CN115786304A - 一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用 - Google Patents
一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用。所述Cas12a蛋白突变体在dLbCas12a蛋白基础上发生D156R、G532R和K538R组合突变,G532R和K595R组合突变或G532R、K538V和Y542R组合突变中的任意一种或至少两种的组合。本发明以dLbCas12a为基础进行改造,获得了识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体,并构建了可识别PAM范围拓宽的高效碱基编辑器,该碱基编辑器在细胞与胚胎水平上均能对经典PAM和非经典PAM实现高效的C>T或A>G编辑;且能够在细胞与胚胎水平实现同时多位点高效的C>T或A>G编辑,成功地丰富了现有的碱基编辑工具箱。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域,涉及一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用。
背景技术
得益于基因编辑技术的产生与发展,人们现在处于灵活、精确操纵基因的时代,可以通过对基因进行改造,来研究基因功能、进行基因治疗以及改良动植物性状等等。基因编辑技术的出现,极大地推动了人类遗传疾病从症状与遗传基础研究、到疾病治疗的创新发展。
随着CRISPR/Cas***的发现与发展,其因设计简单、易于操作、编辑活性高和成本低廉等优势,已成为研究人员最常用的一项新型基因编辑技术。据调查统计,人类遗传性疾病中最大的一类是由于基因点突变引起的(也称为单核苷酸多态性SNP),约占致病性遗传变异的58%。其中,在基因点突变引起的疾病中,C>T突变占比47%,而A>G突变占比14%。碱基编辑工具出现之前,进行碱基替换的方式主要是同源重组(Homology-directed repair,HDR),虽然CRISPR/Cas***的出现显著提高了HDR效率,但是目前效率仍然较低。因此,开发可以在基因组中有效引入单碱基突变或者纠正单碱基突变的新型基因编辑方法,对于点突变相关疾病的机制研究及其治疗,具有非常重要的意义。
碱基编辑技术是新发展而来的基因编辑技术,可以满足上述单碱基突变的需求。通过将脱氨酶与CRISPR/Cas***融合,目前已经成功构建出可诱导碱基C转换为T的胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和可诱导碱基A转换为G的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)(KomorAC,KimYB,Packer M S,et al.Programmable editingofa target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J].Nature,2016,533(7603):420-424;Gaudelli N M,Komor A C,Rees HA,etal.Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNAwithout DNAcleavage[J].Nature,2017,551(7681):464-471)。但是,目前常用的ABE以及CBE大多是以Cas9为基础构建的,其识别富含C/G的PAM(Protospacer adjacent motif)序列,因此限制了这些碱基编辑器的靶向范围。Cas12a(早期被称为Cpf1)可以识别富含A/T的PAM序列,所以可以很好地补充现有的基于Cas9的碱基编辑器,拓宽碱基编辑***的可靶向范围。此外,Cas12a还具有其他优势:切割DNA双链之后产生黏性末端;具有RNA酶活性,可以切割pre-crRNA形成多条成熟的向导RNA(gRNA);特异性较Cas9更高等。其中,Cas12a的RNA酶活性尤为重要,它可以切割pre-crRNA,形成多条成熟的向导RNA,同时靶向多个基因位点,实现多基因同时编辑。这使得Cas12a作为一种重要的基因编辑工具,具有独特的应用价值。目前,有报道的天然Cas9和Cas12a同源蛋白虽然可以识别不同的PAM序列,但是可靶向范围仍然是有限的,特别是一些天然蛋白的PAM限制更大或者其在哺乳动物细胞中的活性较差。因此,对现有Cas9和Cas12a蛋白进行改造,获得PAM限制性更少的蛋白变体是突破该局限性的一种有效方式。
