CN115651851B

CN115651851B - 一种水心病菠萝内生菌及在植物病害防治上的应用

Info

Publication number: CN115651851B
Application number: CN202211670543.5A
Authority: CN
Inventors: 姚艳丽; 张秀梅; 杨家帅; 刘裕; 李明伟; 刘胜辉; 朱祝英; 吴青松; 林文秋; 高玉尧; 孙伟生; 陆新华; 付琼
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: CN115651851A

Abstract

本发明提供了一种水心病菠萝内生菌，其为小刺青霉菌，命名为Penicillium sp.SXB1，于2022年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62986。该菌株具有稳定广谱抑菌活性，对菠萝黑腐病菌、草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、芒果叶斑病菌、细菌角斑病菌等具有良好的拮抗作用，抑菌率均达到了56%以上，尤其是对辣椒炭疽病菌，抑菌率都达到了83%，为炭疽病等多种植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。

Description

一种水心病菠萝内生菌及在植物病害防治上的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种水心病菠萝内生菌及在植物病害防治上的应用。

背景技术

菠萝（Ananas comosus（Linn.）Merr）是凤梨科凤梨属多年生草本果树，是我国重要的热带水果之一，也是我国热区农民重要的经济收入来源之一。水心病是一种生理性病害，是指菠萝果实生长后期，收获前2-4周开始出现果肉水浸状的情况。由于果肉细胞间隙充满液体，所以这种果实不耐存放，并且会随着发病程度的加深散发出酒糟味和恶臭味。虽然水心病导致菠萝品质劣变，造成巨大的经济损失，但我们观察到一个有趣的现象，发生水心病的菠萝一般不在发生其它病害。菠萝内生菌作为潜在的生物防治资源，具有巨大的潜在开发应用价值。但是，目前对菠萝内生菌的研究较少，业内研究人员在菠萝内生菌对菠萝黑心病控制效果和菠萝耐贮性方面进行了初步的研究，但利用水心病菠萝内生菌资源对菠萝病害的预防作用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种水心病菠萝内生菌，其为小刺青霉菌，具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。

本发明的第一个方面是提供一种水心病菠萝内生菌，其为小刺青霉菌，命名为Penicillium sp. SXB1（下文也称“水心病菠萝内生菌SXB1”），于2022年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No： 62986。

本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的水心病菠萝内生菌在拮抗菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌中的应用。

本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的水心病菠萝内生菌在防治菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌所致病害中的应用。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的水心病菠萝内生菌的发酵液。

本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的发酵液在拮抗菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的发酵液在防治菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌所致病害中的应用。

本发明的第七个方面是提供一种菌剂，含有本发明第一个方面所述的水心病菠萝内生菌。

本发明的水心病菠萝内生菌为青霉菌属的一个新种，具有稳定广谱抑菌活性，对菠萝黑腐病菌、草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、芒果叶斑病菌、细菌角斑病菌等具有良好的拮抗作用，抑菌率均达到了53.5%以上，尤其是对辣椒炭疽病菌，抑菌率达到82.9%，为炭疽病等多种植物病害的防治拓展了新领域，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1的形态特征图，其中A为气生菌丝形态，B为菌落形态，C为孢子形态。

图2为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1的***发育进化树。

图3为不同温度对水心病菠萝内生菌SXB1菌丝生长的影响。

图4为不同PH值对水心病菠萝内生菌SXB1菌丝生长的影响。

图5为不同碳源对水心病菠萝内生菌SXB1菌丝生长的影响。

图6为不同氮源对水心病菠萝内生菌SXB1菌丝生长的影响。

图7为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对峙菠萝黑腐病菌1-6d的抑菌效果，其中，上方为对照组，下方为处理组。

图8为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对峙草莓炭疽病菌1-9d的抑菌效果，其中，上方为对照组，下方为处理组。

图9为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对峙辣椒炭疽病菌1-9d的抑菌效果，其中，上方为对照组，下方为处理组。

