CN115725631A - 可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌构建及在抗逆育种中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有可控高突变率的谷氨酸棒杆菌及其应用。利用基因工程方法敲除或敲降了谷氨酸棒杆菌出发菌中的nucS或/和xpb或/和tagI基因，进一步过表达dinP基因，能够有效提高谷氨酸棒杆菌的自然突变频率，有助于实现在特定环境胁迫条件下“边突变边筛选”目的，快速选育具有优良抗逆性、适配性和稳定性的基因工程菌。该工程菌具有高突变率和较好可控性，可实现体内基因组连续突变进化，能够大大缩短实验室适应性进化周期，具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建及其在抗逆育种中应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的食品安全级工业微生物菌种，已被广泛用于多种氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和维生素等的生物合成，具有重要的经济价值和应用前景。但是在工业发酵条件下，例如发酵生产谷氨酸及其衍生产品时，谷氨酸棒杆菌时常面临着诸多的生理或非生理逆境胁迫，严重影响菌种的正常生理状态以及相关目标产物的高效积累，其中低酸胁迫、高温胁迫、高渗胁迫等是比较常见的环境胁迫压力。高性能的微生物菌种是发酵工程的基础，也是提高生物发酵产品产量和质量的重要保障，拥有优良稳定抗逆表型的工程微生物对于实现更高的发酵产量、产率和生产强度是必需的。但是由于技术手段和理论知识的限制，传统代谢工程较多集中于局部代谢网络的调控和优化，而对菌株外界环境胁迫的响应机制解析和耐受性能改造的认识和研究，一直以来是工业微生物遗传改造的短板。
适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution, ALE)是通过模拟自然进化中的变异和选择过程，以特定或逐渐增加的胁迫来筛选性能优良的突变体，是实现对微生物菌株优良性状选育的常用方法之一。虽然该方法是获得优异工程菌株的一种有效策略，但是由于微生物自然突变率水平极低，适应性进化可能需要较长时间连续培养才能积累突变，上述过程周期冗长且易在传代中容易染菌而导致进化失败。另外，由于随机突变的自身性质和频率是难以控制的，获得的有益突变种类和数量通常较少，适应性实验室进化在选育高性能微生物底盘菌方面仍具有较大局限性。
菌株突变表型通常是由编码DNA修复酶和蛋白质的基因功能失调引起的，这些基因确保了DNA复制的准确性。微生物在长期进化过程中发展出了许多修复DNA损伤的策略方法，包括碱基切除修复***、核酸切除修复***、错配修复***、同源重组修复***和SOS修复***等，理论上通过敲除、敲降或者过表达相关修复途径基因，可以提高微生物的基因组复制突变率，从而使其加快适应生理环境胁迫。微生物生活在不断变化的环境中，具有一种根据对环境的适应程度来调节突变率的生存策略。当适应能力受到遗传变异性的限制时，生物体自然选择倾向于群体中突变率较高的细胞。因此，可控高突变率对于微生物环境适应是有利的，将有助于增加有益突变产生概率，使微生物在一个相对较短的连续逆境周期内获得鲁棒性明显提升的进化表型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可控高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法及其应用，利用该工程菌建立基因组水平连续突变提升工具，可以实现在给定环境胁迫条件下的“边突变边筛选”，达到具有优良抗逆表型的谷氨酸棒杆菌工程菌可控高效选育目标。
为了更好地认识和理解谷氨酸棒杆菌DNA复制修复***在赋予基因组突变中的作用，本发明分别选取谷氨酸棒杆菌碱基切除修复***、核酸切除修复***、错配修复***、同源重组修复***和SOS修复***中的主要组分作为测试靶点（表2），通过构建相应的基因缺失或过表达菌株，并基于利福霉素抗性筛选实验（利福霉素抗性通常是由于其作用靶点RNA多聚酶β亚单位的编码基因rpoB突变引起），评估上述基因靶点在赋予谷氨酸棒杆菌基因组突变中的作用。经过多轮实验测试，最终获得4株具有较高突变水平的谷氨酸棒杆菌突变体，即nucS基因缺失菌株∆nucS，xpb基因缺失菌株∆xpb，tagI基因缺失和dinP过表达菌株∆tagI+P tuf -dinP，以及组合突变菌∆nucS ∆xpb ∆tagI+P tuf -dinP。
