CN115606718B - 一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂及其制备方法与应用，属于鱼饲料技术领域。每100g添加剂中包括20‑40g发酵中草药、5‑10g的岩藻黄素及0.02‑0.08g的酵母锰，余量为载体；发酵中草药所使用的中草药包括质量比为1:1的密蒙花和蔓荆子，使用的发酵菌为保藏编号为CGMCC：1.2696的乳酸片球菌。该添加剂能有效改善菜籽油替代鱼油引发的肝脏超微结构改变，确保鱼体的生长和健康不受菜籽油替代鱼油的影响。相应的制备方法简单，易操作。将其用于黄颡鱼幼鱼饲料中，可有效解决黄颡鱼幼鱼在实际生产中菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，降低鱼油使用量，减少饲料原料进口依赖。

Description

一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及鱼饲料技术领域，具体而言，涉及一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂及其制备方法与应用。
背景技术
鱼油为水产动物优质的脂肪源，我国超过2/3的鱼油来自进口，每年消耗全球鱼油总量的50-60％。目前，亟需研发鱼油替代技术，降低水产配合饲料对鱼油的依赖，以解决水产养殖对鱼油依赖性过强的问题。菜籽油为国产原料产量最大的油类，被成为“国油之王”。同时，基于菜籽油中脂肪酸较为平衡，油酸、亚油酸和亚麻酸含量适宜，饱和脂肪酸含量较低等原因，成为鱼油的一种优质替代油源。
黄颡鱼，俗称黄骨鱼，因其肉质细腻、营养丰富、具有滋补作用，深受消费者喜爱，同时也是出口创汇的优良品种。黄颡鱼仔稚鱼期主要以摄食鲜活的生物饵料为主，因此，在其幼鱼人工养殖过程中，需历经转食配合饲料的应激，为维持黄颡鱼幼鱼高存活率，生产中通常以鱼油和豆油作为脂肪源制备饲料。
实际生产中发现，用高比例菜籽油替代鱼油会诱发肝脏超微结构损伤。因此，寻找特定的营养调控方法解决这一关键技术问题具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂，以解决上述技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种上述添加剂的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种含有上述添加剂的黄颡鱼幼鱼饲料。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂，每100g添加剂中包括20-40g发酵中草药、5-10g的岩藻黄素以及0.02-0.08g的酵母锰，余量为载体；
发酵中草药所使用的中草药包括密蒙花和蔓荆子，密蒙花与蔓荆子的质量比为1:1；
发酵中草药所使用的发酵菌为保藏编号为CGMCC：1.2696的乳酸片球菌。
在可选的实施方式中，每100g添加剂中包括30g发酵中草药、8g的岩藻黄素以及0.05g的酵母锰，余量为载体。
在可选的实施方式中，载体为海泡石。
第二方面，本申请提供如前述实施方式任一项的添加剂的制备方法，包括以下步骤：按配比混合发酵中草药、岩藻黄素、酵母锰以及载体。
在可选的实施方式中，发酵中草药的制备包括：于中草药固态发酵培养基中接种乳酸片球菌种子液，发酵。
在可选的实施方式中，乳酸片球菌种子液在中草药固态发酵培养基中的接种量为4-6wt％。
在可选的实施方式中，发酵是于30℃的条件下进行20-24h。
在可选的实施方式中，发酵后，还包括干燥发酵所得物。
在可选的实施方式中，干燥是于60-65℃的条件下进行。
在可选的实施方式中，干燥至发酵所得物的水分含量不超过10wt％。
在可选的实施方式中，中草药固态发酵培养基的制备包括：将培养基基质与水混合，灭菌；
其中，培养基基质由中草药与麸皮、葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4以及 MgSO4·7H2O按重量比为78-82：8-12：4-6：0.5-0.7：0.3-0.5：0.08-0.12混合而得。
在可选的实施方式中，培养基基质与水的混合比为1g：1.5-2.5mL。
