CN107142272A - 一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法。本发明设计开发的质粒调控方法基于Crispr/Cas9***；其利用表达的dCas9蛋白以及转录的针对于质粒复制区靶序列的gRNA，有效的实现了质粒复制的调控抑制，该方法尚未见其它文献和专利报道，是一种全新的方法。该方法中使用的针对复制区的靶序列，可以有多种选择，保证了利用不同的dCas9/gRNA对，实现不同程度的质粒复制调控的目的。该方法能够有效的降低质粒复制后产量2‑34倍，相比以前专利报道的方法，具有调控范围更广，调控能力更强的特点。总之，该方法设计新颖，能够有效实现对质粒复制不同程度的调控。

Description

一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法。

技术背景

质粒是细胞中染色体以外，能够独立自主复制的较小的DNA分子。其长度从数千乃至几百万碱基不等。其拷贝数也能从几个到上千个不等。天然存在的质粒分子，通常对宿主细胞的生存没有决定性的作用，但是能够携带一些特殊的基因，比如抗生素抗性基因，致病调控基因等，增加宿主细胞的遗传与生理多样性。鉴于这些特点，在20世纪70年代前后，质粒DNA被开发成为有效的基因工程载体，用以携带外源基因到特定的宿主，进行基因克隆以及外源蛋白表达。

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性短杆菌，是人和动物肠道中最主要的栖居菌之一。实验室培养的大肠杆菌通常30min能够复制一代。其基因组长度为～4.7Mb,包含大约4000个基因。由于其结构简单，培养方式简单，生长迅速，遗传背景清晰，目前已经作为模式微生物，被广泛的应用于基因工程，分子生物学，代谢工程以及合成生物学相关的研究以及工业应用中。

目前，实验室和工业应用构建的～90％以上的质粒是在大肠杆菌中进行克隆复制或者生产的。这其中包括用于表达抗原分子的DNA疫苗；用于微生物，植物，动物蛋白表达和功能研究的质粒；用于微生物，植物，动物基因编辑以及转录控制的质粒以及用于自然界生物基因库保存的质粒等。质粒在大肠杆菌中的复制状态以及拷贝数等对于利用质粒进行功能研究以及工业应用具有重要的意义。比如，通过控制质粒的复制，调控质粒上基因的表达，对于研究质粒上单基因或多基因的表达，利用质粒进行合成生物学和分子生物学的研究具有重要价值。同时，控制质粒的复制能够有效的解决毒性基因克隆或表达困难的问题。一些DNA序列，其在大肠杆菌中随机或者定向转录出来的mRNA或者翻译出来的蛋白质能够对大肠杆菌的生长造成很大的干扰。这类基因被称为毒性基因。这些毒性基因在克隆进一些特定的载体比如哺乳动物表达载体pCDNA3.1以及大肠杆菌克隆载体pUC57的时候，由于这些载体的拷贝数比较高，使得这些外源基因的mRNA转录物以及蛋白表达产物对大肠杆菌生长干扰极大的增强，造成大肠杆菌死亡或者生长停滞。控制质粒的复制，使得质粒在大肠杆菌中复制的时候能够维持在一个较低的水平，是在构建毒性基因克隆表达质粒过程中常用的一种策略。

目前，基因工程和工业应用的，绝大多数构建的质粒为ColEI类型的质粒；代表性的ColE1质粒,比如pUC，pET，p15A以及pMB1系列质粒。ColEI类型的质粒的复制依赖于复制区转录的两个小RNA，RNAI以及RNAII。RNAII全长555bp。在质粒复制开始的时候，它首先被宿主的RNA聚合酶从其启动子区转录出来，并与质粒DNA模板形成复合物。接下来，其被宿主体内的RNAase H切割，产生游离的3’羟基端，并作为引物被DNA聚合酶I识别，引导质粒的复制。RNAI全长108bp，在ColEI的复制中起着负调控的作用。它从复制起点上游的455bp处(RNAII的中间)，以RNAII相反的方向转录，一直延伸到RNAII的5’转录起始区。它通过与RNAII的结合，阻止RNAII和DNA复制起始复合物的形成来抑制质粒的复制。RNAII对复制起始的正向作用和RNAI对复制起始的负向作用的平衡决定了质粒复制的拷贝数(Solar etal.1998Microbiol Mol Biol Rev；Tomizawa J.1984Cell；Camps M.2010,Recent Pat DNAGeneSeq)。

