CN111454848B - 一种雅致放射毛霉gd48及其发酵产物、菌剂与应用 - Google Patents

一种雅致放射毛霉gd48及其发酵产物、菌剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物学领域，具体公开了一种雅致放射毛霉GD48及其发酵产物、菌剂与应用。本发明的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其保藏编号为CGMCC No.19367。本发明的雅致放射毛霉GD48对番茄镰刀枯萎病病原尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)具有明显的拮抗作用，可以显著减轻番茄镰刀枯萎病的发生。本发明为番茄重要土传病害镰刀枯萎病的防治提供了研究基础，对植物病害的绿色防控提供了新思路。

Description

一种雅致放射毛霉GD48及其发酵产物、菌剂与应用
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体地说，涉及一种雅致放射毛霉GD48及其发酵产物、菌剂与应用。
背景技术
番茄是一种世界范围内重要的蔬菜作物，也是我国主栽蔬菜之一。番茄镰刀枯萎病是由尖孢镰刀菌的专化型Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici(FOL)导致的，是一种对番茄产量产生严重影响的病害。由于该病害目前还没有很好的抗病品种，并且通过土壤进行传播，病原菌从根系侵染经由番茄维管束向上传播，一旦发病后很难通过化学农药进行防治。现阶段农业上对该病害一般采用土壤化学熏蒸及施用抗真菌农药等手段，但这些方法对环境污染大，并且残留的农药化学物质严重危害人畜健康。
近年来，生物防治的手段因其环境友好，无化学残留等特性逐渐得到人们的广泛关注。但目前关于生防菌株的研究主要集中在细菌中的假单胞菌属，枯草芽孢杆菌属以及真菌中的木霉属等，采用毛霉菌对番茄镰刀枯萎病的生物防治的报道很少。有必要开发新的能防治番茄镰刀枯萎病的菌株，以进一步充实生防菌株，为生物防治植物病害提供新的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，丰富现有植物病害的绿色生物防治方法，本发明的目的是提供一种可以抑制尖孢镰刀菌番茄专化型，显著减轻番茄镰刀枯萎病发生的雅致放射毛霉GD48及其发酵产物、菌剂与应用。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明中，所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48的保藏编号为CGMCCNo.19367。
具体保藏信息为：
分类命名：雅致放射毛霉Actinomucor elegans
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101
保藏日期:2020.01.14
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19367
进一步地，本发明提供所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48的发酵产物。
本发明提供一种菌剂，其含有上述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或所述的发酵产物。
优选地，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
本发明提供一种番茄镰刀枯萎病防治剂，其含有上述雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)GD48或所述的发酵产物。
本发明提供一种尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)抑制剂，其含有上述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或所述的发酵产物。
本发明还提供一种上述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或所述的发酵产物或所述的菌剂在抑制尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)中的应用。
本发明还提供一种上述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或所述的发酵产物或所述的菌剂在防治番茄镰刀枯萎病中的应用。
在防治番茄镰刀枯萎病时，所述应用的具体方式为：将所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48、所述发酵产物或所述菌剂施加于番茄根际土壤。
优选地，在应用时使用所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48的孢子悬液，更优选地，所述孢子悬液的菌活数为108cfu·mL-1。
本发明的有益效果至少在于：
本发明的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48对番茄镰刀枯萎病病原尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)具有明显的拮抗作用，在温室实验中可以显著减轻番茄镰刀枯萎病的发生。本发明为番茄重要土传病害镰刀枯萎病的防治提供研究基础，对植物病害的绿色防控提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1的病原菌菌落图(空白对照)；