图10为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对峙芒果叶斑病链格孢霉菌1-9d的抑菌效果，其中，上方为对照组，下方为处理组。

图11为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对细菌角斑病菌1-9d的抑菌效果，其中，上方为对照组，下方为处理组。

图12为本发明的水心病菠萝内生菌SXB1对5种致病菌的抑制率。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种水心病菠萝内生菌，鉴定为小刺青霉菌（Penicillium spinulosum），命名为Penicillium sp. SXB1，于2022年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62986，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明的水心病菠萝内生菌从水心病菠萝样品中分离得到。菠萝样品于2022年4月采自广东省湛江市中国热带农业科学院南亚热带作物研究所菠萝种质资源鉴定圃。

一、水心病菠萝内生菌株的分离与鉴定

1、水心病菠萝组织表面消毒

选取表面无机械损伤的菠萝，纵切后观察水心病的发病情况。取水心病果实，用无菌水冲洗纵切面2次，75%酒精冲洗1次，100%酒精喷于表面，点燃高温灭菌20～30s，得到表面无菌水心病菠萝组织。

2、水心病菠萝内生菌分离

组织匀浆法：将表面消毒后的水心病菠萝果肉组织（不含果心）切成2～3cm的小块，上、中、下部各取2块，放置于无菌研钵中，75%酒精浸泡1min，无菌水清洗1次，研碎后加无菌水稀释100倍，取100ul组织液涂布于PDA培养基上，28℃培养3～5d，每天观察，并用移菌环将新长出的菌丝挑出，单独培养。

3、水心病菠萝内生菌的鉴定

将水心病菠萝内生真菌在PDA培养基上28℃恒温培养5～7d，观察其形态学特征并对其进行形态学鉴定。结果如图1所示：菌落边缘整齐，绿色、粉末状，有黄色溢出物，气生菌丝白色。在显微镜下观察到该菌丝孢子梗有节、内壁粗糙，孢子椭圆。根据其形态结构特征，将其初步鉴定为青霉菌属。

对内生真菌进行ITS基因测序，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，并构建***发育树。结果如图2所示，ITS序列分析结果表明，分离的水心病菠萝内生菌株与真菌内生菌Fungal sp.（JQ692118.1）处于同一分支上，表明与其相似度最高，同时与Penicillium spinulosum（MK841437.1）属于同一亚群，结合其形态学特征，将该真菌鉴定为小刺青霉菌（Penicillium spinulosum），命名为Penicillium sp. SXB1。

二、水心病菠萝内生菌生理特性分析

1、不同温度对菌丝生长的影响

在PDA平板上移入直径5 mm的菌碟，分别置于8℃、28℃、34℃和37℃温度下培养，培养2.5 d 后测量菌落生长直径，每处理 3 皿，重复 3 次。

2、不同PH值对菌丝生长的影响

将PDA培养基灭菌后，用0.2 mol·L^-1HCl和0.2 mol·L^-1 NaOH溶液在无菌条件下将培养基的pH值调到5、7、8和9共4个酸碱度，每个皿内倒入20 m L培养基，冷却后再将直径5mm 菌碟接种于不同pH的平板中央，在28℃温度下培养2 d后观察菌落生长情况，每处理3皿，重复 3 次。

3、不同碳源对菌丝生长的影响

以Richard 培养基为基础培养基，分别以相同含碳量的果糖、葡萄糖和可溶性淀粉替换其中的蔗糖，配制成3种含有不同碳源的培养基，以无碳源的培养基作为对照，将直径为5 mm 的菌碟接种于不同碳源的培养基平板中央，在 28 ℃温度下培养 2 d 后观察菌落生长情况，每处理 3 皿，重复 3 次。

4、不同氮源对菌丝生长的影响

以Richard 培养基为基础培养基，分别以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、酵母膏、磷酸氢二胺和硝酸铵替换其中的硝酸钾，配制成5种含有不同氮源的培养基，以无氮源的培养基作为对照，将直径为 5 mm 的菌碟接种于不同氮源的培养基平板中央，在 28 ℃温度下培养 2 d 后观察菌落生长情况，每处理 3 皿，重复 3 次。

