CN115667290A - 新型il10激动剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有改善的抗肿瘤治疗功效的IL10激动剂。

Description

新型IL10激动剂及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月12日提交的美国临时申请号63/023,703的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
2.序列表
本申请含有已以ASCII格式电子提交的序列表，并在此通过引用整体并入。所述创建于2021年5月7日的ASCII副本名为RGN-002WO_SL.txt，大小为95,986字节。
3.发明背景
细胞因子白介素-10(IL-10或IL10)，也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，是通过作用于T细胞、B细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)来调节多种免疫应答的多效性细胞因子。尽管IL10主要在巨噬细胞中表达，但也在激活的T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中检测到表达。由于其对抗原呈递的抑制(通过降低II型主要组织相容性复合体(MHC-II)和共刺激配体CD80/CD86的表达)、对髓系细胞释放促炎细胞因子的抑制和对T细胞致敏(priming)的抑制(通过对CD28信号传导的抑制)，IL10起初被报道为抑制免疫应答。然而，最近的研究还描述了IL10通过B细胞的共刺激、NK细胞溶细胞活性的增强以及溶细胞性T细胞增殖、细胞因子释放和溶细胞活性的增强的免疫刺激作用(由Mosser和Zhang，2008，Immunol Rev.226:205-18综述)。
人IL10是非共价连接的同二聚体，其受体是包含两个IL10Rα(也称为IL10R1)分子和两个IL10Rβ(也称为IL10R2)分子的异四聚体复合物。IL10Rα在所有IL10响应细胞上表达，而IL10Rβ在大多数细胞类型中组成型表达。在结合IL10后，IL10Rα诱导IL10Rβ的构象变化，从而允许IL10Rβ也结合IL10。一旦IL10/IL10Rα/Il10Rβ复合物组装，酪氨酸激酶Jak1和Tyk2就会被激活，并使IL10Rα细胞内结构域中的特定酪氨酸残基磷酸化，从而导致介导IL10下游信号传导的信号转导和转录激活因子3(STAT3)的募集。与IL10独有的IL10Rα不同，IL10Rβ亚基由包括IL22、IL26和INFλ在内的其他II型细胞因子的受体共享(由Shouval等人，2014，Adv.Immunol.122:177-210综述)。
由于IL10的多效活性，其与包括炎症病症、免疫相关病症、纤维化病症和癌症在内的广泛的疾病、病症和病况相关。
在治疗中使用IL10尤其是任何形式的重组IL10的一个缺点是其短血清半衰期。IL10体内活性的丧失可能是由于包括肾清除和蛋白水解降解在内的多个因素。
通过提高IL10的循环寿命(延迟清除)、溶解度和稳定性，拥有能够更好地耐受治疗期间的全身性暴露的IL10激动剂将是一个优势。本公开解决了本领域中的这个需求以及其他相关需求。
4.发明概述
本公开源于具有预料不到的改善的体内治疗功效，特别是抗肿瘤活性的IL10激动剂的发现。
可用于本公开的IL10激动剂的IL10部分描述于第6.3节中。
可用于本公开的IL10激动剂的Fc结构域描述于第6.4节中。
可用于本公开的IL10激动剂的靶向部分描述于第6.5节中。
可用于本公开的IL10激动剂的稳定化部分描述于第6.6节中。
本公开的IL10激动剂的各种示例性构象描述于下文具体实施方案60至77中。
可用于连接本公开的IL10激动剂的不同组分的接头描述于第6.7节中。
本公开进一步提供了编码本公开的IL10激动剂的核酸。编码IL10激动剂的核酸可以是单个核酸(例如，编码IL10激动剂的所有多肽链的载体)或多个核酸(例如，编码IL10激动剂的不同多肽链的两个或更多个载体)。本公开进一步提供了经工程改造以表达本公开的核酸和IL10激动剂的宿主细胞和细胞系。本公开进一步提供了产生本公开的IL10激动剂的方法。示例性核酸、宿主细胞和细胞系，以及产生IL10激动剂的方法描述于下文第6.8节和具体实施方案199至204中。
本公开进一步提供了包含本公开的IL10激动剂的药物组合物。示例性药物组合物描述于下文第6.8.3节和具体实施方案211至223中。
本文进一步提供了使用本公开的IL10激动剂和药物组合物的方法，例如用于治疗癌症和免疫病症。示例性方法描述于第6.10节中。本公开的IL10激动剂可用于联合疗法，例如作为CART疗法的辅助剂。示例性联合治疗方法公开于6.11中。本公开的治疗方法的具体实施方案描述于下文具体实施方案224至304中。
5.附图说明
图1A-1B说明了IL10对CD8 T细胞的致敏与效应功能的不同影响。
图2A-2B说明了本公开的IL10激动剂。图2A说明了IL10激动剂的一般形式，图2B说明了本公开的IL10激动剂的具体实施方案。图示旨在描述包括在IL10激动剂中的结构域的N端至C端顺序，而非旨在传达比例或三维构象。IL10M11(未图示)与IL10M3相似，但具有替代IL10M3的人IL10部分的鼠IL10部分。
图3A-3F说明了IL10突变蛋白对STAT3介导的萤光素酶报告基因活性的活性。重组IL10和IL10突变蛋白在工程化的Ramos/STAT3-Luc(图3A-图3C)和TF-1/STAT3-Luc(图3D-3F)报告细胞中增加STAT3反应元件驱动的萤光素酶活性。图由所使用的IL10激动剂所区分，其中黑色实心圆圈代表IL10M1(图3A、图3D)、IL10M2(图3B、图3E)或IL10M3(图3C、图3F)，空心填充正方形代表同种型对照(对于图3A、图3B、图3D和图3E为人IgG4隐形(lgG4stealth)，对于图3C和图3F为小鼠IgG1)，三角形代表可商购的人IL10(购自Peptrotech)。
图4A-4I说明了IL10突变蛋白将来自供体5500Y的原代人T细胞的细胞因子释放抑制到与重组人IL10相似的水平。来自供体5500Y的T细胞释放的IL2(图4A、图4D、图4G)、TNFa(图4B、图4E、图4H)和IFNγ(图4C、图4F、图4I)与同种异体丝裂霉素C处理的PBMC和IL10M1(图4A-图4C)、IL10M2(图4D-图4F)或IL10M3(图4G-图4I)共孵育。图由IL10突变蛋白所区分，其中黑色实心圆圈代表IL10突变蛋白，空心方块代表同种型对照(对于IL10M1和IL10M2为hIgG4，对于IL10M3为mIgG1)，灰色三角形代表重组人IL10。
图5A-5C说明了IL10突变蛋白将来自供体6900M的原代人T细胞的细胞因子释放抑制到与重组人IL10相似的水平。来自供体6900M的T细胞释放的IL2(图5A、图5D、图5G)、TNFa(图5B、图5E、图5H)和IFNγ(图5C、图5F、图5I)与同种异体丝裂霉素C处理的PBMC和IL10M1(图5A-图5C)、IL10M2(图5D-图5F)或IL10M3(图5G-图5I)共孵育。图由IL10突变蛋白所区分，其中黑色实心圆圈代表IL10突变蛋白，空心方块代表同种型对照(对于IL10M1和IL10M2为hIgG4s，对于IL10M3为mIgG1)，灰色三角形代表重组人IL10。
图6A-6B显示了IL10突变蛋白与同种型对照相比在同基因小鼠模型中的抗肿瘤活性。显示了在第11天(图6A)和第32天(图6B)的肿瘤体积。
图7A-7F显示了不同IL10突变蛋白在STAT3萤光素酶测定中的活性。
图8A-8I显示了IL10M11的抗肿瘤活性。IL10M11在预防性或治疗性施用后对多种肿瘤细胞系具有抗肿瘤活性(图8A-8E)。IL10M11施用导致产生TNFα和IFN-γ的CD4和CD8 T细胞的频率增加(分别为图8F和8G)。IL10M11诱导长期记忆和对继发性肿瘤攻击的排斥(分别为图8H和8I)。
图9A-9C显示了IL10M11与PD-1拮抗剂和CD40激动剂联合施用的结果。这些结果表明，调节这些通路增强了由IL10M11引发的持久的原发性和记忆性抗肿瘤应答。
图10A-10E显示了A20、Colon25、MC38和B16F10肿瘤中总CD45+免疫细胞和分析的免疫细胞亚群的密度。这些结果表明，A20、Colon26和MC38细胞中总CD45+免疫细胞的密度远高于B16F10肿瘤，并且B16F10肿瘤具有更少的Ki67增殖CD4和CD8 T细胞和/或记忆表型。
图11A-11I显示了PD-1和IL10R1 I在脾脏、引流***(dLN)和肿瘤中的多种髓系细胞中的表达。IL10R1在T细胞，特别是CD8 T细胞上的表达非常局限于肿瘤浸润性CD8 T细胞，在次级淋巴组织如MC38-cOVA和Colon26的脾脏和引流LN的T细胞上几乎没有表达。几乎所有的IL10R1+CD8 T细胞都表达PD1分子。
图12A-12G显示PD-L1在四种不同肿瘤类型(A20、Colon26、MC38和B16F10)中的表达。结果表明，PD-L1的表达在肿瘤类型中是可变的。
图13A-13C说明了A20肿瘤模型研究的实验设计(图13A)和用对照、IL10M11或PD-1拮抗剂抗体治疗的结果(图13B和13C)。150mm3 A20 B细胞淋巴瘤对PD-1Ab治疗有应答，具有肿瘤生长的显著延迟以及约50％的无肿瘤存活率。IL10M11引发了针对A20的更深入和更广泛的免疫应答，具有约85％的无肿瘤存活率。
图14A-14C说明了Colon26肿瘤模型研究的实验设计(图14A)和用对照、IL10M11或PD-1拮抗剂抗体治疗的结果(图14B和14C)。100mm3肿瘤对PD1Ab治疗完全耐受。用IL10M11治疗导致约85％的无肿瘤存活率。
图15A-15C说明B16F10肿瘤模型研究的实验设计(图15A)和用对照、IL10M11或PD-1拮抗剂抗体治疗的结果(图15B和145)。100mm3 B16F10肿瘤对PD1 Ab应答较差。IL10M11显著延迟了肿瘤的生长并使大多数肿瘤产生应答。
图16A-16C说明MC38肿瘤模型研究的实验设计(图16A)和用对照、IL10M11、PD-1拮抗剂抗体或IL10M11和PD-1拮抗剂抗体的组合治疗的结果(图16B和16C)。PD1 Ab和IL10-Fc作为单药具有相似的抗肿瘤作用。PD1Ab和IL10-Fc的组合通过延缓肿瘤生长和提高无肿瘤存活率而显著增加抗肿瘤应答。
图17A-17B显示了治疗后肿瘤微环境的免疫谱结果。如图所示，IL10治疗显著增加了免疫原性MC38肿瘤模型(图17A)和免疫原性较低的4T1肿瘤模型(图17B)中的CD8 T细胞密度，其在两种情况下都与更好的预后相关。
图18A-18B显示了MC38肿瘤(图18A)和4T1肿瘤(图18B)中PD1+CD8 T细胞的密度。
图19显示了用IL10M11治疗幼稚、非荷瘤小鼠后各种细胞因子的血清水平。
图20显示了用IL10M11治疗B16F10荷瘤小鼠后各种细胞因子的血清水平。IL12、IL1b、IL2、IL4和IL5由IL10上调，但不由PD1抗体上调。
图21A-21B显示了IL12(图21A)和IL4(图21B)的血清水平，归一化为同种型对照治疗小鼠中的平均值。IL12和IL4的上调显示在A20、MC38、MC38-cOVA、B16F10和Colon26肿瘤模型中。
图22A-22B说明了MC38肿瘤模型研究的实验设计(图22A)和用对照、IL10M11、PD-1拮抗剂抗体、IL10M11和PD-1拮抗剂抗体的组合、或连接至PD-1结合结构域的IL10(mPD1-mIL10)治疗的结果(图22B和22C)。PD1 Ab和IL10-Fc作为单药均表现出抗肿瘤作用(PD1 Ab的作用很小，IL10-Fc的作用中等)。IL10-Fc和PD-1Ab的组合显著提升了疗效。PD1-IL10-Fc在疗效方面与对照Ab-IL10或IL10-Fc没有任何差异。
6.发明详述
6.1.定义
缔合的：在IL10激动剂或其组分(例如，靶向部分如抗体)的上下文中，术语“缔合的”是指两条或多条多肽链之间的功能关系。特别地，术语“缔合的”是指两条或更多条多肽彼此缔合，例如，通过分子相互作用非共价地缔合或通过一个或多个二硫桥或化学交联键共价地缔合，从而产生功能性IL10激动剂。可以存在于本公开的IL10激动剂中的缔合的实例包括(但不限于)Fc区中同二聚体或异二聚体Fc结构域之间的缔合、Fab或scFv中VH和VL区之间的缔合、Fab中的CH1和CL之间的缔合，以及结构域取代的Fab中CH3和CH3之间的缔合。
癌症：术语“癌症”是指以异常细胞不受控制(并且通常是快速)生长为特征的疾病。癌细胞可以在局部扩散或通过血流和淋巴***扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例并且包括但不限于乳腺癌、***癌、卵巢癌、***、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、肾上腺癌、自主神经节癌、胆管癌、骨癌、子宫内膜癌、眼癌、输卵管癌、生殖道癌、大肠癌、脑膜癌、食道癌、腹膜癌、垂体癌、***癌、胎盘癌、胸膜癌、唾液腺癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、上呼吸道癌、尿道癌、***癌、外阴癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
互补决定区或CDR：如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。一般来说，每个重链可变区有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，每个轻链可变区有三个CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义、ABM定义和IMGT定义。参见例如，Kabat,1991,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-948(Chothia编号方案)；Martin等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(ABM编号方案)；以及Lefranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77(IMGT编号方案)。公共数据库也可用于识别抗体内的CDR序列。
EC50：术语“EC50”是指在特定暴露时间后诱导基线和最大值之间的半数响应的分子(如IL10激动剂)的半数最大有效浓度。EC50基本上代表其中观察到其最大效应的50％的抗体或IL10激动剂的浓度。在某些实施方案中，EC50值等于在如第7.1.2节中所述的测定中给定半数最大STAT3激活的IL10激动剂的浓度。
表位：表位或抗原决定簇是由本文所述的抗体或其他抗原结合部分识别的抗原(例如，靶分子)的一部分。表位可以是线性的或构象的。
Fab：在本公开的靶向部分的上下文中，术语“Fab”指一对多肽链，第一条包含抗体N端的可变重(VH)结构域至第一恒定区(本文称为C1)，并且第二条包含抗体N端的可变轻(VL)结构域至能够与第一恒定区配对的第二恒定区(本文称为C2)。在天然抗体中，VH位于重链的第一恒定区(CH1)的N端，并且VL位于轻链的恒定区(CL)的N端。本公开的Fab可以根据天然方向排列或包括有助于正确VH和VL配对的结构域取代或交换。例如，可能用CH3区对取代Fab中的CH1和CL区对，以促进异二聚体分子中正确修饰的Fab链配对。也可以颠倒CH1和CL，使得CH1附接至VL且CL附接至VH，这种构象通常称为Crossmab。
Fc结构域和Fc区：术语“Fc结构域”指与另一重链的相应部分配对的重链部分。术语“Fc区”指通过缔合两个重链Fc结构域形成的基于抗体的结合分子的区域。Fc区内的两个Fc结构域可以彼此相同或不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但一个或两个Fc结构域可以有利地被修饰以允许例如通过杵臼相互作用异二聚化。此外，Fc结构域可以包括来自一种以上免疫球蛋白同种型的嵌合序列。
宿主细胞：如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入本公开的核酸的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这些术语指特定的受试细胞和这种细胞的后代或潜在后代。因为在后代中可以由于突变或环境影响发生某些修饰，因此这种后代实际上可以与亲代细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。典型的宿主细胞是真核宿主细胞，如哺乳动物宿主细胞。示例性真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，例如脊椎动物细胞，如小鼠、大鼠、猴或人细胞系，例如HKB11细胞、PER.C6细胞、HEK细胞或CHO细胞。
IL10突变蛋白：是具有IL10活性的变体IL10分子。变体可以是例如与野生型IL10相比具有一个或多个氨基酸取代的IL10融合蛋白(例如，与IL-2Ra融合的IL10)和/或突变体IL10。与野生型IL10相比，IL10突变蛋白可以具有改变的功能(例如，受体结合、亲和力、细胞因子活性)和/或改变的药代动力学。虽然在本公开的IL10激动剂的上下文中，术语“IL10突变蛋白”有时指IL10分子的非靶向组分(和缔合的接头部分)，并且应理解术语“IL10突变蛋白”涵盖具有或不具有靶向部分以及具有或不具有多聚化部分的IL10分子，除非上下文另有说明。
主要组织相容性复合体和MHC：这些术语指天然存在的MHC分子、MHC分子的单条链(例如，MHC I类α(重)链、β2微球蛋白、MHC II类α链和MHC II类β链)、MHC分子的这些链的单个亚基(例如MHC I类α链的α1、α2和/或α3亚基、MHC II类α链的α1-α2亚基、MHC II类β链的β1-β2亚基)以及部分(例如，肽结合部分，例如肽结合槽)、突变体及其各种衍生物(包括融合蛋白)，其中这些部分、突变体和衍生物保留展示抗原肽以供T细胞受体(TCR)例如抗原特异性TCR识别的能力。MHC I类分子包含由重链的α1和α2结构域形成的可容纳约8-10个氨基酸的肽的肽结合槽。尽管两类MHC都结合肽内约9个氨基酸(例如，5至17个氨基酸)的核心，但MHC II类肽结合槽(II类MHCα多肽的α1结构域与II类MHCβ多肽的β1结构域缔合)的开放性质允许更宽范围的肽长度。结合MHC II类的肽的长度通常在13到17个氨基酸之间变化，但较短或较长的长度并不少见。因此，肽可以在MHC II类肽结合槽内移动，从而在任何给定时间改变直接位于凹槽内的9-聚体。本文使用特定MHC变体的常规鉴定。该术语涵盖“人白细胞抗原”或“HLA”。
可操作地连接：如本文所用，术语“可操作地连接”指多肽链的两个或更多个区域之间的功能关系，其中两个或更多个区域连接以产生功能性多肽或两种或更多种核酸序列，例如产生两个多肽组分的框内融合或将调节序列连接到编码序列。
单链Fv或scFv：如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体的VH和VL结构域的多肽链，其中这些结构域存在于单条多肽链中。
特异性(或选择性)结合：如本文所用，术语“特异性(或选择性)结合”是指靶向部分例如抗体或其抗原结合结构域(“ABD”)，与在生理条件下相对稳定的靶分子形成复合物。特异性结合可以表征为约5x10-2M或更小(例如，小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10- 7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、或小于10-10M)的KD。用于确定抗体或抗体片段(例如，IL10激动剂或组分靶向部分)对靶分子的结合亲和力的方法是本领域公知的并且包括例如平衡透析、表面等离子共振(例如，Biacore测定)、荧光激活细胞分选(FACS)结合测定等。然而，包含特异性结合来自一个物种的靶分子的靶向部分或其ABD的本公开的IL10激动剂可以与来自一个或多个其他物种的靶分子具有交叉反应性。
受试者：术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可以互换使用。
靶分子：如本文所用，术语“靶分子”是指在细胞表面或细胞外基质中表达的任何生物分子(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质或其组合)，其可以由本公开的IL10激动剂中的靶向部分特异性结合。
靶向部分：如本文所用，术语“靶向部分”指可以在本公开的IL10激动剂所定位的位点处(例如，肿瘤细胞上或肿瘤微环境中的淋巴细胞上)结合细胞表面或细胞外基质分子的任何分子或其结合部分(例如，免疫球蛋白或抗原结合片段)。除了将IL10激动剂定位到特定位点之外，靶向部分还可以具有功能活性。例如，作为抗PD1抗体或其抗原结合部分的靶向部分也可以通过抑制PD1信号传导而表现出抗肿瘤活性或增强IL10突变蛋白的抗肿瘤活性。
治疗、疗法、处理：如本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“处理”指增殖性病症的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善，或由于一种或多种本公开的IL10激动剂的施用引起的增殖性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)的改善。在具体实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“处理”指患者不一定可辨别的增殖性病症的至少一种可测量的物理参数如肿瘤的生长的改善。在其他实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“处理”指通过例如稳定可辨别的症状在生理上，或通过例如稳定物理参数在生理上，或两者来抑制增殖性疾病的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“处理”指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
肿瘤：术语“肿瘤”与本文中的术语“癌症”可以互换使用，例如，这两个术语都涵盖固体和液体肿瘤，例如扩散的或循环的肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前的以及恶性的癌症和肿瘤。
肿瘤相关抗原：术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”指整体或作为片段(例如，MHC/肽)在癌细胞表面表达的分子(通常是蛋白质、碳水化合物、脂质或它们的一些组合)，并且其可用于将药物优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，TAA是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施方案中，TAA是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多的细胞表面分子。在一些实施方案中，TAA是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，TAA将整体或作为片段(例如，MHC/肽)在癌细胞的细胞表面上表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。因此，术语“TAA”涵盖对癌细胞具有特异性的抗原，在本领域中有时称为肿瘤特异性抗原(“TSA”)。
通用轻链：如本文在靶向部分的上下文中使用的术语“通用轻链”指能够与靶向部分的重链区配对并且也能够与其他重链区配对的轻链多肽。通用轻链也称为“共同轻链”。
VH：术语“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括scFv或Fab的重链。
VL：术语“VL”指免疫球蛋白轻链的可变区，包括scFv或Fab的轻链。
6.2.IL10激动剂
本公开提供了包含IL10部分、任选的多聚化部分和任选的靶向部分的IL10激动剂。
IL10也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，被归类为2型(类)细胞因子，其为一组包括IL19、IL20、IL22、IL24(Mda-7)和IL26、干扰素(例如，IFNγ、IFNβ、IFNγ)和干扰素样分子(例如，限制素、IL28A、IL-28B)的细胞因子。
IL10是在免疫调节和炎症中具有多效性的细胞因子。其由肥大细胞产生，抵消这些细胞在过敏反应部位的炎症作用。虽然其能够抑制促炎细胞因子如IFNγ、IL2、IL3、TNFα和GM-CSF的合成，但IL10还对某些T细胞和肥大细胞具有刺激作用，并刺激B细胞成熟、增殖和抗体产生。IL10可以阻断NFκB活性并参与JAK-STAT信号传导通路的调节。其还诱导CD8+T细胞的细胞毒活性和B细胞的抗体产生，并抑制巨噬细胞活性和促肿瘤炎症。CD8+T细胞的调节是剂量依赖性的，其中更高的剂量诱导更强的细胞毒性应答。
人IL10是同二聚体。每个单体都作为178个氨基酸的未成熟分子形式产生，其中前18个是信号肽，在分泌时被切割以产生含有160个氨基酸的成熟IL10。尽管每个亚基在残基12和108之间以及残基62和114之间含有两个链内二硫键，二聚体中的IL10单体是非共价缔合的。单体以非共价方式二聚化以形成V形结构，其中每一半由六个α螺旋组成，其中四个来自一个亚基，两个来自另一个亚基。本公开的IL10激动剂可以是单体或多聚体形式，例如二聚体(同二聚体或异二聚体)或高阶复合物。为方便起见，同二聚体(或同一多肽的更高阶多聚体)的IL10激动剂通过其组成单体来描述；然而，在合适的细胞系中重组表达组分单体后，可以产生同二聚体(或更高阶的多聚体)分子。
适用于本公开的IL10激动剂的示例性IL10部分描述于第6.2节中。
IL10激动剂可以是单体或两条多肽链的同二聚体，每条多肽链包含IL10部分、Fc部分(例如，包含CH2结构域和CH3结构域的Fc结构域)、任选的铰链部分、任选的接头部分和任选的靶向部分。
因此，IL10激动剂可以是单体或两个多肽单体的同二聚体或异二聚体。单体或二聚体中的每个单体可以从氨基端到羧基端包含：
i)任选的靶向部分；
ii)任选的铰链结构域；
iii)Fc结构域，例如包含CH2结构域和CH3结构域的Fc结构域；
iv)接头部分；和
v)IL10部分。
IL10激动剂的二聚化可以通过两个单体的铰链结构域之间的二硫键、两个单体的Fc结构域之间的二硫键、两个单体的IL10部分之间的非共价键或以上两种的任何组合或所有三种发生。当期望IL10激动剂的单体形式时，单体二聚化的能力通过修饰IL10部分和Fc结构域以降低其二聚化能力，Fc结构域例如如第6.3节中的IL10部分和第6.4节中所描述。
示例性Fc部分描述于第6.4节中，包括赋予IL10激动剂二聚化能力的Fc结构域。活性IL10是二聚体分子并且IL10在体内具有非常差的药代动力学，部分由于血流中的单体化。不受理论的束缚，据信并入Fc结构域和任选的铰链结构域尤其通过稳定IL10的二聚体结构而改善IL10激动剂的血清稳定性和药代动力学特征。
有时，为方便起见，IL10部分和Fc结构域部分以及它们之间任选的接头在本文中称为IL10突变蛋白，但是术语“突变蛋白”也涵盖具有靶向部分的分子。示例性靶向部分描述于第6.5节中，包括与肿瘤相关抗原结合、与肿瘤微环境抗原结合、与肿瘤淋巴细胞结合或与MHC-肽复合物结合的抗原结合结构域(例如，scFv或Fab)。
发现当IL10部分位于Fc结构域的N端时，所得重组IL10激动剂在N端和/或C端被截短。例如，对于N端IL10部分，所得重组IL10激动剂缺少C端赖氨酸或在N端和C端均被截短，仅具有403个氨基酸全长构建体的残基3-402。在具有位于Fc结构域C端的IL10部分的IL10激动剂中没有观察到这种情况。因此，在一些实施方案中，IL10部分位于Fc结构域的C端。
在各种实施方案中，IL10激动剂不包含(a)稳定化部分，如聚乙二醇和/或白蛋白；(b)抗体可变区(例如，针对纤连蛋白和生腱蛋白-C的剪接同工型的L19、F16、G11或F8的可变区；或抗CD86抗体的可变区)；(c)非靶向抗体可变区；(d)非结合抗体可变区；(e)抗体CDR；(f)抗体CH1结构域；(g)抗体CL结构域；(h)另一种细胞因子(例如，IL4)；(i)位于IL10部分C端的Fc结构域；(j)以上两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部的任意组合。IL10激动剂可以包括连接分子的不同组分例如融合蛋白中存在的不同结构域的一个或多个接头序列。示例性接头描述于第6.7节中。
在其他实施方案中，IL10激动剂不包含(a)稳定化部分，如亲水聚合物(例如，聚乙二醇)、白蛋白、XTEN、PAS、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉)、聚糖(例如，N-和O-连接聚糖)、聚唾液酸和/或脂肪酸；(b)抗体可变区(例如，针对纤连蛋白和生腱蛋白-C的剪接同工型的L19、F16、G11或F8的可变区；抗CD86抗体的可变区；或抗PD1抗体的可变区)；(c)非靶向抗体可变区；(d)非结合抗体可变区；(e)抗体CDR；(f)抗体CH1结构域；(g)抗体CL结构域；(h)另一种细胞因子(例如，IL4)；(i)位于IL10部分C端的Fc结构域；(j)人血清白蛋白结合剂或结合结构域；或(k)以上两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或全部的任意组合。
在某些方面，本公开的IL10激动剂在施用于受试者(例如，患有癌症的患者或荷瘤小鼠)后，增加肿瘤内CD8+T细胞与Treg细胞的比率。在一些实施方案中，用本公开的IL10激动剂治疗导致肿瘤内CD8 T细胞密度增加。这种增加可以是例如肿瘤中CD8 T细胞密度至少2倍的增加、至少3倍的增加或至少4倍的增加。
在某些方面，用本公开的IL10激动剂治疗导致肿瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加。肿瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加可以是例如至少10％的增加。CD45+免疫细胞的实例包括，例如CD4 T细胞和髓系细胞(例如，CD45+白细胞)。
在一些方面，相对于未用IL10激动剂或包括IL10激动剂的药物组合物治疗的合适对照或相对于用IL10激动剂或药物组合物治疗之前受试者自身的血清IL12水平，用本公开的IL10激动剂治疗上调血清IL12水平。相对于合适对照或治疗前受试者自身的血清IL12水平，IL10激动剂或本公开可以使血清IL12水平上调例如至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。
在一些方面，相对于未用IL10激动剂或包括IL10激动剂的药物组合物治疗的合适对照或相对于用IL10激动剂或药物组合物治疗之前受试者自身的血清IL4水平，用本公开的IL10激动剂治疗上调血清IL4水平。相对于合适对照或治疗前受试者自身的血清IL4水平，IL10激动剂或本公开可以使血清IL4水平上调例如至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。
在本公开的IL10激动剂中，当靶向部分是抗体的抗原结合结构域(“ABD”)时，二聚体IL10激动剂的一个或两个单体可以例如以Fab或scFv的形式携带ABD。
Fc结构域可以是例如具有或不具有降低糖基化和/或效应功能的取代的IgG1或IgG4 Fc结构域，如第6.4.1节及其小节所述。
在某些方面，IL10激动剂包含IL10突变蛋白，该突变蛋白包含IL10M1、IL10M2、IL10M3、IL10M4、IL10M5、IL10M6、IL10M7、IL10M8、IL10M9或IL10M10的氨基酸序列，或与其具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列，具有任选的靶向部分。
本公开的IL10激动剂的组分的进一步细节呈现如下。
6.3.IL10部分
本公开的IL10拮抗剂的IL10部分包含野生型或变体IL10结构域。
IL10部分涵盖成熟的人和非人(例如，鼠、大鼠、猪、非人灵长类动物)IL10多肽，包括其同源物、变体和片段，以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL10多肽和上述的修饰形式。
在真核细胞中，人IL10作为178个氨基酸的前体多肽合成，从中去除18个氨基酸以生成成熟的分泌型IL10。
因此，在一些实施方案中，本公开的IL10部分包含成熟的人IL10，对应于178个氨基酸前体序列的位置S19-N178，例如具有以下氨基酸序列或第7.1.1节中所示氨基酸序列的成熟的人IL10。
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro GlyAsn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr PhePhe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu AspPhe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu GluGlu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn SerLeu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe LeuPro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys LeuGln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr IleGlu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn(SEQ ID NO:1)
