CN115724912A - 一种垂体后叶提取液的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种垂体后叶提取液的纯化方法，包括如下步骤，取垂体后叶粉，用水提取，过滤；采用沉降离心机将步骤1）滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，得提取液A；将步骤2）残渣重复步骤1）、2）方法，合并滤液，得提取液B；合并提取液A和提取液B，通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，得到澄清的微滤后溶液；将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液C；重复用注射用水冲洗步骤5）截留端溶液，切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液D；合并透过端溶液C和D，再用冰醋酸调节pH 3~4，得垂体后叶提取液成品。本发明无需配置缓冲体系，直接采用水提，大大简化了操作步骤，沉降离心与切向流膜包提高了除杂效果，使用冰醋酸调节pH，所得成品稳定性增强。

Description

一种垂体后叶提取液的纯化方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种垂体后叶提取液的纯化方法。

背景技术

垂体后叶激素，是由脑垂体后叶中提取的一种混合类多肽激素，主要包含加压素和缩宫素两种主要成分。加压素由九个氨基酸组成，因含有两个半胱氨酸，所以又称八肽。加压素具有抗利尿和升高血压两种作用，因此也称为抗利尿激素。缩宫素也由九个氨基酸组成，因其对平滑肌有刺激作用，能使子宫平滑肌收缩，具有催产作用，故又称催产素。

垂体后叶提取液即为垂体后叶注射液的原料，在提取垂体后叶中活性成分时，对猪脑垂体后叶提取液制备过程中过滤困难，会同时提取出一些分子量较大的有关物质，高分子物质超标又带有颜色，在药物中无治疗作用，可能影响药物的稳定性、疗效，甚至对人体的健康有害，因此去除此类高分子量杂质尤其关键。

CN201510215900.2公开了一种垂体后叶激素的纯化方法。该方法包括下述步骤：

(1)将垂体后叶激素原液与缓冲液混合，所述的缓冲液的pH 值为3.0～5.0；

(2)采用超滤膜进行超滤，收集截留液；

(3)将截留液用水稀释，加入酸调节溶液pH 值至1.0～2.0；

(4)采用超滤膜进行反超滤，收集超出液，即可。

该专利除杂的原理是通过加入酸，是蛋白质变性沉淀，然后过滤去除；该方法可以去除垂体后叶提取液中高分子量杂质，制得的产品纯度高，但需进行两次超滤，生产成本较高，生产耗时较长，且需要添加酸调节溶液，在生产过程中引入了新的物质，不利于注射液的质量控制。

现有技术在生物大分子活性物质分离纯化过程中，为了去除分子量较大的有关物质，目前主要采用透析、凝胶层析或超滤技术。在垂体后叶激素粗提液中一部分有关物质会与垂体后叶激素凝聚，另一部分有关物质又保持与垂体后叶激素分离，同时垂体后叶激素自身也会形成多聚体。若采用透析技术纯化垂体后叶激素会使原液稀释，同时收率较低，生产周期长；采用凝胶层析技术则载量小，生产成本高，操作技术要求高，对与有关物质结合的垂体后叶激素不能彻底分离，影响收率。采用超滤时，大部分垂体后叶激素并不能透过超滤膜，而是与有关物质一起存在于截留液，降低了后叶素的收率。