专利US 7,794,971 B1在大肠杆菌中利用诱导型的启动子表达了一个聚合酶基因pcnb的突变体，通过影响RNAI的多腺苷酸化，从而影响质粒的复制。PCNB聚合酶能够决定RNAI的多腺苷酸化，从而影响RNAI的降解以及与RNAII的复合物形成。pcnb突变体，能够大量积累RNAI的半衰产物。这些产物与RNAII的结合，从而抑制质粒的复制。该专利所述的菌株，同时被Epicentre公司(USA)开发成了商业化的感受态，对外售卖。据报道，在不诱导的情况下，其能针对性的降低CorE1类型的质粒，比如pET28a，pUC57等拷贝数4～20倍。同时，专利US 20110269184 A1利用一个诱导型的启动子在基因组上转录RNAI或RNAII，来实现CorE1类型质粒复制调控的目的。据其专利所述，其能够将pUC19质粒在细胞中的量降低10％，能够将去除RNAI序列的pUC19在细胞中的产量降低3倍左右。

然而由于专利限制以及实际使用效果一般的原因，这两种方法都无法被很好的应用。另外，由于这两种方法都是通过调控ColEI复制子起始复制的小RNA的功能，来达到调控质粒复制的目的，调控模式单一，这些方法很难用于对质粒复制的动态调控或者不同能力的调控。鉴于质粒复制调控对于调控质粒基因表达，研究质粒基因功能以及进行毒性基因克隆上的用途，开发出更加有效的，能够进行动态调控的质粒复制调控***显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控大肠杆菌中质粒复制的方法

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法，包括如下步骤：

步骤1：在被调控质粒R的复制起始区，选择一段20bp的靶序列N20，其中靶序列的3’端相邻的序列为NGG；

步骤2：在大肠杆菌细胞内表达一个Cas9蛋白的失活突变体dCas9蛋白(Cas9蛋白的H840-A及D10-A双突变体)以及转录出针对被调控质粒R复制起始区靶序列N20的gRNA。

进一步的其中步骤1中靶序列的选择在质粒R复制区的正链或负链上，该靶序列具有与大肠杆菌基因组上的序列不同源的特点。

进一步的其中步骤2中gRNA的基因序列为：N20(步骤1涉及的靶序列)+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(gRNA scaffold+termination sequence)。

进一步的其中步骤2中dCas9蛋白可以通过***染色体上的dCas9基因来表达或通过带有不同于待调控的R质粒复制子的质粒来表达。

进一步的其中步骤2中dCas9蛋白为Cas9蛋白的第10位天冬氨酸以及第840位的组氨酸突变为丙氨酸的突变体(dCas9序列参考文献Jinek et al.2012,Science.所述；序列见SEQ ID NO:1；突变位点以下划线标注)。所述的dCas9蛋白可以通过***染色体上的dCas9基因来表达或通过带有不同于待调控的R质粒复制子的质粒来表达。

进一步的其中步骤2中gRNA的表达可以通过***染色体上的gRNA的靶基因来转录或通过带有不同于待调控的R质粒复制子的质粒来转录。

进一步的其中步骤1，2中，为了能够实现对质粒复制能力的不同程度的调控，可以选择多个针对复制起始区不同的靶序列位点设计多个gRNA表达序列。利用表达出的dCas9蛋白和转录出的不同的gRNA实现对质粒复制不同程度的调控。

本发明的有益效果：

本发明利用Crispr/Cas9***开发出一套调控质粒复制的方法。Crispr/Cas9***最早发现于微生物细胞中，是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。最近一些年，科学家们利用该***的DNA编辑能力，开发出了一系列针对哺乳动物，植物，微生物的基因组编辑(基因敲除/基因敲入)，基因表达调控以及染色体复制调控的工具。然而，利用Crispr/Cas9***进行质粒复制调控尚未见报道。本发明利用表达的dCas9蛋白以及转录的针对于质粒复制区靶序列的gRNA，有效的实现了质粒复制的调控抑制，是一种全新的方法。该方法中使用的针对复制区的靶序列，可以有多种选择，保证了利用不同的dCas9/gRNA对，实现不同程度的质粒复制调控的目的(如图1为利用Crispr/Cas9***调控质粒复制原理示意图)。本发明提供的方法比专利US 7,794,971 B1及US 20110269184 A1涉及的***，其能够更加灵活的实现对质粒复制不同程度的调控。其能够有效的降低同等条件下复制的质粒产量2-34倍，这比已存在的专利US 7,794,971 B1及US 20110269184 A1涉及的***调控范围更广，调控能力更强。总之，该方法具有设计新颖，适用性广的特点，能够有效实现质粒复制不同程度的调控。

