些实施例中，所述甲基化标志物通过构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型在制备恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤恶性潜能的评估工具中的应用。
在其中一些实施例中，所述工具可以包括试剂、试剂盒和***。
在其中一些实施例中，所述试剂盒包括用于检测受试者样本中所述甲基化标志物的甲基化水平的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂是根据采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
优选的，所述试剂是采用于简化亚硫酸氢盐测序技术所使用的试剂。
在本发明中，所述***包括甲状腺滤泡性肿瘤良恶性诊断和评估***。
在其中一些实施例中，所述诊断或评估***包括检测表2中所述甲基化标志物的甲基化水平的物质；所述诊断或评估***包括数据处理装置，所述数据处理装置内设诊断或评估模块，所述诊断或评估模块根据受试者样本中标志物的甲基化水平判断受试者甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性风险。
在其中一些实施例中，所述诊断或评估模块是获取待测甲状腺肿瘤样本中所述70个甲基化标志物对应的甲基化水平，形成样本-标志物的数值矩阵，通过输入恶性甲状腺癌潜能的评估模型获得评分，根据评分鉴别甲状腺肿瘤的良恶性或评估恶性潜能未定的甲状腺肿瘤的恶性潜能。
具体的，所述诊断模块是获取待测甲状腺肿瘤样本中所述70个甲基化标志物对应的甲基化水平，形成样本-标志物的数值矩阵，通过输入恶性甲状腺癌潜能的评估模型，获得每例样本是恶性肿瘤的概率，当甲基化预测恶性肿瘤概率大于0.5时，即模型判断为恶性肿瘤FTC，反之为良性肿瘤FTA。
具体的，所述评估模块是将TT-UMP样本通过RRBS测序技术检测并计算所述70个标志物对应的甲基化值，形成样本-标志物的数值矩阵，输入恶性甲状腺癌潜能的评估模型，获得恶性潜能打分，根据甲基化打分结果，可以将所有UMP样本分为三类(三个风险级别)：1——低风险，甲基化分值为0-0.4；2——中风险，甲基化分值为0.4-0.6；3——高风险，甲基化分值为0.6-1。
本发明的第四方面提供了一种鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测受试者样本中的标志物甲基化水平的试剂，所述标志物为表2中所示的甲基化标志物。
在其中一些实施例中，所述受试者样本包括甲状腺滤泡性肿瘤的组织样本。
在其中一些实施例中，所述试剂是根据采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂是采用于简化亚硫酸氢盐测序技术所使用的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂包括酶切试剂、甲基化接头连接所需的试剂、亚硫酸氢盐转化处理试剂、引物以及引物扩增试剂等。
所述酶切试剂包括甲基化敏感或不敏感的限制性内切酶，优选的，MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI限制性内切酶。所述甲基化接头的连接所需的试剂包括缓冲液、DNA连接酶和ATP。所述引物扩增所需试剂包括扩增缓冲液、4种dNTP、引物和DNA聚合酶。所述引物和所述试剂均可由市面上公司购买。
进一步地，本发明还提供了一种预测恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤的恶性潜能的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测受试者样本中的标志物甲基化水平的试剂，所述标志物为表2中所示的甲基化标志物。
本发明的第五面提供了所述的甲基化标志物在构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型中的应用。
在其中一些实施例中，所述恶性甲状腺癌潜能的评估模型可以用来鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性，也可以用来评估恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤的恶性潜能。
在本发明中基于所述甲基化标志物构建的评估模型在制备判断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性产品中的应用。
有益效果
本发明利用128甲状腺滤泡性病变的石蜡组织标本，发现70个甲状腺滤泡性肿瘤相关甲基化标志物，基于该70个标志物构建的评估模型在判断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性判断时敏感性及特异性非常高(特异性100％，敏感性为92.3％，准确度为96.2％，AUC值为0.994)；同时基于该70个标志物构建的评估模型可以预测交界性甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性，指导临床大夫做出正确的诊治策略，避免过度诊疗。发明人进一步利用这些生物标记物开发鉴别诊断甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的工具和评估恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤的恶性潜能的工具(试剂、试剂盒和诊断或评估***)为甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性诊断或评估提供参考价值。
附图说明
图1：ROC曲线示甲基化指标在验证集中的准确度及特异性；
图2：36例UMP样本基因突变及甲基化分值在不同风险组中的比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