成熟鼠、猪和大鼠IL10的序列在Zdanov等人，1995,Structure 3(6):591-601的图5中公开，其通过整体引用并入本文。
因此，“IL10部分”涵盖与成熟的野生型人、鼠、猪或大鼠IL10具有基本相似序列的蛋白质，更优选与成熟的野生型人IL10具有基本相似序列的蛋白质。在各种实施方案中，IL10部分包含与人、鼠、猪或大鼠IL10序列，例如与包含人IIL10前体的氨基酸残基S19-N178的成熟的人IIL10序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，与野生型IL10相比，本公开的IL10激动剂在IL10部分中具有一个或多个氨基酸修饰，例如取代、缺失或***。可以引入一个或多个氨基酸修饰以改变IL10的一种或多种性质，例如其稳定性。Josephson等人,2000,J Biol Chem 275:13552-13557已经描述了具有单体形式的稳定性增加的特定的经修饰的人IL10分子，其在N116和K117之间(即，在IL10的螺旋结构域D和E之间)具有起到铰链作用的接头序列的***。在一个实施方案中，***在N116和K117之间(或非人物种的IL10中的等效位置)的序列是六个氨基酸和/或包含序列GGGSGG(SEQ ID NO：2)。在一个实施方案中，IL10部分在N116和K117之间(即，在IL10的螺旋结构域D和E之间)没有接头序列的***。在一些实施方案中，与野生型IL10相比，IL10部分在IL10部分中不具有任何氨基酸修饰，例如取代、缺失或***。
人IL10在N116处含有潜在的N-连接糖基化位点，该位点位于分子表面并保留在非人物种中。Zdanov等人,1995,Structure 3(6):591-601。因此，本公开涵盖在N116或其他物种的IL10中的等效位置处具有或不具有N-连接聚糖的IL10分子。这个潜在的N连接糖基化位点在大鼠、鼠和猪IL10中是保守的。鼠和大鼠IL10在其N端附近含有第二个潜在的N连接糖基化位点(mIL10中的N8和大鼠IL10中的N1)。本公开涵盖具有和不具有这种额外的N-连接聚糖的鼠或大鼠IL10部分。
6.4.Fc结构域
本公开的IL10激动剂可以包括衍生自任何合适物种的Fc结构域。在一个实施方案中，Fc区衍生自人Fc结构域。在优选的实施方案中，IL10结构域与IgG Fc区(例如，IgG1或IgG4 Fc区)融合。
IL10结构域可以融合至IgG Fc区的N端或C端。如实施例中所示，与融合至IgG Fc的N端相比，与IgG Fc区的C端融合保持IL10结构域更大程度的活性。
本公开的一个实施方案涉及二聚体，该二聚体包含通过将IL10结构域与抗体的Fc区融合而产生的两个Fc融合多肽。二聚体可以通过例如以下方法制备：将编码融合蛋白的基因融合物***到合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，并使表达的融合蛋白与抗体分子非常相似地组装，因此在Fc部分之间形成链间键以产生二聚体。
Fc结构域可以衍生自任何合适的抗体类别，包括IgA(包括亚类lgA1和lgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1。在一个实施方案中，Fc结构域衍生自IgG4。
Fc区内的两个Fc结构域可以彼此相同或不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但为了产生多特异性结合分子例如本公开的IL10激动剂，Fc结构域可以有利地不同以允许异二聚化，如下文第6.4.1节所述。
在天然抗体中，IgA、IgD和IgG的重链Fc结构域由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)组成，而IgE和IgM的重链Fc结构域由三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)组成。它们二聚化以形成Fc区。
在本公开的IL10激动剂中，Fc区和/或其中的Fc结构域可以是嵌合的，组合衍生自一种以上免疫球蛋白同种型的序列。因此，Fc区和/或其中的Fc结构域可以包含来自一种或多种不同类别的抗体，例如一种、两种或三种不同类别的抗体的重链恒定结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG1的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG2的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG3的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG4的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中，Fc区包含来自IgM的CH4结构域。IgM CH4结构域通常位于CH3结构域的C端。
在一个实施方案中，Fc区包含衍生自IgG的CH2和CH3结构域以及衍生自IgM的CH4结构域。
在进一步的实施方案中，嵌合Fc结构域可以包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4CH2区的CH2序列的部分或全部，以及衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4的CH3序列的部分或全部。嵌合Fc结构域还可以含有嵌合铰链区，如第6.7.1.1节所述。例如，嵌合铰链可以包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。可以包括在本文所述的任何IL10突变蛋白中的嵌合Fc结构域的具体实例从N端至C端包含：[IgG4 CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4CH2]-[IgG4CH3]。可以包括在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一个实例从N端至C端包含：[IgG1 CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。可以包括在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些和其他实例描述于WO 2014/121087中。具有这些通用结构排列的嵌合Fc区及其变体可以具有改变的Fc受体结合，进而影响Fc效应功能。
应当理解，用于产生本公开的IL10激动剂的Fc区的重链恒定结构域可以包括天然存在的恒定结构域的变体。与野生型恒定结构域相比，此类变体可以包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中，本公开的Fc区包含至少一个在序列上不同于野生型恒定结构域的恒定结构域。应当理解，变体恒定结构域可以比野生型恒定结构域更长或更短。优选地，变体恒定结构域与野生型恒定结构域至少60％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少70％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少80％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少90％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少95％相同或相似。
IgM和IgA作为常见H2L2抗体单元的共价多聚体在人体中天然存在。当IgM结合了J链时，以五聚体形式存在，或者当它缺少J链时，以六聚体形式存在。IgA以单体和二聚体形式存在。IgM和IgA的重链具有称为尾段的18个氨基酸至C端恒定结构域的延伸。尾段包括在聚合物中的重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基，并且据信在聚合中具有重要作用。尾段还含有糖基化位点。在某些实施方案中，本公开的IL10激动剂不包含尾段。
并入本公开的IL10激动剂的Fc结构域可以包含一种或多种改变蛋白质功能特性的修饰，例如结合Fc受体如FcRn或白细胞受体、结合补体、修饰的二硫键结构或改变的糖基化模式。改变效应功能的示例性Fc修饰描述于第6.4.1节中。
还可以改变Fc结构域以包括提升不对称IL10激动剂可制备性的修饰，例如通过允许作为不同Fc结构域优先于相同Fc结构域配对的异二聚化。异二聚化允许IL10激动剂的产生，其中不同的多肽组分通过含有序列不同的Fc结构域的Fc区彼此连接。异二聚化策略的示例在第6.4.1.1节中举例说明。
替代性地，Fc结构域可以是具有降低的自缔合能力的可溶性单体Fc结构域。参见例如,Helm等人,1996,J.Biol.Chem.271:7494-7500以及Ying等人,2012,J Biol Chem.287(23):19399–19408。IL10激动剂仍然可以通过IL10部分二聚化。可溶性单体Fc结构域的实例包含在对应于CH3中的T366和/或Y407的位置中的氨基酸取代，如美国专利公开号2019/0367611中所述。在一些实施方案中，IL10激动剂在CH3中对应于T366和/或Y407的位置处没有被取代。单体Fc结构域可以是任何Ig亚型，并且可以包括降低效应功能的额外取代，如第6.4.1节所述。
如本文所用，术语“Fc区”可以包括具有或不具有铰链序列的Fc结构域。在其中Fc区包含包括铰链结构域的重链恒定区的各种实施方案中，铰链结构域内的位置233-236可以是G、G、G和未占用；G、G、未占用和未占用；G、未占用、未占用和未占用；或全部未占用，其中位置按EU编号编号。任选地，重链恒定区从N端至C端包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。任选地，重链恒定区从N端至C端包含CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。任选地，CH1区(如果存在的话)、铰链区的其余部分(如果有的话)、CH2区和CH3区是相同的人同种型。任选地，CH1区(如果存在的话)、铰链区的其余部分(如果有的话)、CH2区和CH3区是人IgG1。任选地，CH1区(如果存在的话)、铰链区的其余部分(如果有的话)、CH2区和CH3区是人IgG2。任选地，CH1区(如果存在的话)、铰链区的其余部分(如果有的话)、CH2区和CH3区是人IgG4。
任选地，恒定区具有修饰的CH3结构域以减少与蛋白A的结合。
可以包括在本公开的任何IL10突变蛋白中的Fc区的这些和其他实例描述于WO2016/161010中。示例性铰链序列示于第6.7.1节及其小节中。
应当理解，上述任何修饰可以以任何合适的方式组合以实现期望的功能特性和/或与其他修饰组合以改变IL10激动剂的特性。
6.4.1.具有改变的效应功能的Fc结构域
在一些实施方案中，Fc结构域包含一个或多个减少与Fc受体的结合和/或效应功能的氨基酸取代。
在特定实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是激活的Fc受体。在具体实施方案中，Fc受体是激活的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRlla，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应功能是选自补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌的一种或多种。在特定实施方案中，效应功能是ADCC。
在一个实施方案中，Fc区在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的位置处包含氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更具体的实施方案中，Fc区在选自L234、L235和P329的位置处包含氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施方案中，Fc区包含氨基酸取代L234A和L235A (根据Kabat EU索引编号)。在一个这样的实施方案中，Fc区是IgdFc区，特别是人Igd Fc区。在一个实施方案中，Fc区在位置P329处包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区包含在位置P329处的氨基酸取代和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更具体的实施方案中，进一步的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施方案中，Fc区包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。在更特定的实施方案中，Fc区包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。
通常，相同的一个或多个氨基酸取代存在于Fc区的两个Fc结构域的每一个中。因此，在特定实施方案中，Fc区的每个Fc结构域包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(KabatEU索引编号)，即，在Fc区的第一和第二Fc结构域的每一个中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L234A)替换，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L235A)替换并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基替换(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc。
在另一个实施方案中，Fc结构域是具有与Fc受体减少的结合的IgG4 Fc结构域。与Fc受体具有减少的结合的示例性IgG4 Fc结构域可以包含选自下表1的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域仅包括如下所示序列的粗体部分：
Figure BDA0003938945220000191
Figure BDA0003938945220000201
Figure BDA0003938945220000211
Figure BDA0003938945220000221
在特定实施方案中，具有降低的效应功能的IgG4包含上文所述的WO2014/121087的SEQ ID NO:31的氨基酸序列的粗体部分(SEQ ID NO:6的氨基酸99至326，或SEQ ID NO:31；所述粗体序列在本文中有时称为IgG4)，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，具有降低的效应功能的IgG4包含与WO 2014/121087的SEQ ID NO：31(SEQ ID NO:6)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
对于作为异二聚体的本公开的IL10激动剂，可能引入上述变体IgG4 Fc序列的组合，例如在WO2014/121087的每种情况下，包含SEQ ID NO：30(或其粗体部分)和SEQ ID NO：37(或其粗体部分)的组合的Fc区或包含SEQ ID NO:31(或其粗体部分)和SEQ ID NO:38(或其粗体部分)的组合的Fc区。
在特定实施方案中，Fc结构域包含在第7.1.1节中指定为hIgG4s的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个特定实施方案中，Fc结构域包含在第7.1.1节中指定为hIgGl的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。hIgG1(SEQ ID NO:32)是基于IgG1的变体Fc序列，其包含D265A、N297A突变(EU编号)以降低效应功能。
6.4.1.1.Fc异二聚化变体
某些IL10激动剂需要两个Fc结构域之间的二聚化，与天然免疫球蛋白不同，这两个Fc结构域可操作地连接至不同的N端区域，例如一个Fc结构域连接至Fab，另一个Fc结构域连接至IL10部分。形成Fc结构域的两个Fc区的不充分异二聚化可能是提高期望异二聚分子产量的障碍，并且代表了纯化的挑战。本领域可用的多种方法可以用于增强可能存在于本公开的IL10激动剂中的Fc结构域的二聚化，例如如以下所述：EP1870459A1；美国专利号5,582,996；美国专利号5,731,168；美国专利号5,910,573；美国专利号5,932,448；美国专利号6,833,441；美国专利号7,183,076；美国专利申请公开号2006204493A1；和PCT公开号WO 2009/089004A1。
本公开提供了包含Fc异二聚体，即包含异源的、不相同的Fc结构域的Fc区的IL10激动剂。通常，Fc异二聚体中的每个Fc结构域包含抗体的CH3结构域。CH3结构域衍生自任何同种型、类别或亚类的抗体的恒定区，优选IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)类别的恒定区，如前文部分所述。
两条不同重链在CH3结构域处的异二聚化产生期望的IL10激动剂，而相同重链的同二聚化将降低期望的IL10激动剂的产量。因此，在优选的实施方案中，缔合形成本公开的IL10激动剂的多肽将含有具有相对于未修饰的Fc结构域有利于异二聚体缔合的修饰的CH3结构域。
在具体实施方案中，促进Fc异二聚体形成的所述修饰是所谓的“杵入臼”或“杵臼”修饰，其包括在Fc结构域之一中的“杵”修饰和在另一个Fc结构域中的“臼”修饰。杵入臼技术描述于例如,在美国专利号5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人,1996,Prot Eng 9:617-621以及Carter,2001,Immunol Meth 248:7-15中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得突起可以定位在空腔中以便促进异二聚体形成并且阻碍同二聚体形成。突起通过用更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建。与突起相同或相似大小的补偿空腔通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链在第二多肽界面中产生。
因此，在一些实施方案中，将Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内生成可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中的突起，并且将Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内生成第一亚基的CH3结构域内的突起可定位其中的空腔。优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。突起和空腔可以通过例如通过位点特异性诱变改变编码多肽的核酸或通过肽合成来制备。示例性取代是Y470T。
在具体的此类实施方案中，在第一Fc结构域中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)，并且在Fc结构域中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在进一步的实施方案中，在第一Fc结构域中，另外地位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换)，并且在第二Fc结构域中，另外地位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。在特定实施方案中，第一Fc结构域包含氨基酸取代S354C和T366W，并且第二Fc结构域包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据KabatEU索引编号)。
在一些实施方案中，静电转向(例如，如Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem285(25):19637-46中所述)可用于促进Fc区的第一和第二Fc结构域的缔合。
作为使用经修饰以促进异二聚化的Fc结构域的替代或补充，可以修饰Fc结构域以允许能够选择Fc异二聚体的纯化策略。在一个这样的实施方案中，一种多肽包含消除其与蛋白A结合的修饰的Fc结构域，从而使得产生异二聚体蛋白的纯化方法能够产生。参见例如，美国专利号8,586,713。因此，IL10激动剂包含第一CH3区和第二Ig CH3区，其中第一和第二Ig CH3区彼此相差至少一个氨基酸，并且与缺乏氨基酸差异的相应IL10激动剂相比，其中至少一个氨基酸差异降低IL10激动剂与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一CH3结构域结合蛋白A并且第二CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变/修饰，如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；通过EU编号为H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(通过IMGT；通过EU为Y436F)。这类修饰在本文中称为“星形”突变。
6.5.靶向部分
在本公开的IL10激动剂中引入靶向部分允许将高浓度的IL10递送到肿瘤微环境中或递送至肿瘤反应性淋巴细胞，特别是CD8+T淋巴细胞，在那里它们可以发挥局部作用。
适当的靶向部分形式描述于第6.5.2节中。靶向部分优选地是抗原结合部分，例如抗体或抗体的抗原结合部分，例如scFv，如第6.5.2.1节中所述，或Fab，如第6.5.2.2节中所述。
抗体和抗原结合部分通常与特定的抗原决定簇结合并能够将IL10激动剂引导至靶位点，例如带有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。由本公开的靶向部分识别的示例性靶分子描述于第6.5.1节中。
6.5.1.靶分子
由本公开的IL10激动剂的靶向部分识别的靶分子通常存在于例如激活的T细胞的表面、肿瘤细胞的表面、病毒感染的细胞的表面、其他病变细胞的表面，游离于血清中、细胞外基质(ECM)中、或存在于靶位点的免疫细胞，例如肿瘤反应性淋巴细胞或肽-MHC复合物中的肽。在外源施用免疫细胞(例如，表达嵌合抗原受体(“CAR”)的T细胞)的情况下，靶向部分可以识别在CAR T细胞表面上存在的嵌合抗原受体或另一种分子。
示例性靶分子是成纤维细胞激活蛋白(FAP)、生腱蛋白-C的A1结构域(TNC A1)、生腱蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、***特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、***特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、MAGE肿瘤抗原家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE-肿瘤抗原家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人***瘤病毒蛋白、Smad肿瘤抗原家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR缔合的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓系细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生生长因子受体)、ErbB2上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜***、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、***酶、***酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、prostein、PSMA、存活和端粒酶、***癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)以及生腱蛋白-C的A1结构域(TnC A1)。
在一些实施方案中，靶向部分结合MHC-肽复合物或MHC-肽复合物中的肽，例如肿瘤新抗原。一些肿瘤新抗原是病毒抗原。
病毒抗原的非限制性实例包括EBV抗原(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-1)、丙型肝炎病毒抗原(例如，丙型肝炎病毒E2糖蛋白)、HIV抗原(例如，HIV gp160和HIV gp120)；CMV抗原；HPV特异性抗原或流感病毒抗原(例如，流感病毒血凝素)。可以由本公开的靶向部分结合的肿瘤新抗原的特定实施方案是LCMV衍生肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV核心(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165,C165A)、NYESO1(157-165,C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、生存素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)和WT1(126-134)。
ECM抗原的非限制性实例包括黏结蛋白聚糖(syndecan)、乙酰肝素酶、整联蛋白、骨桥蛋白、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白、胶原蛋白和基质蛋白(matrixin)。
其他靶分子是肿瘤或病毒淋巴细胞的细胞表面分子，例如T细胞共刺激蛋白，如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在特定实施方案中，靶分子是检查点抑制剂，例如CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2。
在一些实施方案中，IL10激动剂不包含靶向部分，例如但不限于与肿瘤相关抗原结合、与肿瘤微环境抗原结合、与肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子结合、或与检查点抑制剂结合的靶向部分。
在各种实施方案中，IL10激动剂不包含PD1结合靶向结构域。
6.5.2.靶向部分形式
在某些方面，靶向部分可以是保留与抗原决定簇特异性结合的任何类型的抗体或其片段。在一个实施方案中，抗原结合部分是全长抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分是免疫球蛋白分子，特别是IgG类免疫球蛋白分子，更特别是IgG1或IgG4免疫球蛋白分子。抗体片段包括但不限于VH(或VH)片段、VL(或VL)片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体(minibodies)、二价抗体(diabodies)、三价抗体(triabodies)和四价抗体(tetrabodies)。在本公开的IL10激动剂中，抗体片段可以有利地引入到Fc结构域的N端。
6.5.2.1.scFv
单链Fv或“scFv”抗体片段在单条多肽链中包含抗体的VH和VL结构域，能够表达为单链多肽，并保留衍生它们的完整抗体的特异性。通常，scFv多肽进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于靶标结合的期望结构。适用于连接scFv的VH和VL链的接头的实例是第6.7节中确定的接头。
除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以具有任意顺序的VL和VH可变区，例如，对于多肽的N端末端和C端末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
scFv可以包含来自任何合适物种的VH和VL序列，如鼠、人或人源化VH和VL序列。
为了产生编码scFv的核酸，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到另一个编码接头的片段，例如，编码第6.7节中所述的任何接头(通常是含有氨基酸甘氨酸和丝氨酸的序列的重复，如氨基酸序列(Gly4～Ser)3(SEQ ID NO:53))，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区由灵活的接头连接(参见例如，Bird等人，1988,Science 242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554)。
6.5.2.2.Fab
Fab结构域传统上是通过使用酶(如木瓜蛋白酶)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割而产生的。在本公开的IL10激动剂中，Fab结构域通常作为IL10激动剂的一部分重组表达。
Fab结构域可以包含来自任何合适物种的恒定区和可变区序列，因此可以是鼠科动物的、嵌合的、人的或人源化的。
Fab结构域通常包含与连接至VL结构域的CL结构域配对的连接至VH结构域的CH1结构域。在野生型免疫球蛋白中，VH结构域与VL结构域配对构成Fv区，CH1结构域与CL结构域配对以进一步稳定结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可以进一步稳定Fab结构域。
对于本公开的IL10激动剂，特别是当IL10含有两个不同的Fab结构域并且轻链不是共同或通用轻链时，使用Fab异二聚化策略以允许属于相同Fab的Fab结构域的正确缔合并最大限度地减少属于不同Fab的Fab结构域的异常配对是有利的。例如，可以使用下表2中所示的Fab异二聚化策略：
Figure BDA0003938945220000291
Figure BDA0003938945220000301
因此，在某些实施方案中，通过彼此交换Fab的VL和VH结构域或彼此交换CH1和CL结构域来促进Fab的两个多肽之间的正确缔合，例如，如WO2009/080251中所述。
还可以通过在Fab的CH1结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和在Fab的CL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和/或在VH结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和在VL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰来促进正确的Fab配对。被修饰的氨基酸通常是VH:VL和CH1:CL界面的一部分，因此Fab组分优先彼此配对，而不是与其他Fab的组分配对。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰限于可变区(VH、VL)和恒定区(CH1、CL)的如残基的Kabat编号所示的保守框架残基。Almagro,2008,Frontiers In Bioscience13:1619-1633提供了基于Kabat、Chothia和IMGT编号方案的框架残基的定义。
在一个实施方案中，在VH和CH1和/或VL和CL结构域中引入的修饰是彼此互补的。重链和轻链界面的互补性可以基于空间和疏水接触、静电/电荷相互作用或多种相互作用的组合来实现。蛋白质表面之间的互补性在文献中广泛描述为锁钥配合、杵入臼、突起和空腔、供体和受体等，所有这些都暗示了两个相互作用表面之间结构和化学匹配的性质。
在一个实施方案中，一个或多个引入的修饰在Fab组分的界面中引入了新的氢键。在一个实施方案中，一个或多个引入的修饰在Fab组分的界面中引入了新的盐桥。示例性取代描述于WO 2014/150973和WO 2014/082179，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，Fab结构域包含CH1结构域中的192E取代和CL结构域中的114A和137K取代，这在CH1和CL结构域之间引入盐桥(参见例如,Golay等人,2016,J Immunol196:3199-211)。
在一些实施方案中，Fab结构域在CH1结构域中包含143Q和188V取代，在CL结构域中包含113T和176V取代，这用于交换CH1结构域和CL结构域之间的疏水和极性接触区(参见例如,Golay等人,2016,J Immunol 196:3199-211)。
在一些实施方案中，Fab结构域可以在一些或所有VH、CH1、VL、CL结构域中包含修饰以引入促进Fab结构域正确组装的正交Fab界面(Lewis等人,2014Nature Biotechnology32:191-198)。在实施方案中，在VH结构域中引入39K、62E修饰，在CH1结构域中引入H172A、F174G修饰，在VL结构域中引入1R、38D、(36F)修饰，在CL结构域中引入L135Y、S176W修饰。在另一个实施方案中，在VH结构域中引入39Y修饰并且在VL结构域中引入38R修饰。
也可以用工程化二硫键替换天然CH1:CL二硫键来对Fab结构域进行修饰，从而提高Fab组件配对的效率。例如，可以通过在CH1结构域中引入126C和在CL结构域中引入121C来引入工程化二硫键(参见例如,Mazor等人,2015,MAbs7:377-89)。
也可以通过将CH1结构域和CL结构域替换为促进正确组装的替代结构域来对Fab结构域进行修饰。例如，Wu等人,2015,MAbs 7:364-76描述了用T细胞受体的恒定区取代CH1结构域并用T细胞受体的b结构域取代CL结构域，并通过在VL结构域中引入38D修饰和在VH区中引入39K修饰，使用VL结构域和VH结构域之间的额外的电荷-电荷相互作用将这些结构域替换配对。