附图说明：

图1利用Crispr/Cas9***调控质粒复制原理示意图。

其中，A,染色体上或者拥有不同于R质粒复制子类型的质粒上的dCas9表达以及gRNA转录；B,dCas9和gRNA形成复合物共同调控质粒R的复制。

图2针对质粒R复制子ColEI随机选择的3个靶序列G-01，G-02,G-03序列及位置图谱。

图3表达dCas9和gRNA的pTD-1/2/3质粒图谱。

具体实施方式

实施例1：利用Crispr/Cas9***调控携带ColE1类型复制子高拷贝质粒的复制

本实施例的目的是构建一套Crispr/Cas9***调控携带ColEI类型复制子高拷贝质粒的复制。其步骤如下：

1.针对于ColEI类型复制子区，设计3条不同的gRNA靶序列，命名为G-01(accagcggtggtttgtttgc),G-02(tcgccactggcagcagccac),G-03(ctttctcccttcgggaagcg)(见附图2),其中靶序列的3’端相邻的序列为NGG。其中G-01位于复制区DNA的正链上，G-02，G-03位于复制区DNA的负链上。

2.针对于ColEI类型复制子高拷贝质粒，设计一个表达Crispr/Cas9调控***的质粒，其带有如下特点：a.1个pSC101类型的温敏型复制子,保证该质粒在大肠杆菌中的复制；b.1个dCas9蛋白的表达框，保证dCas9的表达；c.1个gRNA转录框，其中编码gRNA的基因是在Lac启动子的控制下转录；Lac启动子的活力受质粒上的LacI蛋白负调控；d.1个卡拉霉素抗性基因表达框(表达卡拉霉素抗性基因)。在GenScript公司合成携带编码gRNA-1(G-01+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT)；gRNA-2(G-02+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT)；gRNA-3(G-03+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT)编码基因的质粒pTD-1,pTD-2和pTD-3(质粒图谱示意图见附图2；质粒序列见SEQ ID NO:2,其中G-01，G-02和G-03的序列以NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN表示)。

3.测试质粒表达的Crispr/Cas9***对ColEI类型质粒的调控。

a.取ColEI类型质粒pUC57和3个dCas9和gRNA表达质粒，pTD-1,pTD-2和pTD-3；以pUC57/pTD-1，pUC57/pTD-2和pUC57/pTD-3的双质粒组合转化大肠杆菌Top10菌株(NEB,UK)，分别涂布于卡拉霉素和氨苄青霉素双抗平板，过夜培养。同时将pUC57单独转化到大肠杆菌Top10菌株(NEB,UK)中，涂布于氨苄青霉素的抗性平白上，过夜培养，作为实验对照。

b.从各平板上挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，过夜培养。

c.按照1/500的接种量，转接到LB液体培养基中。

d.当菌株生长至OD600～1，取12ml培养物中，分3份，利用Axygen(USA)质粒小抽试剂盒抽提质粒。

e.取等量抽提的质粒用KpnI酶切，采用10ul的反应体系，37℃反应1h(选择KpnI的原因是它在pUC57，pTD-1,pTD-2和pTD-3质粒上均为单酶切位点)。利用Agilent2100Bioanalyzer检测仪(USA)，检测pUC57的产量，并换算出12ml菌液抽提的pUC57的总量。

4.如下表1结果，转化有pTD-1,pTD-2,pTD-3的菌株，其pUC57的产量分别降低了1.95倍，33.7倍和18.6倍。这表明选用不同的gRNA能够不同程度的降低pUC57质粒的拷贝数，证实了我们设计的Crispr/Cas9***能够有效的实现对质粒复制不同程度的调控。相比目前已存在的专利US 7,794,971 B1及US 20110269184 A1涉及的***，其能够更加灵活的实现对pUC57质粒复制不同程度的调控。同时，pTD-2显示能够使得pUC57产量降低最多33.7倍，这比已存在的***所揭示的能实现的最大程度(20倍)的调控要强得多。