本发明的通过亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)对128例(包括46例FTA，36例TT-UMP及46例FTC)甲状腺滤泡性肿瘤的石蜡标本进行甲基化检测。首先，发明人在训练集(由33例FTA及33例FTC组成)中找出70个甲状腺滤泡性肿瘤相关甲基化标志物，并利用70个差异甲基化标志物构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型；利用构建的甲基化标志物模型对26例甲状腺滤泡性肿瘤样品(病理检测结果13例FTA及13例FTC)进行良恶性鉴别，进一步验证了基于甲基化标志物构建的模型对甲状腺良恶性鉴别诊断具有高度的灵敏度和特异性。最后，发明人将甲基化标志物构建的评估模型用于预测36例交界性(恶性潜能未定的)甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性，发现7例低风险样本均未检测到恶性突变(0％)，14例中风险样本有5例检测到恶性突变(35.7％)，15例高风险样本有11例检测到突变(73.3％)。高风险组的突变样本比例显著高于低风险组(p＝0.004)，且显著高于中风险组，说明属于高风险组中的甲状腺肿瘤，携带基因突变的概率较高，其恶性潜能显著高于中低风险组，该组患者应该进行密切的随访，以免进展成恶性肿瘤；而对于低风险组的患者携带基因突变的可能性低，可进行随诊，避免过治疗。
实施例1：甲状腺肿瘤良恶性的甲基化标志物筛选
发明人收集2010年至2016年间经北京协和医院病理科诊断的甲状腺滤泡性肿瘤的石蜡标本，共计128例(包括46例FTA，36例TT-UMP及46例FTC)，提取DNA，DNA进行磁珠纯化(Backman Ampure Xp beads)；通过亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)进行甲基化检测分析，首先在训练集(由33例FTA及33例FTC组成)中寻找出差异甲基化分子。
甲基化检测分析由上海鹍远生物技术有限公司完成：取100ng纯化后的样本DNA进行酶切反应，反应体系见表1，反应温度如下：37℃3小时，80℃20分钟，4℃保存。其中37℃为酶切反应温度，80℃为酶灭活温度。混合酶包含7种限制性内切酶：MSP I(NEB，R0106L)、HaeIII(NEB，R0108L)、BanII(Thermo ScientificTM，ER0281)、HpyCH4V(NEB，R0620L)、AluI(Thermo ScientificTM，ER0011)、SphI(NEB，R0182L)和BssSI(Thermo ScientificTM，ER1841)；对上述酶切产物进行甲基化接头的连接，连接产物进行磁珠纯化；使用ZYMOresearch公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit进行亚硫酸氢盐转化处理；进行索引引物扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；文库质控：用Qubit和qPCR两种方法测定文库浓度，并用PerkinElmer公司labChip片段分析仪分析文库片段大小；测序：用Illumina平台仪器HiseqX Ten进行测序。
表1酶切反应体系
反应混合物 体积/微升
10x反应缓冲液 4.0
混合限制性内切酶 1.0
1.2pg/μL非甲基化lambda DNA 0.8
DNA+无核酸酶水 34.2
总计 40
本发明按照(Guo S,et al.(2017)Identification of methylation haplotypeblocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumortissue-of-origin mapping from plasma DNA.Nat Genet 49(4):635-642.)方法，根据多个DNA甲基化数据库(ENCOD、TCGA)，筛选MHB(两个相邻CpG位点的最小连锁不平衡度r2大于0.5的区域)作为FA和FTC样品的候选甲基化标记物。每个样品需检测到不少于25,000个MHB方可用于下游分析，且候选MHB需在不少于90％的样品中检测到。选择PDR(proportion ofdiscordant reads)或MHL(Methylation Haplotype Load(MHL)标准偏差不小于0.02的MHB作为候选标记物。最终在训练集(由33例良性FTA及33例恶性FTC构成)中发现70个有统计学差异的甲基化分子标志物，其中34个位于启动子区，7个位于外显子区，6个位于内含子区，2个位于3’-UTR区域，21个位于基因间区，具体内容见表2。
表2 70个甲基化标志物及其具***置
Figure GDA0003312494680000071
Figure GDA0003312494680000081
Figure GDA0003312494680000091
实施例2利用70个差异甲基化标志物构建恶性甲状腺癌潜能的评估模型
将实施例1中每个样本的测序结果进行质控分析后，将70个标志物区段的序列挑选出来，并根据每个标志物对应的甲基化值计算方式进行计算(甲基化值计算方式参照GuoS,et al.(2017)Identification of methylation haplotype blocks aids indeconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-originmapping from plasma DNA.Nat Genet 49(4):635-642.)，如果有区段内某CpG位点测序深度低于10×，则该区段的甲基化值为NA。形成样本-标志物的数值矩阵，部分示例性数据见表3。模型的构建由上海鹍远生物技术有限公司完成。
表3 10个甲状腺肿瘤样本的标志物甲基化值矩阵
Figure GDA0003312494680000101
……