本发明基因表达调控策略包括降低基因组中nucS、xpb和tagI表达水平，提高dinP基因表达水平。由此本发明提供一种高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程方法敲除或敲降了出发菌中的nucS或/和xpb或/和tagI基因。优选地，进一步过表达dinP基因。
在一个具体实施方式中，所述dinP基因编码的蛋白质的NCBI登录号为CAF20484，但并不局限于这一具体蛋白质，其包括在谷氨酸棒杆菌的同源基因编码的蛋白质。
在一个优选方式中，利用基因工程方法敲除或敲降了出发菌中的nucS、xpb和tagI基因，并进一步还过表达dinP基因。
具体地，所述基因工程方法是基于CRISPR-dCpf1***的基因编辑方法或基于RNA干扰方法。其中，CRISPR-dCpf1***是目前被广泛运用的基因编辑***，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导失去切割活性的dCpf1核酸酶靶向特定目标序列，实现抑制或激活靶基因转录，达到对特定基因表达进行调控的目的。
其中优选地，所述基于CRISPR-dCpf1***的出发载体是质粒pJYS3-dCpf1，基于所述质粒是含有的温度敏感型复制子的质粒，在高温条件下无法复制，进而终止宿主细胞的突变，因而实现可控的高突变率。因而，本发明提供的基因表达调控工具包括重组质粒pJYS3-dCpf1-nucS、pJYS3-dCpf1-xpb、pJYS3-dCpf1-tagI+Ptuf -dinP和pJYS3-dCpf1-nucS- xpb-tagI+Ptuf -dinP，所述重组质粒一种含有温度敏感型复制子的质粒，在高温条件下无法复制，进而终止宿主细胞的突变。
其中，所述通过CRISPR转录产生的sgRNA介导失去切割活性的dCpf1核酸酶靶向特定所述的nucS、xpb、tagI基因和dinP基因，实现抑制或激活其基因转录，达到对其表达进行调控的目的。
本发明进而提供所述的构建方法获得的高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌。
具体地，所述的高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌在获得目标性状、表型或特性的突变菌中的应用。优选地，采用胁迫条件下对所述高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌进行培养，对得到的突变菌株进行筛选获得目标性状、表型或特性的突变菌。
更优选地，用于选育抗逆性能提升的突变菌。例如，采用酸胁迫适应性进化，以pH5.8、pH5.5、pH5.2低酸胁迫进行传代培养，然后筛选在低酸胁迫下具有较好生长特性的驯化菌，获得耐酸性能明显提升的谷氨酸棒杆菌突变菌。更具体地，将作为出发菌株应用于低酸耐受性进化实验，可以实现宿主底盘在一个相对较短的连续筛选周期内，获得对环境低酸胁迫具有更好适应性的进化菌株，提示该可控高突变率菌株在抗逆育种方面具有广阔的应用前景。
通过本发明能够有效提高谷氨酸棒杆菌的自然突变频率，有助于实现在特定环境胁迫条件下“边突变边筛选”目的，快速选育具有优良抗逆性、适配性和稳定性的基因工程菌。获得的工程菌具有高突变率和较好可控性，可实现体内基因组连续突变进化，能够大大缩短实验室适应性进化周期，具有广阔应用前景。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌高突变率菌的筛选测试。
图2为pJYS3-dCpf1-nucS-xpb-tagI+Ptuf -dinP重组质粒图谱。
图3为高突变率工程菌的低酸耐受快速进化应用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
其中实施例用到的引物如下表1。
表1所需的引物
| 引物名称 | 引物序列 (5’-3’) |
| nucS-up-F | TCCA<u>GCTCTTC</u>ATCCCTTATCGCCGGCGTTTCGGATGG |
| nucS-up-R | CCATGTTCTTAGAACAATGTTAAACGCATGCACCCACCATAAC |
| nucS-down-F | GTTATGGTGGGTGCATGCGTTTAACATTGTTCTAAGAACATGG |
| nucS-down-R | TCCA<u>GCTCTTC</u>AAGAGCATCGGCCATCTCAGCATCTGG |
| xpb-up-F | TCCA<u>GCTCTTC</u>ATCCCAGGCCTTAATTGATGGCGAAAACCC |
| xpb-up-R | GTTGTGCACGTTATAGCTCTTTAAAAGCCACGAAATGCTTC |
| xpb-down-F | GAAGCATTTCGTGGCTTTTAAAGAGCTATAACGTGCACAAC |