作为使用Fab异二聚化策略来促进正确的VH-VL配对的替代或补充，可以使用共同轻链(也称为通用轻链)的VL用于本公开的IL 10激动剂的每个Fab VL区。在各种实施方案中，与使用原始同源VL相比，使用如本文所述的共同轻链减少了IL10激动剂的不适当种类的数量。在各种实施方案中，IL10激动剂的VL区从包含共同轻链的单特异性抗体中鉴定。在各种实施方案中，IL10激动剂的VH区包含在小鼠B细胞中体内重排的人重链可变基因片段，这些基因片段先前已被工程化以表达有限的人轻链库或与人重链同源的单条人轻链，并且响应于暴露于感兴趣的抗原，生成含有与一种人VL或两种可能的人VL中的一种同源的多种人VH的抗体谱，其中所述抗体谱对感兴趣的抗原具有特异性。共同轻链衍生自重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列，并包括体细胞突变(例如，亲和力成熟)形式。参见例如，美国专利号10,412,940。
6.6.稳定化部分
本公开的IL10激动剂可以包含可以延长分子在体内的血清半衰期的稳定化部分。血清半衰期通常分为α期和β期。通过添加适当的稳定化部分可以显著改善任一个时期或两个时期。例如，相对于不含稳定化部分的相应IL10激动剂，稳定化部分可以将IL10激动剂的血清半衰期延长超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、400％、600％、800％、1000％或更多。出于本公开的目的，血清半衰期可以指在人或其他哺乳动物(例如，小鼠或非人灵长类动物)中的半衰期。此外，公认在IL10激动剂中包含Fc结构域可延长IL10部分的半衰期；在本公开的上下文中，术语“稳定化部分”是指除Fc结构域/Fc区之外的部分。
野生型IL10具有小于30分钟的血清半衰期。本公开的IL10激动剂优选在人和/或小鼠中具有至少约2小时、至少约4小时、至少约6小时或至少约8小时的血清半衰期。在一些实施方案中，本公开的IL10激动剂具有至少10小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时的血清半衰期。
稳定化部分包括聚氧化烯部分(例如，聚乙二醇)、糖(例如，唾液酸)和耐受良好的蛋白质部分(例如，Fc及其片段和变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。
可用于本公开的IL10激动剂的其他稳定化部分包括在Kontermann等人，2011，Current Opinion in Biotechnology 22:868-76中描述的那些。此类稳定化部分包括但不限于人血清白蛋白融合物、人血清白蛋白缀合物、人血清白蛋白结合剂(例如，AdnectinPKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(即，基于三种氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉(HES))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含聚合糖作为稳定化部分的IL10激动剂。
血清白蛋白也可以通过能够与白蛋白非共价相互作用的模块用于半衰期的延长。因此，本公开的IL10激动剂可以包括白蛋白结合蛋白作为稳定化部分。白蛋白结合蛋白可以与本公开的IL10激动剂的一种或多种其他组分缀合或遗传融合。具有白蛋白结合活性的蛋白质在某些细菌中已知。例如，链球菌蛋白G含有若干由约50个氨基酸残基(6kDa)组成的小白蛋白结合结构域。血清白蛋白结合蛋白的其他实例如美国公开号2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。白蛋白结合结构域与蛋白质的融合导致半衰期大大延长(参见Kontermann等人，2011，Current Opinion in Biotechnology 22:868-76)。
在其他实施方案中，稳定化部分是人血清白蛋白。在其他实施方案中，稳定化部分是转铁蛋白。
在其他实施方案中，稳定化部分是聚乙二醇部分或另一种聚合物，如下文第6.6.1节所述。
稳定化部分可以通过接头连接至本公开的IL10激动剂的一种或多种其他组分，例如如下文第6.7节所述。
在某些实施方案中，IL10激动剂不与聚乙二醇、其他亲水聚合物、白蛋白、人血清白蛋白结合剂、XTEN、PAS、聚唾液酸和/或羟乙基淀粉缀合。在一些实施方案中，IL10激动剂不包含N-连接聚糖和/或O-连接聚糖。在特定实施方案中，IL10激动剂缺乏任何稳定化部分。
6.6.1.聚乙二醇
在一些实施方案中，IL10激动剂包含聚乙二醇(PEG)或另一种亲水聚合物作为稳定化部分，例如乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。
PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可以商购获得或可以根据本领域熟知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，纽约，Vol.3，第138-161页)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，不考虑大小或PEG末端的修饰，并且可以由下式表示：X--O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n为20至2300，X为H或末端修饰，例如C1-4烷基。PEG可以含有结合反应所必需的其他化学基团，这些化学基团来自分子的化学合成；或者作为分子部分最佳距离的间隔物。此外，这样的PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一条PEG链的PEG称为多臂或支链PEG。支链PEG描述于例如欧洲申请号473084A和美国专利号5,932,462中。
一种或多种PEG分子可以连接在IL10激动剂的不同位置，并且这种连接可以通过与胺、硫醇或其他合适的反应基团反应来实现。胺部分可以是例如在IL10激动剂(或其组分)的N端存在的伯胺或存在于氨基酸如赖氨酸或精氨酸中的胺基。
PEG化可以通过定点PEG化来实现，其中将合适的反应基团引入蛋白质中以产生PEG化优先发生的位点。在一些实施方案中，IL10激动剂被修饰以在期望位置引入半胱氨酸残基，从而允许半胱氨酸上的定点PEG化。可以将突变引入本公开的IL10激动剂的编码序列中以生成半胱氨酸残基。这可以通过例如将一个或多个氨基酸残基突变为半胱氨酸来实现。用于突变为半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其他亲水残基。优选地，待突变为半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。基于一级序列或三维结构用于预测残基的表面可及性的算法在本领域中是众所周知的。IL10的三维结构描述于例如Wang等人，2005，Science 310(5751):1159-63中，并且可以用于鉴定可突变为半胱氨酸的表面暴露残基。可以选择突变以避免破坏IL10与其一种或多种受体之间的相互作用。半胱氨酸残基的PEG化可以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-邻吡啶基二硫化物来进行。
PEG通常用适合与多肽上预期位点偶联的合适激活基团激活。PEG化方法在本领域中是众所周知的，并进一步描述于Zalipsky等人,“Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides"in Polyethylene GlycolChemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,纽约(1992)以及Zalipsky,1995,Advanced Drug Reviews 16:157-182中。
PEG部分的分子量可以广泛变化并且可以是支链的或直链的。通常，PEG的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。PEG的示例性重均分子量包括约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。在某些实施方案中，PEG的分子量为40,000道尔顿。也可以使用具有上述任何一种的总分子量的支链形式的PEG。在一些实施方案中，PEG具有两个分支。在一些实施方案中，PEG具有四个分支。在另一个实施方案中，PEG是双-PEG(NOF Corporation，DE-200MA)，其中两条含有IL10的多肽链相缀合。
本领域已知的常规分离和纯化技术可用于纯化PEG化的IL10激动剂，如尺寸排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。产物也可以使用SDS-PAGE分离。可以分离的产物包括单、二、三、多和非PEG化的IL10激动剂，以及游离PEG。可以通过在洗脱峰周围汇集更宽的部分来控制单PEG缀合物的百分比，以增加组合物中单PEG的百分比。约90％的单PEG缀合物代表了产率和活性的良好平衡。
在一些实施方案中，PEG化的IL10激动剂将优选保留与未修饰的IL10激动剂相关的生物活性的至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，生物活性指其结合IL10R1的能力，如通过KD、kon或koff所评估。
6.7.接头
在某些方面，本公开提供IL10激动剂，其中IL10激动剂的两种或更多种组分通过肽接头彼此连接。作为示例而非限制，接头可用于连接(a)IL10部分和Fc结构域；(b)IL10部分和靶向部分；(c)Fc结构域和靶向部分(例如，Fab结构域或scFv)；(d)靶向部分内的不同结构域(例如，scFv中的VH和VL结构域)。
肽接头的范围可以为2个氨基酸至60个或更多个氨基酸，并且在某些方面，肽接头长度的范围为3个氨基酸至50个氨基酸、4至30个氨基酸、5至25个氨基酸、10至25个氨基酸、10个氨基酸至60个氨基酸、12个氨基酸至20个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸、或25个氨基酸至35个氨基酸。
带电荷的(例如，带电荷的亲水接头)和/或柔性接头是特别优选的。
可用于本公开的IL10激动剂的柔性接头的实例包括由Chen等人,2013,Adv DrugDeliv Rev.65(10):1357-1369以及Klein等人,2014,Protein Engineering,Design&Selection 27(10):325-330所公开的那些。特别有用的柔性接头是甘氨酸和丝氨酸的重复序列，例如GnS(SEQ ID NO:9)或SGn(SEQ ID NO:10)的单体或多聚体，其中n是从1至10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，接头是G4S(SEQ ID NO:51)重复的单体或多聚体，例如(GGGGS)n(SEQ ID NO:11)。
6.7.1.铰链序列
在其他实施方案中，本公开的IL10激动剂包含铰链区作为接头。具体而言，当IL10激动剂含有基于免疫球蛋白的靶向部分时，铰链可用于将靶向部分(例如，Fab结构域)连接到多聚化结构域(例如，Fc结构域)。即使在没有靶向部分的情况下，也可以使用铰链序列来稳定IL10激动剂二聚体。
铰链区可以是天然的或修饰的铰链区。铰链区通常位于Fc区的N端。
天然铰链区是通常在天然存在的抗体中的Fab和Fc结构域之间发现的铰链区。修饰的铰链区是长度和/或组成不同于天然铰链区的任何铰链。此类铰链可以包括来自其他物种的铰链区，如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊铰链区。其他修饰的铰链区可以包含衍生自与重链Fc区的类别或亚类不同的抗体的完整铰链区。替代性地，修饰的铰链区可以包含天然铰链或重复单元的一部分，其中重复单元中的每个单元衍生自天然铰链区。在进一步的备选方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转化为中性残基如丝氨酸或丙氨酸，或通过将适当放置的残基转化为半胱氨酸残基来改变天然铰链区。通过这种方式，铰链区中半胱氨酸残基的数量可以增加或减少。其他修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可以设计以具有期望的特性如长度、半胱氨酸组成和柔性。
许多修饰的铰链区已经描述于例如，美国专利号5,677,425、WO 99/15549、WO2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170、WO 98/25971和WO 2005/003171，并且这些通过引用并入本文。
在各种实施方案中，铰链结构域内的位置233-236可以是G、G、G和未占用；G、G、未占用和未占用；G、未占用、未占用和未占用；或全部未占用，其中位置通过EU编号编号。
在一些实施方案中，本公开的IL10突变蛋白包含修饰的铰链结构域，其相对于相同同种型(例如，人IgG1或人IgG4)的野生型铰链结构域降低对Fcγ受体的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的二聚体IL10激动剂的一条或两条链的Fc区在其N端具有完整的铰链区。
在一个实施方案中，本公开的二聚体IL10激动剂的一条或两条链的Fc区和铰链区衍生自IgG4并且铰链区包含修饰的序列CPPC。与含有序列CPPC的IgG1相比，人IgG4的核心铰链区含有序列CPSC。存在于IgG4序列中的丝氨酸残基导致该区域的柔性增加，因此一部分分子在相同蛋白质链内形成二硫键(链内二硫键)，而不是与IgG分子中的其他重链桥接形成链间二硫键。(Angel等人，1993，Mol Immunol 30(1)：105-108)。将丝氨酸残基变为脯氨酸以提供与IgG1相同的核心序列，从而可以在IgG4铰链区完全形成链间二硫键，从而降低纯化产物的异质性。这种改变的同种型称为lgG4P。
6.7.1.1嵌合铰链序列
铰链区可以是嵌合铰链区。
例如，嵌合铰链可以包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。
在特定实施方案中，嵌合铰链区包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ IDNO:12)(WO2014/121087的SEQ ID NO:8，其通过整体引用并入本文)或ESKYGPPPPCPCPAPPVA(SEQ ID NO:13)(WO2014/121087的SEQ ID NO:9)。此类嵌合铰链序列可以适当地连接至IgG4CH2区(例如通过引入IgG4 Fc结构域例如人或鼠Fc结构域，其可以在CH2和/或CH3区中进一步修饰以降低效应功能，例如如第6.4.1节所述)。
6.7.1.2.具有降低的效应功能的铰链序列
在进一步的实施方案中，可以修饰铰链区以降低效应功能，例如如WO2016161010A2中所述，其通过整体引用并入本文。在各种实施方案中，修饰的铰链区的位置233-236是G、G、G和未占用；G、G、未占用和未占用；G、未占用、未占用和未占用；或全部未占用，其中位置通过EU编号编号(如WO2016161010A2的图1所示)。这些片段可以表示为GGG-、GG--、G---或----，其中“-”表示未占用的位置。
位置236在经典人IgG2中未被占用，但在其他经典人IgG同种型中被占用。在所有四种人同种型中，位置233-235被除G以外的残基占用(如WO2016161010A2的图1所示)。
位置233-236内的铰链修饰可以与被P占用的位置228组合。位置228在人IgG1和IgG2中天然被P占用，但在人IgG4中被S占用，在人IgG3中被R占用。IgG4抗体中的S228P突变有利于稳定IgG4抗体和减少外源性和内源性抗体之间重链轻链对的交换。优选地，位置226-229分别被C、P、P和C占用。
示例性铰链区具有残基226-236，有时称为中间(或核心)和下铰链，被称为GGG-(233-236)、GG--(233-236)、G---(233-236)和没有G(233-236)的修饰铰链序列占用。任选地，铰链结构域氨基酸序列包含CPPPPAPGGG-GPSVF(SEQ ID NO:14)(WO2016161010A2的SEQID NO:1)、CPPPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO:15)(WO2016161010A2的SEQ ID NO:2)、CPPCPAP---GPSVF(SEQ ID NO:16)(WO2016161010A2的SEQ ID NO:3)、或CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO:17)(WO2016161010A2的SEQ ID NO:4)。
上述修饰的铰链区可以并入通常包括CH2和CH3结构域的重链恒定区，并且其可以具有位于指定区域侧翼的额外铰链片段(例如，上铰链)。存在的此类额外恒定区片段通常具有相同的同种型，优选人同种型，但可以是不同同种型的杂合体。这种额外的人恒定区片段的同种型优选是人IgG4，但也可以是人IgG1、IgG2或IgG3或其中结构域具有不同同种型的杂合体。人IgG1、IgG2和IgG4的示例性序列显示于WO2016161010A2的图2-4中。
在具体实施方案中，修饰的铰链序列可以地连接至IgG4 CH2区(例如通过引入IgG4 Fc结构域例如人或鼠Fc结构域，其可以在CH2和/或CH3结构域中进一步修饰以降低效应功能，例如如第6.4.1节所述)。
6.8.核酸和宿主细胞
在另一个方面，本公开提供了编码本公开的IL10激动剂的核酸。在一些实施方案中，IL10激动剂由单个核酸编码。在其他实施方案中，例如在异二聚体分子或包含由多于一条多肽链组成的靶向部分的分子的情况下，IL10激动剂可以由多个(例如，两个、三个、四个或更多个)核酸编码。
单个核酸可以编码包含单条多肽链的IL10激动剂、包含两条或更多条多肽链的IL10激动剂或包含多于两条多肽链的IL10激动剂的一部分(例如，单个核酸可以编码包含三条、四条或更多条多肽链的IL10激动剂的两条多肽链，或包含四条或更多条多肽链的IL10激动剂的三条多肽链)。对于表达的单独控制，编码两条或多条多肽链的开放阅读框可以在不同的转录调节元件(例如，启动子和/或增强子)的控制下。编码两条或多条多肽的开放阅读框也可以由相同的转录调控元件控制，并由允许翻译成单独多肽的内部核糖体进入位点(IRES)序列分开。
在一些实施方案中，包含两条或更多条多肽链的IL10激动剂由两个或更多个核酸编码。编码IL10激动剂的核酸的数量可以等于或小于IL10激动剂中多肽链的数量(例如，当多于一条多肽链由单个核酸编码时)。
本公开的核酸可以是DNA或RNA(例如，mRNA)。
在另一个方面，本公开提供了含有本公开的核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于单个载体中或存在于相同宿主细胞的单独载体中或单独宿主细胞中，如下文更详细描述的。
6.8.1载体
本公开提供了包含编码本文描述的IL10激动剂或IL10激动剂组分(例如二聚体IL10激动剂的多肽链中的一条或两条)的核苷酸序列的载体。载体包括但不限于病毒、质粒、黏粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
可以使用多种载体***。例如，一类载体利用衍生自动物病毒的DNA元件，动物病毒例如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(Rous肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用衍生自RNA病毒的RNA元件，RNA病毒如森林脑炎(Semliki Forest)病毒、东方马脑炎病毒和黄病毒。
此外，可以通过引入一种或多种允许选择转染宿主细胞的标记来选择已将DNA稳定整合到其染色体中的细胞。例如，标记可以为营养缺陷型宿主提供原性、杀生物剂抗性(例如，抗生素)或对重金属如铜等的抗性。选择性标记基因可以直接连接到待表达的DNA序列上，也可以通过共转化导入相同细胞中。mRNA的最佳合成可能还需要额外的元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦准备好用于表达的表达载体或含有构建体的DNA序列，就可以将表达载体转染或引入合适的宿主细胞。可以采用各种技术来实现这一点，如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。用于培养所得转染细胞和回收所表达多肽的方法和条件是本领域技术人员已知的，并且基于本说明书，可以根据所使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞而变化或优化。
6.8.2.细胞
本公开还提供了包含本公开的核酸的宿主细胞。
在一个实施方案中，宿主细胞经基因工程改造以包含本文所述的一种或多种核酸。
在一个实施方案中，宿主细胞通过使用表达盒进行基因工程改造。短语“表达盒”是指能够影响基因在与此类序列相容的宿主中的表达的核苷酸序列。此类盒可以包括启动子、带有或不带有内含子的开放阅读框和终止信号。也可以使用在影响表达中必需或有帮助的附加因子，例如诱导型启动子。
本公开还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。
还提供了作为哺乳动物细胞中重组细胞表达的产物的IL10激动剂。
细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。
6.8.3.产生方法
本公开还提供了用于产生本公开的IL10激动剂的方法。
在一些实施方案中，IL10激动剂通过培养第6.8.2节中所述的宿主细胞并回收宿主细胞表达的IL10来产生。在某些实施方案中，该方法还包括步骤a)使回收的IL10激动剂与被配置用于捕获IL10激动剂的亲和柱接触，b)洗脱亲和柱以产生洗脱物，和c)对洗脱物进行尺寸排阻色谱。
亲和柱可以是被配置用于捕获IL10激动剂的任何亲和柱。例如，亲和柱可以包括与IL10激动剂的Fc结构域或IL10部分特异性结合的结合分子(例如，抗体或亲和配体)。在一个实施方案中，亲和柱是蛋白A亲和柱。蛋白A是包括与IgG的Fc区结合的五个区域的亲和配体。通常与琼脂糖偶联的这些区域可以自由结合IgG Fc，其中一分子偶联的蛋白A能够结合至少两分子IgG。在另一个实施方案中，亲和柱包括能够特异性且可逆地结合IL10激动剂的IL10部分的IL10抗体。
一旦与亲和柱结合，捕获的IL10激动剂就用洗脱缓冲液洗脱，以产生包含IL10激动剂的洗脱物。许多洗脱缓冲液是本领域已知的，本领域技术人员可以选择合适的缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液是Pierce Gentle洗脱缓冲液(pH6.6)。
然后对包含IL10激动剂的洗脱物进行尺寸排阻色谱以分离和纯化那些不形成聚集体的IL10激动剂。许多尺寸排阻色谱方法和柱是本领域已知的。本领域技术人员可以选择合适的尺寸排阻色谱方法和/或柱。在一些实施方案中，使用尺寸排阻超高效液相色谱。在特定实施方案中，使用Superdex 200,26/600pg柱(MilliporeSigma,St.Louis,MO USA)。
在一些实施方案中，在使洗脱的IL10激动剂通过尺寸排阻色谱之前，将亲和层析后包含IL10的洗脱缓冲液更换为另一种缓冲液。这可以通过本领域已知的方法实现，例如透析。如果尺寸排阻色谱柱需要使用特定的缓冲液，则可能需要更换缓冲液。在一个实施方案中，在进行尺寸排阻色谱之前，将洗脱缓冲液(例如，Pierce Gentle)更换为PBS+5％甘油。
受益于本公开，本领域技术人员可以选择具有方向(即，N端对C端IL10部分)、接头长度和纯化方法的IL10激动剂构建体以获得期望的IL10激动剂。在一些实施方案中，期望的IL10激动剂被最低限度地聚集，并且在构建体的N端和/或C端不被截短。在某些实施方案中，IL10激动剂在Fc结构域的C末端包含IL10部分、G4S(SEQ ID NO:51)的单、双或三重复的接头，并且使用包括尺寸排阻色谱的方法纯化。
在产生之后，本公开的IL10激动剂可以配制成药物组合物，例如如第6.9节中所述。
6.9.药物组合物
6.9.1.包含IL10激动剂多肽的药物组合物
本公开的IL10激动剂，例如通过第6.8.3节中所述的方法产生的IL10激动剂可以以包含IL10激动剂和一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂的组合物形式提供。组合物可以配制用于特定用途，如用于兽医用途或人的药物用途。组合物的形式(例如，干粉、液体制剂等)和所用的赋形剂、稀释剂和/或载剂将取决于IL10激动剂的预期用途以及用于治疗用途的施用方式。
对于治疗用途，组合物可以作为包括药学上可接受的载剂的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的期望方法)。药物组合物可以通过多种途径施用于患者，如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、瘤内、鞘内、外用或局部。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定的抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，药物组合物将通过静脉内或皮下施用。
药物组合物可以方便地以单位剂型存在，每剂含有预定量的本公开的IL10激动剂。单位剂量中包括的IL10激动剂的量将取决于待治疗的疾病以及本领域熟知的其他因素。此类单位剂量可以是含有一定量的适合单次施用的IL10激动剂的冻干干粉形式，或者液体形式。干粉单位剂型可以与注射器、适量的稀释剂和/或可用于施用的其他组分一起包装在试剂盒中。液体形式的单位剂量可以方便地以预填充有适合单次施用的一定量的IL10激动剂的注射器形式提供。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物包括至少5mg、至少10mg、至少20mg或至少50mg的IL10激动剂。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物仅包括或几乎仅包括全长IL10激动剂。例如，在一些实施方案中，药物组合物不包括可检测量的IL10激动剂的C端截短变体和/或可检测量的IL10激动剂N端截短变体。如本文所提供的，将IL10部分定位在Fc结构域的N端可以导致重组表达的IL10激动剂的N端和/或C端截短。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物包括最少的或不包括IL10激动剂聚集体。如本文所提供的，尺寸排阻色谱法可用于产生非聚集的IL10激动剂。在一些实施方案中，如通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)所测定的，药物组合物包括少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％的以聚集体形式存在的IL10激动剂。在一些实施方案中，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定的，药物组合物不含有可检测量的IL10激动剂聚集体。
药物组合物也可以从含有适合多次施用的量的IL10激动剂中批量供应。
通过将具有期望纯度的IL10激动剂与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和其他杂项添加剂混合，可以制备药物组合物以作为冻干制剂或水溶液储存。参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol,ed.1980)。此类添加剂在所采用的剂量和浓度下对接受者应该是无毒的。
缓冲剂有助于将pH值维持在接近生理条件的范围内。它们可以以多种浓度存在，但通常以约2mM至约50mM的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以约0.2％-1％(w/v)的量添加。用于本公开的合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤化铵(例如，氯化铵、溴化铵和碘化铵)、氯化六甲铵、和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开的液体组合物的等渗性，并且包括多元糖醇，例如三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛的赋形剂，其涵盖范围可以从填充剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个或更少残基的肽)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；和三糖如棉子糖；和多糖如右旋糖酐。稳定剂可以以每重量IL10激动剂0.5至10wt％的量存在。
可以添加非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解糖蛋白并保护糖蛋白免受搅拌引起的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、聚氧杂异构体(184、188等)和普朗尼克多元醇。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL，例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存在。
其他混杂赋形剂包括填充剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。
6.9.2.用于递送编码IL10激动剂的核酸的药物组合物
本公开的IL10激动剂可以通过任何可用于基因疗法的方法递送，例如作为mRNA或通过在合适启动子的控制下编码IL10激动剂的病毒载体递送。
示例性基因疗法载体包括基于腺病毒或AAV的治疗剂。用于本文的方法、用途或组合物的基于腺病毒或基于AAV的治疗剂的非限制性实例包括但不限于：rAd-p53，其是编码野生型人肿瘤抑制蛋白的重组腺病毒载体p53，例如用于治疗癌症(也称为
Figure BDA0003938945220000451
Qi等人，2006，Modern Oncology，14:1295-1297)；Ad5_d11520，其是缺乏用于使宿主p53失活的E1B基因的腺病毒(也称为H101或ONYX-015；参见例如，Russell等人，2012，Nature Biotechnology 30:658-670)；AD5-D24-GM-CSF，含有细胞因子GM-CSF的腺病毒，例如用于治疗癌症(Cerullo等人，2010，Cancer Res.70:4297)；rAd-HSVtk，具有HSV胸苷激酶基因的复制缺陷型腺病毒，例如用于癌症治疗(开发为
Figure BDA0003938945220000452
Ark Therapeutics，参见例如美国专利号6,579,855；由Advantagene开发为ProstAtakTM；国际PCT申请号WO2005/049094)；rAd-TNFα，在放化疗诱导的EGR-1启动子的控制下表达人肿瘤坏死因子α(TNFα)的复制缺陷型腺病毒载体，例如用于癌症治疗(TNFeradeTM,GenVec；Rasmussen等人,2002,Cancer Gene Ther.9:951-7；Ad-IFNβ，其中E1和E3基因已缺失的腺病毒血清型5载体，在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的指导下表达人干扰素-β基因，例如用于治疗癌症(BG00001和H5.110CMVhIFN-β，Biogen；Sterman等人，2010，Mol.Ther.18:852-860)。
核酸分子(例如，mRNA)或病毒可以配制成药物组合物中唯一的药物活性成分，或者可以与用于治疗特定疾病的其他活性剂联合。任选地，本文提供的组合物中可以包括其他药剂、药学制剂、载剂、佐剂、稀释剂。例如，润湿剂、乳化剂和润滑剂中的任何一种或多种，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可以存在于组合物中。可以包括在组合物中的示例性其他药剂和赋形剂包括例如水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸和磷酸。
当用作过继性细胞转移疗法(例如如第6.11.1节所述的表达CAR的细胞疗法)的辅助疗法时，细胞疗法例如表达CAR的细胞，可以被工程化以表达本公开的IL10激动剂。IL10激动剂可以靶向特定基因组基因座，例如内源性IL10基因座或在激活或功能失调的淋巴细胞中具有活性的另一个基因座例如PD-1基因座，或***到非特异性基因组基因座中。靶向特定基因组基因座可以通过基因编辑来实现，例如使用锌指蛋白、CRISPR/Cas9***等。
6.10.治疗适应症和治疗方法
本公开的IL10激动剂可用于治疗可用IL10治疗的病症，例如炎症和免疫相关病症、纤维化病症、癌症和癌症相关病症或心血管病症(例如，动脉粥样硬化)。
在特定实施方案中，由本公开的IL10激动剂治疗的病症是自身免疫、移植排斥、创伤后免疫应答、传染病或移植物抗宿主病。在特定实施方案中，所述病症是自身免疫性疾病、器官或骨髓移植排斥、移植物抗宿主病、寄生虫感染、肉芽肿、克罗恩病、结肠炎、胰腺炎、炎症性肺、过敏病症、哮喘、特应性皮炎、或鼻炎。