发明内容

本发明一种垂体后叶提取液的纯化方法，无需配置缓冲体系，直接采用水提，操作简单，沉降离心与切向流膜包除杂效果好，使用冰醋酸调节pH成品稳定性强。

为实现上述发明目的，本发明一种垂体后叶提取液的纯化方法，具体实施方案为：

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，包括如下步骤，

1）取垂体后叶粉，用水提取，过滤；

2）采用沉降离心机将步骤1）滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，得提取液A；

3）将步骤2）残渣重复步骤1）、2）方法，合并滤液，得提取液B；

4）合并提取液A和提取液B，通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，得到澄清的微滤后溶液；

5）将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液C；

6）重复用注射用水冲洗步骤5）截留端溶液，切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液D；

7）合并透过端溶液C和D，再用冰醋酸调节pH 3~4，得垂体后叶提取液成品。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，所述水提取、沉降离心、切向流膜包微滤、切向流膜包超滤按顺序依次联合使用。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，该方法步骤1）所述水提使用的水为纯化水、注射用水中的一种或两种，优选注射用水。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤2）所述沉降离心转速为2500~4200 r/min，优选4000 r/min。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤3）所述残渣提取分离重复次数为1-5次，优选2-3次。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤4）切向流微滤膜包材质为：聚醚砜、聚偏氟乙烯、再生纤维素等，优选再生纤维素，切向流微滤膜包孔径为0.2~1.0 μm，优选为0.65 μm。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤5）和6）切向流超滤膜包材质为：聚醚砜、再生纤维素等，优选聚醚砜，切向流超滤膜包孔径为10~100 KD，优选为100 KD。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤6）截留端溶液冲洗、超滤重复次数为3-10次，优选5次。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，步骤4）、步骤5）、步骤6）所述夹具装备共用。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，所述水提取中注射用水与垂体后叶粉比例为（1-7）：（30-90）。。

本发明所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，所述水提取中注射用水与垂体后叶粉比例为（1-3）：（45-80），优选1:50。

本发明技术优势分析：

本发明工艺先用沉降离心的方法来替代传统的布氏漏斗方法，能快速得到分离的提取液，再用切向流膜包的微滤方法除去不溶性的物质，提高澄明度，使滤液变澄清，切向流微滤膜包的孔径选用0.2~1.0 μm。过滤完再用切向流的超滤膜包过滤，就可以得到高分子量物质合格的提取液，切向流超滤膜包的孔径选用10 KD~100 KD。

现有的垂体后叶素提取工艺中，提取液与后叶粉的分离通过布氏漏斗过滤，容易堵塞滤纸，过滤速度很慢，且得到的滤液澄明度不高。在提取结束后，为了提高澄明度，降低高分子量物质，进一步采用滤膜过滤，此时过滤的速度同样很慢，影响过滤效率，过滤完后的滤液检测高分子量物质，达不到药典标准。现有的垂体后叶提取液超滤纯化技术会将大部分的有效成分升压素和缩宫素与高分子量物质一同截留，造成有效成分收率低，提高了制备成本，

本发明针对以上缺点采用水提取、沉降离心粗过滤并结合微滤、超滤技术，能很好的解决传统工艺存在的这些问题：

1）使用沉降离心代替传统的布氏漏斗过滤，加快了提取过程固液分离的速度，避免了呈粘稠状态的后叶粉吸附在滤纸上不容易分离的困扰，采用沉降离心，后叶粉沉降在离心管底，第二、三次提取时，只需用提取溶剂冲洗，就很快将后叶粉冲离管底，不粘附，此时后叶粉没有损失，从而不影响第二、三次提取的效率和收率，所以沉降离心是一个很不错的分离方法。

2）沉降离心分离完后，采用切向流膜包代替滤膜进行微滤，能有效的除去提取液中的浑浊物质，大大提高提取液的澄明度，这对超滤膜包的使用，起到了很好的保护作用，可以延长超滤膜包使用的寿命。接着采用超滤膜包，能高效的除去高分子量物质，从而解决了不符合药典标准的问题，采用切向流膜包用于微滤和超滤，有一个无与伦比的优势，就是这两套膜包可以采用同一套夹具设备使用，从而避免了占用空间，同时也降低了设备成本。

此外，本发明使用冰醋酸调节pH成品，所得成品稳定性增强，易于保存。

具体实施方式

下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明范围。

实施例1：

（1）取干燥后叶粉300克，加入注射用水15 kg，在室温下搅拌30分钟，采用沉降离心机将滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，转速3800转/分，10分钟分离，残渣再用注射用水8kg、8 kg按同法提取二次，将三次提取液合并；