图2为本发明实施例1的雅致放射毛霉GD48对病原菌的拮抗图；
图3为本发明实施例2的温室种植实验中病情指数折线图，统计时间自处理二出现发病指征开始，一共两周。CK+FOL表示基质空白处理加病原，GD48+FOL表示基质雅致放射毛霉GD48处理后加病原。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中所用的尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)记载于：Gordon,T.R.(2017).Fusarium oxysporum and the Fusariumwilt syndrome.Annual Review of Phytopathology,55,23-39.
https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-080615-095919。
该菌株为造成番茄镰刀枯萎病的病原菌株。
实施例1Actinomucor elegans GD48的分离纯化和鉴定
在黑龙江肇源县(45°48’26.47”N 125°09’20.75”E)采集室外种植的健康番茄，取番茄根系组织放入盛有100ml磷酸缓冲液的三角瓶中，于25℃，150r/min的摇床震荡30分钟，然后取出根后得到根际土混悬液。取1ml混悬液进行梯度稀释，最终取10-4的土壤混悬液进行真菌的分离。
平板稀释涂布法的具体操作为吸取30μL土壤混悬液于PDA平板，用涂布器涂匀，使液体完全被平板吸收，同一份样品进行三个重复。在30℃恒温培养箱培养1周后，挑取不同形态真菌菌落进行进一步纯化。
对不同形态菌株进行平板对峙实验进行复筛，操作方法为：
在PDA固体平板上分别对称放置一个直径4mm的待测真菌菌饼和一个番茄枯萎病原(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)菌饼，以无菌水处理作为对照，放置于恒温培养箱进行培养，至空白对照长满培养基，开始统计菌落直径，采用十字交叉法测定菌落直径，重复三次。待测菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(接种拮抗菌后的生长直径)，用抑制率表示：
抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％；
共获得6株具有拮抗镰刀枯萎病病原的真菌，具体抑制率见表1。其中GD48具有较好的抑制效果，生长相同天数时，其在PDA培养基上相比于空白对照(参见图1)有明显拮抗镰刀枯萎病病原的作用(参见图2平板拮抗结果，其中平板左侧为病原菌，右侧为GD48)，因此选择GD48作为番茄镰刀枯萎病的拮抗菌。
表1
处理 菌落直径(mm) 抑制率(％)
GD48 26±1.5 69.41±9.8
GD27 30±1.7 64.71±9.8
GD20 35±1.2 58.82±9.4
GD23 43±2.0 49.41±9.7
GD24 45±1.3 47.06±9.8
GD28 38±1.7 55.29±9.8
对照 85 —
对于所获得的菌株GD48，根据形态学特征，其在固体PDA培养基上形态近似毛霉，棉絮状，有匍匐菌丝和假根。孢囊梗直立，其主枝顶端有一较大孢子囊。孢子囊球形，主枝上的直径在80-120微米之间。孢子囊破裂后释放出孢子，形态学鉴定属于放射毛霉。
通过分子生物学鉴定手段，我们对GD48rDNA上ITS序列进行扩增，将测序结果在NCBI数据库上进行Blast同源比对，初步鉴定其为Actinomucor elegans。并将该序列通过临接法构建***发育树，结果显示GD48属于雅致放射毛霉。综合以上形态学和分子生物学鉴定结果，确定GD48为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)，其核苷酸序列参见SEQ IDNO.1。该序列为细胞核DNA转录间隔区序列internal transcribed spacer(ITS)序列。
实施例2番茄镰刀枯萎病的防治效果
本实施例采用盆栽实验验证菌株雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48在温室中对番茄镰刀枯萎病的拮抗效果。
本实施例中，先制备GD48孢子悬液，即将保存菌株先接种于固体PDA培养基，待菌丝长满培养基，挑取少量菌丝于含有液体PDB培养基的三角瓶中，在37℃、150r/min震荡培养12～16h，将所得到培养液用过滤的方法除去菌丝体，得到孢子悬液，然后在显微镜下用血球计数板进行计数，统计孢子悬液的浓度。孢子悬液计数方法为在显微镜下，使用血球计数板，先要测定每个小方格中孢子的数量，再换算成每毫升菌液中孢子的数量。并用磷酸缓冲液进行稀释得到1×107cfu·mL-1的孢子悬液。
将番茄种子进行表面消毒后，于暗处催芽48h。之后用于种植实验。种植时，基质土为经过灭菌处理的营养土，种植前于土中添加蛭石。
本实施例共设置4个处理，每个处理3次生物学重复。
处理一：将番茄种于基质中，仅清水处理，不添加病原菌和GD48；
处理二(CK+FOL)：将番茄种于基质中，待番茄长出2片真叶后，将幼苗拔出，于浓度为1×107cfu·mL-1(计数方法同GD48)的病原菌(尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum f.sp.Lycopersici)，FOL)孢子悬液中浸泡1h后种回基质，并取5ml上述的病原菌孢子悬液进行灌根处理；
处理三：将番茄种植于添加了雅致放射毛霉孢子悬液(GD48的浓度为1×107cfu·g-1)的基质土中，不添加病原菌；