在其他实施方案中，待治疗的疾病是增殖性疾病，优选癌症，例如实体瘤。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本公开的IL10激动剂治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨骼、***、消化***、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经***(中枢和外周)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖***。还包括癌前病症或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。类似地，其他细胞增殖病症也可以通过本公开的IL10激动剂来治疗。此类细胞增殖病症的实例包括但不限于：高丙种球蛋白血症、淋巴增殖性病症、副蛋白血症、紫癜、结节病、Sezary综合征、Waldenstron巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增多症和除瘤形成外位于上文列出的器官***中的任何其他细胞增殖疾病。
在一些实施方案中，待治疗的疾病对用抗PD1抗体的治疗具有抗性。在一些实施方案中，待治疗的疾病对抗PD1抗体的单一疗法具有抗性。虽然PD1/PD-L1检查点的阻断已被证明可有效治疗多种恶性肿瘤，但在相当大比例的患者中无效，其中一些初始应答者出现耐药并伴有疾病复发(Nowicki等人，2018，Cancer J.24(1):47-53)。对抗PD1抗体治疗的抗性可以是原发性的或获得性的。导致对PD1抑制的原发性和获得性抗性的机制是本领域已知的，鉴定对PD1抑制有抗性的恶性肿瘤的方法也是本领域已知的。参见例如,Nowicki等人,如上；Shergold等人,2019,Pharmacological Research 145:204258；以及Fares等人,2019,American Society of Clinical Oncology Educational Book 39:147-164。
本公开的IL10激动剂通常以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病症，以治疗有效量施用或应用本公开的IL10激动剂或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。技术人员很容易认识到，在许多情况下，用IL10激动剂治疗可能无法治愈，而只能提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，术语“有效量”和“治疗有效量”涵盖赋予部分益处的剂量和给药方案。
在一些实施方案中，本公开的IL10激动剂或其药物组合物以相对于合适对照足以增加实体瘤中CD8 T细胞密度的量施用或应用(参见第7.7节和图18A-18B)。本公开的IL10激动剂或其药物组合物可以以增加实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的量施用或应用。CD45+免疫细胞包括，例如CD4 T细胞和髓系细胞。此外，本公开的IL10激动剂或其药物组合物可以以相对于合适对照足以上调血清IL12和/或IL4表达的量施用或应用(参见第7.7节和图21A-21B)。在某些方面，本公开的IL10激动剂或其药物组合物相对于对照可以使IL12血清水平上调至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、或至少30倍(图21A)。在进一步的方面，本公开的IL10激动剂或其药物组合物相对于对照可以使IL4血清水平上调至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍(图21A)。
用于确定IL12和/或IL4的参考值或基线值的合适对照样品可以衍生自与用本公开的IL10激动剂或其药物组合物治疗的个体具有相同疾病病症的个体。对照样品可以与接受本公开的IL10激动剂或其药物组合物治疗的受试者年龄匹配。参考值或基线值可以从合适的个体或合适的个体群体中获得，并用作多重分析的一般参考值。替代性地，对照样品可以基于在开始IL10激动剂治疗之前的受试者的自身值。识别和选择合适的对照在本领域技术人员的普通技能范围内。
需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更具体地是人。对于疾病的预防或治疗，本公开的IL10激动剂的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者的体重、特定的IL10激动剂、疾病的严重程度和病程、抗体是否用于预防或治疗目的施用、先前或同时的治疗干预、患者的临床病史和对IL10激动剂的应答、以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的医师将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的合适剂量。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
未缀合的IL10的单次施用范围可以为约50,000IU/kg至约1,000,000IU/kg或更多，更典型地为约600,000IU/kg的IL10。这可以一天重复几次(例如，2-3次)，持续几天(例如，约连续3-5天)，然后可以在停止一段时间(例如，约7-14天)后重复一次或多次。因此，治疗有效量可以包括在一段时间内仅单次施用或多次施用(例如，在约10-20天期间内约20-30次单独施用，每次给予约600,000IU/kg的IL10)。
类似地，IL10激动剂适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的IL10激动剂可以是例如通过一次或多次单独施用，或通过连续输注施用至患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病情，治疗通常会持续到出现期望的疾病症状抑制。IL10激动剂的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用从约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重、至约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其中得出的任何范围。在可从本文所列数字得出的范围的非限制性实例中，基于上述数字可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。这种剂量可以例如每周或每三周间歇施用(例如，使患者接受约二至约二十剂，或例如约六剂的IL10激动剂)。可以施用初始较高负荷剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可以是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定来监测。
对于全身施用，治疗有效剂量最初可以通过体外测定如细胞培养测定来估计。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的EC50在内的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。
还可以使用本领域熟知的技术从体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据容易地优化对人的施用。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的IL10激动剂的血浆水平。通过注射施用的通常患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天，通常为约0.5至1mg/kg/天。治疗有效的血浆水平可以通过每天施用多个剂量来实现。血浆中的水平可以例如通过ELISA HPLC测量。
在局部施用或选择性摄取的情况下，IL10激动剂的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
本文所述的治疗有效剂量的IL10激动剂通常会提供治疗益处而不会引起显著毒性。IL10激动剂的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序确定(参见例如，实施例8和9)。细胞培养测定和动物研究可用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与治疗作用的剂量比即为治疗指数，其可以表示为LD50/ED50的比值。优选表现出大治疗指数的IL10激动剂。在一个实施方案中，根据本公开的IL10激动剂表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定适合人类使用的一系列剂量。剂量优选地在包括几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以取决于多种因素在这个范围内变化，例如所用的剂型、所用的施用途径、受试者的状况等。准确的配方、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况选择。(参见例如，Fingl等人,1975,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1，通过整体引用并入本文)。
用本公开的IL10激动剂治疗的患者的主治医师将会知道由于毒性、器官功能障碍等如何以及何时终止、中断或调整施用。相反，如果临床应答不充分(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。在感兴趣的病症的管理中施用剂量的大小将随着待治疗的病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以通过标准预后评估方法来部分地评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
6.11.联合疗法
根据本公开的IL10激动剂可以与治疗中的一种或多种其他额外的药剂联合施用。例如，本公开的IL10激动剂可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖为治疗需要此类治疗的受试者的症状或疾病而施用的任何药剂。这种额外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应症的活性成分，优选具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性成分。
对于癌症的治疗，本公开的IL10激动剂可以与一种或多种抗肿瘤剂(例如，化学治疗剂)或抗肿瘤治疗方式(例如，放射)联合施用。额外药剂的种类将在很大程度上取决于所治疗的潜在疾病的性质(例如，在膀胱癌的治疗中，烷基化剂如顺铂的添加可以是合适的)。与IL10激动剂联合施用的一种或多种其他药剂(例如，化疗剂)以对预期目的有效的量给予。此类额外药剂的有效量取决于所用IL10激动剂的量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。
IL10激动剂通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
与本发明的IL10激动剂联合使用的化疗剂的实例包括但不限于烷化剂如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类如苯并多巴、卡波醌、美托多巴、乌多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺包括六甲密胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、胆固醇苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮杂丝氨酸、博来霉素、放线菌素、角霉素、樟脑霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依柔比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、苯丙霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗柔比星、链黑霉素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫胺嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素如二***、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾酮内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如弗林酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；苯丁酸；比生群；依达曲沙；去氧麻黄碱；秋水仙胺；地吖醌；二甲双胍；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达胺；米托胍；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三乙烯亚胺苯醌；2,2',2″-三氯三乙胺；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；胞嘧啶；阿糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂和铂配位络合物如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；米托蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；卡培他滨；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。术语“化疗剂”还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗***，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬、奥纳司酮和托瑞米芬；以及抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，额外的试剂可以是本领域鉴定为可用于肿瘤疾病治疗的一种或多种化学或生物药剂，包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂如IL12、INFα或抗-表皮生长因子受体、放射疗法、针对肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如，树突细胞疗法)、抗肿瘤疫苗、具有复制能力的病毒和CART细胞，例如如第6.11.1节所述。
对于免疫和炎性病症的治疗，本公开的IL10激动剂可以与免疫抑制或免疫调节疗法联合使用。免疫抑制疗法的非限制性实例包括免疫抑制化合物，如环孢菌素A、环磷酰胺、FK506、他克莫司、皮质类固醇、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、西罗莫司、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、脱氧肝素、强的松等。
在一些实施方案中，本公开的IL10激动剂可以与抗PD1抗体联合使用。与本公开的IL10激动剂联合使用的抗PD1抗体的实例包括但不限于MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的组合物中)和单独施用，在这种情况下，本公开的IL10激动剂的施用可以发生在额外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后。
6.11.1.使用IL10激动剂疗法和免疫疗法的联合疗法
本公开的IL10激动剂可以有利地与表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，例如，表达CAR的T(“CAR-T”)细胞，例如CAR-T联合用于癌症或自身免疫性疾病的治疗。
调理或淋巴耗竭疗法，例如环磷酰胺和氟达拉滨的方案，也可以施用于接受CAR和IL10激动剂疗法的受试者。这种治疗通常在向受试者施用表达CAR的细胞之前的几天内进行。例如，环磷酰胺可以施用两天，例如，在输注表达CAR的细胞之前的第-8天和第-7天(输注日为第零天)，并且氟达拉滨可以从第-6天至第-2天连续五天向受试者施用。在一个实施方案中，向受试者施用60mg/kg的环磷酰胺。在一个实施方案中，向受试者施用25mg/m2的氟达拉滨。在一个实施方案中，在第-1天，即向受试者输注表达CAR的细胞的前一天，不进行治疗。
表达CAR的细胞可以以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重范围内的量施用，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞以1×106至1×1011个细胞或1×107至1×108个细胞的剂量施用。
在施用于人受试者之前，可以用抗CD3和/或抗CD28抗体连同IL10扩增来激活表达CAR的细胞。
表达CAR的细胞，例如T细胞，优选地是受试者自体的，但也可以是同种异体来源的。
在一个实施方案中，从施用表达CAR的细胞群之日起连续四天通过推注向人受试者施用IL10激动剂。
在一个实施方案中，从施用表达CAR的细胞群之日开始至少连续五天通过推注向人受试者施用IL10激动剂。
IL10激动剂可以施用更长的时间，例如一周、两周、一个月或更长时间。可以降低给药频率，例如在表达CAR的细胞耗竭后。例如，IL10激动剂可以最初每天施用，然后将给药频率降低到每周一次。
IL10疗法的起始可以在施用表达CAR的细胞的同一天，或一天、二天、三天、四天、五天、六天或一周后开始。
在一个实施方案中，细胞群包含从受试者获得的T细胞，这些T细胞已经被工程化以重组表达CAR。
在一个实施方案中，在向受试者施用细胞群后，IL10激动剂血浆水平维持一到两周。
在一个实施方案中，在向受试者施用细胞群后，IL10激动剂血浆水平维持一个月。
6.11.1.1.CAR组分
典型的CAR包含连接至胞内信号传导模块的细胞外区域，该细胞外区域含有抗原结合结构域(例如，抗体的抗原结合结构域)，该胞内信号传导模块包括在抗原结合后诱导T细胞激活的CD3信号传导结构域(例如，T细胞受体的CD3ζ信号传导区)。抗原结合结构域可以是scFv的形式，如第6.5.2.1节所述。
抗原结合结构域通常通过接头(例如，如第6.7节中所述的接头)、任选的间隔物(例如，如第6.11.1.1.1节中所述)、任选的铰链(例如，如第6.11.1.1.2节中所述)、跨膜结构域(例如，如第6.11.1.1.3节中所述)和细胞内信号传导模块(例如，如第6.11.1.1.4节中所述)连接至信号结构域。
6.11.1.1.1.间隔结构域
在特定实施方案中，CAR的抗原结合结构域(后接任选的接头)后接一个或多个“间隔结构域”，其指将抗原结合结构域从效应细胞表面移开以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域(Patel等人，1999，Gene Therapy 6：412-419)。间隔结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区例如CH2和CH3。间隔结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施方案中，间隔结构域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
6.11.1.1.2.铰链结构域
CAR的抗原结合结构域通常后接一个或多个“铰链结构域”(位于任选的接头和/或间隔物的下游)，它们在使抗原结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中发挥作用。CAR通常在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
“改变的铰链区”是指(a)具有最高达30％氨基酸变化(例如，最高达25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链区，(b)具有最高达30％的氨基酸变化(例如，最高达25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)的长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在铰链区的一部分，或(c)包含核心铰链区的天然铰链区的一部分(其长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可以被一个或多个其他氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。改变的免疫球蛋白铰链区可以替代性地或额外地具有被另一个氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。
适用于本文所述的CAR的其他示例性铰链结构域包括衍生自1型膜蛋白如CD8α、CD4、CD28和CD7的细胞外区域的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一个实施方案中，铰链结构域包含CD8α铰链区。
6.11.1.1.3.跨膜(TM)结构域
“跨膜结构域”是融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜的CAR部分。如本文所用，术语“跨膜结构域”是指在细胞膜、优选真核细胞膜(例如，哺乳动物细胞膜)中热力学稳定的任何多肽结构。
TM结构域可以衍生自天然、合成、半合成或重组来源。TM结构域可以衍生自以下(例如，至少包含以下的跨膜结构域)：T细胞受体的alpha、beta或zeta链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154或PD1。在特定实施方案中，TM结构域是合成的并且主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。
在某些实施方案中，CAR包含CD3ζ跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:18)或LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVK(SEQ ID NO:19)的跨膜结构域)、CD28跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:20)的跨膜结构域)或CD8α跨膜结构域(例如，包含氨基酸序列KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR PEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:21)的跨膜结构域)。
TM可以后接短接头，优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其连接TM结构域和CAR的细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头(例如，根据第6.7节的接头)提供了特别合适的接头。
6.11.1.1.4.细胞内信号传导结构域
CAR通常包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号结构域”是指参与将有效抗原结合信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能的CAR部分，效应细胞功能例如为激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包括细胞毒性因子至结合CAR的靶细胞的释放，或通过抗原与细胞外CAR结构域结合而引发的其他细胞应答。
术语“效应功能”是指免疫效应细胞的特定功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助或包括细胞因子分泌的活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，该截短部分可用于代替整个结构域，只要其转导效应功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
众所周知，仅通过TCR生成的信号不足以完全激活T细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞激活可以说是由两类不同的细胞内信号传导结构域介导的：通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性初级激活的初级信号传导结构域和以不依赖于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选的实施方案中，本文考虑的CAR包含胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本公开的方法中特别使用的含有ITAM的初级信号传导结构域的说明性实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特别优选的实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内初级信号传导和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序串联至跨膜结构域的羧基端。
本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激信号传导结构域以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，它们提供T淋巴细胞在与抗原结合后有效激活和发挥功能所需的第二信号。这种共刺激分子的示例性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。
在一些实施方案中，CD3信号传导区与CD28、4-1BB(也称为CD137)、CD70或OX40(也称为CD134)或其组合的共刺激胞内域连接，或具有串联的两个CD3ζ的信号传导结构域。这些胞内域允许抗原呈递细胞(APC)识别TCR期间T细胞的强烈激活，改善细胞因子的产生和CAR-T细胞的增殖。
在另一个实施方案中，CAR包含CD28和CD137共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在又一个实施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含CD137和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
示例性CD3ζ信号传导区可以包含以下氨基酸序列之一：
LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:22)；
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR(SEQ ID NO:23)。
示例性CD28信号传导区可以包含以下氨基酸序列之一：
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:24)；
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:25)；
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:26)；
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:20)。
示例性CD137(41BB)信号传导区可以包含以下氨基酸序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:27)。
6.11.1.1.5.标签
在一些实施方案中，CAR包含用于鉴定CAR的标签，例如V5表位标签衍生自存在于猿猴病毒5(SV5)副粘病毒的P和V蛋白上的小表位(Pk)。V5标签通常以所有14个氨基酸(GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:28))使用，尽管它也以较短的9氨基酸序列(IPNPLLGLD(SEQID NO:29))使用。
6.11.1.1.6.信号肽
在一些实施方案中，CAR包含信号肽。信号肽促进细胞表面CAR的表达。信号肽，包括天然存在的蛋白质的信号肽或合成的、非天然存在的信号肽，与本文所述的CAR在使用上兼容的信号肽对于本领域技术人员来说是显而易见的。在一些实施方案中，信号肽位于CAR的抗原结合部分的N端。当CAR在细胞(例如，T细胞)中表达和加工时，信号肽被切割，因此通常不存在于成熟分子中。
6.11.1.2.CART细胞的制备
为了离体生成CART细胞，可以在将编码CAR的核酸例如通过病毒转导引入细胞之前和/或之后对PBMC、外周血淋巴细胞或从中富集的T细胞进行扩增。
可通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离出可用于生成CART细胞的T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(例如，3x28)缀合的珠(如
Figure BDA0003938945220000581
M-450 CD3/CD28 T)孵育足够用于期望T细胞的阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段为约30分钟。在进一步的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选实施方案中，该时间段为10至24小时。在一个优选的实施方案中，孵育时间为24小时。对于T细胞从白血病患者中的分离，较长的孵育时间(如24小时)的使用可以提高细胞产量。在与其他细胞类型相比T细胞很少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，更长的孵育时间的使用可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率，可以优先选择T细胞亚群用于或针对培养起始或在此过程中的其他时间点。此外，通过增加或减少珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以优先选择T细胞亚群用于或针对培养起始或其他期望时间点。本领域技术人员将认识到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可以期望执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择”的细胞。“未选择”的细胞也可以进行进一步的选择。
T细胞群通过阴性选择的富集可以用针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。T reg细胞也可以通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法来耗竭。
在某些实施方案中，例如对于涉及治疗如第6.11.1.4节所述的自身免疫性疾病的应用，可以期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62L高、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。T reg也可以通过FoxP3的重组表达来诱导。
无论是在对T细胞进行基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，通常可以使用本领域已知的方法来激活和扩增T细胞，例如如美国专利号7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；或7,175,843中所述。
通常，可用于本公开的方法的T细胞通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体而言，T细胞群可通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触来刺激，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)和钙离子载体接触来刺激。对于在T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和任选的抗CD28抗体接触，例如在抗CD3和抗CD28珠上接触。
在向人受试者施用之前，还可以用IL12调节表达CAR的细胞(参见例如，Emtage等人，2003，J.Immunother.16(2):97-106，通过引用并入本文)。
6.11.1.3.癌症免疫疗法
相应地，本公开提供了在有需要的人受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的IL10激动剂以及施用表达CAR的细胞例如表达CAR的T细胞(或“CART细胞”)。用于治疗癌症的特别有用的T细胞亚型是具有强CAR介导的细胞毒性的T细胞，例如CD3+CD8+T细胞，其可以如上文6.11.1.2所述制备。
对于癌症的治疗，CAR的细胞外结构域可以靶向肿瘤相关抗原，例如如第6.5.1节所述。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原是CD20、EGFR、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、GD2、EGFR变体、ROR1、c-Met、HER2、CEA、间皮素、GM2、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123 CD133、CD171、MUC16、MUC1、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、Lewis Y、IgG kappa链、叶酸受体-α、PSCA或EpCAM。在特定实施方案中:
οCAR设计用于靶向CD22以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。
οCAR设计用于靶向间皮素以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等。
οCAR设计用于靶向CD33/IL3Ra以治疗急性髓性白血病等。
οCAR设计用于靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等。
οCAR设计用于靶向PSMA以治疗***癌等。
οCAR设计用于靶向糖脂F77以治疗***癌等。
οCAR设计用于靶向EGFRvIII以治疗胶质母细胞瘤等。
οCAR设计用于靶向GD-2以治疗神经母细胞瘤、黑色素瘤等。
οCAR设计用于靶向NY-ESO-1TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。
οCAR设计用于靶向MAGE A3 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。
对CAR-IL10激动剂联合疗法特别有用的是IL10激动剂，其包含识别存在于表达CAR的淋巴细胞表面上的细胞表面抗原的靶向部分。
6.11.1.4.自身免疫疾病的免疫疗法
嵌合抗原受体(CAR)T细胞已成为血液癌症的有力治疗选择。通过使用修饰T细胞以有效靶向疾病细胞的相同想法，科学家们通过转染编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体，有效地工程改造了具有预定抗原特异性的T细胞。以非MHC限制方式工程改造的CAR修饰的T细胞具有广泛应用的优势，特别是在移植和自身免疫方面。
为了用于治疗自身免疫性疾病，CAR的胞外域优选地对与自身免疫应答相关的靶抗原或配体具有特异性。这种修饰导致重定向的Treg在炎症部位的激活，以抑制促炎效应型免疫应答。CAR Treg疗法靶向的自身免疫性疾病的实例是多发性硬化症、炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、克罗恩病、银屑病、I型糖尿病、干燥症、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎；格雷夫斯病和葡萄膜炎。
在特定的实施方案中，CART细胞被工程化以表达靶向以下疾病特异性的抗原或配体的CAR：
ο炎性肠病(IBD)，其中抗原或配体是在患病结肠或回肠中表达的抗原或配体；
ο类风湿性关节炎，其中抗原或配体是胶原的表位或存在于关节中的抗原；
οI型糖尿病或自身免疫性胰岛炎，其中抗原或配体是胰腺β细胞抗原；
ο多发性硬化症，其中抗原或配体是例如髓鞘碱性蛋白(MBP)抗原或MOG-1或MOG2-2，或神经元抗原；
ο自身免疫性甲状腺炎，其中抗原或配体是甲状腺抗原；
ο自身免疫性胃炎，其中抗原或配体是胃抗原；
ο自身免疫性葡萄膜炎或葡萄膜视网膜炎，其中抗原或配体是S-抗原或另一种葡萄膜或视网膜抗原；
ο自身免疫性***，其中抗原或配体是睾丸抗原；
ο自身免疫性***，其中抗原或配体是卵巢抗原；
ο银屑病，其中抗原或配体是角质形成细胞抗原或存在于真皮或表皮中的另一种抗原；
ο白癜风，其中抗原或配体是黑色素细胞抗原，如黑色素或酪氨酸酶；
ο自身免疫性***炎，其中抗原或配体是***抗原；
ο任何不期望的免疫应答，其中抗原或配体是激活抗原或在存在于不期望的应答位点的T效应细胞上表达的其他抗原；
ο组织排斥，其中抗原或配体是移植组织特异性的MHC；或者
ο炎性病症，其中抗原或配体是在参与炎症的造血谱系的非淋巴样细胞上表达的抗原或配体。
在一个实施方案中，T细胞可以被工程化以表达嵌合自身抗原受体(CAAR)T细胞，从而特异性地消除导致自身免疫性疾病的B细胞。因此，除非上下文另有说明，否则提及表达CAR的T细胞包括提及表达CAAR的T细胞。
7.实施例
7.1.材料和方法
7.1.1.IL10激动剂的产生
生成了编码下表3中列出的IL10和IL10突变蛋白(用IL10M_标识)的构建体和Fc对照。IL10突变蛋白构建体包括不同构型的鼠或人IL10、IgG1或IgG4 Fc结构域，以及来自不同G4S(SEQ ID NO:51)重复序列的不同长度的接头：
Figure BDA0003938945220000631
构建体在哺乳动物细胞系中重组表达并纯化。
Figure BDA0003938945220000641
Figure BDA0003938945220000651
Figure BDA0003938945220000661
Figure BDA0003938945220000671
Figure BDA0003938945220000681
Figure BDA0003938945220000691
7.1.2.STAT3报告基因测定
开发了STAT3驱动的基于萤光素酶的报告基因测定法，以在先前报道的表达IL10受体的两种细胞系TF-1和Ramos中(Tan等人,1993,J Biol Chem.268(28):21053-9)评估IL10和IL10突变蛋白激活STAT3介导的转录的能力。
7.1.2.1.报告TF-1细胞的工程化
TF-1细胞(ATCC,#CRL-2003)在5μg/mL聚凝胺存在下用含有STAT3萤光素酶报告基因构建体(Cignal STAT3-Luc慢报告基因,SA Biosciences,CLS-6028L-8)的慢病毒颗粒转导。选择嘌呤霉素抗性细胞(TF-1/STAT3-Luc)并在RPMI+10％FBS+P/S/G+2ng/mL GM-CSF+1μg/mL嘌呤霉素中维持。
7.1.2.2.报告Ramos细胞的工程化
Ramos.2G6.4C10细胞(ATCC,#CRL-1923)在5μg/mL聚凝胺存在下用含有STAT3萤光素酶报告基因构建体(Cignal STAT3-Luc慢报告基因,SA Biosciences,CLS-6028L-8)的慢病毒颗粒转导。选择嘌呤霉素抗性细胞(Ramos/STAT3-Luc)并在RPMI+10％FBS+P/S/G+1μg/mL嘌呤霉素中维持。
7.1.2.3.报告细胞的IL10刺激
在该实验中，工程化报告细胞通过重组IL10或IL10突变蛋白进行刺激。细胞因子通过与IL10受体α亚基(IL10Ra)结合，募集β亚基(IL10Rb)，从而允许组装信号传导复合物并诱导STAT3磷酸化(Yoon等人，2006，J Biol Chem.281(46)：35088-96)。STAT3磷酸化导致STAT3应答元件的转录活性增强，从而驱动报告基因萤光素酶的产生。
7.1.2.4.萤光素酶测定设置
补充有10％FBS和P/S/G的RPMI1640用作测定培养基以制备细胞悬液和抗体稀释液。
筛选前一天，将工程化报告细胞以1:3的比例稀释。测定当天将细胞离心并以1x106/mL重悬于测定培养基中。IL10、IL10突变蛋白和对照按照11点稀释以1:5稀释，范围为100nM至10fM，其中第12点不含重组蛋白。将5x104个报告细胞添加到96孔白色平底板中，并与连续稀释的IL10、IL10突变蛋白或对照蛋白一起孵育。将板在37℃/5％CO2下孵育5小时30分钟，然后加入100μL ONE-GloTM(Promega)试剂以裂解细胞并检测萤光素酶活性。在多标签读板器Envision(PerkinElmer)上以相对光单位(RLU)捕获发射的光。一式两份测试所有系列稀释液。
对于EC50值的测定，排除了导致钩状效应(其中蛋白质浓度高于导致信号的剂量依赖性降低的最大信号)的点。抗体的EC50值使用GraphPad PrismTM软件从第12点剂量反应曲线上的四参数逻辑方程确定，其中第12稀释点不含重组蛋白。倍数诱导使用以下等式计算：
Figure BDA0003938945220000711
7.1.3.使用原代人免疫细胞在基于细胞的测定中表征人IL10突变蛋白
开发了原代混合T细胞/同种异体PBMC功能测定，以评估IL10刺激对T细胞激活期间IL2、TNFα和IFNγ释放的影响。
7.1.3.1.人原代PBMC分离
从健康的供体leukopak(供体123)中分离出人外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商推荐的方案，使用50mL SepMateTM管通过密度梯度离心完成PBMC分离。简而言之，将leukopak用D-PBS以1:2稀释，并将30ml在15mL Ficoll上分层，添加到50mL SepMate管中。根据SepMate制造商的方案进行后续步骤。将分离的PBMC冷冻在补充有10％DMSO的FBS中。
7.1.3.2.人原代T细胞分离
T细胞分离自2个健康供体的leukopak(供体5500Y和6900M)。T细胞分离使用RosetteSep人T细胞富集混合物(StemCell)按照制造商方案完成。按照制造商推荐的方案，使用50mL SepMateTM管通过密度梯度离心分离T细胞。分离的T细胞置于补充有10％DMSO的FBS中。
7.1.3.3.从与IL10和同种异体PBMC共孵育的原代T细胞释放细胞因子
在该实验中，通过与经丝裂霉素C处理以阻止PBMC生长的同种异体PBMC共培养3天来刺激原代T细胞。在共培养期间添加IL10或IL10突变蛋白的滴定液，并通过使用同质、免洗AlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer，AL208F，AL217S，AL221F)测量细胞培养上清液中IL2、TNFα和IFNγ的释放来确定它们对T细胞活性的影响。
先前从供体5500Y和6900M中分离和冷冻的人T细胞在测定当天在含有50U/mlbenzonase核酸酶的刺激培养基(X-VIVO 15细胞培养基中添加10％FBS、HEPES、NaPyr、NEAA和0.01mM BME)中解冻。将细胞以1200rpm离心10分钟，重悬于刺激培养基中并以1x105个细胞/孔的浓度铺板到96孔圆底板中。先前从供体123分离和冷冻的人PBMC在测定当天在含有50U/ml benzonase核酸酶的刺激培养基中解冻。将细胞以1200rpm离心10分钟，然后以1×107个细胞/mL的浓度重悬于含有50μg/mL丝裂霉素C的刺激培养基中。在37℃下孵育1小时后，将PBMC用含有2％FBS的D-PBS洗涤3次，重悬于刺激培养基中，并以每孔1.5×105个细胞的最终浓度添加到含有T细胞的孔中。随后，IL10、IL10突变蛋白和对照按照9点稀释以1:5稀释，IL10范围为500nM至1.28pM，IL10突变蛋白或对照抗体范围为100nM至0.256pM，其中第10个稀释点不含重组蛋白。将系列稀释的蛋白质添加到孔中，并将板在37℃/5％CO2下孵育72小时。然后将板离心以沉淀细胞，并收集50μL上清液。从中取出5μL上清液，并根据制造商的方案在人IL-2、TNFα和IFNγAlphaLISA测定中进行测试。测量值在多标签读板器Envision上获得。生成已知IL-2、TNFα和IFNγ浓度的标准曲线，以推断测定孔中释放的每种细胞因子的pg/mL。一式两份测试所有系列稀释液。
细胞因子的IC50值使用GraphPad PrismTM软件从10点剂量反应曲线上的四参数逻辑方程确定，其中第10个稀释点不含重组蛋白。抑制百分比使用以下等式计算：
Figure BDA0003938945220000721
7.1.4.IL10突变蛋白在同基因肿瘤同种异体移植模型中的活性
7.1.4.1.肿瘤的植入和给药组的分配
向雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)皮下植入肿瘤细胞。将1x106个肿瘤细胞皮下植入6至8周龄的雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)的右侧腹部。
治疗干预或同种型对照腹膜内施用3周。小鼠每周两次接受腹膜内注射测试物品，持续3周，并且在整个研究过程中每周两次监测肿瘤体积和体重。
7.1.4.2.肿瘤大小和生长抑制的计算
计算每组的平均和中值肿瘤大小，以及相对于对照治疗组的肿瘤生长抑制百分比。每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并使用公式(长度x宽度2)/2计算肿瘤体积。进行测量直到对照组的平均肿瘤大小达到4000mm3，或直到任何组中的任何小鼠由于溃疡或体重减轻超过20％而需要安乐死。肿瘤生长抑制根据下式计算：[1-(T最终-T起初)/(C最终-C起初)]*100，其中T(治疗组)和C(对照组)代表所有小鼠存活当天的平均肿瘤质量。观察延长至第54天(最后一次治疗后3周)以确定无肿瘤小鼠的频率。
7.2.实施例1：STAT3报告基因测定中IL10突变蛋白的活性
在如第7.1.2节所述的基于STAT3报告细胞的生物测定中评估了重组IL10突变蛋白刺激IL10受体的能力。
激活曲线显示于图3中。工程化报告细胞、Ramos/STAT3-Luc或TF-1/STAT3-Luc细胞与重组人IL10、IL10突变蛋白、人IgG4s同种型对照或鼠IgG1同种型对照共孵育的EC50和倍数诱导值总结于表4中。
当用对照蛋白处理报告细胞时，没有检测到萤光素酶活性的增加。相比之下，报告细胞Ramos/STAT3-Luc和TF-1/STAT3-Luc与人IL10的共孵育诱导萤光素酶活性(分别为4.5和5.9倍)。Ramos/STAT3-Luc和TF-1/STAT3-Luc与IL10突变蛋白的共孵育也诱导萤光素酶活性(Ramos/STAT3：IL10M1：3.7倍，IL10M2：3.6倍，IL10M3：3.2倍；TF-1/STAT3-Luc，IL10M1：4.8倍，IL10M2：4.1倍，IL10M3：3.4倍)，其中亚纳摩尔EC50值如表4和图3所示。
Figure BDA0003938945220000731
Figure BDA0003938945220000741
缩写：
NC：因为数据不符合4参数逻辑方程未计算。
ND：因为未观察到浓度依赖性应答未测定。
7.3.实施例2：IL10突变蛋白对原代人T细胞中细胞因子释放的活性
在测量IL2、TNFα和IFNγ细胞因子产生的功能性原代T细胞测定中评估IL10抑制T细胞刺激的能力。
细胞因子释放的数据显示于图4和图5中(分别针对供体5500Y和6900M)，与同种异体丝裂霉素C处理的PBMC共孵育的T细胞的IC50和百分比抑制值总结于表5和表6(分别针对供体5500Y和供体6900M)，其中分别滴定H4sH10154P3(人IgG4隐形同种型对照)、mIgG1(小鼠IgG1同种型对照)、人IL10或IL10突变蛋白。
来自2个供体(图4：供体5500Y和图5：供体6900M)的T细胞与同种异体丝裂霉素C处理的PBMC的共孵育导致可测量的IL2(A)TNFα(B)和IFNγ释放(C)。在T细胞/PBMC共孵育期间添加人IL10或IL10 Fc突变蛋白滴定液以剂量依赖性方式降低了IL2、TNFα和IFNγ释放(供体5500Y：表5和图4；供体6900M：
表6和图5)。
Figure BDA0003938945220000742
缩写：
NC：因为数据不符合4参数逻辑方程未计算。
ND：因为未观察到浓度依赖性应答未测定。
Figure BDA0003938945220000751
缩写：
NC：因为数据不符合4参数逻辑方程未计算。
ND：因为未观察到浓度依赖性应答未测定。
7.4.实施例3：IL10突变蛋白的抗肿瘤活性
评估了同基因肿瘤同种异体移植模型中IL10突变蛋白的活性。如第7.1.4节所述，将Colon 26肿瘤细胞植入BALB-C小鼠。一旦肿瘤在第11天达到平均体积110mm3(范围为80至140mm3)，将小鼠随机分组(n＝7/组)并以同种型对照(0.167mg/kg)或IL10突变蛋白(0.1mg/kg)的等摩尔量给药hIgG4s同种型对照、IL10M1或IL10M2。
结果总结在表7中并显示在图6中。
Figure BDA0003938945220000752
在所有小鼠存活的第32天，与同种型对照治疗组相比，用6剂IL10M1的治疗导致约90％的肿瘤生长抑制，而用IL10M2的治疗具有最小的效果(约7％的肿瘤生长抑制)。延伸观察进一步显示，在IL10M1治疗组中，7只小鼠中有4只变得没有肿瘤，相比而言，IL10M2治疗组的7只中只有2只无肿瘤小鼠，而对照组中没有无肿瘤小鼠。这些数据支持以下结论：在Colon 26体内肿瘤模型中，与N端Fc-IL-10融合蛋白(IL10M2)相比，融合至hIgG4s-Fc的C端的IL10(IL10M1)显示出更好的功效。
7.5.实施例4：接头长度对IL10突变蛋白活性的影响
具有不同接头长度的IL10突变蛋白的活性(包括IL10M1和IL10M2的两个不同批次，分别称为批次1和批次2或L1和L2)在如第7.1.2节所述的Ramos/STAT3-Luc和TF-1/STAT3-Luc测定中进行了评估。将细胞收集、旋转、重悬于测定培养基(Jurkat培养基)中并以5x105个细胞/孔以50μl的体积接种于白底/侧平底培养皿中，然后加入50μl含有IL10或IL10突变蛋白滴定液的培养基。
将细胞孵育5.5小时，然后加入100μL ONE-Glo萤光素酶试剂(PromegaCorporation，Madison Wisconsin)。将板在ONE-Glo存在下孵育3分钟，并在Envision荧光读板器(Perkin Elmer,Waltham,MA)上读取活性。
倍数诱导和EC50如第7.1.2.4节所述确定。结果总结于表8-1和8-2中，并显示于图7A-7F中。
Figure BDA0003938945220000771
这些结果显示，IL10部分位于Fc部分的C端的IL10突变蛋白比IL10部分位于Fc部分的N端的IL10突变蛋白具有更高的活性和更低的EC50。此外，虽然G4S(SEQ ID NO:51)接头长度对倍数诱导和EC50仅具有很小的影响，但IL10部分位于Fc部分的C端的IL10突变蛋白完全不存在接头，导致活性的大幅降低。
7.6.实施例5：IL10抗肿瘤活性的作用机制
同基因肿瘤同种异体移植模型用于评估融合至小鼠Fc的小鼠IL-10(IL10M11)在预防性或治疗性环境中的体内抗肿瘤功效。
简而言之，雌性小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)皮下植入物种匹配的肿瘤细胞(Tissue Culture Core，Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)：C57BL/6同基因肿瘤细胞MC38-cOVA(MC38结肠癌细胞，工程改造以过表达鸡卵清蛋白)；BALB/c同基因肿瘤细胞Colon26(结肠癌)、A20(B细胞淋巴瘤)、4T1(乳腺癌)或RENCA(肾细胞癌)。
在预防性环境中，在MC38-cOVA肿瘤植入前2天开始治疗，并每周持续两次。在治疗性环境中，根据平均肿瘤体积(通常为60～120mm3)，将小鼠随机分为治疗组(n＝7-9)。在肿瘤随机分组后开始治疗，每周持续两次。
IL10M11或同种型对照以等摩尔剂量腹膜内施用(每只小鼠6-9剂)。在IL10M11滴定研究中，同种型对照的剂量等于IL10M11的最高摩尔剂量。
每周测量两次肿瘤大小和小鼠体重。为了研究IL10抗肿瘤活性的作用机制，在肿瘤同种异体移植模型中对IL10M11进行预防性和治疗性评估。如第7.1.4节所述，将肿瘤细胞植入BALB-C或C57BL/6小鼠中，并将IL10M11预防性(肿瘤植入前)或治疗性(肿瘤植入后7天)施用于小鼠。结果显示于图8A-8D中。
7.6.1.材料与方法
肿瘤的植入和给药组的分配：对于MC38-cOVA、Colon26和RENCA同基因肿瘤模型，将1x106个肿瘤细胞(the Tissue Culture Core at Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)分别皮下植入6至8周龄雌性C57BL/6或BALB/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)的右侧腹部。对于A20和4T1同基因肿瘤模型，将1x106个肿瘤细胞(the Tissue CultureCore at Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)分别皮下植入6至8周龄雌性C57BL/6或BALB/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)的右侧腹部。一旦肿瘤达到60-120mm3的平均体积(取决于每个独特的肿瘤模型)，将小鼠随机分组(n＝7-9/组)并给药IL10M11、CD40、PD-1、对照试剂或有时给药组合。小鼠每周两次接受腹膜内注射测试物品共6-9剂，并且在整个研究过程中每周两次监测肿瘤体积和体重。在测试抗肿瘤记忆应答时，排斥原发性Colon26肿瘤攻击的小鼠接受5x106 Colon26肿瘤细胞，而幼稚小鼠仅接受1x106 Colon26肿瘤细胞。
肿瘤大小和生长抑制的计算：计算每组的平均和中值肿瘤大小，以及相对于对照治疗组的肿瘤生长抑制百分比。每周两次用卡尺测量肿瘤长度和宽度，并使用公式(长度x宽度2)/2计算肿瘤体积。进行测量直到对照组的平均肿瘤大小达到4000mm3，或直到任何组中的任何小鼠由于溃疡或体重减轻超过20％而需要安乐死。肿瘤生长抑制百分比根据下式计算：[1-(T最终-T起初)/(C最终-C起初)]*100％，其中T(治疗组)和C(对照组)代表所有小鼠存活当天的平均肿瘤质量。
7.6.2.结果
用最高测试剂量的IL10M11(0.1mg/kg)预防性治疗MC38-cOVA肿瘤显示出边际抗肿瘤功效，具有约30％的肿瘤生长抑制(TGI)和8只中的1只无肿瘤小鼠(图8A)。较低剂量(0.005或0.0003mg/kg)的IL10M11没有抗肿瘤作用。相比之下，用IL10M11(0.1mg/kg)治疗已建立的MC38-cOVA肿瘤导致约65％TGI和7只中的4只无肿瘤小鼠(图8B)。
在Colon26、A20和4T1肿瘤模型中进一步测试IL10M11的治疗功效。该治疗在Colon26和A20模型中均引发了100％的总应答率(ORR)、100％的TGI和接近100％的无肿瘤存活率(图8C和图8D)。在4T1肿瘤模型中也观察到显著的TGI，包括超过100mm3的大型已建立肿瘤的生长控制；然而，没有实现无肿瘤存活(图8E)。
在研究结束时收集的4T1肿瘤被分离并接受免疫细胞组成和功能的流式细胞术分析。对来自IL10M11治疗的小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞的分析显示，产生IFNγ/TNFα的CD4和CD8 T细胞的频率、密度和平均荧光强度(MFI)增加(图8F和图8G)。
在原发性Colon26或A20肿瘤攻击中存活的小鼠分别通过双侧植入Colon26和RENCA(图8H)或A20和Colon26(图8I)肿瘤对进行再次攻击。阳性对照Colon26和RENCA，或A20和Colon26双侧肿瘤在植入幼稚小鼠时都迅速生长。然而，在IL10M11治疗后完全排斥原发性肿瘤的小鼠引发长期抗肿瘤记忆应答，并排斥相同肿瘤的二次攻击，但不排斥不相关的肿瘤类型(图8H和8I)。
最后，确定了IL10M11与CD40激动剂Ab或PD-1拮抗剂Ab组合的抗肿瘤作用。IL10M11、CD40 Ab和PD-1Ab各自作为单药表现出抗肿瘤应答(图9A)。任何两种治疗方式的组合进一步增强了它们的抗肿瘤功效(图9A)并增加了无肿瘤存活率(图9B)。
7.7.实施例6：IL10在抗PD-1Ab敏感和响应性性肿瘤中的抗肿瘤活性
多个同基因肿瘤移植模型用于评估任何治疗前肿瘤微环境中的免疫浸润作为基线，也用于比较融合至小鼠IgG1的小鼠IL-10(IL10M11)与抗PD-1拮抗剂Ab(小鼠IgG1)在治疗环境中的体内抗肿瘤功效。
简而言之，雌性小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)皮下植入物种匹配的肿瘤细胞：具有MC38结肠癌细胞和B16F10黑色素瘤细胞的C57BL/6小鼠，或具有Colon26结肠癌细胞和A20 B细胞淋巴瘤细胞的BALB/c小鼠(所有细胞来自Tissue Culture Core atRegeneron Pharmaceuticals,Inc.)。当肿瘤大小达到约100mm3时，切除肿瘤并进行标准方案，用于CD45+免疫细胞和CD45门内列出的亚群的免疫分析。在一些情况下，还对脾脏和引流***以及肿瘤进行免疫细胞/肿瘤细胞上IL10R1、PD1或PD-L1的表面表达分析。在治疗环境中，在肿瘤植入数天后施用治疗，通常是在肿瘤大小达到平均体积75～150mm3(取决于肿瘤类型)时，将小鼠随机分为不同的治疗组(n＝7-8/组)。小鼠给药mIgG1同种型对照、IL10M11或抗小鼠PD1 Ab。每周进行两次治疗以及肿瘤大小和体重的测量。
7.7.1.材料与方法
肿瘤的植入和给药组的分配:对于B16F10、MC38、MC38-cOVA、Colon26和A20同基因肿瘤模型，分别将0.5-10x106个肿瘤细胞(the Tissue Culture Core at RegeneronPharmaceuticals,Inc.)皮下植入6至8周龄雌性C57BL/6或BALB/c小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)的右侧腹部。一旦肿瘤达到75-150mm3的平均体积(取决于每个独特的肿瘤模型)，将小鼠随机分组(n＝7-8/组)并给药IL10M11、PD1 Ab、PD1-IL10、对照试剂、或有时给药组合。小鼠每周两次腹膜内注射测试物品共6-9剂，并且在整个研究过程中每周两次监测肿瘤体积和体重。
肿瘤大小和生长抑制的计算：计算每组的平均和中值肿瘤大小，以及相对于对照治疗组的肿瘤生长抑制百分比。每周两次用卡尺测量肿瘤长度和宽度，并使用公式(长度x宽度2)/2计算肿瘤体积。进行测量直到对照组的平均肿瘤大小达到4000mm3，或直到任何组中的任何小鼠由于溃疡或体重减轻超过20％而需要安乐死。肿瘤生长抑制根据下式计算：[1-(T最终-T起初)/(C最终-C起初)]*100％，其中T(治疗组)和C(对照组)代表所有小鼠存活当天的平均肿瘤质量。观察延长至第54天(最后一次治疗后3周)以确定无肿瘤小鼠的频率。
根据MSD(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD,美国)的标准方案进行血清中细胞因子的MSD多路复用。
7.7.2.结果
如图10A-10E所示，A20、Colon26和MC38肿瘤中总CD45+免疫细胞以及所有分析的免疫细胞亚群的密度远高于B16F10肿瘤中的对应物。进一步的分析还表明，B16F10肿瘤具有较少的Ki67增殖CD4和CD8 T细胞以及记忆表型。
如预期的那样，IL10R1在脾脏和肿瘤中由多种髓系细胞组成性和普遍性表达。引人注目的是，IL10R1在T细胞，特别是CD8 T细胞上的表达非常局限于肿瘤浸润性CD8 T细胞，在次级淋巴组织如MC38-cOVA和Colon26的脾脏和引流LN的T细胞上几乎没有表达(参见图11A-11I)。研究进一步表明，几乎所有的IL10R1+CD8 T细胞都表达PD1分子。这些数据表明:1)那些IL10R1+PD1+CD8 T细胞可以是肿瘤抗原特异性的；2)IL10R1在肿瘤T细胞亚群上高度受限的表达模式，可能代表了IL10M11在小鼠中的良好安全性背后的生物学原因；3)IL10-Fc与PD-1拮抗Ab的组合是增强抗肿瘤应答的可能策略。
PD-L1的表达在测试的四种不同肿瘤类型中是可变的(图12A-12G)。接下来，确定了每种肿瘤类型对PD1拮抗Ab与IL10M11治疗的应答。如图13A-13C所示，150mm3 A20 B细胞淋巴瘤对PD-1Ab治疗的应答非常好，其中肿瘤生长显著延迟，无肿瘤存活率约50％。然而，IL10M11引发了针对A20的更深入和更广泛的免疫应答，其中无肿瘤存活率约85％。在Colon26肿瘤模型(图14A-14C)中，100mm3肿瘤对PD1 Ab治疗完全耐受。相比之下，IL10M11再次显示出约85％的无肿瘤存活率。已知B16F10的免疫原性较低，免疫细胞浸润较少，这在本研究中得到证实(图10A-10E)。100mm3B16F10肿瘤对PD1 Ab应答较差。然而，IL10M11显著延迟了肿瘤生长并使大多数肿瘤产生应答(图15A-15C)。由于观察到90-100mm3 MC38肿瘤对PD1 Ab应答较差(参见图22A-22B)，测试了75mm3的MC38结肠癌。在该研究中，虽然PD1Ab和IL10-Fc作为单药具有相似的抗肿瘤作用，但两者的组合通过延缓肿瘤生长和提高无肿瘤存活率而显著增强了抗肿瘤应答(图16A-16C)。
为了描述IL10-Fc(例如，IL10M11)的相关作用机制，对治疗后的肿瘤微环境进行免疫分析。IL10治疗显著增加了免疫原性MC38肿瘤模型(图17A)和免疫原性较低的4T1肿瘤模型(图17B)中的CD8 T细胞密度，这在两种情况下都与更好的预后相关。进一步的研究表明，IL10增加了PD1+CD8 T细胞密度，表明那些CD8 T细胞可能曾经是激活的肿瘤特异性CD8T细胞(图18A-18B)。在4T1肿瘤模型中，除CD8 T细胞外，IL10M11倾向于增加总体CD45免疫浸润，包括CD4 T细胞和髓系细胞(图17A-17B和18A-18B)，这提供了为何IL10在免疫原性较低的肿瘤模型如4T1和B16F10中起作用的合理解释。
为了确定IL10-Fc的潜在药效学(PD)标志物，使用商业多重MSD平台分析了各种细胞因子的血清水平。在幼稚、非荷瘤小鼠(图19)和荷瘤B16F10小鼠(图20)中，一组标志性细胞因子(IL12、IL1b、IL2、IL4和IL5)由IL10独特地上调，但不由PD1 Ab上调。当归一化为同种型对照治疗的小鼠中的平均值时，在多种肿瘤模型(如A20、MC38、MC38-cOVA、B16F10和Colon26)中观察到非常明显的IL12和IL4的多倍上调趋势(图21A-21B)。一些样品是在不同时间点从同一肿瘤模型中收集的(MC38和Colon26)，但仍显示出一致的趋势。
基于先前发现的PD1与IL10R1的共表达以及通过IL10-Fc和PD-1拮抗Ab的组合增强的抗肿瘤功效，探索了PD1靶向的IL10作为治疗剂的可能性。据报道，较高剂量的Pagilodecakin(peg化IL10)在临床试验中显示出一些毒性。将不同治疗方式(IL10-Fc、对照Ab-IL10、PD1-IL10和PD1 Ab)的IL10摩尔量而非PD1摩尔量归一化是合理的。如图22A-22B所示，PD1Ab和IL10-Fc作为单药具有它们各自预期的抗肿瘤效果(PD1 Ab的效果非常微弱，而IL10-Fc的效果中等)。虽然IL10-Fc和PD-1Ab的组合显著提高了疗效，但PD1-IL10-Fc在疗效方面与对照Ab-IL10或IL10-Fc相比没有显示任何差异。
7.8.实施例8：IL10激动剂的纯化
评估了IL10激动剂的多个迭代(即IL10M1至IL10M11)，以确定它们重组表达和回收的能力。具有位于Fc结构域的N端或C端的IL10部分的IL10激动剂是可回收的，尽管两种构型都导致大量的聚集的IL10激动剂。开发了纯化方法来产生非聚集的IL10激动剂。
7.8.1.材料与方法
如第7.1节所述，生成编码IL10突变蛋白的构建体并在哺乳动物细胞系中重组表达并纯化。裂解细胞，将PBS缓冲液中的细胞裂解物以0.4ml/min的流速上样到PrismA蛋白A亲和柱上。亲和柱用pH 6.6的Pierce Gentle洗脱缓冲液洗脱。然后通过针对1x TBS+5％甘油、然后2x PBS+5％甘油的透析交换缓冲液。然后使用Superdex 200,26/600pg柱(MilliporeSigma,St.Louis,MO USA)对缓冲液交换的洗脱物进行尺寸排阻色谱。收集包括非聚集的IL10激动剂的级分。
7.8.2.结果
对于在Fc结构域的C端具有IL10部分的IL10激动剂，纯化方案产生了完整的、非聚集的IL10激动剂，在尺寸排阻超高效液相色谱中没有观察到异常峰。在Fc结构域的N端具有IL10部分的IL10激动剂也被回收，但不是完整的，缺少C端赖氨酸，或作为具有氨基酸3至402的片段回收，而全长构建体具有残基1至403。
纯化的、非聚集的IL10激动剂可以与赋形剂一起配制成药物组合物，其中配制的药物组合物具有IL10激动剂的最小聚集体。
7.具体实施方案，参考文献的引用
尽管已经说明和描述了各种具体实施方案，但是应当理解，可以在不背离本公开的精神和范围的情况下进行各种改变。本公开通过以下列出的编号实施方案来举例说明。
在以下编号的实施方案和随后的权利要求的优选方面，IL10结构域、Fc结构域及其变体优选地包含人IL10、人Fc结构域及其变体的氨基酸序列，例如与此类人序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性的变体。
1.IL10激动剂，其包含:
(a)Fc结构域；
(b)接头；和
(c)IL10部分。
2.实施方案1的IL10激动剂，其进一步包含位于所述Fc结构域N端的铰链结构域。
3.实施方案1或实施方案2的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
4.实施方案1至3中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
5.实施方案1至4中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其组合的CH2和Ch3结构域。
6.实施方案1至5中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是IgG1。
7.实施方案1至6中任一项的IL10激动剂，其中所述IgG1是人IgG1。
8.实施方案1至6中任一项的IL10激动剂，其中所述IgG1是鼠IgG1。
9.实施方案1至5中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是IgG4。
10.实施方案9的IL10激动剂，其中所述IgG1是人IgG4。
11.实施方案9的IL10激动剂，其中所述IgG1是鼠IgG4。
12.实施方案1至4和9中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQ IDNO：31具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
13.实施方案1至4、9和12中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQID NO：31具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