（2）将合并的提取液通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，孔径尺寸0.45 μm过滤，得到澄清的微滤后溶液；

（3）将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，孔径尺寸50 KD，得到透过端溶液，称量截留端溶液重量，再用等量的注射用水冲洗截留端溶液，重复操作5次，合并所有透过端溶液，再用冰醋酸调节pH 3~4；

上述步骤微滤切向流膜包材质选用聚醚砜，超滤切向流膜包材质选用再生纤维素。

实施例2：

（1）取干燥后叶粉300克，加入注射用水15 kg，在室温下搅拌60分钟，采用沉降离心机将滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，转速4200转/分，10分钟分离，残渣再用注射用水8kg、8 kg按同法提取二次，三次提取液合并，用冰醋酸调节pH 3~4；

（2）将合并的提取液通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，孔径尺寸0.65 μm过滤，得到澄清的微滤后溶液；

（3）将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，孔径尺寸100 KD，得到透过端溶液，称量截留端溶液重量，再用等量的注射用水冲洗截留端溶液，重复操作5次，合并所有透过端溶液，再用冰醋酸调节pH 3~4；

上述步骤微滤切向流膜包材质选用聚偏氟乙烯，超滤切向流膜包材质选用再生纤维素。

实施例3：

（1）取干燥后叶粉300克，加入注射用水15 kg，在室温下搅拌60分钟，采用沉降离心机将滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，转速4000转/分，10分钟分离，残渣再用注射用水8kg、8 kg按同法提取二次，三次提取液合并，用冰醋酸调节pH 3~4；

（2）将合并的提取液通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，孔径尺寸0.80 μm过滤，得到澄清的微滤后溶液；

（3）将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，孔径尺寸100 KD，得到透过端溶液，称量截留端溶液重量，再用等量的注射用水冲洗截留端溶液，重复操作5次，合并所有透过端溶液，再用冰醋酸调节pH 3~4；

上述步骤微滤切向流膜包材质选用再生纤维素，超滤切向流膜包材质选用聚醚砜。

对比实施例1（CN 201510215900.2）

（1）缓冲液配制：配制浓度为100 mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至3.0。

（2）样品预处理：量取垂体后叶激素原液2.0 L，按原液：缓冲液＝4：1(体积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。

（3）超滤：采用2 KDa的超滤膜进行超滤，收集截留溶液，待透过端液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。

（4）稀释：准确量取截留端溶液200 mL，按照5倍体积加入纯化水，采用2M HCl调节样品pH至2.0。

（5）反超滤：采用5 KDa的超滤膜，对稀释截留端溶液进行超滤，收集透过端溶液，待透过端液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。

对比实施例2（现有技术）：

（1）缓冲液配制：配制浓度为100 mmol/L的CH3COONa-CH3COOH缓冲液，pH调节至5.0。

（2）样品预处理：量取垂体后叶激素原液2.0 L，按原液：缓冲液＝1：1(体积比)的比例，加入缓冲液，搅拌混匀。

（3）超滤：采用2 KDa的超滤膜进行超滤，收集截留溶液，待透过端液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。

（4）稀释：准确量取截留端溶液，按照5倍体积加入纯化水，采用2M H2SO4调节样品pH至1.5。

（5）反超滤：采用5 KDa的超滤膜，对稀释截留端溶液进行超滤，收集透过端溶液，待透过端液体积达到垂体后叶超滤起始体积的90％时，停止超滤。

对上述实施例和对比实施例样品的澄明度、高分子量杂质水平和活性成分收率，结果如下表所示：

样品来源	澄明度	高分子量物质（%）	升压素收率（%）	缩宫素收率（%）
					实施例1	澄清	0	91.2	90.5
实施例2	澄清	0	95.5	95.1
					实施例3	澄清	0	97.1	95.3
对比实施例1	浑浊	0	68.2	62.6
					对比实施例2	浑浊	0	78.1	74.5