| xpb-down-R | TCCA<u>GCTCTTC</u>AAGAGAGCAGAAGTGGGTGTCAAAGATGTC |
| tagI-up-F | TCCA<u>GCTCTTC</u>ATCCGGTTACGGGACTGATTGCCAGCATCG |
| tagI-up-R | CTGATTTCCTAAGCCCACACACTCATGGATTCTCCTTGGGG |
| tagI-down-F | CCCCAAGGAGAATCCATGAGTGTGTGGGCTTAGGAAATCAG |
| tagI-down-R | TCCA<u>GCTCTTC</u>AAGACGGCTTCGATTGCAACGTTTGCCACCATG |
| dinP-up-F | TCCA<u>GCTCTTC</u>ATCCCGCGAAACCCGGTGCTTGC |
| dinP-up-R | CTGACACGCTAAAACGCGCTTTTTATGGTAG |
| tuf-F | CTACCATAAAAAGCGCGTTTTAGCGTGTCAG |
| tuf-R | CACCCAGCGTTGCATTGTATGTCCTC |
| dinP-down-F | GAGGACATACAATGCAACGCTGGGTG |
| dinP-down-R | TCCA<u>GCTCTTC</u>AAGATATTCCGATGGTTGCACCGAGG |
| pCRD206-F | CCA<u>GCTCTTC</u>ATCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG |
| pCRD206-R | CCA<u>GCTCTTC</u>AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATC |
| DCpf1-D917A-F | CGTTCGCCGCGAGCGATGGACAGGATGTGCACGTCGTTAGCCTTCTCCTTC |
| DCpf1-D917A-R | CATCCTGTCCATCGCTCGCGGCGAACGCCACCTCGCCTACTACACCCTGGTC |
| DCpf1-E1006A-F | GAAGTTCAGGTCTGCGAAGACCACGATTGCGTTGTAC |
| DCpf1-E1006A-R | CGTGGTCTTCGCAGACCTGAACTTCGGCTTCAAGCG |
| nucS-PAM-F | GTCATCGCCCGTTGCTCAGTTGAATTTCTACTGTTGTAGATATTTAAATAAAACGAAAGGCTC |
| nucS-PAM-R | AACTGAGCAACGGGCGATGACATCTACAACAGTAGAAATTCGGATCCATTATACCTAGGACTGAGCTAG |
| xpb-PAM-F | GATATCGTCCAATCCGATAAGACAGAATTTCTACTGTTGTAGATATTTAAATAAAACGAAAGGCTC |
| xpb-PAM-R | CTGTCTTATCGGATTGGACGATATCTACAACAGTAGAAATTCGGATCCATTATACCTAGGACTG |
| tagI-PAM-F | gatGGCTGCGCAAGATCCCCTGATgaatttctactgttgtagatatttaaataaaacgaaaggctc |
| tagI-PAM-R | cATCAGGGGATCTTGCGCAGCCatctacaacagtagaaattcggatccattatacctaggactg |
| P<sub>tuf</sub>-dinP-F | CAGTCTAGCTATCGCCAGCGTTTTAGCGTGTCAGTAG |
| P<sub>tuf</sub>-dinP-R | gtatttcatgggcttacactattcgtcatcccccgtttc |
谷氨酸棒杆菌DNA复制修复相关的功能元件描述如下表2。
实施例1：谷氨酸棒杆菌高突变率工程菌株的构建与测试
微生物在长期进化过程中发展出了许多修复DNA损伤的方法或途径，例如尿嘧啶糖基修复酶***和错配修复***能纠正复制的错误，光复活修复***、切除修复***、重组修复***和SOS修复***等能修复环境因素和体内化学物质造成的DNA分子损伤。谷氨酸棒杆菌DNA修复***和机制与大肠杆菌存在较大差异，但是缺少在许多微生物中已发现的具有重要功能MutS/MutL错配修复***。为了更好地认识和理解谷氨酸棒杆菌的DNA复制修复***在赋予基因组突变中的作用，选取了碱基切除修复***、核酸切除修复***、错配修复***、同源重组修复***和SOS修复***中的主要组分作为靶点，通过基因敲除策略获得相应的基因缺失突变菌，基于利福霉素抗性实验（菌株获得利福霉素抗性通常是由于其作用靶分子RNA多聚酶的β亚单位的编码基因rpoB突变引起），评估上述基因缺失后对于谷氨酸棒杆菌基因组水平突变率的影响。