在可选的实施方式中，灭菌是于115-120℃的条件下进行18-22min。
在可选的实施方式中，在制备培养基基质之前，还包括将中草药进行粉碎。
在可选的实施方式中，乳酸片球菌种子液的制备包括：将乳酸片球菌接入MRS液体中培养，随后再接种于MRS固体培养基上培养。
在可选的实施方式中，MRS液体培养基的制备原料包括：10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、5g葡萄糖、1g吐温80、0.2g MgSO4·7H2O、 2g C6H17N3O7、5g CH3COONa、2g K2HPO4以及0.05g MnSO4·H2O。
在可选的实施方式中，MRS固体培养基的制备包括：于MRS液体培养基中按100mL：1.2-1.8g的比例加入琼脂粉。
第三方面，本申请提供一种黄颡鱼幼鱼饲料，其制备原料中含有如前述实施方式任一项的添加剂，黄颡鱼幼鱼饲料中还同时含有豆油和菜籽油，且黄颡鱼幼鱼饲料中不含鱼油。
在可选的实施方式中，黄颡鱼幼鱼饲料中含有质量比为1:1的豆油和菜籽油。
在可选的实施方式中，添加剂在黄颡鱼幼鱼饲料中的添加量为 0.05-0.2wt％；优选为0.1wt％。
本申请的有益效果包括：
本申请通过将密蒙花和蔓荆子配合使用(密蒙花与蔓荆子的质量比为1： 1)，并经特定的乳酸片球菌发酵，不仅可共同保护肝脏结构、增加抗氧化酶活性、降低细胞内氧自由基含量，减少自噬体的释放，维持线粒体和粗面内质网数量稳定；而且可减少或避免氧自由基与脂类、蛋白质、核酸反应破坏膜结构，进而有利于维持细胞膜、线粒体膜、内质网膜的完整性。此外，乳酸片球菌发酵分泌的酶，能够将密蒙花及蔓荆子的细胞壁内部存在的大量有效成分解离出来，利于黄颡鱼机体的吸收，从而增强药效，解决中草药见效慢的问题。
岩藻黄素在本发明中用于加快黄颡鱼幼鱼的脂肪代谢，平衡血脂，减少脂质在肝细胞内沉积，防止细胞核和线粒体等细胞器遭受挤压变形；同时，其还可减轻黄颡鱼幼鱼的线粒体功能障碍，激发降解和修复受损线粒体；此外，其与本申请中的发酵中草药和酵母锰共同作用，可降低氧自由基的产生，保护膜结构不受破坏。
酵母锰具有较高的稳定性、溶解性和生物利用率，易于鱼体消化吸收、无刺激、无毒副作用。其可与岩藻黄素配合加快鱼体脂肪代谢，降低脂质在细胞中的沉积，与发酵中草药和岩藻黄素一起降低氧自由基产生。
上述添加剂的制备方法简单，易操作。将其用于黄颡鱼幼鱼饲料中，可有效解决黄颡鱼幼鱼在实际生产中菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，降低鱼油使用量，减少饲料原料进口依赖。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例中正常组对应的黄颡鱼幼鱼肝脏组织结构图；
图2至图4依次为试验例中试验组1至试验组3对应的黄颡鱼幼鱼肝脏组织结构图；
图5为试验例中对照组对应的黄颡鱼幼鱼肝脏组织结构图；
图6至图14依次为试验例中对比组1至对比组9对应的黄颡鱼幼鱼肝脏组织结构图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂及其制备方法与应用进行具体说明。
发明人提出：菜籽油因其含有介酸等成分在替代鱼油时会诱发肝脏超微结构损伤，而肝脏是鱼类重要的腺体和消化代谢器官，肝脏超微结构损伤会诱发鱼体各种代谢疾病，严重威胁鱼体的生长和健康。
基于此，本申请提出一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂，每100g该添加剂中包括20-40g发酵中草药、5-10g的岩藻黄素以及0.02-0.08g的酵母锰，余量为载体。
其中，每100g添加剂中发酵中草药的含量可以为20g、22g、25g、28g、 30g、32g、35g、38g或40g等，也可以为20-40g范围内的其它任意值。
每100g添加剂中岩藻黄素的含量可以为5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、 8g、8.5g、9g、9.5g或10g等，也可以为5-10g范围内的其它任意值。
每100g添加剂中酵母锰的含量可以为0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、 0.07g或0.08g等，也可以为0.02-0.08g范围内的其它任意值。