高分子量物质采用中国药典2020年版，分子排阻色谱法测定。

本发明使用水提、沉降离心、切向流技术配合，提高了溶液除杂效果、澄明度：水提取相较于醇提、酸提不会增加原液有关物质；沉降离心利用固-液比重差，并依靠离心力场使之扩大几千倍，固相在离心力的作用下被沉降，从而实现固液分离，避免了呈粘稠状态的后叶粉吸附在滤纸上不容易分离的困扰，有利于高分子物质去除，后叶粉损失微小保障了有效成分的收率；采用切向流膜包代替滤膜进行微滤，能有效的除去提取液中的浑浊物质，大大提高提取液的澄明度；采用10 KD以上的超滤膜包，和对比实施例采用的2 KD和5 KD的比较， 10 KD以上膜包更有利于有效成分升压素和缩宫素透过超滤膜包，降低有效成分截留率，从而进一步提高有效成分收率，上述工艺每一步骤顺序协同配合，保证了本发明纯化效果。

实验例1：

按照实施例3方法，将水提改为有机酸提，将最后得到的所有透过端溶液，不用冰醋酸调节pH 3~4，制得样品1；取实施例3方法成品得样品2，将样品1、样品2放置一个月，进行高分子量物质，升压素、缩宫素检测，结果如下：

样品	澄明度	高分子量物质（%）	升压素收率（%）	缩宫素收率（%）
					样品2	澄清	0	97.1	95.3
样品1	澄清	0	80.3	77.1

样品1、样品2比较，发现水提与用冰醋酸调节pH 3~4后，放置1个月，有稳定提取液的作用。

实验例2：

按照实施例3方法，将布氏漏斗替换沉降离心机，将普通滤膜替换切向流膜包，制得样品3；取实施例3方法成品得样品2，将样品2、样品3，进行高分子量物质，升压素、缩宫素检测，结果如下：

样品	澄明度	高分子量物质（%）	升压素收率（%）	缩宫素收率（%）
					样品2	澄清	0	97.1	95.3
样品3	澄清	33.6	79.3	78.1

样品2、样品3比较，发现沉降离心配合用切向流膜包后，对于去除高分子物质效果更佳。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）取垂体后叶粉，用水提取，过滤；

2）采用沉降离心机将步骤1）滤液和粘稠后叶粉残渣进行分离，得提取液A；

3）将步骤2）残渣重复步骤1）、2）方法，合并滤液，得提取液B；

4）合并提取液A和提取液B，通过装有切向流膜包的夹具装备进行微滤，得到澄清的微滤后溶液；

5）将微滤后溶液通过装有切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液C；

6）重复注射用水冲洗步骤5）截留端溶液，切向流膜包的夹具装备进行超滤，得到透过端溶液D；

7）合并透过端溶液C和D，再用冰醋酸调节pH 3~4，得垂体后叶提取液成品。

2.根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，该方法步骤1）所述水提取使用的水为纯化水、注射用水中的一种或两种，优选注射用水。

3. 根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤2）所述沉降离心转速为2500~4200 r/min，优选4000 r/min。

4.根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤3）所述残渣提取分离重复次数为1-5次，优选2-3次。

5. 根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤4）切向流微滤膜包材质为：聚醚砜、聚偏氟乙烯、再生纤维素等，优选再生纤维素，切向流微滤膜包孔径为0.2~1.0 μm，优选为0.65 μm。

6. 根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤5）和6）切向流超滤膜包材质为：聚醚砜、再生纤维素等，优选聚醚砜，切向流超滤膜包孔径为10~100KD，优选为100 KD。

7.根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤6）截留端溶液冲洗、超滤重复次数为3-10次，优选5次。

8.根据权利要求1所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，步骤4）、步骤5）、步骤6）所述夹具装备共用。

9.根据权利要求2所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，所述水提取中注射用水与垂体后叶粉比例为（1-7）：（30-90）。

10.根据权利要求9所述一种垂体后叶提取液的纯化方法，其特征在于，所述水提取中注射用水与垂体后叶粉比例为（1-3）：（45-80），优选1:50。