采用基于温度敏感和SacB蔗糖致死原理的同源重组技术进行靶基因的无痕敲除，详细步骤可见公开专利CN112375726B、CN103805552B等。利用重叠延伸PCR的方法，获得含有靶基因上下游~1 kb侧翼序列的融合片段，亚克隆于pCRD206或pK18mobsacB等谷氨酸棒杆菌常用敲除载体，构建靶基因敲除质粒。在一个具体实施案例中，ΔnucS基因缺失突变体可通过以下构建方法获得：分别使用引物对nucS-up-F/nucS-up-R和nucS-down-F/nucS-down-R扩增获得谷氨酸棒杆菌nucS位点上游和下游侧翼区域，并通过重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)方法将上述获得的PCR产物融合成一个片段，随后基于Golden Gate快速克隆技术将其与pCRD206质粒骨架进行连接，获得pCRD206-nucS敲除质粒。将敲除质粒电转化相应谷氨酸棒杆菌后，经过两轮同源双交换过程后，可筛选得到ΔnucS基因缺失突变体。本实施例中提及的其它靶基因缺失突变体也采用相同策略筛选获得。在另一个具体实施案例中，dinP基因原位过表达突变体可通过以下构建方法获得：使用引物对tuf-F/tuf-R扩增获得谷氨酸棒杆菌强启动子tuf序列，使用引物对dinP-up-F/dinP-up-R和dinP-down-F/dinP-down-R扩增获得谷氨酸棒杆菌dinP位点上游和下游侧翼区域，并通过重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)方法将上述获得的PCR产物融合成一个片段，随后基于Golden Gate快速克隆技术将其与pCRD206质粒骨架进行连接，获得pCRD206-Ptuf-dinP原位表达质粒。将敲除质粒电转化相应谷氨酸棒杆菌后，经过两轮同源双交换过程后，可筛选得到Ptuf -dinP原位过表达菌。
采用利福霉素抗性实验评估基因组突变率。将野生型菌和相应基因突变菌接种于LBHIS液体培养基中，32℃、200 r/min培养过夜，取合适浓度的菌悬液直接涂布于添加有100 μg/mL利福霉素的LBHIS平板以及不添加利福霉素的LBHIS平板，32℃静置培养48 h后统计长出的菌落数量，计算基因突变率并拍照记录。基因组突变率公式如下所示：V=M/S，其中M表示为利福霉素抗性平板上生长的菌落数量，S表示为未添加利福霉素抗性的平板上生长的菌落总数。结果如图1所示，敲除基因组nucS[NCBI-ProteinID:CAF19919;Endonuclease]、xpb[NCBI-ProteinID:CAF19522；DNA/RNA helicase of superfamilyII]、tagI[NCBI-ProteinID:CAF20861；DNA-3-methyladenine glycosylase I]同时过表达dinP[NCBI-ProteinID:CAF20484；Y-family DNA polymerases]靶点均能不同程度地提高菌株的基因组突变频率。研究结果表明，野生型菌自然基因组突变频率为3.60±1.61×10-8，ΔnucS突变体的基因组突变频率为9.01±2.09×10-6，∆xpb突变体的基因组突变频率为1.17±0.31×10-6，∆tagI+P tuf -dinP突变体的基因组突变频率为1.05±0.12×10-6。相较于野生型菌自然突变频率，上述突变体的基因组突变频率分别提高了约250倍、32倍和29倍，提示***改造上述靶位点将有助于提高菌株的自然突变频率。随机挑取能够在利福霉素抗性平板上生长的单菌落，通过扩增获得rpoB基因编码区，然后对其进行Sanger测序分析，统计碱基突变的类型及位置（其中基于利福霉素抗性实验中，菌株获得利福霉素抗性通常是由于其作用靶分子RNA多聚酶的β亚单位的编码基因rpoB突变引起）。经分析发现，测序区域的碱基突变主要出现在五个位置：即第426位A→G (Gln→Arg)，第435位C→T (Ser→Phe)，第439位C→T (His→Tyr)，第439位A→G (His→Arg)和第444位C→T (Ser→Leu)，其中上述基因突变包含了SNPs中嘧啶置换嘧啶、嘌呤置换嘌呤的基本类型，并且C→T碱基转换突变数量占比最多，基本覆盖了上述所有的高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌。
实施例2：具有可控高突变率谷氨酸棒杆菌调控工具的构建