在一些优选的实施方式中，每100g添加剂中包括30g发酵中草药、8g 的岩藻黄素以及0.05g的酵母锰，余量为载体。
本申请中，发酵中草药所使用的中草药包括密蒙花和蔓荆子，发酵中草药所使用的发酵菌为乳酸片球菌。
其中，密蒙花为马钱科醉鱼草属植物密蒙花的干燥花蕾及花序，又名黄饭花、小锦花等，具有清热泻火、养肝明目以及抗氧化的功效。蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆或蔓荆的干燥成熟果实，具有具有抗炎、抗氧化、解热镇痛、抑制组胺释放以及抗肿瘤等多种生物活性。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)选自保藏编号为CGMCC：1.2696 的菌种，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本申请通过将密蒙花和蔓荆子配合使用(密蒙花与蔓荆子的质量比为1： 1)，并经特定的乳酸片球菌发酵，不仅可共同保护肝脏结构、增加抗氧化酶活性、降低细胞内氧自由基含量，减少自噬体的释放，维持线粒体和粗面内质网数量稳定；而且可减少或避免氧自由基与脂类、蛋白质、核酸反应破坏膜结构，进而有利于维持细胞膜、线粒体膜、内质网膜的完整性。此外，乳酸片球菌发酵分泌的酶，能够将密蒙花及蔓荆子的细胞壁内部存在的大量有效成分解离出来，利于黄颡鱼机体的吸收，从而增强药效，解决中草药见效慢的问题。
岩藻黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗肥胖和神经保护等多方面的药理作用，毒副作用很小。在本发明中，其用于加快黄颡鱼幼鱼的脂肪代谢，平衡血脂，减少脂质在肝细胞内沉积，防止细胞核和线粒体等细胞器遭受挤压变形；同时，其还可减轻黄颡鱼幼鱼的线粒体功能障碍，激发降解和修复受损线粒体；此外，其与本申请中的发酵中草药和酵母锰共同作用，可降低氧自由基的产生，保护膜结构不受破坏。
锰为参与葡萄糖和脂肪代谢的多种酶的激活剂，同时也是抗氧化酶的催化剂，本申请采用酵母锰(锰螯合物产品)，其具有较高的稳定性、溶解性和生物利用率，易于鱼体消化吸收、无刺激、无毒副作用。并且，其可与岩藻黄素配合加快鱼体脂肪代谢，降低脂质在细胞中的沉积，与发酵中草药和岩藻黄素一起降低氧自由基产生。
作为参考地，本申请采用的载体为海泡石。其作为纤维状富镁粘土矿物，表面积大，吸附性、流动性好，在本申请中作为饲料载体，可使各组分均匀分布，自由流动。当将该添加剂制备饲料时，有助于饲料颗粒硬度的提高，饲料易于结粒，延长颗粒饲料在水中的稳定性，同时，其含有丰富的动物必需矿物质、微量元素，可促进鱼体生长。
承上，菜籽油在替代鱼油时至少会导致以下问题：
A、肝细胞质中充满较多大的脂肪滴，细胞核遭挤压变形，核膜残缺；线粒体数量和粗面内质网数量明显减少，且排列不规则；
B、线粒体出现多种形态，线粒体双膜结构和内质网膜遭到损伤和破坏，肝脏超微结构损伤。
本申请通过将发酵中草药(中草药包括密蒙花和蔓荆子，发酵菌种为 CGMCC：1.2696的乳酸片球菌)、岩藻黄素、酵母锰以及海泡石按上述配比配合，不仅能够起到各组分本身所原有作用，而且还能够通过组分间的协调互补以及复配作用。密蒙花和蔓荆子经乳酸片球菌发酵后，药效增强，可降低高菜籽油日粮对细胞的毒性作用，减少氧自由基产生，从而稳定线粒体和粗面内质网数量稳定，维持膜结构不受损伤；岩藻黄素和锰对发酵中草药的功能起到增效作用，同时可平衡血脂代谢，减少因脂质过多沉积导致的肝细胞超微结构改变。以上物质共同发挥作用，可有效改善菜籽油替代鱼油引发的肝脏超微结构改变，确保鱼体的生长和健康不受菜籽油替代鱼油的影响。
相应地，本申请还提供了上述添加剂的制备方法，包括以下步骤：按配比混合发酵中草药、岩藻黄素、酵母锰以及载体。
作为参考地，上述发酵中草药的制备包括：于中草药固态发酵培养基中接种乳酸片球菌种子液，发酵。
示例性地，乳酸片球菌种子液在中草药固态发酵培养基中的接种量可以为4-6wt％，如4wt％、4.5wt％、5wt％、5.5wt％或6wt％等，也可以为4-6wt％范围内的其它任意值。
发酵可以于30℃的条件下进行20-24h，如于30℃的条件进行24h。