5、实验结果

试验结果表明，在PDA培养基上水心病菠萝内生菌SXB1在8℃下不能生长，28℃～37℃下均能生长，最适生长温度为28℃～34℃（图3）。PH值对菌丝生长的试验结果表明，SXB1在PH值为5～9的PDA培养基上均能生长，在PH值为5～8的培养基中生长较好（图4）。如图5所示，在供试的4种碳源培养基上，果糖和可溶性淀粉均能明显促进水心病内生菌SXB1的生长，其中可溶性淀粉效果最好，说明该菌更容易利用多糖碳源。在葡萄糖培养基上的菌落直径和对照蔗糖培养基上的无明显差异。不同氮源对菌丝生长影响的结果表明，6种氮源培养基上（图6），甘氨酸和磷酸氢二铵能明显促进水心病菠萝内生菌SXB1的生长，而在以蛋白胨、酵母膏和硝酸铵为氮源的培养基上菌落直径和对照硝酸钾培养基上无明显差异。

三、水心病菠萝内生菌的拮抗实验

采用水心病菠萝内生菌SXB1对4种植物病害（菠萝黑腐病、草莓炭疽病、辣椒炭疽病和芒果叶斑病）的病原菌进行平板对峙实验，统计菌落生长的直径，并计算抑菌率。

1、供试病原菌

菠萝黑腐病菌(Thielaviopsis paradoxa)；草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae Brooks (ATCC 58718)；辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum Simmonds(ATCC 56815)；芒果链格孢霉叶斑病菌（Alternaria tenuissima）；细菌角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Smith et Bryan) Young, Dye & Wilkie）。

2、平板对峙法

从病原菌菌落边缘刻出直径0.5左右的菌饼，菌丝朝下接种于PDA培养基平板中心，用同样的方法刻出4拮抗内生菌菌饼，分别接种于距离病原菌菌饼2cm左右的四个方向上，用不接种拮抗菌的平板做对照，28℃恒温培养6-9d，测量病原菌菌落直径，计算抑菌率。

3、抑菌率计算方法：

拮抗菌抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%

4、实验结果

实验结果如图7-12和表1所示。实验结果表明，水心病菠萝内生菌SXB1对这4种病原菌都有一定的抑菌效果，其中对辣椒炭疽病菌的抑菌效果最好。根据上述公式计算抑菌率，发现除了对菠萝黑腐病菌的抑制率表现为先升后降，即抑菌率在第4d时达到最高71.6%，随后抑菌率降低。对其它3种致病菌的抑菌率表现为随着时间的增长，抑菌率逐步提高，水心病菠萝内生菌SXB1对草莓炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、芒果叶斑病链格孢霉菌和细菌角斑病菌的抑菌率在第9d时达到最高，分别为55.5%，82.9%、55.6%和53.5。

表1 水心病菠萝内生菌SXB1对4种植物病原真菌的最大抑菌活性

植物病原真菌	抑菌率（%）
		菠萝黑腐病菌	71.6%
草莓炭疽病菌	55.5%
		辣椒炭疽病菌	82.9%
芒果叶斑病菌	55.6%
		细菌角斑病菌	53.5%

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种水心病菠萝内生菌，其特征在于，其为小刺青霉菌，命名为Penicillium sp.SXB1，于2022年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCCNo： 62986。

2.如权利要求1所述的水心病菠萝内生菌在拮抗菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌中的应用。

3.如权利要求1所述的水心病菠萝内生菌在防治菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌所致病害中的应用。

4.权利要求1所述的水心病菠萝内生菌的发酵液。

5.如权利要求4所述的发酵液在拮抗菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌中的应用。

6.如权利要求4所述的发酵液在防治菠萝黑腐病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或芒果叶斑病菌、和/或细菌角斑病菌所致病害中的应用。

7.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的水心病菠萝内生菌。