本实施例提供了一种基于CRISPR-dCpf1***的基因表达调控工具，所述作用靶点和效果包括降低基因组中nucS、xpb和tagI表达水平，提高dinP基因表达水平。CRISPR-dCpf1***是目前被广泛运用的基因编辑***，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导失去切割活性的dCpf1核酸酶靶向特定目标序列，实现抑制或激活靶基因转录，达到对特定基因表达进行调控的目的。本发明提供的基因表达调控工具是利用商业化质粒pJYS3_ΔcrtYf骨架构建获得，通过使用引物对dCpf1-D917A-F/dCpf1-D917A-R和dCpf1-E1006A-F/dCpf1-E1006A-R对Cpf1蛋白D917A和E1006A进行点突变，失活Cpf1蛋白的DNA切割活性，最终获得质粒pJYS3-dCpf1。分别使用引物对nucS-PAM-F/nucS-PAM-R、xpb-PAM-F/xpb-PAM-R、tag1-PAM-F/tagI-PAM-R，在pJYS3-dCpf1质粒的基础上分别构建获得pJYS3-dCpf1-nucS、pJYS3-dCpf1-xpb、pJYS3-dCpf1-tagI质粒，在这些质粒上分别含有一段Cpf1蛋白识别的PAM序列区（如表3所示）。使用引物对Ptuf-dinP-F/Ptuf-dinP-R扩增获得Ptuf-dinP片段，在pJYS3-dCpf1-tagI质粒的基础上分别构建获得pJYS3-dCpf1-tagI+Ptuf-dinP质粒。通过将上述位点组合后获得pJYS3-dCpf1-nucS-xpb-tagI+Ptuf -dinP重组质粒，其质粒序列如SEQ ID NO.1 所示。所述重组质粒能够表达失去切割活性的dCpf1核酸酶，以及靶向特定目标序列的sgRNA，同时质粒骨架上含有温度敏感型复制子，在高温条件下无法复制，进而终止宿主细胞的突变。将上述重组质粒pJYS3-dCpf1-nucS、pJYS3-dCpf1-xpb、pJYS3-dCpf1- tagI+Ptuf -dinP和pJYS3-dCpf1-nucS-xpb-tagI+Ptuf -dinP分别电转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032，然后将其涂布在含利福霉素的平板上，并计算其突变率。
表3基因元件和gRNA序列
| Geneelement | 5’-NYTV-3’ | Sequence (5’-3’) |
| nucS | 5’-TTTA-3’ | gaatttctactgttgtagatGTCATCGCCCGTTGCTCAGTTgaatttctactgttgtagat |
| xpb | 5’-TTTA-3’ | gaatttctactgttgtagatATCGTCCAATCCGATAAGACAgaatttctactgttgtagat |
| tagI | 5’-GTTG-3’ | gaatttctactgttgtagatGGCTGCGCAAGATCCCCTGATgaatttctactgttgtagat |
| array | gaatttctactgttgtagatGTCATCGCCCGTTGCTCAGTTgaatttctactgttgtagatATCGTCCAATCCGATAAGACAgaatttctactgttgtagatGGCTGCGCAAGATCCCCTGATgaatttctactgttgtagat |
分析结果表明，含有重组质粒pJYS3-dCpf1-nucS菌株与∆nucS基因缺失菌表现出相似的基因组突变频率，为野生型对照菌的270倍；含有重组质粒pJYS3-dCpf1-xpb或pJYS3-dCpf1-tagI+Ptuf -dinP的菌株，其基因组突变频率均稍低于相应的∆xpb或∆tagI+ P tuf -dinP菌，分别为野生型对照菌的12倍和7倍。
为了获得更高的基因组突变效率，我们将上述作用靶点进行组合操作。一方面，在染色体上同时敲除nucS、xpb、tagI和过表达dinP基因后，获得组合突变菌∆nucS ∆xpb ∆ tagI+P tuf -dinP；另一方面，通过构建获得pJYS3-dCpf1-nucS-xpb-tagI+Ptuf -dinP重组质粒（如图2所示），并将其转入谷氨酸棒杆菌，旨在降低nucS、xpb、tagI基因表达水平，同时提高dinP基因水平。采用利福霉素抗性实验评估上述两种菌的基因组突变率，发现组合突变菌∆nucS ∆xpb ∆tagI+P tuf -dinP的基因组突变率（2.42±0.39×10-5）为野生型对照菌（3.60±1.61×10-8）的672倍，而含有pJYS3-dCpf1-nucS-xpb-tagI+Ptuf -dinP重组质粒的菌株基因组突变率（平均突变率1.24±0.21×10-5）为野生型对照菌（3.60±1.61×10-8）的344倍。