进一步地，发酵后，对发酵所得物进行干燥。
示例性地，干燥可以于60-65℃(如65℃)的条件下进行。干燥至发酵所得物的水分含量不超过10wt％即可。
作为参考地，上述中草药固态发酵培养基的制备包括：将培养基基质与水混合，灭菌；
其中，培养基基质由中草药与麸皮、葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4以及 MgSO4·7H2O按重量比为78-82：8-12：4-6：0.5-0.7：0.3-0.5：0.08-0.12混合而得。
在一些具体的实施方式中，培养基基质由中草药与麸皮、葡萄糖、 (NH4)2SO4、K2HPO4以及MgSO4·7H2O按重量比为80：10：5：0.6：0.4： 0.1混合而得。
培养基基质与水的混合比可以为1g：1.5-2.5mL，如1g：1.5mL、1g： 2mL或1g：2.5mL等。
灭菌可以于115-120℃的条件下进行18-22min，如于120℃的条件进行 20min。
在一些优选的实施方式中，在制备培养基基质之前，还可将中草药进行粉碎，过80目筛。
作为参考地，上述乳酸片球菌种子液的制备包括：将乳酸片球菌接入 MRS液体中培养，随后再接种于MRS固体培养基上培养。
在一些具体的实施方式中，MRS液体培养基的制备原料包括：10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、5g葡萄糖、1g吐温80、0.2g MgSO4·7H2O、 2g C6H17N3O7、5g CH3COONa、2gK2HPO4以及0.05g MnSO4·H2O。
在具体配制过程中，将MRS液体培养基的制备原料装入含1L蒸馏水的容器中搅拌完全溶解，于pH值为6.8、120℃的条件下高压灭菌30min，冷却至室温后备用即可。
MRS固体培养基的制备包括：于MRS液体培养基中按100mL：1.2-1.8g (如100mL：1.5g)的比例加入琼脂粉。MRS液体培养基可参照上述方法配制得到。
此外，本申请还提供了一种黄颡鱼幼鱼饲料，其制备原料中含有上述添加剂，该黄颡鱼幼鱼饲料中还同时含有豆油和菜籽油，且不含鱼油。
示例性地，上述黄颡鱼幼鱼饲料中含有质量比为1:1的豆油和菜籽油。
较佳地，本申请提供的添加剂在黄颡鱼幼鱼饲料中的添加量可以为 0.05-0.2wt％，如0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％或0.2wt％等，也可以为0.05-0.2wt％范围内的其它任意值，优选为0.1wt％。
通过在含有质量比为1:1的豆油和菜籽油的黄颡鱼幼鱼饲料中按上述配比添加本申请提供的添加剂，可有效解决黄颡鱼幼鱼在实际生产中菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，降低鱼油使用量，减少饲料原料进口依赖。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种预防菜籽油诱发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构的添加剂，每100g该添加剂中含有20g发酵中草药(10g密蒙花和10g蔓荆子)、5g 岩藻黄素、0.02g酵母锰，余量为海泡石。
该添加剂经以下方式制备得到：
(1)MRS液体培养基配制：将10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、 5g葡萄糖、1g吐温80、0.2g MgSO4·7H2O、2g C6H17N3O7、5g CH3COONa、 2g K2HPO4以及0.05g MnSO4·H2O加入装有1L蒸馏水的容器中搅拌至完全溶解，于pH值为6.8、120℃的条件下高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
(2)MRS固体培养基制备：在每100mL的MRS液体培养基中加入 1.5g琼脂粉，混匀后，于120℃的条件下高压灭菌30min，冷却至室温，备用。
