CN117701542A - 胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用，其氨基酸序列如附表所示，在高活性蛋白的分支附近发现了尚未报道的SddA，将其作为候选蛋白来进一步进行结构比对，检查并且基于结构比对的结果选择了自于Saccharopolyspora flava的SddA作为最终候选胞嘧啶脱氨酶之一进行活性评估，检测了SfSddA在HEK293T细胞中4个核靶位点的编辑效率，在靶标的位置显示出高效的C到T的编辑效率，所以包含SfSddA的CBE具有活性高、尺寸小等诸多优点，相比于现有其他CBE具有明显优势。

Description

胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用，可以有效实现真核细胞基因中C到T的转换。

背景技术

CRISPR/Cas***以其方便、高效的优势成为近些年来应用最广的基因编辑工具。在sgRNA的引导下，Cas蛋白到达靶位点处切割产生双链断裂，联合后续的DNA修复过程，借助于非同源末端连接实现基因敲除，或给予一段DNA模板，借助于同源重组实现基因修复。然而同源重组介导的基因修复效率普遍不高，且会引入大量的***与缺失。

更简便、高效且精准的单碱基编辑技术成为更有效地的纠正导致人类疾病点突变工具，也成为基因治疗研究的热门选择。目前开发的单碱基编辑***主要包括胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、鸟嘌呤碱基编辑器（GBE）和先导编辑器（PrimeEditor）。

CBE的核心组成元件是nCas9或dCas9和胞嘧啶脱氨酶，Cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶组成融合蛋白，还融合有尿嘧啶糖基化酶抑制剂（uracil glycosylase inhibitor，UGI）。具体工作原理：当融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA时，胞嘧啶脱氨酶可结合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因组DNA形成的R-loop区的ssDNA处，将该ssDNA上一定范围内的胞嘧啶（C）脱氨变成尿嘧啶（U），进而通过DNA复制或修复将U转变为胸腺嘧啶（T），最终实现C/G碱基对至T/A碱基对的直接替换。由David Liu实验室开发的CBE经历了四代升级，***胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI包含了大鼠的胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1），突变的Cas9（D10A）-nCas9以及两个尿嘧啶糖基化酶抑制子，实现了编辑效率及精准度的不断提升。但作为CBE的核心部件，已有的胞嘧啶脱氨酶受到基因序列上下文限制、效率低而脱靶效应明显、由于尺寸过大而无法通过腺相关病毒（AAV）病毒载体在体内运送等诸多限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的胞嘧啶脱氨酶，用于优化CBE，上述新型的胞嘧啶脱氨酶为源自黄色糖多孢菌（Saccharopolysporaflava）的单碱基DNA脱氢酶（SddA），将其命名为SfSddA，是基于针对现有单碱基DNA脱氢酶（SddA）数据的生物信息学分析发现的，SfSddA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还有一个目的是提供多核苷酸序列，表达如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还有一个目的是提供一种融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其包含Cas酶域；胞嘧啶脱氨酶域以及UGI域；所述的胞嘧啶脱氨酶域为SfSddA。

本发明还有一个目的是提供一种表达上述融合蛋白的多核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还有一个目的是提供一种重组表达载体，其包含上述融合蛋白的多核苷酸序列。

本发明还有一个目的是提供一种遗传工程化的宿主细胞，包含上述的重组表达载体或基因组中整合有所述的融合蛋白的多核苷酸序列，以及sgRNA，以及AAV。

本发明还有一个目的是提供一种胞嘧啶单碱基编辑器，其特征在于，所述的胞嘧啶单碱基编辑器是将编码上述融合蛋白的多核苷酸序列整合到表达载体上得到。

本发明还有一个目的是提供上述胞嘧啶碱基编辑器在制备用于介导基因编辑的试剂中的用途，用于进行基因编辑，降低脱靶效应、提高靶向编辑效率或提高靶向编辑的保真度。

本发明还有一个目的是提供一种基因编辑方法，包括以所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑，将编码所述的胞嘧啶碱基编辑器的多核酸序列以及sgRNA共同注射受体，从而进行基因编辑，所述的受体包括：体细胞或生殖细胞，所述的生殖细胞包括胚胎细胞或受精卵。