目前,研究人员已经将不同的Cas9变体与脱氨酶相融合,发展了一系列PAM序列扩展的碱基编辑器,但对于扩展Cas12a衍生的碱基编辑器的靶向范围的研究还鲜有报道。此外,利用Cas12a衍生的碱基编辑器进行多位点同时编辑的尝试存在效率极低的问题。综上所述,基于Cas12a开发靶向范围更广、可同时对多基因位点进行高效编辑的碱基编辑器,对于基因编辑领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种Cas12a蛋白突变体、含有其的碱基编辑器和应用,本发明以dLbCas12a为基础,分别引入突变,获得了可识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体,能够有效应用于基因编辑,拓展基因编辑靶向范围,同时利用其RNA酶活性,获得可同时对多基因位点进行碱基编辑的高效碱基编辑器。
为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种Cas12a蛋白突变体,所述Cas12a蛋白突变体在dLbCas12a蛋白基础上发生D156R、G532R和K538R组合突变,G532R和K595R组合突变或G532R、K538V和Y542R组合突变中的任意一种或至少两种的组合,所述dLbCas12a蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明中,基于目前Cas12a蛋白靶向范围受限的问题,基于dLbCas12a蛋白(Catalytically dead Lachnospiraceae bacterium Cas12a),在其基础上进行改造,分别引入突变D156R、G532R和K538R组合突变(D156R/G532R/K538R),G532R和K595R组合突变(G532R/K595R)或G532R、K538V和Y542R组合突变(G532R/K538V/Y542R),获得了可识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体,能够有效应用于基因编辑中,对于拓宽现有的基因编辑***的基因组可靶向范围具有重要意义。
SEQ ID NO.1:
MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDENNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIARGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALADLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVAFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKHGS。
第二方面,本发明提供核酸分子,所述核酸分子含有编码第一方面所述的Cas12a蛋白突变体的核酸序列。
第三方面,本发明提供一种表达载体,所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
第四方面,本发明提供一种重组细胞,所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子。
第五方面,本发明提供第一方面所述的Cas12a蛋白突变体在制备基因编辑产品中的应用。
第六方面,本发明提供一种碱基编辑器,所述碱基编辑器为脱氨酶和第一方面所述的Cas12a蛋白突变体融合形成的融合蛋白。
本发明中,通过遗传改造获得可识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体,利用该突变体与脱氨酶进行融合可进一步构建可识别PAM范围拓宽的高效碱基编辑器。
本发明中,所述脱氨酶可融合于所述Cas12a蛋白突变体的N-末端、C-末端或内部的融合位点。
本发明中,本领域用于构建碱基编辑器的脱氨酶均适用于本发明。
本发明中,所述脱氨酶可选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。
本发明中,所述胞嘧啶脱氨酶选自人源胞嘧啶脱氨酶(hAPOBEC3A,hA3A)。
本发明中发现,与使用大鼠来源胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)构建的碱基编辑器相比,利用胞嘧啶脱氨酶hA3A和本发明Cas12a蛋白突变体融合得到的碱基编辑器的编辑效率更高,而不受序列环境的影响。
本发明中,所述hA3A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。
SEQ ID NO.2:
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIFDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN。
SEQ ID NO.3:
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHGQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN。
本发明中,所述腺嘌呤脱氨酶可选自TadA-8e(TadA*8e)。
本发明中,所述TadA-8e的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
SEQ ID NO.4:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGWRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN。
本发明中,利用胞嘧啶脱氨酶和本发明dLbCas12a蛋白的突变体融合制备胞嘧啶碱基编辑器(命名为dLbCas12a-CBE),利用腺嘌呤脱氨酶和本发明Cas12a蛋白突变体融合制备腺嘌呤碱基编辑器(命名为dLbCas12a-ABE),作用原理示意图分别如图1和图2所示,dLbCas12a蛋白的突变体通过与向导RNA结合形成复合物之后,在基因组上寻找靶位点,向导RNA与基因组靶向结合之后,利用脱氨酶的脱氨活性对窗口范围内的碱基脱氨,实现碱基编辑。
此外,Cas12a蛋白具有RNA酶特性,可以对串联的pre-crRNA实现切割,形成多条成熟的向导RNA,可分别形成不同的碱基编辑器复合物,实现多基因位点同时高效的编辑,具体如图9所示,可在启动子下游串联多条向导RNA,转录形成pre-crRNA之后,利用Cas12a自身的RNA酶特性可将其加工成多条成熟的向导RNA,Cas12a与向导RNA形成复合物之后即可寻找基因组中的靶位点实现基因编辑,可在细胞与胚胎水平对多个基因组位点实现同时编辑,且编辑效率与单位点编辑相差无异。
第七方面,本发明提供第一方面所述的Cas12a蛋白突变体或第六方面所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用。
优选地,所述基因编辑可以为同时在多基因位点进行基因编辑。
第八方面,本发明提供一种基因编辑方法,所述基因编辑方法包括:
利用第一方面所述的Cas12a蛋白突变体和向导RNA组成CRISPR-Cas***进行基因编辑,或者,
利用第一方面所述的Cas12蛋白突变体和由串联向导RNA经加工形成的向导RNA组成CRISPR-Cas***进行多基因位点同时基因编辑。
第九方面,本发明提供一种碱基编辑方法,所述碱基编辑方法包括:
使用第六方面所述的碱基编辑器进行碱基编辑。
优选地,所述碱基编辑方法包括:
使用第六方面所述的碱基编辑器和串联向导RNA进行多基因位点同时碱基编辑。
优选地,所述碱基编辑方法包括以下步骤:
通过在dLbCas12a蛋白中引入D156R/G532R/K538R、G532R/K595R或G532R/K538V/Y542R中任一突变体获得可识别非经典PAM的Cas12a突变体,再将其与脱氨酶相融合制备靶向范围拓宽的碱基编辑器,将其与靶位点向导RNA一同转入待编辑细胞,利用其形成的蛋白-RNA复合物对靶位点进行编辑。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明以dLbCas12a为基础,分别引入突变D156R/G532R/K538R、G532R/K595R和G532R/K538V/Y542R,获得了识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体:enCas12a、RR和RVR,随后将胞嘧啶脱氨酶hA3A或腺嘌呤脱氨酶TadA-8e与所述Cas12a蛋白突变体融合,构建了可识别PAM范围拓宽的高效碱基编辑器,该碱基编辑器在细胞与胚胎水平上均能对经典PAM(TTTV)和非经典PAM实现高效的C>T或A>G编辑;同时,借助Cas12a自身的RNA酶活性,该***又可实现多基因位点同时高效的编辑,已证明该***可在细胞与胚胎水平对多个基因组位点实现同时高效的C>T或A>G编辑,且编辑效率与单位点编辑相差无异,成功地丰富了现有的碱基编辑工具箱。
附图说明
图1为本发明胞嘧啶碱基编辑器原理示意图;
图2为本发明腺嘌呤碱基编辑器原理示意图;
图3为本发明胞嘧啶碱基编辑器结构示意图;
图4为本发明腺嘌呤碱基编辑器结构示意图;
图5为HEK293T细胞中胞嘧啶碱基编辑效率图;