(3)乳酸片球菌种子液的制备：在无菌操作台内将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC：1.2696的乳酸片球菌转接于已灭菌的MRS液体中，30℃恒温箱培养12h后接种于MRS固体培养基上，培养24小时后，挑取单一、成熟菌落接种于MRS液体培养基中，连续培养3代(12h)，放于冰箱4℃保存备用。
(4)将密蒙花和蔓荆子分别烘干后，粉碎，过80目筛，按质量比为 1:1混合均匀，得到中草药混合物。将该中草药混合物与麸皮、葡萄糖、 (NH4)2SO4、K2HPO4以及MgSO4·7H2O按重量比为80：10：5：0.6：0.4： 0.1均匀混合后，得到培养基基质。
(5)将上述培养基基质按照固液比为1g：2mL与双蒸水混合，随后于 120℃的条件下灭菌20min，冷却至室温，得到中草药固态发酵培养基。
(6)于上述中草药固态发酵培养基中按接种量为5wt％接种上述乳酸片球菌种子液，于30℃的条件下发酵24h，随后于65℃烘干至发酵所得物的水分含量不超过10wt％，得到发酵中草药。
(7)将上述发酵中草药与岩藻黄素、酵母锰以及海泡石分别粉碎过80 目，按配比逐级混合即得。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：每100g添加剂中含有30g发酵中草药(密蒙花和蔓荆子质量比为1：1)、8g岩藻黄素、0.05g酵母锰，余量为海泡石。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：每100g添加剂中含有40g发酵中草药(密蒙花和蔓荆子质量比为1：1)、10g岩藻黄素、0.08g酵母锰，余量为海泡石。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于：每100g添加剂中含有30g发酵中草药，余量均为海泡石。
也即，本对比例的添加剂中不含岩藻黄素和酵母锰。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于：每100g添加剂中含有8g岩藻黄素、 0.05g酵母锰，余量为海泡石。
也即，本对比例的添加剂中不含发酵中草药。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于：每100g添加剂中含有30g发酵中草药(仅为密蒙花)、8g岩藻黄素、0.05g酵母锰，余量为海泡石。
也即，本对比例添加剂的发酵中草药全为密蒙花，不含蔓荆子。
对比例4
本对比例与实施例2的区别在于：每100g添加剂中含有30g发酵中草药(仅为蔓荆子)、8g岩藻黄素、0.05g酵母锰，余量为海泡石。
也即，本对比例添加剂的发酵中草药全为蔓荆子，不含密蒙花。
对比例5
本对比例与实施例2的区别在于：添加剂中所用的中草药未经乳酸片球菌发酵。
对比例6
本对比例与实施例2的区别在于：乳酸片球菌为保藏编号为CGMCC： 1.123的乳酸片球菌。
对比例7
本对比例与实施例2的区别在于：发酵中草药所使用的中草药中，密蒙花和蔓荆子的质量比为1:2。
对比例8
本对比例与实施例2的区别在于：发酵中草药所使用的中草药中，密蒙花和蔓荆子的质量比为2:1。
对比例9
本对比例与实施例2的区别在于：发酵中草药所使用的中草药中，以龙胆草等量代替密蒙花，以股绞蓝等量代替蔓荆子。
试验例
本试验采用单因子设计，用小型颗粒机加工成粒径为2mm左右的颗粒，常温风干后置于4℃冰箱保存备用。
将鱼驯化一周后，挑选体格健壮、规格整齐(均重为1±0.03g)的黄颡鱼幼鱼1680尾，随机分成14组，每组3个重复，每个重复40尾。
分组如下：
1个正常组，饲喂适宜含量的鱼油及豆油(质量比为1:1)；
1个对照组，饲喂适宜含量的菜籽油及豆油(质量比为1:1)；
3个试验组，饲喂适宜含量的菜籽油和豆油(质量比为1:1)以及实施例1-3提供的添加剂(3个试验组定义为试验组1、试验组2和试验组3，依次对应实施例1-3的添加剂)；
9个对比组，饲喂适宜含量的菜籽油和豆油(质量比为1:1)以及对比例1-8提供的添加剂(8个对比定义为对比组1至对比组8，依次对应对比例1-8的添加剂)。
基础日粮组成如表1所示。