本发明还有一个目的一种用于进行基因编辑的试剂或试剂盒，其包括上述SfSddA或上述胞嘧啶碱基编辑器。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明通过研究报道的所有的DddA和SddA的数据，人为分类了其中数据集中的高活性蛋白，并进行了多序列比对生成种子数据集用于HMMER search，精简在生成数据库查询到的蛋白序列结果，然后与处理过的蛋白组进行多序列比对以构建进化树。由此在高活性蛋白的分支附近发现了尚未报道的SddA，将其作为候选蛋白来进一步进行结构比对，检查并且基于结构比对的结果选择了自于Saccharopolysporaflava的SddA作为最终候选胞嘧啶脱氨酶之一进行活性评估。

具体的本发明检测了SfSddA在HEK293T细胞中4个核靶位点的编辑效率，在靶标的位置显示出高效的C到T的编辑效率。

由上述可知，本发明的包含SfSddA的CBE具有活性高、尺寸小等诸多优点，相比于现有其他CBE具有明显优势。

附图说明

图1为本发明的胞嘧啶脱氨酶SfSddA结构预测图；

图2为sgRNA-1 C to T突变效率测序峰图，sgRNA-1识别的PAM序列为GGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₄to T网站评估突变效率为67%，C₆to T网站评估突变效率为61%。

图3为sgRNA-2 C to T突变效率测序峰图，sgRNA-2识别的PAM序列为GGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₅to T网站评估突变效率为14%，C₆to T网站评估突变效率为12%。

图4为sgRNA-3 C to T突变效率测序峰图，sgRNA-3识别的PAM序列为TGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₆to T网站评估突变效率为12%。

图5为sgRNA-4 C to T突变效率测序峰图，sgRNA-4识别的PAM序列为TGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₅to T网站评估突变效率为12%，C₆to T网站评估突变效率为10%。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实施例中制备了得到了新型的胞嘧啶脱氨酶、表达所述的胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸序列、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合蛋白、表达上述融合蛋白的多核苷酸序列和重组表达载体。

实施例1 、构建胞嘧啶脱氨酶SfCBE。

通过氨基酸序列比对确认SfSddA氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，预测结构如图1。合成SfSddA并将其克隆于酶切去除APOBEC的AncBE4max载体上，得到胞嘧啶脱氨酶SfCBE。

实施例2 、构建sgRNA载体。

根据NCBI基因库人的基因序列（人基因组序列的版本号是GRCh38），根据PAM序列（NGG）选择用于基因编辑的sgRNA靶向的区域，设计并合成4条针对人基因的sgRNA序列，具体如下：

sgRNA1-F序列：5-ccggGAACACAAAGCATAGACTGC-3;

sgRNA1-R序列：5-aaacGCAGTCTATGCTTTGTGTTC-3;

sgRNA2-F序列：5-ccggGAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3;

sgRNA2-R序列：5-aaacTTCTTCTTCTGCTCGGACTC-3;

sgRNA3-F序列：5-ccggGGAATCCCTTCTGCAGCACC-3;

sgRNA3-R序列：5-aaacGGTGCTGCAGAAGGGATTCC-3;

sgRNA4-F序列：5-ccggGGCCACACTAGCGTTGCTGC-3;

sgRNA4-R序列：5-aaacGCAGCAACGCTAGTGTGGCC-3。

将上述四对单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成四条靶向人不同基因位点的sgRNA的寡聚核苷酸链，然后将四个sgRNA分别连接至酶切后的线性化74707载体中得到四个靶向人核基因sgRNA表达载体。