构建模型：
模型构建使用的是本文前面的33例FTA和33例FTC的甲基化水平矩阵(markers)，66例样本的分类信息存储为第一列为样本名，第二列为分类信息(FTC名为p.ftc，FTA名为n.fta)的矩阵(pheno)。
打开R程序包，导入xx例样本的分类信息矩阵和相应的甲基化水平矩阵
pheno＝read.delim(“分类信息矩阵的存储路径”,sep＝"\t",as.is＝T,header＝T,check.names＝FALSE)
markers＝ead.delim(“甲基化水平矩阵的存储路径”,sep＝"\t",as.is＝T,header＝T,check.names＝FALSE)
将甲基化水平矩阵转置为行名为样本名称,列名为甲基化标志物名称的矩阵
imput＝t(markers)
用临近值补充法补上NA值
library(DMwR)
imputed＝knnImputation(imput)
设置建模参数
library(caret,quietly＝T)
ctrl<-trainControl(method＝"repeatedcv",savePredictions＝T,classProbs＝T,number＝3,repeats＝10,allowParallel＝TRUE)
构建随机森林模型
mod_rf<-train(imputed,pheno,method＝'rf',trControl＝ctrl)
实施例3甲基化标志物用于甲状腺肿瘤良恶性鉴别
本实施例利用实施例2构建的模型对26例甲状腺滤泡性肿瘤样品进行良恶性鉴别。过程如下：
根据实施例2的方法，构建类似表3的26个样品的样本-标志物的数值矩阵。
打开R程序包，导入26例待评估样本-标志物的数值矩阵
valdata＝read.delim(“样本-标志物矩阵的存储路径”,sep＝"\t",as.is＝T,row.names＝1,header＝T,check.names＝F)
将矩阵转置为行名为样本名称,列名为甲基化标志物名称的矩阵
imput＝t(valdata)
并用临近值补充法补上NA值
library(DMwR)
imputed＝knnImputation(imput)
再导入已建立的恶性甲状腺癌潜能的评估模型(RFmodelFTC)
model＝readRDS("RFmodelFTC存储路径")
之后开始进行模型评估，得出每一例样本是更倾向于恶性或者良性
library(randomForest)
class＝predict(model,imputed,type＝"response")
并计算出每例样本是恶性肿瘤的概率
probs＝predict(model,imputed,type＝"prob")
使用随机森林模型根据甲基化水平预测的肿瘤概率值，绘制ROC曲线，曲线下面积AUC为0.994，灵敏度92.3％，特异性100％，准确性为96.2％，最佳诊断的cut-off值为0.5，即当甲基化预测恶性肿瘤概率大于0.5时，即模型判断为恶性肿瘤FTC，反之为良性肿瘤FTA(图1)。将最终判断结果与病理检测结果(13例FTA及13例FTC)进行比较，发现26例样本，仅一例的甲基化标志物模型与病理诊断不一致(见表4)，上述ROC结果进一步证明70个甲基化标志物的联合鉴别甲基化肿瘤良恶具有良好的效果。
表4 26例甲状腺肿瘤患者的良恶性鉴别
样品 病理判断 甲基化预测 甲基化评估恶性概率
1 p.ftc p.ftc 0.596
2 p.ftc p.ftc 0.546
3 p.ftc p.ftc 0.692
4 n.fta n.fta 0.418
5 n.fta n.fta 0.246
6 n.fta n.fta 0.378
7 n.fta n.fta 0.22
8 n.fta n.fta 0.49
9 n.fta n.fta 0.266
10 p.ftc p.ftc 0.886
11 p.ftc p.ftc 0.508
12 p.ftc p.ftc 0.784
13 p.ftc n.fta 0.462
14 p.ftc p.ftc 0.68
15 n.fta n.fta 0.172
16 n.fta n.fta 0.298
17 n.fta n.fta 0.314
18 n.fta n.fta 0.074
19 n.fta n.fta 0.408
20 n.fta n.fta 0.168
21 n.fta n.fta 0.36
22 p.ftc p.ftc 0.752
23 p.ftc p.ftc 0.762
24 p.ftc p.ftc 0.572
25 p.ftc p.ftc 0.762
26 p.ftc p.ftc 0.702
实施例4甲基化标志物用于TT-UMP恶性潜能的评估
探究上述基于70个甲基化标志物构建的恶性甲状腺癌潜能评估模型是否可用于TT-UMP恶性潜能的预测。根据实施例2的方法，构建类似表3的UMP样本的样本-标志物的数值矩阵。
打开R程序包，导入UMP样本的甲基化标志物数值矩阵
valdata＝read.delim(“样本-标志物矩阵的存储路径”,sep＝"\t",as.is＝T,row.names＝1,header＝T,check.names＝F)
将矩阵转置为行名为样本名称,列名为甲基化标志物名称的矩阵
imput＝t(valdata)
并用临近值补充法补上NA值
library(DMwR)
imputed＝knnImputation(imput)
再导入已建立的恶性甲状腺癌潜能的评估模型(RFmodelFTC)
model＝readRDS("RFmodelFTC存储路径")
进行恶性潜能打分：
probs＝predict(model,imputed,type＝"prob")
根据甲基化打分结果，可以将所有UMP样本分为三类(三个风险级别)：1——低风险，甲基化分值为0-0.4；2——中风险，甲基化分值为0.4-0.6；3——高风险，甲基化分值为0.6-1。将甲基化打分结果与已知的与甲状腺癌发生相关的基因突变检测结果进行比较(表5)，7例低风险样本均未检测到恶性突变(0％)，14例中风险样本有5例检测到恶性突变(35.7％)，15例高风险样本有11例检测到突变(73.3％)。高风险组的突变样本比例显著高于低风险组(p＝0.004)，且显著高于中风险组(图2)。说明属于高风险组中的甲状腺肿瘤，其恶性潜能显著高于低风险组及中风险组，该组患者应该进行密切的随访，以免进展成恶性肿瘤；而对于低风险组的患者携带基因突变的可能性低，可进行随诊，避免过度治疗。