试验鱼于42个水族箱中(圆柱形，装水量80L)养殖，每日投喂3次 (时间分别在7:30、12:30、17:30)，饱食投喂，每次投喂持续30min，尽可能保证饲料被鱼摄食，减少饲料浪费，记录投喂量，养殖期为8周。每天定时(7:30和17:30)测定水族箱内水体的水温、溶氧和pH，并定期测定水质。养殖期间，采取自然光照条件(昼夜比为10h:14h)，水温控制在 (27±3)℃，每天换水约1/3，保持水体pH值为7.5-8.0，溶解氧含量大于 5mg/L，氨氮含量小于0.4mg/L，亚硝酸盐含量小于0.06mg/L。
养殖试验结束，禁食24h，统计每一水族箱中鱼的尾数并称总重。将鱼用浓度为100mg·L-1的MS-222(Sigma，美国)麻醉，置于冰盘上解剖取其肝脏样品于液氮中保存。采用南京建成公司的试剂盒进行测定线粒体和内质网MDA含量、细胞内ROS含量。同时，解剖后取肝脏样品用2.5％的戊二醛固定24小时后，OsO4固定1小时，切成70nm厚度的切片，染色后用透射电子显微镜(HitachiH-7650)观察。
其结果如表2、表3以及图1至图14所示。
表1基础日粮组成(％)
注：预混料为每千克饲料提供以下矿物质(g·kg-1of diet)和维生素(IU or mg·kg-1of diet)： CuSO4·5H2O 0.02g；FeSO4·7H2O 0.25g；ZnSO4·7H2O 0.22g；MnSO4·4H2O0.07g；Na2SeO3 0.0004g； KI 0.00026g；CoCl2·6H2O 0.001g；维生素A 9000IU；维生素D2000IU；维生素E 45mg；维生素K3 2.2mg；维生素B1 3.2mg；维生素B2 10.9mg；烟酸20mg；维生素B6 5mg；维生素B12 0.016mg；维生素C 50mg；泛酸10mg；叶酸1.65mg；胆碱600mg肌醇10mg；生物素0.012mg。
①、不同处理组黄颡鱼幼鱼生长性能结果如表2所示。
表2不同处理组黄颡鱼幼鱼生长性能的比较
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
由表2可知：对照组黄颡鱼幼鱼增重率显著低于正常组(P<0.05)，饲料系数显著高于正常组(P<0.05)，由此可见，用菜籽油替代鱼油会降低黄颡鱼幼鱼的生长性能。
试验组1-3的增重率和饲料系数与正常组无显著差异(P>0.05)，表明添加申请实施例提供的添加剂可解决黄颡鱼幼鱼饲料中用菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，且其中试验组2效果最佳。
对比组1-4的效果显著低于试验组，说明组分间存在一定的协同作用，在本申请饲料添加剂中，需要将各成分配伍使用才能够解决菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，缺少任一种组分均不能达到预期效果。
对比组5的效果显著低于试验组，说明本申请饲料添加剂中的中草药发酵后使用才能达到预期效果；对比组6-8的效果显著低于试验组，说明发酵菌必须用乳酸片球菌CGMCC：1.2696且中草药比例需为1：1才能达到预期效果；对比组9的试验效果低于试验组，说明用相同保肝的中草药替代本申请中的中草药并不能达到预期效果。
②、不同处理组黄颡鱼幼鱼线粒体和内质网损伤指标结果如表3所示。
表3不同处理组黄颡鱼幼鱼线粒体和内质网损伤指标比较
由表3可知：对照组黄颡鱼肝细胞线粒体和内质网脂质过氧化物MDA 和细胞内ROS含量显著高于正常组(P<0.05)，说明菜籽油替代鱼油会诱发黄颡鱼幼鱼肝脏线粒体和内质网损伤。
试验组内黄颡鱼肝脏线粒体和内质网脂质过氧化物MDA和细胞内 ROS含量较对照组和对比组显著降低(P<0.05)表明，本申请提供的添加剂可以显著减轻菜籽油替代鱼油引发的肝细胞线粒体和内质网氧化损伤。
对比组1-9的效果显著低于试验组，说明需按照本发明的配方组分使用才能达到预期效果，任何一种成分的缺失，或组分间的比例变化、发酵益生菌的变化或缺失中草药发酵环节均会导致试验效果的显著下降。
③、不同处理组黄颡鱼幼鱼肝脏组织结构图如图1至图14所示。
由图1至图4可以看出：正常组和试验组肝脏细胞结构显示正常状态，细胞核圆滑，细胞质均匀，细胞膜清晰可见，线粒体多，分布均匀，粗面内质网排列有序。
由图5至图14可以看出：对照组和对比组1-9对应的肝细胞质中充满较多大的脂肪滴，线粒体数量和内质网数量明显减少，细胞核被挤压变形，并偏移至细胞边缘处，部分细胞核凋亡。
