CN115644067B

CN115644067B - 一种生产滇黄精双单倍体的方法

Info

Publication number: CN115644067B
Application number: CN202211578048.1A
Authority: CN
Inventors: 张金渝; 杨美权; 邓国宾; 杨天梅; 杨维泽; 起明菊; 赵露琴; 曾祥飞
Original assignee: Yunnan Plant Insect Medicine Biotechnology Co ltd; Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Plant Insect Medicine Biotechnology Co ltd; Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-12-09
Also published as: CN115644067A

Abstract

本发明涉及药用植物组培育种技术领域，具体公开一种生产滇黄精双单倍体的方法，包括以下步骤：花蕾进行预处理；花蕾进行消毒剥取花药；将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；将染色体加倍处理后的小芽继续接种于愈伤分化培养基中长出完整植株；将分化出的植株接种于生根培养基中生根培养；将生根苗进行染色体倍性检测，筛选获得滇黄精双单倍体植株；步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4‑D 0.6～0.8mg/L+2‑IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4；本发明采用的愈伤诱导培养基，不但能成功将花药培养成愈伤，其诱导愈伤率还高达80%以上。

Description

一种生产滇黄精双单倍体的方法

技术领域

本发明涉及药用植物组培育种技术领域，具体涉及一种生产滇黄精双单倍体的方法。

背景技术

滇黄精（Polygonatum kingianum coll.et Hemsl.）为百合科黄精属多年生草本植物，以根茎入药，有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。

双单倍体（DH）是近年来才发展起来的技术，具体是指利用细胞内具有配子染色体数目的个体、组织或细胞，经染色体加倍后获得的100%纯合体。

各产地及种质的滇黄精，其有效成分含量、单株生物产量以及抗病虫害能力等，都有极大差异，但目前在滇黄***质选育上，大都集中在选上，即采用收集野生种质，再进行人工筛选优质种质进行再繁殖，而在人工诱导育种上，目前也仅有张旺凡等《黄精多倍体诱导初报》[J]，中国种业，2011（1）：48～49以及李国泰等《玉竹多倍体的育种研究》[J]，中国林副特产，2018（4）：14～16，报道了与滇黄精同属植物多花黄精和玉竹的多倍体育种。

本发明拟通过滇黄精花药的离体培养，获得单倍体小芽，再通过染色体加倍，获得双单倍体，弥补了滇黄精的人工诱导育种技术的缺失。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种生产滇黄精双单倍体的方法，弥补滇黄精的人工诱导育种技术的缺失的问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种生产滇黄精双单倍体的方法，包括以下步骤：

（1）选取具有花药的滇黄精花蕾进行预处理；

（2）将预处理好的花蕾进行消毒，并在消毒后剥取花药；

（3）将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；

（4）将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；

（5）将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；

（6）将染色体加倍处理后的小芽继续接种于愈伤分化培养基中长出苗体；

（7）将分化出的苗体接种于生根培养基中生根培养；

（8）将生根苗进行染色体倍性检测，筛选获得滇黄精双单倍体植株；

步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4-D 0.6～0.8mg/L+2-IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4。

步骤（1）中，预处理方法为置于4±2℃全黑暗环境下处理24～36小时。

步骤（2）中，消毒方法为依次用75%酒精消毒20～30s，饱和漂白粉溶液消毒20～30min，0.05%升汞+2滴吐温-80溶液消毒3～4min。

步骤（5）中，染色体加倍处理方法为用0.02～0.04%秋水仙素+0.05～0.06%安磺灵+6-BA 3.0mg/L+0.5%DMSO在25±2℃，黑暗条件下浸泡36～48小时。

步骤（4）和步骤（6）所述的愈伤分化培养基为MS+NAA 0.02～0.05mg/L+IBA 0.1～0.2mg/L+BR 0.4～0.5mg/L+TDZ 2.0～3.0mg/L。

步骤（5）和步骤（6）所述的小芽为愈伤明显凸起，刚好有芽的状态。

步骤（7）所述的生根培养基为1/2MS+NAA 0.5～0.8mg/L+IBA 1.0～1.2mg/L+活性炭 0.5g/L。

本发明的有益效果在于

1、本发明采用的改良N6+2,4-D 0.6～0.8mg/L+2-IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L作为愈伤诱导培养基，不但能成功将花药培养成愈伤，其诱导愈伤率还高达80%以上。

