CN101921746A - 基于PCR技术的100bpDNAladder制备用模板p111及其制备体系 - Google Patents

Abstract

基于PCR技术的100bp DNA ladder重组载体p111，图谱中含有3个100bp的重组DNA片段，每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为E100E100E100E。制备体系为以重组载体p111为模板，在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体：100/200/300/400/500-

-100/200/300/400/500，共25种复合体；经EcoRI酶切后，上述的复合体可被分解为各种100bp DNA ladder中所需的DNA片段。

Description

基于PCR技术的100bpDNAladder制备用模板p111及其制备体系

技术领域

本发明设计属于分子生物学和基因工程研究领域中电泳耗材DNAmarker(脱氧核糖核酸分子量标准)的制备方法的革新。具体地说，本发明以一种专有的PCR模板设计，建立了一种全新的基于PCR技术的制备100bp DNA ladder的新模式。

背景技术

DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个由DNA片段大小决定的分布梯度，用以指示电泳过程实验DNA样品的分子量。目前，DNA分子量标准多是购自生物公司；同时由于其应用的普遍性和必要性，为了节约开支，很多实验室都自己制备常用的分子量标准。按照DNA分子量标准制备所涉及的关键技术(过程)，其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。

1.通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准

利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点(天然的或人为加入的)，采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种：天然来源的特种DNA(如基因组)和人工构建的质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最常见的此类DNA分子是Lamda噬菌体的基因组DNA(λDNA)，由其产生的DNA分子量标准有λDNA/HindIII，λDNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如pBR322DNA/AluI marker和pBR322DNA/BsuRI(HaeIII)marker，但是所用的内切酶都是不常用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分离纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠杆菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大，获得的DNA片段片段在凝胶上片段锐利，过程重复性好。但这种制备方法也存在明显的缺点：构建含有多DNA片段的重组载体技术要求较高，技术水平直接决定了所构建载体产生的DNA分子量标准的质量。同时这种载体酶切的制备方式也不适用于DNA小片段的制备，目前DNA小片段主要是通过PCR扩增的方式进行制备。

2.通过PCR扩增制备DNA分子量标准

由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和购买dNTP的成本，其他PCR试剂如Taq DNA聚合酶，模板DNA，反应Buffer等均可自制。由于 生产效率低，劳动强度高，因而限制了其大规模的制备和应用。

由于上述的PCR技术制备DNA分子量标准的缺陷，很多人都尝试采用新的PCR设计以提高PCR技术制备DNA分子量标准的效率，但是技术水平改观不大。

长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域缺少作为PCR模板用的复合重组载体设计方案和一种用于100bp DNA ladder中片段扩增的专用载体，以及与之相应的制备体系。利用本发明中的载体可以复合体的方式制备DNA小片段，然后通过PCR产物的酶切得到所需的目标DNA小片段；以克服普通PCR扩增产生DNA片段生产效率低，劳动强度高等缺陷；从而能够快速、大规模的地生产DNA分子量标准100bp ladder。

发明内容

鉴于此，我们设计和构建了用作PCR扩增模板的重组载体p111，并建立了相应的100bp DNA ladder的制备体系，恰恰满足了上述需求，其目的在于：提供了一种100bp DNA ladder类型DNA分子量标准小片段PCR扩增的重组载体p111。

本发明的进一步目的在于：提供一种利用上述重组载体通过PCR扩增和酶切相结合的方法制备100bp DNA ladder中所需的DNA分子的制备体系。

为了实现上述目的，本发明提供的重组载体p111是一种专门用于100bpDNA ladder制备用的PCR重组载体；其图谱中含有3个100bp的重组DNA片段，每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为：E100E100E100E。

本发明中100bp DNA ladder的PCR扩增用重组载体p111的构建方法，包括如下步骤：

分别以拟南芥基因组的DNA为模板，利用PCR的方法扩增获得了如下片段100E、E100E、E100bp，其中100bpE的3’末端、E100bp的5’末端，E100E的两个末端带有EcoRI限制向内切酶的位点，三种DNA片段经EcoRI酶切后，以一种顺序连接的方式进行连接，然后以末端引物(DNA片段100E的正向引物+DNA片段E100的反向引物)对连接产物进行扩增，筛选获得连接产物100-100-100bp。同时为其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌呤核苷酸)；将上述连接产物TA克隆到克隆载体pGFM-T easy中，即得到所需的模板p111。

其100bp DNA ladder制备体系为：

以重组载体p111为模板，在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体：

100/200/300/400/500- 

-100/200/300/400/500，共25种复合体。经EcoRI酶切后，上述的复合体可被分解为各种100bp DNA ladder中所需的DNA片段(100、200、300、400、500bp)。

本发明的有益效果在于：设计了一种PCR扩增重组载体p111，其中含有3条由4个EcoRI酶切位点分隔的100bp重组片段；以此重组载体为PCR扩增模板能够以复合体的形式高效制备100bp ladder中的DNA片段(通过EcoRI酶切)。与传统的PCR扩增方法相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反应缓冲液、耗材等)、效率高(多片段的同时扩增)、省时省力等优点；其优势还在于通 过引物位点的选择可以灵活的调整所制备的DNA片段的种类及其之间的数量关系。

附图说明

图1是生产100bp DNA ladder用的重组载体p111图谱。

具体实施实例

参照附图，本发明提供的重组载体p111是一种专门用于100bp DNAladder制备用的PCR扩增模板；其图谱中含有3个100bp的重组DNA片段，每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为：E100E100E100E。

其100bp DNA ladder制备体系为：

以重组载体p111为模板，在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体：

100/200/300/400/500- 

-100/200/300/400/500，共25种复合体；

经EcoRI酶切后，上述的复合体可被分解为各种100bp DNA ladder中所需的DNA片段(100、200、300、400、500bp)。

Claims (2)

1.基于PCR技术的100bp DNA ladder重组载体p111，其特征在于：其图谱中含有3个100bp的重组DNA片段，每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的结构为：E100E100E100E。

2.根据权利要求1所述的基于PCR技术的100bp DNA ladder重组载体p111的制备体系为：特征在于：以重组载体p111为模板，在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体：100/200/300/400/500--100/200/300/400/500，共25种复合体；

经EcoRI酶切后，上述的复合体可被分解为各种100bp DNA ladder中所需的DNA片段(100、200、300、400、500bp)。