表5甲基化打分结果与基因突变检测结果
Figure GDA0003312494680000131
Figure GDA0003312494680000141
Figure GDA0003312494680000151
其中，TP53、PIK3CA、TSHR、NRAS、HRAS、GNAS、PPARG-PAX8、KRAS是现有研究中与甲状腺癌发生相关的突变基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.检测甲基化标志物的甲基化水平的试剂在制备甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的鉴别诊断试剂盒中的应用，所述甲基化标志物包括如下甲基化标志物：chr1:119543868:119543879、chr1:180202465:180202541、chr1:203044677:203044823、chr1:203045227:203045293、chr10:124896784:124897154、chr12:52745149:52745173、chr13:92051635:92051674、chr14:38071275:38071410、chr14:38091345:38091744、chr14:60977845:60977865、chr16:85620063:85620331、chr17:40937184:40937480、chr17:46631705:46632377、chr18:19747115:19747127、chr18:70209347:70209475、chr2:105474371:105474381、chr2:203036052:203036236、chr2:80530770:80530826、chr2:95401381:95401629、chr21:38077572:38077685、chr4:111554966:111554989、chr4:1400384:1400459、chr4:40632502:40632519、chr5:72594262:72594269、chr6:168502296:168502347、chr7:101241802:101241926、chr7:157485865:157486031、chr7:158798629:158798674、chr7:27182264:27183525、chr7:45002063:45002754、chr7:50467662:50468309、chr8:55366694:55366747、chr9:139740669:139740676、chr1:203044677:203044823、chr13:92051635:92051674、chr14:60977845:60977865、chr18:19747115:19747127、chr7:27182264:27183525、chr10:102822370:102822647、chr11:2000109:2000154、chr15:48470425:48470556、chr15:60883371:60883395、chr16:4715122:4715220、chr19:52104749:52104928、chr2:128158537:128158621、chr21:48087183:48088183、chr22:38071168:38071189、chr7:26415938:26416562、chr1:16862044:16862199、chr10:102822370:102822647、chr10:105253375:105253477、chr12:116946248:116946304、chr12:50355085:50355570、chr12:52652220:52652362、chr13:32605660:32605843、chr13:77459521:77459792、chr14:102172655:102172687、chr16:88599725:88600068、chr17:80009015:80009025、chr19:12831808:12832195、chr19:13213485:13213513、chr19:13213644:13213814、chr19:15344092:15344411、chr19:8674674:8674749、chr20:48902548:48902611、chr22:42710260:42710349、chr3:193987426:193987681、chr3:194208192:194208617、chr6:31696240:31696334、chr7:26415826:26415917。
2.检测甲基化标志物的甲基化水平的试剂在制备恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤恶性潜能的评估试剂盒中的应用，所述甲基化标志物包括如下甲基化标志物：chr1:119543868:119543879、chr1:180202465:180202541、chr1:203044677:203044823、chr1:203045227:203045293、chr10:124896784:124897154、chr12:52745149:52745173、chr13:92051635:92051674、chr14:38071275:38071410、chr14:38091345:38091744、chr14:60977845:60977865、chr16:85620063:85620331、chr17:40937184:40937480、chr17:46631705:46632377、chr18:19747115:19747127、chr18:70209347:70209