由此可见，菜籽油替代鱼油会引发黄颡鱼幼鱼肝脏超微结构改变，本申请提供的添加剂可有效解决该问题，且各组分需按特定比例配伍使用才能达到效果，任一组分的缺少或改变均会导致应用效果显著下降。
综上所述，本申请提供的添加剂能够有效改善菜籽油替代鱼油引发的肝脏超微结构改变，确保鱼体的生长和健康不受菜籽油替代鱼油的影响。相应的制备方法简单，易操作。将其用于黄颡鱼幼鱼饲料中，可有效解决黄颡鱼幼鱼在实际生产中菜籽油替代鱼油引发的生长性能下降问题，降低鱼油使用量，减少饲料原料进口依赖。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述黄颡鱼幼鱼饲料的制备原料中含有添加剂，所述黄颡鱼幼鱼饲料中还同时含有豆油和菜籽油，且所述黄颡鱼幼鱼饲料中不含鱼油；
每100g所述添加剂中包括20-40g发酵中草药、5-10g的岩藻黄素以及0.02-0.08g的酵母锰，余量为载体；
所述发酵中草药所使用的中草药为密蒙花和蔓荆子，所述密蒙花与所述蔓荆子的质量比为1：1；
所述发酵中草药所使用的发酵菌为保藏编号为CGMCC No.1.2696的乳酸片球菌；
所述发酵中草药的制备包括：于中草药固态发酵培养基中接种乳酸片球菌种子液，发酵；所述乳酸片球菌种子液在所述中草药固态发酵培养基中的接种量为4-6wt%；发酵是于30℃的条件下进行20-24h；
所述中草药固态发酵培养基的制备包括：将培养基基质与水混合，灭菌；其中，所述培养基基质由所述中草药与麸皮、葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4以及MgSO4·7H2O按重量比为78-82：8-12：4-6：0.5-0.7：0.3-0.5：0.08-0.12混合而得；
乳酸片球菌种子液的制备包括：将乳酸片球菌接入MRS液体中培养，随后再接种于MRS固体培养基上培养；所述MRS液体培养基的制备原料包括：10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、5g葡萄糖、1g吐温80、0.2g MgSO4·7H2O、2g C6H17N3O7、5g CH3COONa、2g K2HPO4以及0.05g MnSO4·H2O；所述MRS固体培养基的制备包括：于MRS液体培养基中按100mL：1.2-1.8g的比例加入琼脂粉；
所述培养基基质与水的混合比为1g：1.5-2.5mL；
发酵后，还包括干燥发酵所得物；
干燥是于60-65℃的条件下进行；
干燥至所述发酵所得物的水分含量不超过10wt%。
2.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，每100g所述添加剂中包括30g发酵中草药、8g的岩藻黄素以及0.05g的酵母锰，余量为载体。
3.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述载体为海泡石。
4.根据权利要求1-3任一项所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述添加剂的制备包括以下步骤：按配比混合所述发酵中草药、所述岩藻黄素、所述酵母锰以及所述载体。
5.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，灭菌是于115-120℃的条件下进行18-22min。
6.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，在制备所述培养基基质之前，还包括将所述中草药进行粉碎。
7.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述黄颡鱼幼鱼饲料中含有质量比为1:1的豆油和菜籽油。
8.根据权利要求1所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述添加剂在所述黄颡鱼幼鱼饲料中的添加量为0.05-0.2wt%。
9.根据权利要求8所述的黄颡鱼幼鱼饲料，其特征在于，所述添加剂在所述黄颡鱼幼鱼饲料中的添加量为0.1wt%。
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