2、经花药培养获得的单倍体一般是在愈伤阶段进行染色体加倍，而滇黄精经花药培养获得的愈伤近染色体加倍处理后，不能分化出丛生芽，更不能获得完整植株，而本发明是经愈伤进行初步分化成小芽后，再进行染色体加倍处理，弥补了目前滇黄精乃至整个黄精属用芽进行染色体加倍的空白。

3、滇黄精花药诱导的愈伤经分化成小芽后，高浓度的秋水仙素可诱导小芽染色体加倍，获得双单倍体，但其还能至小芽大量死亡，而未死亡的小芽继续分化培养均不能继续长大成为得具茎叶的植株，同时，还会导致四倍体甚至更多倍性的嵌合体产生，而低浓度的秋水仙素和其他如二甲戊灵、安磺灵等化学诱导剂均不能有效诱导染色体加倍，本发明创造性的使用了低浓度的秋水仙素，结合适宜浓度的安磺灵以及6-BA三种化学诱导剂进行复合诱导，可使染色体加倍成为双单倍体的成功率高达32%以上，同时不能诱导出四倍体或者其他倍性的嵌合体。

4、本发明所诱导的双单倍体，不仅自身可筛选出具有极其优良性状的优质种质，还可作为父本，与其他优良品系的母本进行杂交育种，获得更加良好纯净杂交种，亦可作为基因编辑等其他基因育种的纯净材料。

附图说明

图1实施例1中步骤5所述的用于染色体加倍的分化芽效果图；

图2：实施例1中经步骤6进行染色体加倍处理后，分化芽没有出现被影响效果图；

图3：实施例1中步骤7继续分化培养的芽正常生长效果图；

图4：实施例1中步骤8获得的生根苗。

具体实施方式

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1

1、材料的选择与清洁：选择滇黄精无明显病虫害的花蕾，用软毛刷蘸取饱和肥皂水溶液刷洗花蕾表面，清洁完表面脏物后用自来水涮洗至无肥皂水残留。

2、材料的预处理：将洗净的花蕾置于具滤纸的培养皿中，放在温度为4±2℃，全黑暗的环境下静置处理24小时。

3、材料的消毒：将预处理好的花蕾，转移至超净台内，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液滴加2滴吐温-80消毒3min，无菌水涮洗6次,7天消毒污染率为6.9%，消毒死亡率为17.8%。

4、愈伤诱导：将消毒好的花蕾，用无菌滤纸吸去表面水分，用镊子将花药从花蕾中取出，切尽滑丝后，将花药接种于改良N6+2,4-D 0.6mg/L+2-IP（异戊烯腺嘌呤） 0.2mg/L+GA3（赤霉素） 0.4mg/L愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃，黑暗环境下培养15天，后保持温度不变，单日照射12小时光强为2000～3000lx的光暗交替下继续培养30天，愈伤诱导率可达83.6%，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4。

5、愈伤初分化（图1）：将花药诱导出的愈伤，接种于MS+NAA 0.02mg/L+IBA 0.1mg/L+BR 0.4mg/L+TDZ 2.0mg/L的愈伤分化培养基上，在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养25天，愈伤出现明显凸起，凸起为芽状态，愈伤分化率为97.8%。

6、染色体加倍处理（图2）：将经愈伤分化培养基诱导出小芽，置于0.02%秋水仙素+0.05%安磺灵+6-BA 3.0mg/L+0.5%DMSO（二甲基亚砜）的混合溶液中，在温度为25±2℃，全黑暗条件下浸泡36小时。

7、继续分化（图3）：将经染色体加倍处理后的小芽，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于MS+NAA 0.02mg/L+IBA 0.1mg/L+BR 0.4mg/L+TDZ 2.0mg/L的愈伤分化培养基中，在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养30天。

8、生根培养（图4）：将分化成具茎叶的植株，接种于1/2MS+NAA 0.5～0.8mg/L+IBA1.0～1.2mg/L+活性炭 0.5g/L的生根培养基中，在在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养50天，生根率为97.0%。

9、倍性检测：取经生根培养植株的根尖，进行染色体染色后镜检，筛选出具2n染色体的植株，双单倍体获得率为32.9%。

实施例2

2、材料的预处理：将洗净的花蕾置于具滤纸的培养皿中，放在温度为4±2℃，全黑暗的环境下静置处理36小时。

3、材料的消毒：将预处理好的花蕾，转移至超净台内，用75%酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液滴加2滴吐温-80消毒4min，无菌水涮洗7次。7天消毒污染率为6.2%，消毒死亡率为18.8%。