14.实施方案1至4、9、12和13中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO：31具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
15.实施方案1至4、9和12至14中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO：31具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
16.实施方案1至4、9和12至15中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO：31具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
17.实施方案1至4、9和12至16中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含SEQID NO：31的氨基酸序列。
18.实施方案1至7中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQ ID NO:33具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
19.如实施方案1至7和18中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQID NO:33具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
20.实施方案1至7、18和19中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQID NO:33具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
21.实施方案1至7和18至20中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQID NO:33具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
22.实施方案1至7和18至21中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含与SEQID NO:33具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
23.实施方案1至7和18至22中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含SEQID NO:33的氨基酸序列。
24.实施方案1至17中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域具有降低的效应功能。
25.实施方案5至24中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域衍生自与所述CH2和/或CH3结构域相同的IgG。
26.实施方案5至24中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域衍生自与所述CH2和/或CH3结构域不同的IgG。
27.实施方案2至26中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域包含嵌合铰链序列。
28.实施方案2至27中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
29.实施方案2至27中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
30.实施方案1至18中任一项的IL10激动剂，其中所述接头的长度为10个氨基酸至60个氨基酸残基。
31.实施方案1至18中任一项的IL10激动剂，其中所述接头的长度为15个氨基酸至25个氨基酸残基。
32.实施方案1至18中任一项的IL10激动剂，其中所述接头的长度为15至20个氨基酸残基。
33.实施方案1至32中任一项的IL10激动剂，其中所述接头包含GnS或SGn的单体或多聚体，任选地其中n是1至7的整数。
34.实施方案33的IL10激动剂，其中所述接头包含G4S的单体或多聚体。
35.实施方案34的IL10激动剂，其中所述接头包含G4S的1至6个重复。
36.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)1。
37.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)2。
38.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)3。
39.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)4。
40.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)5。
41.实施方案35的IL10激动剂，其中所述接头包含(G4S)6。
42.实施方案1至41中任一项的IL10激动剂，其中所述接头连接所述Fc结构域和所述IL10部分。
43.实施方案1至41中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分在所述Fc结构域的C端。
44.实施方案1至41中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分在所述Fc结构域的N端。
45.实施方案1至41中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
46.实施方案1至42中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
47.实施方案1至43中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
48.实施方案1至44中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
49.实施方案1至45中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
50.实施方案1至49中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含成熟人IL10(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的IL10)的氨基酸序列。
51.实施方案1至41中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
52.实施方案1至41和51中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
53.实施方案1至41、51和52中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
54.实施方案1至41和51至53中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
55.实施方案1至41和51至54中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含与成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
56.实施方案1至41和51至55中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含成熟鼠IL10(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的IL10)的氨基酸序列。
57.实施方案1至56中任一项的IL10激动剂，其为单体，任选地其中所述单体在所述IL10部分的N116和K117之间具有接头序列的***和/或所述Fc例如通过在对应于CH3中T366和/或Y407的位置处的一个或多个取代而具有降低的自缔合能力。
58.实施方案1至56中任一项的IL10激动剂，其为单体，其中所述单体在所述IL10部分的N116和K117之间缺乏接头序列的***。
59.实施方案1至56和58中任一项的IL10激动剂，其为单体，其中所述单体在对应于CH3中的T366和/或Y407的位置处未被取代。
60.实施方案1至56中任一项的IL10激动剂，其为同二聚体。
61.实施方案58的IL10激动剂，其包含两个Fc结构域。
62.实施方案61的IL10激动剂，其通过Fc结构域二聚化。
63.实施方案62的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含命名为hIgG4-Fc的氨基酸序列(例如，具有SEQ ID SEQ ID NO:31的氨基酸18至228的氨基酸序列的Fc)。
64.实施方案62的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含命名为hIgG4s-Fc的氨基酸序列(例如，具有SEQ ID SEQ ID NO:31的氨基酸序列的Fc)。
65.实施方案62的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含命名为mIgG1-Fc的氨基酸序列(例如，具有SEQ ID SEQ ID NO:33的氨基酸序列的Fc)。
66.实施方案61的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是非二聚化的。
67.实施方案58至67中任一项的IL10激动剂，其包含两个IL10部分。
68.实施方案67的IL10激动剂，其通过所述IL10部分二聚化。
69.实施方案67的IL10激动剂，其中所述IL10部分是非二聚化的。
70.实施方案1至56中任一项的IL10激动剂，其为异二聚体。
71.实施方案70的IL10激动剂，其包含两个Fc结构域。
72.实施方案71的IL10激动剂，其通过所述Fc结构域二聚化。
73.实施方案71的IL10激动剂，其中所述Fc结构域是非二聚化的。
74.实施方案70至73中任一项的IL10激动剂，其包含两个IL10部分。
75.实施方案74的IL10激动剂，其通过所述IL10部分二聚化。
76.实施方案74的IL10激动剂，其中所述IL10部分是非二聚化的。
77.实施方案70至73中任一项的IL10激动剂，其包含单个IL10部分。
78.IL10激动剂，其包含与IL10M1(即，具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
79.实施方案78的IL10激动剂，其包含与IL10M1的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
80.实施方案78或实施方案79的IL10激动剂，其包含与IL10M1的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
81.实施方案78至80中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M1的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
82.实施方案78至81中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M1的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
83.实施方案78至82中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M1的氨基酸序列。
84.IL10激动剂，其包含与IL10M2(即，具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
85.实施方案84的IL10激动剂，其包含与IL10M2的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
86.实施方案84或实施方案85的IL10激动剂，其包含与IL10M2的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
87.实施方案84至86中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M2的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
88.实施方案84至87中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M2的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
89.实施方案84至88中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M2的氨基酸序列。
90.IL10激动剂，其包含与IL10M3(即，具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
91.实施方案90的IL10激动剂，其包含与IL10M3的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
92.实施方案90或实施方案91的IL10激动剂，其包含与IL10M3的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
93.实施方案90至92中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M3的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
94.实施方案90至93中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M3的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
95.实施方案90至94中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M3的氨基酸序列。
96.IL10激动剂，其包含与IL10M4(即，具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
97.实施方案96的IL10激动剂，其包含与IL10M4的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
98.实施方案96或实施方案97的IL10激动剂，其包含与IL10M4的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
99.实施方案96至98中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M4的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
100.实施方案96至99中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M4的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
101.实施方案96至100中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M4的氨基酸序列。
102.IL10激动剂，其包含与IL10M5(即，具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
103.实施方案102的IL10激动剂，其包含与IL10M5的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
104.实施方案102或实施方案103的IL10激动剂，其包含与IL10M5的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
105.实施方案102至104中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M5的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
106.实施方案102至105中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M5的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
107.实施方案102至106中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M5的氨基酸序列。
108.IL10激动剂，其包含与IL10M6(即，具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
109.实施方案108的IL10激动剂，其包含与IL10M6的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
110.实施方案108或实施方案109的IL10激动剂，其包含与IL10M6的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
111.实施方案108至110中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M6的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
112.实施方案108至111中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M6的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
113.实施方案108至112中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M6的氨基酸序列。
114.IL10激动剂，其包含与IL10M7(即，具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
115.实施方案114的IL10激动剂，其包含与IL10M7的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
116.实施方案114或实施方案115的IL10激动剂，其包含与IL10M7的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
117.实施方案114至116中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M7的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
118.实施方案114至117中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M7的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
119.实施方案114至118中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M7的氨基酸序列。
120.IL10激动剂，其包含与IL10M8(即，具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
121.实施方案120的IL10激动剂，其包含与IL10M8的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
122.实施方案120或实施方案121的IL10激动剂，其包含与IL10M8的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
123.实施方案120至122中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M8的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
124.实施方案120至123中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M8的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
125.实施方案120至124中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M8的氨基酸序列。
126.IL10激动剂，其包含与IL10M9(即，具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
127.实施方案126的IL10激动剂，其包含与IL10M9的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
128.实施方案126或实施方案127的IL10激动剂，其包含与IL10M9的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
129.实施方案126至128中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M9的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
130.实施方案126至129中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M9的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
131.实施方案126至130中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M9的氨基酸序列。
132.IL10激动剂，其包含与IL10M10(即，具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
133.实施方案132的IL10激动剂，其包含与IL10M10的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
134.实施方案132或实施方案133的IL10激动剂，其包含与IL10M10的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
135.实施方案132至134中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M10的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
136.实施方案132至135中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M10的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
137.实施方案132至136中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M10的氨基酸序列。
138.IL10激动剂，其包含与IL10M11(即，具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的IL10激动剂)的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
139.实施方案138的IL10激动剂，其包含与IL10M11的氨基酸序列具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。
140.实施方案138或实施方案139的IL10激动剂，其包含与IL10M11的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。
141.实施方案138至140中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M11的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
142.实施方案138至141中任一项的IL10激动剂，其包含与IL10M11的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
143.实施方案138至142中任一项的IL10激动剂，其包含IL10M11的氨基酸序列。
144.实施方案1至143中任一项的IL10激动剂，其进一步包含靶向部分。
145.实施方案144的IL10激动剂，其中所述靶向部分在所述Fc结构域的N端，并且如果存在铰链结构域，所述靶向部分在所述铰链结构域的N端。
146.实施方案144或实施方案145的IL10激动剂，其中所述靶向部分：
(a)与肿瘤相关抗原结合；
(b)与肿瘤微环境抗原结合；
(c)与肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子结合；或者
(d)与检查点抑制剂结合。
147.实施方案146的IL10激动剂，其中所述靶向部分与肿瘤相关抗原结合。
148.实施方案147的IL10激动剂，其中所述肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)、生腱蛋白-C的A1结构域(TNC A1)、生腱蛋白-C的A2结构域(TNC A2)、纤连蛋白的额外结构域B(EDB)、黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、***特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、***特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、MAGE肿瘤抗原家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE-肿瘤抗原家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100 Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人***瘤病毒蛋白、Smad肿瘤抗原家族、Imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、c-erbB-2、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR缔合的异多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓系细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R-(IL6受体)、CD20、MCSP、PDGFβR(β-血小板衍生生长因子受体)、ErbB2上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、二唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮黏蛋白、gp36、TAG-72、胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜***、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、***酶、***酶特异性抗原(PSA)、PAP、LAGA-1a、p53、prostein、PSMA、存活和端粒酶、***癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)或额外结构域B(EDB)、或生腱蛋白-C的A1结构域(TnC A1)。
149.实施方案147的IL10激动剂，其中所述肿瘤相关抗原是病毒抗原。
150.实施方案149的IL10激动剂，其中所述病毒抗原是爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-1、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、HIV gp160、或HIV gp120、HPV E6、HPV E7、CMV早期膜抗原(EMA)或CMV晚期膜抗原(LMA)。
151.实施方案146的IL10激动剂，其中所述靶向部分与肿瘤微环境抗原结合。
152.实施方案151的IL10激动剂，其中所述肿瘤微环境抗原是细胞外基质蛋白。
153.实施方案152的IL10激动剂，其中所述细胞外基质蛋白是黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整联蛋白、骨桥蛋白、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白、胶原蛋白或基质蛋白。
154.实施方案146的IL10激动剂，其中所述靶向部分与肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子结合。
155.实施方案154的IL10激动剂，其中所述细胞表面分子是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、LAG3、TIM3或B7-H3。
156.实施方案146的IL10激动剂，其中所述靶向部分与检查点抑制剂结合。
157.实施方案156的ILlO激动剂，其中所述检查点抑制剂是CTLA-4、PD1、PDL1、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、VISTA、PSGL1或CHK2。
158.实施方案157的IL10激动剂，其中所述检查点抑制剂是PD1。
159.实施方案144或实施方案145的IL10激动剂，其中所述靶向部分与MHC-肽复合物结合。
160.实施方案159的IL10激动剂，其中所述肽-MHC复合物中的肽包含肿瘤新抗原。
161.实施方案160的IL10激动剂，其中所述肿瘤新抗原是LCMV衍生肽gp33-41、APF(126-134)、BALF(276-284)、CEA(571-579)、CMV pp65(495-503)、FLU-M1(58-66)、gp100(154-162)、gp100(209-217)、HBV核心(18-27)、Her2/neu(369-377；V2v9)；HPV E7(11-20)、KLK4(11-19)、LMP1(125-133)、MAG-A3(112-120)、NYESO1(157-165,C165A)、NYESO1(157-165,C165V)、p54 WT(264-272)、PAP-3(136-143)、PSMA(4-12)、PSMA(135-145)、生存素(96-014)、酪氨酸酶(369-377、371D)或WT1(126-134)。
162.实施方案144至161中任一项的IL10激动剂，其中所述靶向部分是抗体或其抗原结合片段。
163.实施方案162的IL10激动剂，其中所述靶向部分是Fab。
164.实施方案162的IL10激动剂，其中所述靶向部分是scFv。
165.实施方案144至164中任一项的IL10激动剂，其中所述靶向部分不与检查点抑制剂结合，任选地其中所述检查点抑制剂是PD1。
166.实施方案1至164中任一项的IL10激动剂，其缺乏与检查点抑制剂结合的靶向结构域，任选地其中所述检查点抑制剂是PD1。
167.实施方案1至139中任一项的IL10激动剂，其缺乏靶向部分。
168.实施方案1至99和167中任一项的IL10激动剂，其缺乏靶向部分，例如但不限于以下靶向部分：
(a)与肿瘤相关抗原结合的靶向部分；
(b)与肿瘤微环境抗原结合的靶向部分；
(c)与肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子结合的靶向部分；或者
(d)与检查点抑制剂结合的靶向部分。
169.实施方案168的IL激动剂，其缺乏结合PD1的靶向部分。
170.实施方案1至139和165中任一项的IL10激动剂，其缺少CH1结构域。
171.实施方案1至139、165和168中任一项的IL10激动剂，其缺少CL结构域。
172.实施方案1至139和165至171中任一项的IL10激动剂，其缺少抗体可变区。
173.实施方案1至172中任一项的IL10激动剂，其进一步包含亲水性聚合物。
174.实施方案173的IL10激动剂，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇(“PEG”)。
175.实施方案174的IL10激动剂，其中所述PEG具有约7.5kDa至约80kDa的分子量。
176.实施方案175的IL10激动剂，其中所述PEG具有约30kDa至约60kDa的分子量，任选地其中所述分子量为约50kDa。
177.实施方案1至172中任一项的IL10激动剂，其包含稳定化部分。
178.实施方案177的IL10激动剂，其中所述稳定化部分是白蛋白、人血清白蛋白结合剂、XTEN、PAS、亲水性聚合物、聚唾液酸或脂肪酸。
179.实施方案1至172中任一项的IL10激动剂，其不与聚乙二醇缀合。