475、chr2:105474371:105474381、chr2:203036052:203036236、chr2:80530770:80530826、chr2:95401381:95401629、chr21:38077572:38077685、chr4:111554966:111554989、chr4:1400384:1400459、chr4:40632502:40632519、chr5:72594262:72594269、chr6:168502296:168502347、chr7:101241802:101241926、chr7:157485865:157486031、chr7:158798629:158798674、chr7:27182264:27183525、chr7:45002063:45002754、chr7:50467662:50468309、chr8:55366694:55366747、chr9:139740669:139740676、chr1:203044677:203044823、chr13:92051635:92051674、chr14:60977845:60977865、chr18:19747115:19747127、chr7:27182264:27183525、chr10:102822370:102822647、chr11:2000109:2000154、chr15:48470425:48470556、chr15:60883371:60883395、chr16:4715122:4715220、chr19:52104749:52104928、chr2:128158537:128158621、chr21:48087183:48088183、chr22:38071168:38071189、chr7:26415938:26416562、chr1:16862044:16862199、chr10:102822370:102822647、chr10:105253375:105253477、chr12:116946248:116946304、chr12:50355085:50355570、chr12:52652220:52652362、chr13:32605660:32605843、chr13:77459521:77459792、chr14:102172655:102172687、chr16:88599725:88600068、chr17:80009015:80009025、chr19:12831808:12832195、chr19:13213485:13213513、chr19:13213644:13213814、chr19:15344092:15344411、chr19:8674674:8674749、chr20:48902548:48902611、chr22:42710260:42710349、chr3:193987426:193987681、chr3:194208192:194208617、chr6:31696240:31696334、chr7:26415826:26415917。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113178264A (zh) * 2021-05-04 2021-07-27 温州医科大学附属第一医院 一种深肌层浸润数据预测方法及***
CN113322320A (zh) * 2021-05-27 2021-08-31 杭州医学院 一种长非编码rna及其在诊断及治疗神经胶质瘤中的应用
CN115112745A (zh) * 2022-07-19 2022-09-27 中国医学科学院北京协和医院 一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物及其应用
CN115128285B (zh) * 2022-08-30 2023-01-06 西湖大学 一种蛋白质组合对甲状腺滤泡性肿瘤鉴别评估的试剂盒、***
CN117843754A (zh) * 2022-10-04 2024-04-09 中国医学科学院药物研究所 一种角蛋白yk93-5、制法和其药物组合物与用途
CN117487914A (zh) * 2023-10-27 2024-02-02 广东药科大学 靶向zc3h18/pd-l1信号轴在肿瘤免疫逃逸检测、治疗、预后中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016170348A2 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 Mina Therapeutics Limited Sarna compositions and methods of use
EP3737666A4 (en) * 2018-01-12 2022-01-05 Kymera Therapeutics, Inc. PROTEIN DEGRADANTS AND USES THEREOF
US11292792B2 (en) * 2018-07-06 2022-04-05 Kymera Therapeutics, Inc. Tricyclic CRBN ligands and uses thereof
CN110283907A (zh) * 2019-05-31 2019-09-27 江苏大学 甲状腺恶性肿瘤的特异性基因标志物及其应用
CN110499364A (zh) * 2019-07-30 2019-11-26 北京凯昂医学诊断技术有限公司 一种用于检测扩展型遗传病全外显子的探针组及其试剂盒和应用
CN110257525B (zh) * 2019-08-05 2022-10-11 上海奕谱生物科技有限公司 对肿瘤诊断具有显著性的标记物及其用途
CN113308540A (zh) * 2020-02-27 2021-08-27 上海鹍远生物技术有限公司 甲状腺结节相关rDNA甲基化标志物及其应用

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