图6为HEK293T细胞中腺嘌呤碱基编辑效率图;
图7为胚胎中胞嘧啶碱基编辑效率图;
图8为胚胎中腺嘌呤碱基编辑效率图;
图9为利用Cas12a的RNA酶功能实现多位点同时编辑示意图;
图10A为在HEK293T细胞上利用Cas12a蛋白突变体构建的胞嘧啶碱基编辑器实现多位点同时编辑结果图;
图10B为在HEK293T细胞上利用Cas12a蛋白突变体构建的腺嘌呤碱基编辑器实现多位点同时编辑结果图;
图11为在猪胚胎上利用Cas12a蛋白突变体构建的胞嘧啶碱基编辑器实现多位点同时编辑结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例构建Cas12a蛋白突变体,以dLbCas12a(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)为基础,分别引入突变D156R/G532R/K538R、G532R/K595R和G532R/K538V/Y542R,得到3种Cas12a蛋白突变体,分别依次对应命名为enCas12a、RR和RVR。
实施例2
本实施例构建碱基编辑器,以融合点为N-末端为例,在实施例1中dLbCas12a的三个突变体:enCas12a、RR和RVR的N-末端融合胞嘧啶脱氨酶hA3A和腺嘌呤脱氨酶TadA-8e构建相关的碱基编辑器,结构示意图如图3和图4所示。图3为胞嘧啶碱基编辑器结构示意图,分别采用两种hA3A(一种含有Y130F突变,序列为SEQ ID NO.2;另一种含有N57G突变,序列为SEQ ID NO.3),其中UGI为尿嘧啶糖基化酶抑制剂,NLS为核定位信号,dCas12a表示野生型dLbCas12a蛋白,作为对照。图4为腺嘌呤碱基编辑器结构示意图,采用的TadA-8e含有V106W突变,序列为SEQ ID NO.4,其中dCas12a表示野生型dLbCas12a蛋白,作为对照,bqNLS为bipartite SV40 NLS。
实施例3
本实施例分别从细胞和胚胎水平分析实施例2构建的碱基编辑器的编辑效率。
具体方法包括:
细胞水平上,通过将碱基编辑器和向导RNA的编码质粒转染进合适汇合度的待转细胞中,72小时之后提取细胞基因组,利用特异性引物对拟编辑位点进行PCR扩增,然后进行Sanger测序。测序结果可通过EditR在线工具分析,进行编辑效率的评估。
在胚胎水平上,将碱基编辑器和向导RNA质粒进行体外转录获得RNA,然后利用显微操作***将RNA注入动物胚胎中,体外培养至囊胚期,收集单个囊胚,进行基因组获取,然后利用特异性引物对拟编辑位点进行PCR扩增,进行Sanger测序。测序结果可通过EditR在线工具分析,进行编辑效率的评估。
结果如图5~图8所示,图5为HEK293T细胞中胞嘧啶碱基编辑效率图,以enCas12a和RR构建的dLbCas12a-CBE对于TCCC这一非经典PAM,可将编辑效率从低于10%提高至40%,提高8倍;以RR构建的dLbCas12a-CBE对于TCCA这一非经典PAM,可将编辑效率从2%提高至将近20%,提高约10倍;enCas12a和RVR构建的dLbCas12a-CBE对于TATG这一非经典PAM,从几近无的编辑效率提高至30%以上。图6为HEK293T细胞中腺嘌呤碱基编辑效率图,表明以Cas12a突变体构建的dLbCas12a-ABE对于非经典PAM也能实现有效脱氨,例如,对于TTCC这一非经典PAM,以enCas12a和RR构建的dLbCas12a-ABE可将效率从10%提升至20%以上,提高约2倍;对于TATAPAM,以RVR构建的dLbCas12a-ABE则可将效率从不足5%提高至10%。
胚胎水平上,图7为胚胎中胞嘧啶碱基编辑效率图,以Cas12a突变体构建的dLbCas12a-CBE***在经典的PAM TTTV的活性与原始的dLbCas12a-CBE相差无异,而对于一些非经典PAM则有很大提高,比如,对于TTCA这一非经典PAM,以enCas12a和RR构建的dLbCas12a-CBE可将效率从低于5%提高至50%左右,提高约10倍;对于TTCT、TCCC和TCCA这一非经典PAM,则可从几近无效提高至将近40%;而RR构建的dLbCas12a-CBE对于ATTC、TATG和TGTA都有一定的提高。如图8所示,以RR构建的dLbCas12a-ABE在PUM1-16(TCCA)这一位点可将效率从低于5%提升至35%以上,高达7倍的效率提升;而对于IGF1-41(CTTC),以en-Cas12a构建的dLbCas12a-ABE可将近乎无的效率提升至40%以上。
实施例4
本实施例利用实施例2构建的碱基编辑器在HEK293T细胞与猪胚胎中实现多基因同时编辑。