4、愈伤诱导：将消毒好的花蕾，用无菌滤纸吸去表面水分，用镊子将花药从花蕾中取出，切尽滑丝后，将花药接种于改良N6+2,4-D 0.8mg/L+2-IP 0.5mg/L+GA3 0.5mg/L愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃，黑暗环境下培养15天，后保持温度不变，单日照射12小时光强为2000～3000lx的光暗交替下继续培养30天，愈伤诱导率为84.7%，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4。

5、愈伤初分化：将花药诱导出的愈伤，接种于MS+NAA 0.05mg/L+IBA 0.2mg/L+BR0.5mg/L+TDZ 3.0mg/L的愈伤分化培养基上，在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养30天，愈伤出现明显凸起，凸起为芽状态，愈伤分化率为98.5%。

6、染色体加倍处理：将经愈伤分化培养基诱导出小芽，置于0.04%秋水仙素+0.06%安磺灵+6-BA 3.0mg/L+0.5%DMSO（二甲基亚砜）的混合溶液中，在温度为25±2℃，全黑暗条件下浸泡36～48小时。

7、继续分化：将经染色体加倍处理后的小芽，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于MS+NAA 0.05mg/L+IBA 0.2mg/L+BR 0.5mg/L+TDZ 3.0mg/L的愈伤分化培养基中，在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养30天，至长出具茎叶的植株。

8、生根培养：将分化成具茎叶的植株，接种于1/2MS+NAA 0.8mg/L+IBA 1.2mg/L+活性炭 0.5g/L的生根培养基中，在在温度为25±2 ℃的环境下，光照强度3000～4000LX，日照光12h的光暗交替下培养60天，生根率为98.3%。

9、倍性检测：取经生根培养植株的根尖，进行染色体染色后镜检，筛选出具一对染色体的植株，即获得滇黄精双单倍体，双单倍体获得率为35.1%。

实验验证

1、愈伤培养实验

（1）激素对滇黄精花药培养的影响

①仅用生长素试验：采用2,4-D、NAA、IBA三种生长素在不同浓度下试验，发现不论怎么改变浓度，仅2,4-D有较少的将花药诱导出愈伤，但诱导率极低，经多次重复试验，最高也仅能达到7%，而其他两种生长素单独使用均不能较好的诱导出愈伤。

②复配其他植物生长调节剂试验

以N6为基本培养基，采用0.5mg/L的2,4-D，复配其他植物生长调节剂，进行正交试验，其具体试验设计如下表1：

从上表2可以看出，YS7诱导率最高，YS8次之，且YS8的愈伤长势极好。同时可以看出，2-IP对滇黄精花药诱导愈伤较为敏感，但CPPU及PPP333与其有相反作用。与6-BA、KT、ZT组合时也都能较好的诱导出愈伤，但整体诱导率均较2-IP低。后进行多次重复试验，在2,4-D与2-IP单独组合时，诱导率为最高，最高可达89%，而当2,4-D与其他植物生长调节剂组合或在2,4-D与2-IP组合时再添加其他植物生长调节剂，均不能达到单独效果，但在添加GA3时，其诱导率降幅不明显，且GA3有促进愈伤生长的作用。

（2）采用N6培养基进行花药愈伤诱导培养时，发现愈伤松散不致密，玻璃化严重，一方面不利于试验操作，另一方面不利于分化丛生出芽。

本发明成员猜测可能与渗透式有关，后通过改变无机盐浓度、调整糖浓度以及琼脂用量，发现增加无机盐浓度、增加糖浓度以及增加琼脂用量，均能一定程度的减少玻璃化、使愈伤更加致密，但调整无机盐浓度会促使褐化、不生长甚至死亡等的发生，而增加琼脂用量后，培养基太过坚硬，试验操作较为困难，且有一定抑制生长的作用，而当增加糖浓度时，愈伤玻璃化完全消失，且更加致密，进行分化时，分化率基本可达100%，且愈伤长势较不增加糖浓度为更好。