上述结果进一步提示，基于CRISPR-dCpf1可以构建获得具有普适性的重组质粒***，有效调控nucS、xpb、tagI、dinP等靶点的基因表达水平，进而有效提升谷氨酸棒杆菌的自然突变频率。该方法操作简便，具有高效性和普适性，通过选用不同的调控工具能够可控制工程菌株所需突变率水平。
实施例3：具有可控高突变率谷氨酸棒杆菌的抗逆育种应用
为了验证上述高突变率工程菌在高性能菌株选育中的适用性，我们随机选择了一种低酸耐受性实验进行测试。如图3中a-c所示，选用野生型WT和高突变工程菌∆nucS、∆ xpb、∆tagI+P tuf -dinP和∆nucS ∆xpb ∆tagI+P tuf -dinP为出发菌株进行酸胁迫适应性进化，以pH5.8、pH5.5、pH5.2低酸胁迫条件进行传代培养，经过三轮共计9天传代（如图3中a-c），能够快速筛选得到在低酸胁迫下具有较好生长特性的驯化菌，经过后续分离纯化后从100个单菌落中得到一株耐酸性能提升最显著的谷氨酸棒杆菌突变菌Mutant-isolated。如图3中d所示，该突变菌在所测试的不同低酸pH胁迫条件性，生长性能明显优于野生型对照菌。上述结果提示利用该高突变率工程菌可大幅度提升菌株的自发突变频率，缩短适应性进化周期，将有助于后续优化和选育抗逆性能优良的工程底盘菌。
Claims (10)
1.一种高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程方法敲除或敲降了出发菌中的nucS或/和xpb或/和tagI基因。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，进一步过表达dinP基因。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述dinP基因编码的蛋白质的NCBI登录号为CAF20484。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用基因工程方法敲除或敲降了出发菌中的nucS、xpb和tagI基因，并进一步还过表达dinP基因。
5.如权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述基因工程方法是基于CRISPR-dCpf1***的基因编辑方法或基于RNA干扰方法。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基于CRISPR-dCpf1***的出发载体是质粒pJYS3-dCpf1，基于所述质粒是含有的温度敏感型复制子的质粒，在高温条件下无法复制，进而终止宿主细胞的突变，因而实现可控的高突变率。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述通过CRISPR转录产生的sgRNA介导失去切割活性的dCpf1核酸酶靶向特定所述的nucS、xpb、tagI基因和dinP基因，实现抑制或激活其基因转录，达到对其表达进行调控的目的。
8.如权利要求1至7任一项所述的构建方法获得的高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌。
9.如权利要求8所述的高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌在获得目标性状、表型或特性的突变菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，采用胁迫条件下对所述高突变率谷氨酸棒杆菌工程菌进行培养，对得到的突变菌株进行筛选获得目标性状、表型或特性的突变菌；优选地，用于选育抗逆性能提升的突变菌。
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| US20200056191A1 (en) * | 2018-08-15 | 2020-02-20 | Zymergen Inc. | APPLICATIONS OF CRISPRi IN HIGH THROUGHPUT METABOLIC ENGINEERING |
| CN113774077A (zh) * | 2021-09-17 | 2021-12-10 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种应用于结核分枝杆菌的单碱基基因编辑***及方法 |
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2022
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