如图10A和图10B所示,在细胞水平上,将靶向DNMT3B、KLF4、TET1、PRR5L和CFTR的向导RNA按照图9的方式串联在一起,分别与实施例2中Cas12a蛋白突变体构建的CBE或ABE转染HEK293T细胞,72h之后进行细胞基因组提取,通过特异性引物PCR之后进行Sanger测序,利用EditR在线工具进行编辑效率的评估,其中多条向导RNA混合转染细胞与单条向导RNA转染细胞作为对照组。从效率统计结果可知,不论是单条向导RNA转染、多条向导RNA混合转染,还是多条向导RNA串联,编辑效率都相差不大。而且,不论是CBE还是ABE,结果相似。
如图11所示,在胚胎水平上,将靶向猪PUM1、GHR、HMGA2和PUM2的向导RNA按照图9的方式串联在一起,将其分别与Cas12a各种变体构建的CBE或ABE在体外转录为RNA之后利用显微注射操作注入猪的孤雌胚胎中,发育至囊胚之后进行基因组提取,利用特异性引物进行PCR扩增并进行Sanger测序,测序结果利用EditR在线工具进行编辑效率的评估,其中多条向导RNA混合注射作为对照组,从效率统计结果可知,对于PUM1、GHR和HMGA2位点,串联向导RNA与多条向导RNA混合的编辑效率没有差异;而对于PUM2位点,串联向导RNA的编辑效率较多条向导RNA混合的效率有显著提高。
综上所述,本发明以dLbCas12a为基础进行改造,获得了可识别PAM范围扩大的Cas12a蛋白突变体,并将脱氨酶与所述Cas12a蛋白突变体融合,构建了可识别PAM范围拓宽的高效碱基编辑器,且能够实现多位点同时高效的编辑,在细胞和胚胎水平上均能实现,很好地补充了现有的碱基编辑工具箱,成功地拓宽了可靶向的基因组范围,也可以应用到疾病动物模型构建、疾病基因治疗以及品种改良等方面。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种Cas12a蛋白突变体,其特征在于,所述Cas12a蛋白突变体在dLbCas12a蛋白基础上发生D156R、G532R和K538R组合突变,G532R和K595R组合突变或G532R、K538V和Y542R组合突变中的任意一种或至少两种的组合;
所述dLbCas12a蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
2.核酸分子,其特征在于,所述核酸分子含有编码权利要求1所述的Cas12a蛋白突变体的核酸序列。
3.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.权利要求1所述的Cas12a蛋白突变体在制备基因编辑产品中的应用。
5.一种碱基编辑器,其特征在于,所述碱基编辑器为脱氨酶和权利要求1所述的Cas12a蛋白突变体融合形成的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的碱基编辑器,其特征在于,所述脱氨酶融合于所述Cas12a蛋白突变体的N-末端、C-末端或内部的融合位点。
7.根据权利要求5或6所述的碱基编辑器,其特征在于,所述脱氨酶选自胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶;
优选地,所述胞嘧啶脱氨酶选自hA3A;
优选地,所述hA3A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列;
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶选自TadA-8e;
优选地,所述TadA-8e的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
8.权利要求1所述的Cas12a蛋白突变体或权利要求5-7任一项所述的碱基编辑器在基因编辑中的应用;
优选地,所述基因编辑包括同时在多基因位点进行基因编辑。
9.一种基因编辑方法,其特征在于,所述基因编辑方法包括:
利用权利要求1所述的Cas12a蛋白突变体和向导RNA组成CRISPR-Cas***进行基因编辑,或者,
利用权利要求1所述的Cas12蛋白突变体和由串联向导RNA经加工形成的向导RNA组成CRISPR-Cas***进行多基因位点同时基因编辑。
10.一种碱基编辑方法,其特征在于,所述碱基编辑方法包括:
使用权利要求5-7任一项所述的碱基编辑器进行碱基编辑;
优选地,所述碱基编辑方法包括:
使用权利要求5-7任一项所述的碱基编辑器和串联向导RNA进行多基因位点同时碱基编辑。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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