表1携带pTD-1,pTD-2,pTD-3质粒的菌株中抽提的pUC57总量差异

*降低的倍数＝Top10菌株中pUC57的产量/携带pTD-1,pTD-2,pTD-3质粒Top10菌株中pUC57的产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司

<120> 一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> dCas9蛋白编码基因

<400> 1

atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

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attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

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gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160

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<211> 9426

<212> DNA

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<221> misc_feature

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aaaggcttaa gtagcaccct cgcaagctcg gttgcggccg caatcgggca aatcgctgaa 3060

tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc tgagtcgctg tctttttcgt gacattcagt 3120

tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg ggggtaaatg gcactacagg cgccttttat 3180

ggattcatgc aaggaaacta cccataatac aagaaaagcc cgtcacgggc ttctcagggc 3240

gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta tctgactttt tgctgttcag cagttcctgc 3300

cctctgattt tccagtctga ccacttcgga ttatcccgtg acaggtcatt cagactggct 3360

aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 3420

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tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 3840

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aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 4380

ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 4440

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tagtagatga agttgcttat catgagaaat atccaactat ctatcatctg cgaaaaaaat 5340

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ttaagtttcg tggtcatttt ttgattgagg gagatttaaa tcctgataat agtgatgtgg 5460

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tagaaaatct cattgctcag ctccccggtg agaagaaaaa tggcttattt gggaatctca 5640

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ttggagatca atatgctgat ttgtttttgg cagctaagaa tttatcagat gctattttac 5820

tttcagatat cctaagagta aatactgaaa taactaaggc tcccctatca gcttcaatga 5880

ttaaacgcta cgatgaacat catcaagact tgactctttt aaaagcttta gttcgacaac 5940

aacttccaga aaagtataaa gaaatctttt ttgatcaatc aaaaaacgga tatgcaggtt 6000

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tctttgatga taaggtgatg aaacagctta aacgtcgccg ttatactggt tggggacgtt 6900

tgtctcgaaa attgattaat ggtattaggg ataagcaatc tggcaaaaca atattagatt 6960

ttttgaaatc agatggtttt gccaatcgca attttatgca gctgatccat gatgatagtt 7020

tgacatttaa agaagacatt caaaaagcac aagtgtctgg acaaggcgat agtttacatg 7080

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aaaatactca attgcaaaat gaaaagctct atctctatta tctccaaaat ggaagagaca 7380

tgtatgtgga ccaagaatta gatattaatc gtttaagtga ttatgatgtc gatgccattg 7440

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tagtttctga cttccgaaaa gatttccaat tctataaagt acgtgagatt aacaattacc 7860

atcatgccca tgatgcgtat ctaaatgccg tcgttggaac tgctttgatt aagaaatatc 7920

caaaacttga atcggagttt gtctatggtg attataaagt ttatgatgtt cgtaaaatga 7980

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atccgaaatc cactgaaagc acagcggctg gctgaggaga taaataataa acgaggggct 9300

gtatgcacaa agcatcttct gttgagttaa gaacgagtat cgagatggca catagccttg 9360

ctcaaattgg aatcaggttt gtgccaatac cagtagaaac agacgaagaa tccatgggta 9420

tggaca 9426

Claims (7)

1.一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：在被调控质粒R的复制起始区，选择一段20bp的靶序列N20，其中靶序列的3’端相邻的序列为NGG；

步骤2：在大肠杆菌细胞内表达一个Cas9蛋白的失活突变体dCas9蛋白以及转录出针对被调控质粒R复制起始区靶序列N20的gRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中靶序列的选择在质粒R复制区的正链或负链上，该靶序列具有与大肠杆菌基因组上的序列不同源的特点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中gRNA的基因序列为：N20+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中dCas9蛋白可以通过***染色体上的dCas9基因来表达或通过带有不同于待调控的R质粒复制子的质粒来表达。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中gRNA的表达可以通过***染色体上的gRNA的靶基因来转录或通过带有不同于待调控的R质粒复制子的质粒来转录。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选择转录针对不同靶序列的gRNA来实现对质粒复制不同程度的调控。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选择对dCas9的表达以及gRNA的转录进行调控，以实现对质粒复制不同程度的调控。