实施例3、CBE转染293T细胞。

对构建的sgRNA表达载体测序验证后，提取目的质粒，进行乙醇醋酸钠沉淀沉淀纯化，将SfCBE与每个sgRNA表达载体通过脂质体转染的方式引入到293T细胞中，培养12小时后更换培养液，转染72小时后，提取各组细胞的基因组，用特异性的引物进行PCR反应，利用琼脂糖凝胶电泳将所获得的PCR产物胶块测序。通过对测序峰图分析来评估293T细胞的特定基因位点编辑情况，具体编辑效率峰图如图2至图5。如图2所示，sgRNA-1识别的PAM序列为GGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₄to T网站评估突变效率为67%，C₆to T网站评估突变效率为61%。如图3所示，sgRNA-2识别的PAM序列为GGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₅to T网站评估突变效率为14%，C₆to T网站评估突变效率为12%。如图4所示，sgRNA-3识别的PAM序列为TGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₆to T网站评估突变效率为12%。如图5所示，sgRNA-4识别的PAM序列为TGG，C转换T突变位点在黑色箭头所指处，C₅to T网站评估突变效率为12%，C₆to T网站评估突变效率为10%。

如图2至图5的测序峰图分析可知：SfSddA具有在293T细胞中脱氨胞嘧啶的能力，由其组合构成的CBE能够在sgRNA引导下在靶向DNA序列造成C到T的转换。本发明的胞嘧啶碱基编辑器的靶向编辑效率显著性提高。

本发明制备了遗传工程化的宿主细胞，包含上述的重组表达载体或基因组中整合有所述的融合蛋白的多核苷酸序列，以及sgRNA，以及AAV。

本发明制备了胞嘧啶单碱基编辑器，所述的胞嘧啶单碱基编辑器是将编码上述融合蛋白的多核苷酸序列整合到表达载体上得到。

本发明将胞嘧啶碱基编辑器用于进行基因编辑，降低脱靶效应、提高靶向编辑效率或提高靶向编辑的保真度。

本发明以所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑，将编码所述的胞嘧啶碱基编辑器的多核酸序列以及sgRNA共同注射受体，从而进行基因编辑，所述的受体包括：体细胞或生殖细胞，所述的生殖细胞包括胚胎细胞或受精卵。

本发明制备了用于进行基因编辑的试剂或试剂盒，其包括上述SfSddA或上述胞嘧啶碱基编辑器。

在本发明中，本发明的载体可以包含引物序列，例如，可以包含CAG启动子，此外，还可以利用通常所有被视作与CAG启动子同等的EF1α启动子之类的能够在哺乳动物中表达的启动子。并且，还可以是用ICAM2启动子之类的哺乳动物组织特异性启动子。上述CAG启动子作为基因表达启动子中的一种，用于表达外来基因。“启动子”通常作为转录的起点，位于带有所要表达的基因的遗传信息的DNA碱基序列的前部分，位于从转录起点开始的数百个碱基以内。在真核生物中，被称为转录调节因子的蛋白质与启动子部分结合，从而参与RNA聚合酶的结合。

在本发明中，“sgRNA”是指小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）。

在本发明中，该胞嘧啶碱基编辑器还与核定位序列连接；较佳地，N端和/或C端与核定位序列连接。所述的胞嘧啶碱基编辑器与核定位序列之间，还包括连接序列，如标签序列。在所述的胞嘧啶脱氨酶与核定位序列之间，还通过连接序列连接，所述的连接序列可以是任何不影响两者的功能的连接序列，例如可以是标签序列或一些本领域已知的柔性连接序列。合适的标签可以被用于本发明中。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE或Ty1。

本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。

本发明还可以包括所述的SfSddA的片段、衍生物和类似物。如本文所用术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SfSddA相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白（如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，SfSddA还可以包括（但并不限于）：若干个（通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个）氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括经改造的酶的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，SfSddA还包括（但并不限于）：与SfSddA氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。