180.实施方案1至172和179中任一项的IL 10激动剂，其不与白蛋白缀合。
181.实施方案1至172、179和180中任一项的IL 10激动剂，其不与人血清白蛋白结合剂缀合。
182.实施方案1至172和179至181中任一项的IL10激动剂，其不与XTEN缀合。
183.实施方案1至172和179至182中任一项的IL10激动剂，其不与PAS缀合。
184.实施方案1至172和179至183中任一项的IL10激动剂，其不与亲水性聚合物缀合。
185.实施方案1至172和179至184中任一项的IL10激动剂，其不与聚唾液酸缀合。
186.实施方案1至172和179至185中任一项的IL10激动剂，其不与羟乙基淀粉缀合。
187.实施方案1至172和179至186中任一项的IL10激动剂，其不与脂肪酸缀合。
188.实施方案1至172和179至187中任一项的IL10激动剂，其不包括N-连接聚糖。
189.实施方案1至172和179至187中任一项的IL10激动剂，其不包括O-连接聚糖。
190.实施方案1至172和179至189中任一项的IL10激动剂，其缺乏稳定化部分。
191.实施方案1至180中任一项的IL10激动剂，其不含IL4。
192.实施方案1至191中任一项的IL10激动剂，其不含除IL10之外的任何细胞因子。
193.实施方案1至192中任一项的IL10激动剂，其不含位于IL10部分C端的Fc结构域。
194.实施方案1至193中任一项的IL10激动剂，其为哺乳动物细胞中重组细胞表达的产物。
195.实施方案194的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是小鼠细胞系。
196.实施方案194的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是大鼠细胞系。
197.实施方案194的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是猴细胞系。
198.实施方案194的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是人细胞系。
199.一种核酸或多种核酸，其编码实施方案1至198中任一项的IL10激动剂。
200.宿主细胞，其经工程改造以表达实施方案1至198中任一项的IL10激动剂或实施方案194的核酸。
201.实施方案200的宿主细胞，其中所述宿主细胞是小鼠细胞系。
202.实施方案200的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是大鼠细胞系。
203.实施方案200的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是猴细胞系。
204.实施方案200的IL10激动剂，其中所述哺乳动物细胞是人细胞系。
205.产生实施方案1至198中任一项的IL10激动剂的方法，其包括培养实施方案200至204中任一项的宿主细胞并回收由此表达的IL10激动剂。
206.实施方案205的方法，其进一步包括：
(a)使所述回收的IL10激动剂与被配置用于捕获IL10激动剂的亲和柱接触；
(b)洗脱所述亲和柱以产生洗脱物；和
(c)对所述洗脱物进行尺寸排除色谱。
207.实施方案206的方法，其中所述亲和柱是蛋白A亲和柱。
208.IL10激动剂，其通过包括以下步骤的方法产生:
(a)培养实施方案200至204中任一项的宿主细胞；和
(b)回收由此表达的IL10激动剂。
209.实施方案208的IL10激动剂，其中所述方法进一步包括：
(a)使所述回收的IL10激动剂与被配置用于捕获IL10激动剂的亲和柱接触；
(b)洗脱所述亲和柱以产生洗脱物；和
(c)对所述洗脱物进行尺寸排除色谱。
210.制备药物组合物的方法，其包括将通过实施方案205至207中任一项的方法制备的IL10激动剂与赋形剂一起配制。
211.药物组合物，其包含实施方案1至198中任一项的IL10激动剂和赋形剂。
212.药物组合物，其通过实施方案210的方法获得。
213.实施方案210或实施方案211的药物组合物，其包含至少10mg的所述IL10激动剂。
214.实施方案210或实施方案211的药物组合物，其包含至少20mg的所述IL10激动剂。
215.实施方案210或实施方案211的药物组合物，其包含至少50mg的所述IL10激动剂。
216.实施方案211至215中任一项的药物组合物，其中少于30％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
217.实施方案211至216中任一项的药物组合物，其中少于25％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
218.实施方案211至217中任一项的药物组合物，其中少于20％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
219.实施方案211至218中任一项的药物组合物，其中少于15％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
220.实施方案211至219中任一项的药物组合物，其中少于10％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
221.实施方案211至220中任一项的药物组合物，其中少于5％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
222.实施方案211至215中任一项的药物组合物，其不含可检测量的所述IL10激动剂的聚集体，如通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)所测定。
223.实施方案211至222中任一项的药物组合物，其不含可检测量的所述IL10激动剂的C端截短变体。
224.治疗炎性病症、免疫相关病症、纤维化病症或癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用实施方案1至198中任一项的IL10激动剂或实施方案211至223中任一项的药物组合物。
225.实施方案224的方法，其是治疗癌症的方法并且其中所述癌症是实体瘤。
226.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是结肠癌。
227.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是黑色素瘤。
228.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是鳞状细胞癌。
229.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是淋巴瘤。
230.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是胰腺肿瘤。
231.实施方案225的方法，其中所述实体瘤是肺肿瘤。
232.实施方案224至231中任一项的方法，其中所述IL10激动剂或药物组合物与5-氟尿嘧啶、亚叶酸和铂配位络合物联合施用。
233.实施方案224至231中任一项的方法，其中所述IL10激动剂或药物组合物皮下施用。
234.实施方案224至231中任一项的方法，其中所述IL10激动剂或药物组合物静脉内施用。
235.实施方案224至234中任一项的方法，其中所述实体瘤对用抗PD1抗体的治疗耐受。
236.实施方案224至235中任一项的方法，其中所述实体瘤对用抗PD1抗体单一疗法的治疗耐受。
237.实施方案224至236中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用抗PD1抗体。
238.实施方案235至237中任一项的方法，其中所述抗PDl抗体是MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810或BGB-108。
239.实施方案225至238中任一项的方法，其导致所述实体瘤中CD8T细胞密度的增加。
240.实施方案239的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少2倍的增加。
241.实施方案239的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少3倍的增加。
242.实施方案239的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少4倍的增加。
243.实施方案225至242中任一项的方法，其导致所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加。
244.实施方案243的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是5％的增加。
245.实施方案243的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是10％的增加。
246.实施方案243的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是15％的增加。
247.实施方案243的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是20％的增加。
248.实施方案243至247中任一项的方法，其中所述CD45+免疫细胞包含CD4T细胞、髓系细胞或CD4T细胞和髓系细胞两者。
249.实施方案225至248中任一项的方法，其中相对于未用所述IL10激动剂或药物组合物治疗的合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法上调血清IL12。
250.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少2倍。
251.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少5倍。
252.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少10倍。
253.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少15倍。
254.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少20倍。
255.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少25倍。
256.实施方案249的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少30倍。
257.实施方案225至256中任一项的方法，其中相对于未用所述IL10激动剂或药物组合物治疗的合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法上调血清IL4水平。
258.实施方案257的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少2倍。
259.实施方案257的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少5倍。
260.实施方案257的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少10倍。
261.实施方案257的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少15倍。
262.实施方案257的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少20倍。
263.治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用：
(a)表达嵌合抗原受体(“CAR”)的CD8+T细胞(“CART细胞”)；
和
(b)实施方案1至198中任一项的IL10激动剂。
264.实施方案263的方法，其中所述IL10激动剂在施用所述CART细胞的一周内施用于所述受试者。
265.实施方案264的方法，其中所述IL10激动剂在施用所述CART细胞的同一天施用于所述受试者。
266.实施方案263至265中任一项的方法，其包括向受试者给药所述IL10激动剂至少两周的时间段。
267.实施方案266的方法，其中所述IL10激动剂通过连续输注给药。
268.实施方案266的方法，其中所述IL10激动剂通过在所述至少两周的时间段的至少一部分中每天施用来给药。
269.实施方案266的方法，其中所述IL10激动剂根据分次给药方案给药，所述分次给药方案包括：
(a)在所述至少两周的时间段的最初部分以第一给药频率施用所述IL10激动剂；和
(b)在所述至少的两周时间段的后续部分以第二给药频率施用所述IL10激动剂。
270.实施方案269的方法，其中所述第一给药频率是每天一次。
271.实施方案269或实施方案270的方法，其中所述第二给药频率低于所述第一给药频率。
272.实施方案271的方法，其中所述第二给药频率是每周一次。
273.实施方案269至272中任一项的方法，其中在所述CART细胞耗竭的同时或之后，所述受试者从所述第一给药频率转变为所述第二给药频率。
274.实施方案263至273中任一项的方法，其中所述癌症对用抗PD1抗体的治疗耐受。
275.实施方案263至274中任一项的方法，其中所述癌症对用抗PD1抗体单一疗法的治疗耐受。
276.实施方案263至275中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用抗PD1抗体。
277.实施方案274至276中任一项的方法，其中所述抗PDl抗体是MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810或BGB-108。
278.实施例263至277中任一项的方法，其中所述CAR经设计以靶向5T4、甲胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD56、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、C型凝集素样分子1(CLL-1)、EGFRvIII、上皮肿瘤抗原、ERBB2、FLT3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、HER1-HER2组合、HER2-HER3组合、HER2/Neu、HERV-K、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HIV-1包膜糖蛋白gp120、IL-IIRalpha、kappa链、lambda链、黑色素瘤相关抗原、间皮素、MUC-1、突变的p53、突变的ras、***特异性抗原、ROR1或VEGFR2，或其组合。
279.实施方案263至278中任一项的方法，其中所述CAR根据第6.11.1节及其小节配置。
280.实施方案263至279中任一项的方法，其中所述IL10激动剂为根据实施方案211至223中任一项的药物组合物的形式。
281.实施方案263至280中任一项的方法，其导致所述实体瘤中CD8T细胞密度的增加。
282.实施方案281的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少2倍的增加。
283.实施方案281的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少3倍的增加。
284.实施方案281的方法，其中所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加是至少4倍的增加。
285.实施方案263至281中任一项的方法，其导致所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加，任选地其中所述增加是至少10％的增加。
286.实施方案285的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是5％的增加。
287.实施方案285的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是10％的增加。
288.实施方案285的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是15％的增加。
289.实施方案285的方法，其中所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加是20％的增加。
290.实施方案285至289中任一项的方法，其中所述CD45+免疫细胞包含CD4 T细胞和髓系细胞。
291.实施方案263至286中任一项的方法，其中相对于未用所述IL10或药物组合物治疗的合适对照，所述方法上调血清IL12水平。
292.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少2倍。
293.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少5倍。
294.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少10倍。
295.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少15倍。
296.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少20倍。
297.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少25倍。
298.实施方案291的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法使血清IL12水平上调至少30倍。
299.实施方案263至298中任一项的方法，其中相对于未用所述IL10或药物组合物治疗的合适对照，所述方法上调血清IL4水平。
300.实施方案299的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少2倍。
301.实施方案299的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少5倍。
302.实施方案299的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少10倍。
303.实施方案299的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少15倍。
304.实施方案299的方法，其中相对于所述对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法使血清IL4水平上调至少20倍。
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件均通过整体引用并入本文以用于所有目的，如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指出通过引用并入相同的程度用于所有目的。如果在本文并入的一个或多个参考文献的教导与本公开内容之间存在不一致的情况，那么本说明书的教导是预期的。
序列表
<110> 再生元制药公司
<120> 新型IL10激动剂及其使用方法
<130> RGN-002US
<140>
<141>
<150> 63/023,703
<151> 2020-05-12
<160> 59
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 160
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 2
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 3
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
225 230
<210> 4
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 4
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 5
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 6
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 7
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 8
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(10)
<223> 该区域可以包括1-10个残基
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(11)
<223> 该区域可以包括1-10个残基
<400> 10
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<220>
<223> 参见提交的说明书以获得替代和优选实施方案的详细描述
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 12
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala
20
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 14
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 15
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 16
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 17
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 18
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 19
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 19
Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys
20 25
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 20
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 21
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 21
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
<210> 22
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 22
Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
35 40 45
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
65 70 75 80
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
85 90 95
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
100 105 110
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
115 120 125
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
130 135
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 24
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
1 5 10 15
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
35 40 45
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
50 55 60
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
65 70 75 80
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
85 90 95
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 25
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 25
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 26
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 26
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
1 5 10 15
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 27
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 27
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 28
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 29
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp
1 5
<210> 30
<211> 160
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 30
Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe Ser Gln
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Leu Met Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Lys His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Lys Leu Lys Thr Leu Arg Met Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser Asp Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Asp Gln Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Met Met Ile Lys Met Lys Ser
145 150 155 160
<210> 31
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 32
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 33
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1 5 10 15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165 170 175
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 34
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 34
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr
245 250 255
His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala
260 265 270
Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn
275 280 285
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly
290 295 300
Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met
305 310 315 320
Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser
325 330 335
Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His
340 345 350
Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys
355 360 365
Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser
370 375 380
Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys
385 390 395 400
Ile Arg Asn
<210> 35
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 35
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
165 170 175
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
195 200 205
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
210 215 220
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
225 230 235 240
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
245 250 255
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
260 265 270
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
275 280 285
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
290 295 300
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
305 310 315 320
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
325 330 335
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
340 345 350
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
355 360 365
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
370 375 380
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Lys
<210> 36
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 36
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
165 170 175
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
180 185 190
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
195 200 205
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
210 215 220
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
225 230 235 240
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
245 250 255
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
260 265 270
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
275 280 285
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
290 295 300
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