处理四(GD48+FOL)：将番茄种植于添加了雅致放射毛霉孢子悬液(GD48的浓度为1×107cfu·g-1)的基质土中，待番茄长出2片真叶后，将幼苗拔出，于浓度为1×107cfu·mL-1(计数方法同GD48)的病原菌(尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)，FOL)孢子悬液中浸泡1h后种回基质，并取5ml上述的病原菌孢子悬液进行灌根处理。
待处理二出现病征后，开始调查病情发展情况。
0级：无病症；1级：真叶或子叶上出现轻微萎蔫，但生长正常；2级：真叶或子叶上出现明显的坏死斑，根部出现病变，生长受到一定影响；3级：根部坏死引起局部性萎蔫，或生长僵化；4级：整体萎蔫，倒伏枯死，根部严重病变。
病情指数＝[∑(各级病株数×相对级数值)/(总株数×最高级数代表值)]×100。
本实施中的每个处理的株数为24株，最高级数代表值为4。
处理一、处理三无发病情况。处理二、处理四的测试结果参见图3和表2(表2中天数1代表处理二出现病征的第一天)，从中可知在温室盆栽实验中，GD48具有较强的抑病效果。
表2
Figure BDA0002452146920000071
Figure BDA0002452146920000081
Figure BDA0002452146920000091
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种雅致放射毛霉GD48及其发酵产物、菌剂与应用
<130> KHP201111319.9
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 653
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttacgggctt ggtttttctc ttatttttta ccgtgaactg tcttatagca tggcgctagt 60
agagatgcct gagccgccat acggggtagg cggcacagga tgattttaat cgaagccatg 120
gtcaagccga ctttttttca gcttggtacc ccaaaaatta attattctac caaatgaatt 180
cagtattaat attgtaacat gggctcgctg aaaggtggcc tataaaacaa cttttaacaa 240
cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgtagcaaa gtgcgataac tagtgtgaat 300
tgcatattca gtgaatcatc gagtctttga acgcatcttg cacctgctgg tattccagca 360
ggtacgcctg tttcagtatc agaaacaact cttcccttaa gatttttttc ttaaggggac 420
attgagggta tctggcttag aagtaaaatc tctagcccgg agacgcttta aatgactaaa 480
ggcctgcaag ccaaagtttg attgcgcctg aactttttct taatttcaag cgaaagctct 540
tgcgaactag aactttatta ttgccttggg ggcctcccaa agaaaacatt caacaacttg 600
atctgaaatc aggtgggatt acccgctgaa cttaagcata tcataagcgg gag 653

Claims (8)

1.雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48，其特征在于，所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48的保藏编号为CGMCC No.19367。
2.权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48的发酵产物，所述发酵产物为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48发酵产生的孢子悬液。
3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)GD48或权利要求2所述的发酵产物。
4.一种番茄镰刀枯萎病防治剂，其特征在于，含有权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或权利要求2所述的发酵产物。
5.一种尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或权利要求2所述的发酵产物。
6.权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在抑制尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)中的应用，所述发酵产物为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48发酵产生的孢子悬液。
7.权利要求1所述的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在防治番茄镰刀枯萎病中的应用，所述发酵产物为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48发酵产生的孢子悬液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方式为：将所述雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)GD48、所述发酵产物或所述菌剂施加于番茄根际土壤。
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