本发明提供了编码本发明SfSddA或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明中编码所述的SfSddA的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列（和任选的附加编码序列）以及非编码序列。“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明的SfSddA核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或经改造的酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述的蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的SfSddA。一般来说有以下步骤：（1）用本发明的SfSddA的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；（2）在合适的培养基中培养的宿主细胞；（3）从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明提供了含有所述的经改造的酶或其多核苷酸序列的胞嘧啶碱基编辑器。所述的胞嘧啶碱基编辑器的其它组成元件是本领域技术人员已知的。

本发明中，所述的SfSddA多核苷酸序列或所述的胞嘧啶碱基编辑器多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有所述的SfSddA多核苷酸序列或所述的胞嘧啶碱基编辑器多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞后受体细胞。

本发明还提供了一种进行基因编辑的方法，包括以本发明所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑。除了采用本发明所述的胞嘧啶碱基编辑器进行基因编辑以外，其它方面的基因编辑试剂可以运用本领域已知的，例如sgRNA可以采用本领域已知的方式进行设计。

本发明中，适用的基因编辑的对象没有特别的限制，可以是体细胞或生殖细胞，可以是动物细胞或人细胞。

本发明扩展了CBE在实验室和临床上的应用。

最后应当说明的是，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

SfSddA氨基酸序列：

MSALEELLASLREIADQLESARADMSAGMDSWAERAATLEWWLTGTNDPDALDVLAQQPVTTDALRTSWEAVDLTVAVIEDYIGRLEAVESPSSSAASGNSTSGDDQAAQPSMTAPDGSRYPRAVGWAVDVMPRRVREGQGDRTVGYADGAVGQPFTSGHDQTWTPLILERARAVGLPARFAGLLGSHVEMKVATAMIQRGRRHSELVINHVPCGSQAGQRPGCHQALEKYLPEGHTLTVHGTTQGGEPYSHTYHGRAQR。

SfSddA核苷酸序列：

ATGTCCGCCCTCGAGGAACTGCTGGCTAGCCTGAGAGAGATCGCCGATCAGCTGGAATCCGCCAGAGCTGACATGAGCGCCGGAATGGACAGCTGGGCTGAAAGAGCAGCTACACTGGAATGGTGGCTGACAGGCACAAACGACCCCGATGCCCTGGACGTGCTGGCCCAGCAGCCAGTGACCACCGACGCCCTGCGGACATCTTGGGAGGCCGTGGACCTGACCGTGGCCGTCATCGAGGACTACATCGGCAGACTGGAAGCCGTTGAGAGCCCATCTAGCAGCGCCGCTTCTGGAAATAGCACAAGCGGCGACGACCAGGCTGCCCAGCCCAGCATGACCGCCCCTGATGGATCTAGATATCCTAGAGCCGTGGGCTGGGCCGTGGATGTGATGCCTAGGCGGGTGCGGGAAGGCCAGGGCGATAGAACCGTGGGCTACGCCGACGGAGCCGTCGGCCAGCCTTTCACCAGCGGCCACGACCAAACATGGACACCTCTGATCCTGGAGAGAGCCCGCGCCGTGGGACTGCCTGCCAGATTCGCCGGCCTGCTGGGCTCCCACGTGGAAATGAAGGTGGCCACCGCCATGATCCAGCGGGGCCGGCGGCACAGCGAGCTGGTGATTAACCACGTGCCCTGCGGCAGCCAGGCCGGCCAAAGACCTGGTTGTCACCAGGCCCTGGAGAAGTACCTGCCCGAGGGCCATACCCTGACCGTGCACGGCACCACCCAGGGCGGCGAGCCTTACAGCCACACCTACCACGGCAGAGCTCAGAGA。