改良N6+2,4-D 0.6～0.8mg/L+2-IP 0.2～0.5mg/L+GA3 0.4～0.5mg/L作为愈伤诱导培养基。

2、愈伤染色体加倍试验

将愈伤切成1cm²左右大小，在温度为25±2℃，全黑暗条件下，在不同浓度、种类的化学诱导剂（均添加0.5%DMSO）以及诱导时间中进行单因素多水平染色体加倍试验，但采用一定浓度秋水仙素处理后，可使染色体加倍成双单倍体，其比例可达7%左右，但愈伤不能分化成芽，而高浓度秋水仙素浸泡愈伤，不仅不能分化成芽，还会造成愈伤大量死亡。当采用低浓度的秋水仙素以及不论什么浓度的二甲戊灵、安磺灵、甲基胺草磷、氟乐灵等其他化学诱导剂，使愈伤染色体加倍成双单倍体的比例均低于1%，而当用低浓度秋水仙素和其他化学诱导剂进行混合使用时，低浓度秋水仙素和适宜浓度的安磺灵复配使用，可使愈伤染色体加倍率瞬间提高到20%以上，但愈伤仍几乎不能分化成芽，其具体试验数据如下表3：

处理完成后，将愈伤置于分化培养基内进行分化培养，培养30天后，采新生长的愈伤进行染色体染色镜检，试验结果如下表4：

由上表4可以看出，R8的染色体加倍率最佳，但愈伤有部分变黑，后期继续培养不能生长，R3、R5、R7染色体加倍率亦显著高于其他处理，但R3会导致愈伤死亡，R7对愈伤的影响同R8，亦会导致愈伤继续培养不能生长，且R7还会导致一定比例的四倍体。综合比较，R5是愈伤染色体加倍的最佳处理。

3、愈伤分化后用小芽进行染色体加倍试验

用不同浓度的秋水仙素和安磺灵，浸泡不同时间，处理愈伤分化的小芽，其具体试验设计如下表5：

处理完成后，接种于分化培养基继续培养，后再进行生根培养，取根尖进行染色体染色镜检，试验结果如下表6：

由上表6可以看出，XY3和XY8其染色体加倍效果均较好，且不影响芽的生长，亦不会有四倍体产生。

4、植物生长调节剂对小芽染色体加倍的影响

后期对秋水仙素在0.02～0.05%浓度的基础上与安磺灵在0.03～0.06%的基础上进行复配微调，得出0.02～0.04%的秋水仙素与0.05～0.06%的安磺灵复合浸泡36～48小时效果为最佳，在此基础上，又继续添加不同浓度的2,4-D、IAA、6-BA、KT、GA3，其中2,4-D、IAA、6-BA、KT均能在一定程度的增加染色体的加倍率，且不影响小芽后期的生长及生根，其中以3.0mg/L的6-BA效果最佳，可使染色体加倍率提高到32%以上，且不会出现四倍体。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选取具有花药的滇黄精花蕾进行预处理；

（2）将预处理好的花蕾进行消毒，并在消毒后剥取花药；

（3）将花药接种于愈伤诱导培养基中培养；

（4）将诱导出的愈伤接种于愈伤分化培养基中培养；

（5）将愈伤分化出的小芽进行染色体加倍处理；

（7）将分化出的苗体接种于生根培养基中生根培养；

步骤（3）所述的愈伤诱导培养基为改良N6+2,4-D 0.6～0.8mg/L+2-IP 0.2～0.5mg/L+GA₃ 0.4～0.5mg/L，改良N6培养基为其余成分不变，糖添加量改为50g/L，pH改为6.4；

步骤（5）中，染色体加倍处理方法为用0.02～0.04%秋水仙素+0.05～0.06%安磺灵+6-BA 3.0mg/L+0.5%DMSO在25±2℃，黑暗条件下浸泡36～48小时；

步骤（4）和步骤（6）所述的愈伤分化培养基为MS+NAA 0.02～0.05mg/L+IBA 0.1～0.2mg/L+BR 0.4～0.5mg/L+TDZ 2.0～3.0mg/L；

2.根据权利要求1所述的一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，步骤（1）中，预处理方法为置于4±2℃全黑暗环境下处理24～36小时。

3.根据权利要求1所述的一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，步骤（2）中，消毒方法为依次用75%酒精消毒20～30s，饱和漂白粉溶液消毒20～30min，0.05%升汞+2滴吐温-80溶液消毒3～4min。

4.根据权利要求1所述的一种生产滇黄精双单倍体的方法，其特征在于，步骤（7）所述的生根培养基为1/2MS+NAA 0.5～0.8mg/L+IBA 1.0～1.2mg/L+活性炭 0.5g/L。