305 310 315 320
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
325 330 335
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
340 345 350
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
370 375 380
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
385 390
<210> 37
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 37
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn
245 250 255
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
260 265 270
Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser
290 295 300
Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn
305 310 315 320
Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu
325 330 335
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys
340 345 350
Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys
355 360 365
Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe
370 375 380
Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
385 390 395
<210> 38
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 38
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln
225 230 235 240
Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu
245 250 255
Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met
260 265 270
Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp
275 280 285
Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe
290 295 300
Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile
305 310 315 320
Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu
325 330 335
Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys
340 345 350
Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly
355 360 365
Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu
370 375 380
Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
385 390
<210> 39
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 39
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
165 170 175
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
180 185 190
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
210 215 220
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
225 230 235 240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
245 250 255
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
260 265 270
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
275 280 285
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
290 295 300
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
305 310 315 320
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
325 330 335
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
340 345 350
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
355 360 365
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
370 375 380
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
385 390 395
<210> 40
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 40
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
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Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
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Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
165 170 175
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
180 185 190
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
195 200 205
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
210 215 220
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
245 250 255
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
260 265 270
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
290 295 300
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
305 310 315 320
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
325 330 335
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
340 345 350
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
355 360 365
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
370 375 380
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
385 390
<210> 41
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 41
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
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Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
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Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
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Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
195 200 205
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
210 215 220
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
225 230 235 240
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
245 250 255
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
260 265 270
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
275 280 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
290 295 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
305 310 315 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
325 330 335
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
340 345 350
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355 360 365
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
370 375 380
Ser Leu Gly Lys
385
<210> 42
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 42
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
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115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
165 170 175
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
180 185 190
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
195 200 205
Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
210 215 220
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
225 230 235 240
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
245 250 255
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
260 265 270
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
275 280 285
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
305 310 315 320
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
325 330 335
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
340 345 350
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
355 360 365
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
370 375 380
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390
<210> 43
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 43
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
180 185 190
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His
195 200 205
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
210 215 220
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
225 230 235 240
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
245 250 255
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
260 265 270
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
275 280 285
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
290 295 300
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
305 310 315 320
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
325 330 335
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
340 345 350
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
355 360 365
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
370 375 380
<210> 44
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 44
Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe Ser Gln
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Leu Met Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Lys His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Lys Leu Lys Thr Leu Arg Met Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser Asp Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Asp Gln Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Met Met Ile Lys Met Lys Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
165 170 175
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
180 185 190
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
195 200 205
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
210 215 220
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln
225 230 235 240
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
245 250 255
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
260 265 270
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
275 280 285
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
290 295 300
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
305 310 315 320
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
325 330 335
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
340 345 350
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
370 375 380
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
385 390
<210> 45
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Phe
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Asp Glu Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Gly Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Ser Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Lys Val Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 46
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 46
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Arg Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Leu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Tyr Arg Ala Ala Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Asp Arg Val Ile Ile Lys Asp Tyr Tyr Val Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 48
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 49
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Arg Val Thr Arg Thr Ala Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Asp Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> 该区域可以包括1-7个残基
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成肽
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(8)
<223> 该区域可以包括1-7个残基
<400> 58
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多肽
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(30)
<223> 该序列可以包括1-6个"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30

Claims (64)

1.IL10激动剂，其从氨基端至羧基端包含:
(a)IgG Fc结构域；
(b)接头部分；和
(c)IL10部分。
2.权利要求1的IL10激动剂，其中所述IgG Fc结构域包含来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其组合的CH2和CH3结构域。
3.权利要求1或2的IL10激动剂，其中所述CH2和CH3结构域来自IgG1。
4.权利要求3的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含或组成为与SEQ ID NO：32或SEQID NO：33具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1或2的IL10激动剂，其中所述CH2和CH3结构域来自IgG4。
6.权利要求5的IL10激动剂，其中所述Fc结构域包含或组成为与SEQ ID NO:31或SEQID NO:31的氨基酸18至228具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1至6中任一项的IL10激动剂，其中所述Fc结构域具有降低的效应功能。
8.权利要求1至7中任一项的IL10激动剂，其在所述Fc结构域的N端包含铰链结构域。
9.权利要求8的IL10激动剂，其中所述铰链结构域衍生自与所述CH2和/或CH3结构域相同的IgG。
10.权利要求8的IL10激动剂，其中所述铰链结构域衍生自与所述CH2和/或CH3结构域不同的IgG。
11.权利要求8至10中任一项的IL10激动剂，其中所述铰链结构域包含嵌合铰链序列，任选地其中所述嵌合铰链序列包含或组成为SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
12.权利要求1至11中任一项的IL10激动剂，其中所述接头部分包含或组成为GnS或SGn的单体或多聚体，其中n为1至7的整数。
13.权利要求1至12中任一项的IL10激动剂，其中所述接头包含氨基酸序列G4S(SEQ NO：51)的单体或多聚体。
14.权利要求1至13中任一项的IL10激动剂，其中所述接头包含氨基酸序列G4S(SEQ NO：51)的1、2或3个重复。
15.权利要求1至14中任一项的IL10激动剂，其中所述接头连接所述Fc结构域和所述IL10部分。
16.权利要求1至15中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含或组成为与成熟人IL10(SEQ NO:1)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
17.权利要求1至15中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分包含或组成为与成熟鼠IL10(SEQ NO:30)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
18.权利要求1至17中任一项的IL10激动剂，其为同二聚体。
19.权利要求1至17中任一项的IL10激动剂，其为异二聚体。
20.权利要求18或19的IL10激动剂，其包含两个Fc结构域，任选地其中所述IL10激动剂通过所述Fc结构域二聚化。
21.权利要求1至20中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分缺少位于IL10部分结构域间区域的螺旋D和E之间的氨基酸间隔物。
22.权利要求1至21中任一项的IL10激动剂，其不与聚乙二醇缀合。
23.权利要求1至22中任一项的IL10激动剂，其不与白蛋白缀合。
24.权利要求1至23中任一项的IL10激动剂，其不与人血清白蛋白结合剂缀合。
25.权利要求1至24中任一项的IL10激动剂，其不与XTEN、PAS、亲水性聚合物、聚唾液酸、脂肪酸或羟乙基淀粉缀合。
26.权利要求1至25中任一项的IL10激动剂，其不与任何稳定化部分缀合。
27.权利要求1至26中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10部分不包括N-连接聚糖、不包括O-连接聚糖、或既不包括N-连接聚糖也不包括O-连接聚糖。
28.权利要求1至27中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10激动剂缺乏以下靶向部分：
(a)与肿瘤相关抗原结合的靶向部分；
(b)与肿瘤微环境抗原结合的靶向部分；
(c)与肿瘤反应性淋巴细胞的细胞表面分子结合的靶向部分；或者
(d)与检查点抑制剂结合的靶向部分。
29.权利要求1至28中任一项的IL10激动剂，其中所述IL10激动剂缺乏结合PD-1的靶向部分。
30.权利要求1至29中任一项的IL10激动剂，其不含除IL10之外的任何细胞因子。
31.IL10激动剂，其包含或组成为与IL10M1的序列(SEQ ID NO:34)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
32.权利要求31的IL10激动剂，其包含或组成为IL10M1的氨基酸序列。
33.IL10激动剂，其包含或组成为与IL10M4的序列(SEQ ID NO:37)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
34.权利要求33的IL10激动剂，其包含或组成为IL10M4的氨基酸序列。
35.IL10激动剂，其包含或组成为与IL10M5的序列(SEQ ID NO:38)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
36.权利要求35的IL10激动剂，其包含或组成为IL10M5的氨基酸序列。
37.IL10激动剂，其包含或组成为与IL10M11的序列(SEQ ID NO:44)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
38.权利要求37的IL10激动剂，其包含或组成为IL10M11的氨基酸序列。
39.权利要求1至37中任一项的IL10激动剂，其为在哺乳动物细胞中重组表达的产物。
40.一种核酸或多种核酸，其编码权利要求1至39中任一项的IL10激动剂。
41.宿主细胞，其经工程改造以表达权利要求1至38中任一项的IL10激动剂或权利要求40的一种核酸或多种核酸。
42.权利要求41的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。
43.产生权利要求1至38中任一项的IL10激动剂的方法，其包括培养权利要求41或权利要求42的宿主细胞并回收由此表达的IL10激动剂。
44.权利要求42的方法，其进一步包括：
(a)使所述回收的IL10激动剂与被配置用于捕获IL10激动剂的亲和柱接触，任选地其中所述亲和柱是蛋白A亲和柱；
(b)洗脱所述亲和柱以产生洗脱物；和
(c)对所述洗脱物进行尺寸排除色谱。
45.IL10激动剂，其通过包括以下步骤的方法产生：(a)培养权利要求41或权利要求42的宿主细胞和(b)回收由此表达的IL10激动剂。
46.权利要求45的IL10激动剂，其中所述方法进一步包括：
(a)使所述回收的IL10激动剂与被配置用于捕获IL10激动剂的亲和柱接触；
(b)洗脱所述亲和柱以产生洗脱物；和
(c)对所述洗脱物进行尺寸排除色谱。
47.制备药物组合物的方法，其包括将(a)通过权利要求43或权利要求44的方法制备的IL10激动剂，或(b)权利要求45或权利要求46的IL10激动剂与赋形剂一起配制。
48.药物组合物，其包含(a)权利要求1至39、45和46中任一项的IL10激动剂和赋形剂，(b)通过权利要求43或权利要求44的方法获得的IL10激动剂，或(c)通过权利要求47的方法获得的IL10激动剂。
49.权利要求48的药物组合物，其包含至少10mg、至少20mg或至少50mg的所述IL10激动剂。
50.权利要求48或权利要求49的药物组合物，其中小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的所述IL10激动剂以聚集体形式存在，如通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)所测定。
51.权利要求48或权利要求49的药物组合物，其不含可检测量的所述IL10激动剂的聚集体，如通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)所测定。
52.权利要求48至51中任一项的药物组合物，其不含(a)可检测量的所述IL10激动剂的C端截短变体和/或(b)可检测量的所述IL10激动剂的N端截短变体。
53.权利要求1至39、45或46中任一项的IL10激动剂或权利要求48至52中任一项的药物组合物，其用于治疗癌症的方法中，所述方法包括向有此需要的受试者施用权利要求1至39、45或46中任一项的IL10激动剂或权利要求48至52中任一项的药物组合物。
54.权利要求53的IL10激动剂或药物组合物，其中所述癌症是实体瘤。
55.权利要求54的IL10激动剂或药物组合物，其中所述实体瘤是结肠癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、淋巴瘤、胰腺肿瘤或肺肿瘤。
56.权利要求54或55的IL10激动剂或药物组合物，其中所述实体瘤对用抗PD1抗体的治疗耐受。
57.权利要求54至56中任一项的IL10激动剂或药物组合物，其中所述实体瘤对用抗PD1抗体单一疗法的治疗耐受。
58.权利要求53至57中任一项的IL10激动剂或药物组合物，其进一步包括向所述受试者施用抗PD1抗体。
59.权利要求53至58中任一项的IL10激动剂或药物组合物，其中所述抗PD1抗体是MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、或BGB-108。
60.权利要求54至59中任一项的IL10激动剂或药物组合物，其导致所述实体瘤中CD8 T细胞密度的增加，任选地其中所述增加是至少2倍的增加、至少3倍的增加、或至少4倍的增加。
61.权利要求54至60的IL10激动剂或药物组合物，其导致所述实体瘤中CD45+免疫细胞浸润的增加，任选地其中所述增加是至少10％的增加。
62.权利要求61的IL10激动剂或药物组合物，其中CD45+免疫细胞包含CD4T细胞、髓系细胞、或CD4T细胞和髓系细胞两者。
63.权利要求54至62的IL10激动剂或药物组合物，其中相对于未用所述IL10激动剂或药物组合物治疗的合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法上调血清IL12，任选地其中相对于所述合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL12水平，所述方法上调血清IL12至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。
64.权利要求54至63中任一项的IL10激动剂或药物组合物，其中相对于未用所述IL10激动剂或药物组合物治疗的合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法上调血清IL4，任选地其中相对于所述合适对照或相对于用所述IL10激动剂或药物组合物治疗之前所述受试者自身的血清IL4水平，所述方法上调血清IL4至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、或至少20倍。
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