SfSddA融合蛋白氨基酸序列：

PKKKRKVGSMSALEELLASLREIADQLESARADMSAGMDSWAERAATLEWWLTGTNDPDALDVLAQQPVTTDALRTSWEAVDLTVAVIEDYIGRLEAVESPSSSAASGNSTSGDDQAAQPSMTAPDGSRYPRAVGWAVDVMPRRVREGQGDRTVGYADGAVGQPFTSGHDQTWTPLILERARAVGLPARFAGLLGSHVEMKVATAMIQRGRRHSELVINHVPCGSQAGQRPGCHQALEKYLPEGHTLTVHGTTQGGEPYSHTYHGRAQRSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESIRPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARFLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPRAFKYFDTTIDRKVYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV。

SfSddA融合蛋白核苷酸序列：

ccaaagaagaagcggaaagtcggatccATGTCCGCCCTCGAGGAACTGCTGGCTAGCCTGAGAGAGATCGCCGATCAGCTGGAATCCGCCAGAGCTGACATGAGCGCCGGAATGGACAGCTGGGCTGAAAGAGCAGCTACACTGGAATGGTGGCTGACAGGCACAAACGACCCCGATGCCCTGGACGTGCTGGCCCAGCAGCCAGTGACCACCGACGCCCTGCGGACATCTTGGGAGGCCGTGGACCTGACCGTGGCCGTCATCGAGGACTACATCGGCAGACTGGAAGCCGTTGAGAGCCCATCTAGCAGCGCCGCTTCTGGAAATAGCACAAGCGGCGACGACCAGGCTGCCCAGCCCAGCATGACCGCCCCTGATGGATCTAGATATCCTAGAGCCGTGGGCTGGGCCGTGGATGTGATGCCTAGGCGGGTGCGGGAAGGCCAGGGCGATAGAACCGTGGGCTACGCCGACGGAGCCGTCGGCCAGCCTTTCACCAGCGGCCACGACCAAACATGGACACCTCTGATCCTGGAGAGAGCCCGCGCCGTGGGACTGCCTGCCAGATTCGCCGGCCTGCTGGGCTCCCACGTGGAAATGAAGGTGGCCACCGCCATGATCCAGCGGGGCCGGCGGCACAGCGAGCTGGTGATTAACCACGTGCCCTGCGGCAGCCAGGCCGGCCAAAGACCTGGTTGTCACCAGGCCCTGGAGAAGTACCTGCCCGAGGGCCATACCCTGACCGTGCACGGCACCACCCAGGGCGGCGAGCCTTACAGCCACACCTACCACGGCAGAGCTCAGAGAagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagtgacaagaagtacagcatcggcctggccatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctaaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcCggcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgtgagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccagattcctgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctcgggccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaaggtgtaccggagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggtgacagcggcgggagcggcgggagcggggggagcactaatctgagcga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Claims (10)

1.一种胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种多核苷酸序列，其特征在于，表达如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种融合蛋白，其特征在于：其包含Cas酶域；胞嘧啶脱氨酶域以及UGI域；所述的胞嘧啶脱氨酶域是如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶。

4.一种多核苷酸序列，其特征在于：表达如权利要求3所述的融合蛋白。

5.一种重组表达载体，其特征在于：其包含如权利要求4所述的多核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求5重组表达载体或基因组中整合有如权利要求4所述的多核苷酸序列，以及sgRNA。

7.一种胞嘧啶单碱基编辑器，其特征在于，所述的胞嘧啶单碱基编辑器是将如权利要求4所述的多核苷酸序列整合到表达载体上得到。

8.如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器在制备用于介导基因编辑的试剂中的用途，包括用于基因编辑，降低脱靶效应、提高靶向编辑效率或提高靶向编辑的保真度。

9.一种基因编辑方法，其特征在于，包括以如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器介导基因编辑，将编码所述的如权利要求4所述的多核苷酸序列以及sgRNA共同注射宿主细胞。

10.一种用于进行基因编辑的试剂或试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶或如权利要求7所述的胞嘧啶碱基编辑器。